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Revista de Ciencias Biolgicas y de la Salud Universidad de Sonora

El saber de mis hijos har


www.biotecnia.uson.mx mi grandeza

IDENTIFICACIN MORFOLGICA Y POR PCR DE Rhizoctonia solani


KHN A PARTIR DE FRUTOS DE CALABAZA PIPIANA Y SU MANEJO EN
INVERNADERO
MORPHOLOGICAL AND PCR IDENTIFICATION OF Rhizoctonia solani KHN ISOLATED FROM PIPIANA
PUMPKIN FRUITS AND GREENHOUSE MANAGEMENT
Jos Francisco Daz Njera1, Mateo Vargas Hernndez2, Sergio Ayvar Serna3, Omar Guadalupe Alvarado Gmez4*,
Juan Fernando Sols Aguilar5, Jos Aurelio Durn Ramrez3, Huizar Leonardo Daz Ceniceros5 y Adrin Hernndez
Aguilar5
1
Universidad Autnoma Chapingo, Departamento de Fitotecnia, Programa de Posgrado en Horticultura, Km. 38.5 Carretera
Mxico-Texcoco, Chapingo, Estado de Mxico C.P. 56230.
2
Universidad Autnoma Chapingo, Departamento de Suelos, Km. 38.5 Carretera Mxico-Texcoco, Chapingo, Estado de
Mxico C.P. 56230.
3
Centro de Estudios Profesionales. Colegio Superior Agropecuario del Estado de Guerrero. Avenida Vicente Guerrero Nm.
81. Iguala, Guerrero, C.P. 40000.
4
Facultad de Agronoma, UANL. Av. Universidad s/n, Cd. Universitaria, San Nicols de los Garza, N.L. CP66451.
5
Universidad Autnoma Chapingo, Departamento de Parasitologa Agrcola, Km. 38.5 Carretera Mxico-Texcoco, Chapingo,
Estado de Mxico C.P. 56230.

RESUMEN The soil fungi cause severe problems by reducing fruit yields.
Cucurbita argyrosperma (calabaza pipiana), es un This study aimed to identify the causal agent involved in fruit
cultivo importante en el estado de Guerrero. El precio de rot in pipiana pumpkin and evaluate alternative chemical
venta por tonelada de semilla se ha incrementado de $ 15, and biological control in greenhouses. During the months
500 en el ao 2005 a $ 35, 000 en 2011, lo que ha propiciado of august and september 2012, pipiana pumpkin fruits with
que se incremente la superficie sembrada. Los hongos del different symptoms and levels of fruit rot were collected
suelo causan pudricin en frutos reduciendo los rendimien- in the northern part of state of Guerrero. After identifying
tos. El objetivo del estudio fue identificar al agente causal morphologically, DNA extracts were analyzed using PCR with
involucrado en la pudricin de frutos de calabaza pipiana y ITS 1/ITS-4 primers, which amplify an intergenic internal
evaluar alternativas de control qumico y biolgico en inver- spacer (ITS). Rhizoctonia solani was detected in fruits of
nadero. Durante los meses de agosto y septiembre de 2012, pipiana pumpkin in the state of Guerrero. The amplification
se recolectaron frutos, con diferentes sntomas y niveles de products were sequenced showing 99 % of similarity to
pudricin en la zona norte del Estado de Guerrero. Despus sequences from the USA. The consensus sequence was
de identificar morfolgicamente se analiz molecularmente deposited in GenBank with the accession number KJ652221.
mediante el ADN del patgeno, las muestras se analizaron Trichoderma asperellum and the active ingredients free iodine
con la tcnica de PCR, con los oligonucletidos ITS-1/ ITS-4, and quintozene: PCNB exercised better control by delaying
los cuales amplifican un espaciador intergnico interno (ITS). the presence of the pathogen in pipiana pumpkin fruits.
Se identific a Rhizoctonia solani en los frutos analizados. Los
productos de amplificacin fueron secuenciados presentan- INTRODUCCIN
do un 99 % de similitud con secuencias de Estados Unidos La familia Cucurbitaceae incluye 118 gneros y 825
de acuerdo con el GenBank. La secuencia consenso fue especies y Mxico es uno de los ms importantes centros
depositada en GenBank con el nmero de acceso KJ652221. de diversidad, teniendo un importante papel cultural y eco-
Trichoderma asperellum y los ingredientes activos iodo libre nmico dentro de la sociedad (Lira et al., 2002). La calabaza
y quintozeno: PCNB, ejercieron el mejor control al retrasar la pipiana (Cucurbita argyrosperma) es un cultivo importante en
presencia del patgeno en frutos de calabaza pipiana. el estado de Guerrero (Ayvar et al., 2007); siendo uno de prin-
Palabras clave: Cucurbita argyrosperma, patgeno, diagns- cipales estados productores de semilla a nivel nacional (SIAP,
tico, manejo. 2012); adems, el precio de venta por tonelada de semilla ha
aumentado de $ 15 500 en el ao 2005 a $ 35 000 en 2011, lo
ABSTRACT que ha propiciado que se incremente la superficie sembrada
The pipiana pumpkin is an important crop in the en la entidad de 4228 a 5742 ha (SIAP, 2012). Sin embargo,
state of Guerrero; the selling price per ton of the seeds has durante el verano las condiciones clidas y de alta humedad
increased from $15 500 in 2005 to $35 000 in 2011, which relativa favorecen la presencia de enfermedades, siendo un
means that the surface sown in this area has also increased. problema para la produccin de cucurbitceas en Mxico
*Autor para envo de correspondencia: Omar Guadalupe Alvarado Gmez
Volumen XVI, Nmero 3
Correo electrnico: omar-alvarado@prodigy.net.mx 17
Recibido: 18 de febrero de 2014
Aceptado: 12 de mayo de 2014
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(Zitter et al., 2004) y varias partes del mundo (Cohen et al., frutos de calabaza con sntomas y signos de pudricin, se to-
2007). En algunas zonas del estado de Guerrero, se cultiva maron 5 trozos de tejido de 0.5 cm2 de la zona de avance de
calabaza pipiana en suelos planos, pesados y mal drenados, la enfermedad, se desinfectaron con hipoclorito de sodio al
que se conjuntan con el hbito de crecimiento rastrero 1.5 % por dos minutos; se enjuagaron tres veces consecutivas
e indeterminado del cultivo, para generar un microclima con agua destilada estril; se sembraron 100 muestras de te-
con condiciones ptimas para la proliferacin de hongos jido en cajas petri con medio de cultivo papa-dextrosa-agar
fitopatgenos habitantes del suelo, causando prdidas (PDA), elaborado segn Singlenton et al. (1992). Cada colonia
importantes en el rendimiento, disminuyendo los ingresos desarrollada se aisl y se purific por el mtodo punta de
econmicos de los productores dedicados a esta actividad hifa. De las cepas puras del ltimo reaislamiento se hicieron
(Ayvar et al., 2007). Los patgenos se controlan normalmente preparaciones permanentes para observar al microscopio
con fungicidas sistmicos que son compuestos capaces de las caractersticas morfolgicas del agente causal. Se midi
penetrar la cutcula de las hojas y dispersarse en la planta. el largo y ancho de 50 estructuras representativas del aisla-
Se caracterizan por sus propiedades protectoras y curativas, miento. La identificacin a nivel gnero se realiz siguiendo
muy efectivos a bajas concentraciones para el control de las claves de Singlenton et al. (1992) y Wantanabe (2002).
la enfermedad durante largos periodos de tiempo (Gisi y
Sierotzki, 2008). Sin embargo, su uso excesivo ha provocado Pruebas de patogenicidad
contaminacin ambiental y su eficacia disminuye con el paso Se utilizaron 20 frutos en etapa de cosecha del geno-
del tiempo, debido a la evolucin de patgenos resistentes tipo criollo Apipilulco, se desinfestaron con hipoclorito de
(Bartlett et al., 2002). En los agrosistemas, recientemente sodio al 1.5 % por dos minutos y se enjuagaron con agua des-
ha crecido la tendencia del control de enfermedades de las tilada estril, se utiliz un fruto como unidad experimental
plantas sin utilizar productos qumicos (Guign et al., 2010). con cuatro repeticiones en un arreglo completamente al azar.
En los ltimos 30 aos, se han utilizado otras alternativas, El aislamiento mencionado se cultiv en medio PDA para el
incluido el uso de microorganismos para el control biolgico; incremento de inculo. Despus de 15 das de crecimiento,
esta prctica se basa en el uso de organismos enemigos se prepararon suspensiones de inculo en agua destilada
naturales de una plaga o patgeno, con el fin de reducir o estril; se ajust a una concentracin a 80103 propgulos
eliminar sus efectos dainos en las plantas o sus productos mL-1, cada fruto se inocul mediante aspersin de 2.5 mL de
(Lim y Kim, 2010; Yang et al., 2012). No obstante de los xitos la suspensin; como testigo se utilizaron 5 frutos, los cuales
comerciales, hasta el momento, son todava limitados y se se inocularon con agua destilada estril con el mismo proce-
basan principalmente en hongos de los gneros Trichoder- dimiento. Los 25 frutos inoculados se colocaron en charolas
ma, Gliocladium, Streptomyces, Coniothyrium y Candida, as de unicel de 6040 cm, desinfestadas con etanol al 70 %. Se
como bacterias de los gneros Pseudomonas, Bacillus y Agro- incubaron a 26C y 80 % de humedad relativa, los sntomas se
bacterium (Harman et al., 2010; Pliego et al., 2011). La mejor registraron diariamente por ocho das. De las zonas de avan-
estrategia para el control de las enfermedades, es el manejo ce del hongo en los tejidos daados, se tomaron 10 muestras
integrado (Antonopoulos et al., 2010; Bi et al., 2012). El obje- de stos (0.5 cm2) y se desinfestaron con hipoclorito de sodio
tivo de la presente investigacin fue identificar morfolgica al 1.5 % durante 2 min, posteriormente se enjuagaron tres
y molecularmente al agente causal de la pudricin de frutos veces consecutivas con agua destilada estril y se sembra-
de calabaza pipiana y evaluar alternativas de control qumico ron en PDA. Las caractersticas morfolgicas de la colonia y
y biolgico en invernadero. hongo reaislado se compararon con las originalmente ino-
culadas, para comprobar los postulados de Koch. El hongo
MATERIALES Y MTODOS reaislado, se purific e incub durante 15 das en medio de
Identificacin morfolgica del hongo presente en frutos cultivo PDA para la extraccin de ADN.
de calabaza pipiana
Durante los meses de agosto y septiembre del 2011 Identificacin molecular
se recolectaron frutos de C. argyrosperma, con diferentes La extraccin de ADN se realiz a partir de 50 a 100
sntomas y nivel de pudricin, en el campo experimental del mg de micelio utilizando el kit DNeasyMR, siguiendo el proce-
Colegio Superior Agropecuario del Estado de Guerrero, loca- dimiento del fabricante (Qiagen, 2012). El procedimiento fue
lizado en el municipio de Cocula, Gro., localizado en la zona repetido a partir de 4 muestras del hongo. Se realizaron re-
norte de Guerrero, ubicado geogrficamente a 18 19 N, 99 acciones de PCR universal para hongos con los oligos ITS-1fu
39 O del meridiano de Greenwich, a una altitud de 640 m 5-tccgtaggtgaacctgcgg-3 y ITS-4 5-tcctccgcttattgatatgc-3
(Martnez et al., 2011). El tamao de muestra y tipo de mues- (White et al., 1990); los cuales amplifican un espaciador inter-
treo se realiz bajo la metodologa propuesta por Pedroza gnico interno (ITS) y generan un producto de talla variable
(2009), se utiliz un muestreo sistemtico en transecto en entre 500 y 900 pares de bases (pb) aproximadamente. Esta
W. Los sntomas considerados fueron pudriciones de frutos prctica se realiz con una mezcla de reaccin en un volu-
con lesiones acuosas, de color pardo a marrn, en ocasiones men final de 25 L, cuyos componentes finales fueron: amor-
hundidas, con crteres e irregulares, el rea con crteres en tiguador de reaccin 1X, MgCl2 2 mM, dNTPs 200 nM de cada
ocasiones con apariencia costrosa (Zitter et al., 2004). De los uno, 20 pmoles de cada oligonucletido y 1 unidad de Taq

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DNA polimerasa. El programa trmico consisti en mantener previa calibracin, se dej transcurrir 5 horas para permitir
2 min a 94C (un ciclo) , seguido de 30 seg a 94, 30 seg a 55 la reentrada de los productos y transcurrido ese tiempo se
y 1 min a 72C (35 ciclos) y una extensin final de 5 min a 72 asperj 2.5 mL de la concentracin ajustada del patgeno
C. Los productos de las reacciones de PCR fueron separados previa calibracin.
por electroforesis en geles de agarosa a 1.5 %, y las bandas se
observaron en un transiluminador de luz ultravioleta marca Variable evaluada
UVP y se tomaron fotografas. Los fragmentos amplificados La variable evaluada fue das a la presencia de R. solani,
por PCR fueron secuenciados directamente y los resultados la cual se consider determinando en cuantos das despus
se compararon con las secuencias de hongos disponibles en de aplicar los tratamientos e inoculacin del patgeno, ini-
el banco de genes (GenBank) del Centro Nacional de Infor- ciaban la aparicin de colonias sobre los frutos de calabaza.
macin Biotecnolgica (NCBI) del Instituto Nacional de Salud
(NIH) de E.E.U.U. Diseo experimental y anlisis de datos
Se utiliz un diseo experimental completamente
Manejo en invernadero al azar, con cuatro repeticiones. La unidad experimental
Con la finalidad de comparar el efecto de diferentes estuvo constituida por cuatro frutos, por las caractersticas
ingredientes activos sobre el patgeno aislado, la presente del experimento se consider a toda la unidad experimental
investigacin se realiz en el invernadero de Fitopatologa como parcela til. A los datos obtenidos de la variable de
del Departamento de Parasitologa Agrcola de la Univer- estudio, se le realiz un anlisis de varianza. De igual forma,
sidad Autnoma Chapingo, Chapingo Mxico. El material se efectu una prueba de comparacin mltiple de medias
vegetal utilizado fue el genotipo AP de calabaza pipiana utilizando el mtodo Tukey con nivel de significancia al 5 % y
(C. argyrosperma), utilizando solo frutos tiernos de 150 g de una prueba de contrastes ortogonales para comparar el gru-
peso fresco. po de tratamientos qumicos contra el grupo de tratamientos
biolgicos. Todos los anlisis estadsticos se realizaron con el
Obtencin, aplicacin del inculo y tratamientos software Statistical Analysis System (SAS, 2009).
Del muestreo previamente realizado sobre frutos con
diferentes sntomas y niveles de dao; se obtuvo un aisla- RESULTADOS Y DISCUSIN
miento monosprico, mismo que fue sembrado en PDA para Identificacin morfolgica del hongo presente en frutos
su incremento masivo (Singlenton et al., 1992). El material de calabaza pipiana
se incub a temperatura ambiente (24 3 C) por diez das Las colonias de las cepas aisladas de los frutos inocu-
con la finalidad de que el patgeno cubriera en su totalidad lados mostraron un crecimiento micelial de color marrn a
la caja petri. Posteriormente, se ajust una suspensin de castao algodonoso; similar al aislamiento original. Este pa-
propgulos a una concentracin de 80103mL-1. Se aplicaron tgeno mostr micelio maduro formando ramas en ngulo
los tratamientos (Tabla 1), con un aspersor manual marca recto, hifas de 5-8 m de ancho y esclerocios de 1-3 mm de
RL FLO MASTER con capacidad de 2 L, asperjando sobre la dimetro, tpico de R. solani (Sneh et al., 1991; Wantanabe,
superficie de los frutos con un gasto de agua de 300 L ha-1 2002). Por las caractersticas de este hongo se demostr que
se trat de R. solani (Zitter et al., 2004) (Figura 1).
Tabla 1. Productos qumicos y biolgicos evaluados contra
R. solani aislada a partir de frutos de calabaza pipiana (C.
argyrosperma).
Table 1. Chemical and biological products tested against R.
solani isolated from fruits of pipiana pumpkin (C. argyrosper-
ma).

No. Tratamiento Ingrediente activo DosisL-1


1 Trichodermacepa Trichodermaasperellum 1108 UFC
CSAEGro mL-1
2 PHC Biopak-F Bacillus spp., Streptomyces 3g
spp., Trichoderma spp.
3 PHC Root Mate Trichodermavirens cepa 3g
G-41
4 Q 2000 Yodo libre 5 mL
5 Benomil benomilo 1.6 g
6 Pentaclor*600 F quintozeno: PCNB 46 % 8mL Figura 1. Caractersticas morfolgicas de R. solani. 1) cons-
7 Testigo Sin aplicacin -- triccin, 2) septas y 3) ramificacin en ngulo recto.
Figure 1. Morphological characteristics of R. solani. 1) hypha
Fuente: Thompson (2012).
constrict, 2) septa and 3) branching at right angles.

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Identificacin molecular (1990), quin seala que el pentacloro (PCNB, quintozeno) se


Las regiones intergnicas internas ITS de los genes ha utilizado como un fungicida comercial contra patgenos
ribosomales (ARNr) amplificadas por PCR, del aislamiento de plantas transmitidos por el suelo como R. solani. General-
identificado morfolgicamente como R. solani, tuvo una talla mente se acepta que la fungitoxicidad de este compuesto es
de 700pb que concuerda con la talla esperada para la espe- debida a la peroxidacin de lpidos en las membranas, lo que
cie. Las secuencias obtenidas tuvieron un 99 % de similitud comprueba en esta investigacin un buen control.
con la regin ITS, cuya alineacin coincidi con la secuencia
de R. solani JX050241.1 (GenBank). Prueba de contrastes ortogonales
Esta prueba indic que, la comparacin entre produc-
Manejo en invernadero tos biolgicos contra los qumicos result no significativa
Das transcurridos a la presencia de R. solani. (P=0.6000), el grupo de tratamientos biolgicos en promedio
Esta caracterstica es importante, puesto que una vez retard en 4.22 das la aparicin de R. solani, mientras que
identificada la presencia del patgeno en frutos tiernos estos el grupo de tratamientos qumicos la atras en promedio
se daan por completo y se descomponen. Esta variable en 4.33 das. A pesar de que no existi diferencia significativa, el
estudio mostr diferencias significativas (P=<0.0156) entre grupo de productos qumicos fue ligeramente mejor con una
Trichoderma asperellum y los ingredientes activos, iodo libre diferencia en la aparicin del patgeno de 0.11 das (Figura
y quintozeno: PCNB, retardaron la aparicin de R. solani al da 3).
4.67, 4.42 y 4.42 respectivamente, el testigo se diferenci de
todos los tratamientos, apareciendo el patgeno a los 3.17
das despus de la inoculacin (Figura 2). Al respecto Kullnig
et al., (2001) sealan que los factores clave que contribuyen al
efecto antagnico de Trichoderma es su rpido crecimiento,
produccin de metabolitos antimicrobianos y caractersticas
fisiolgicas. Hoyos et al. (2008) evaluaron varios aislamien-
tos de Trichoderma in vitro e invernadero como agentes
biocontroladores de R. solani y Sclerotium rolfsii y la especie
asperellum ejerci el mejor control contra esos patgenos. El
iodo libre ejerci un buen control de R. solani, lo cual se debe
a que este ingrediente activo tiene cualidades germicidas
(Thompson, 2012; Hong et al., 2008). La actividad fungicida
de los cloronitrobencenos ha sido estudiada por Mendoza
Figura 3. Comparacin del grupo de fungicidas qumicos vs.
Biolgicos en la aparicin de R. solani.
Figure 3. Comparison of the groups of chemical vs. biological
fungicides on the occurrence of R. solani.

CONCLUSIONES
El agente causal de la pudricin de frutos de calabaza
pipiana fue R. solani, mismo que fue identificado morfolgica
y molecularmente. Trichoderma asperellum y los ingredientes
activos, iodo libre y quintozeno: PCNB, fueron los que ejer-
cieron el mejor control al retrasar la presencia del patgeno
en frutos.

LITERATURA CITADA
Antonopoulos, D.F., Melton, T. y Mila, A.L. 2010. Effects of
chemical control, cultivar resistance, and structure of
cultivar root system on black shank incidence of tobacco.
Figura 2. Das a la presencia de R. solani por tratamiento. Plant Disease 94:613-620.
T1: Trichoderma cepa CSAEGro; T2: PHC Biopak-F; T3: Ayvar, S.S., Mena, B.A., Durn, R.J.A., Cruzaley, S.R., y Gmez,
PHCRootMate; T4: Q 2000; T5: Benomil; T6: Pentaclor*600 F; M.N.O. 2007. La calabaza pipiana y su manejo integrado.
T7: Testigo. Folleto tcnico. Fundacin Produce de Guerrero, A. C. Campo
Figure 2. Days of the presence of R. solani per treatment. Experimental Iguala. CSAEGro. Iguala, Gro. Mxico. 26p.
T1: Trichoderma CSAEGro strain; T2: PHC Biopak-F; T3: Bartlett, D.W., Clough, J.M., Godwin, J.R., Hall, A.A., Hamer, M.
PHCRootMate; T4: Q 2000; T5: Benomil; T6: Pentaclor*600 F; y Parr-Dobrzanski, B. 2002.The strobilurin fungicides. Pest
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