UNIVERSIDAD NACIONAL DEL CENTRO DEL PER

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS

ESCUELA PROFESIONAL DE AGRONOMA TROPICAL

PROYECTO DE TESIS

PROPAGACIN IN VITRO DE Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom &

Fernandez.

CDIGO CTI : 01010101 Conservacin y caracterizacin de

germoplasma para el desarrollo de variedades
mejoradas en calidad y produccin.

CDIGO UNESCO : 3103.05 Tcnicas de cultivo

EJECUTOR : Gutierrez Huisa, Isaac Elias

DOCENTE : MSc. Carlos Marcelo Oyague

FECHA DE INICIO : 15 de Abril del 2017

FECHA DE CULMINACIN : 15 de Marzo de 2018

SATIPO 2017
I. TTULO

PROPAGACIN IN VITRO DE Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom &

Fernandez.

II. TEMA
Propagacin in vitro

III. PLANTEAMIENTO Y FORMULACIN DEL PROBLEMA

3.1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
Los bosques tropicales de nuestro pas, sufren constantemente un proceso
de degradacin, debido al incremento de reas para la agricultura, la tala y
quema indiscriminada de los bosques, el cual hace que se pierda material
gentico, que an no presentan una identificacin completa y otras aun no
descubiertas (Cavero et al., 1991 citado en Len 1995).

La poblacin de orqudeas est disminuyendo drsticamente, debido a la

falta de conciencia de los colonos quienes por no saber trabajar
organizadamente talan los bosques, queman, siembran y luego cuando el
terreno ya no es frtil siguen depredando los bosques para instalar
nuevamente sus cultivos. Tambin los comerciantes de orqudeas los extraen
de su habitad natural, para luego comercializarlos ilegalmente y no podemos
evitarlo (Glvez, 2005).

En nuestro pas existen laboratorios de propagacin in Vitro, en Satipo se

encuentra Ubicado el laboratorio de la Facultad de ciencias Agrarias (E.P
Agronoma tropical) de la UNCP, que pueden contribuir a recuperar
especies de Phragmipedium y otras especies de orqudeas que estn en
riesgo de extincin. De esta forma estaramos comercializando sin poner
en peligro de extincin.

3.2. FORMULACIN DEL PROBLEMA

Cul es la dosis de reguladores de crecimiento (Auxinas y Giberalinas) en la
propagacin in vitro de Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom &
Fernandez?
IV. OBJETIVOS
4.1. GENERAL
Determinar la dosis de reguladores de crecimiento (Auxinas y Giberalinas) en
la propagacin in vitro de Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom &
Fernandez.

4.2. ESPECFICO
Precisar la dosis de reguladores de crecimiento (Auxinas y Giberalinas)
en la germinacin in vitro de Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom
& Fernandez.

Evaluar el efecto de las dosis de reguladores de crecimiento (Auxinas y

Giberalinas) en la formacin de protocormos y rizoides in vitro de
Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez.

Tasar el efecto de las dosis de reguladores de crecimiento (Auxinas y

Giberalinas) en las caractersticas morfolgicas in vitro de Phragmipedium
Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez.

V. MARCO TERICO
5.1. ANTECEDENTES
Manrique (2006) menciona en su trabajo de investigacin titulado Efecto del
medio bsico, carbn activado, cido giberlico y calidad de luz en la
germinacin in vitro de Masdevallia auropurpurea Reich con el objetivo de
evaluar el efecto de la interccin entre los cuatro factores. Logrando un
resultado para su conclusin que el mejor porcentaje y tiempo de
germinacin se logra en el medio bsico Hidro-Coljap, enriquecido con 2.68
ph4 de cido giberlico, bajo luz roja con un fotoperiodo de 16 horas.

Salazar (2012) en su trabajo de investigacion titulado Germinacin

asimbitica de semillas y desarrollo in vitro de plntulas de Cattleya mendelii
Dombrain (Orchidaceae) con el objetivo de evaluar el efecto de cinco medios
de cultivo en el desarrollo de Cattleya mendelii Dombrain (Orchidaceae) con
el mtodo de cultivo in vitro de orqudeas a partir de semillas lleg a la
conclusin al final de su investigacin que la viabilidad de las semillas fue del
93% y el mejor porcentaje de germinacin se hall en el medio de cultivo
 Murashige-Skoog ms agua de coco (MS + AC) con diferencias significativas
(P < 0.05, Tukey).

Surez, Hernndez, Chvez, Sandoval y Martnez (2007) mencionan en su

trabajo de investigacion titulado Propagacin In Vitro y Aclimatizacin de
Euchile Mariae (Ames) Withner (Orchidaceae) que la funcin del ANA no
jug un papel preponderante en la formacin de PLBs, mientras que la
adicin de BA al medio de cultivo favorece la formacin de stos tanto en las
secciones apicales como basales de los protocormos. El objetivo fue
investigar el efecto de los reguladores de crecimiento ANA y BA para inducir
una respuesta morfogentica a partir de estos explantes.

Daz y Garciglia (2006) mencionan en el trabajo de investigacin titulado

Propagacin y mantenimiento in vitro de orqudeas mexicanas, para
colaborar en su conservacin que obtuvieron a los 4 meses plntulas de
hasta 5 cm de altura con formacin de pseudobulbo y races con velamen, la
adicin de la auxina ANA en combinacin con GA3 promueve el mejor
desarrollo de plntulas. El objetivo de la investigacin fue lograr establecer
los mtodos ptimos de propagacin y mantenimiento in vitro de 9 especies
de orqudeas Mexicanas.

Len (1995) en su tesis Conservacion de Especies Peruanas de Orquideas

Utilizando Tcnicas de Cultivo de Tejidos In Vitro Con el objetivo de
estandarizar tcnicas de propagacin in vitro para 3 especies de orqudeas
peruanas: Cattleya rex Obrien, Cattleya mxima Lindley, y Psychopsis
versteegianum (pulle) Lueckel & Braem, concluye que: La utilizacin de
sustancias orgnicas complejas como el pltano homogenizado (100 g/l) y
endospermo lquido de coco (100 ml/l), en la composicin de los medios,
promueven una rpida diferenciacin del protocormo as como el desarrollo
vegetativo y radicular de plantas.

5.2. MARCO CONCEPTUAL

5.2.1. Especies del genero Phragmipedium existentes en el per
Hatton (2003) menciona que actualmente existen especies
descubiertas de Phragmipedium en el Per, de los cuales el ms
importante es el Phragmipedium kovachii; el siguiente listado
menciona alguna de las especies de Phragmipedium en el Per:
 1. 1 831 Phragmipedium vitatum

2. 1 840 Phragmipedium caudatum

3. 1 850 Phragmipedium carcinum

4. 1 852 Phragmipedium longifolium

5. 1 854 Phragmipedium boissierianum

6. 1 856 Phragmipedium pearcei

7. 1 873 Phragmipedium wallisii

8. 1 981 Phragmipedium besseae

9. 1 994 Phragmipedium richteri

10. 2 002 Phragmipedium kovachii

5.2.2. Taxonoma de la especie Phragmipedium kovachii Atwood,

Dastrom & Fernandez

divisin : spermatophyta
Orden : Orchidales

Familia : orchidacea
Sub familia : Cypripedium
Tribu : Cypripedieae

Gnero : Phragmipedium
Especie: : phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom &
Fernandez

5.2.3. Condiciones edafolgicas

Atwoot (2002 citado en Glvez, 2005) menciona que debido a que el
Phragmipedium en su naturaleza crece en un pH a partir de 5.5 a ms
bajo se adapta al agua limpia as como de lluvia y destilada.
Requieren una temperatura promedio de 20 a 25 C, es decir
temperaturas intermedias, la luz no les afecta tanto en su desarrollo
ya que pueden adaptarse bien.
5.2.4. Caractersticas generales del gnero Phragmipedium
El gnero Phragmipedium presenta las siguientes caractersticas
morfolgicas:

Descripcin general

Segn Zuiderwir (2003 citado en Glvez, 2005) proviene del

nombre Phragma = separacin o demarcacin y el pedium
(pediln) = zapatilla o sandalia que apuntan a la forma del labio.
Las plantas de este gnero son terrestres, otras son epfitas. Las
hojas estn plegadas a lo largo de su longitud, normalmente es
verde ligero y pueden ser de tamao variado. Las flores son
derechas y surgen del centro de las hojas. Ellos desnudan flores
mltiples que abren consecutivamente, dependiendo de las
especies.

La flor como en la mayora de las especies de Phragmipedium

abren en sucesin, pero en algunas especies abren una sola vez.
Un hecho notable sobre las flores es que cuando ella se cae de la
inflorescencia parecen como si estaran frescos. Los granos de
polen estn unidos en la polinia, (Zuiderwir, 2003 citado en
Glvez, 2005)

Oakes y Donovan (1952 citado en Glvez, 2005) mencionan que

las orqudeas del gnero Pliragmipedium tienen diferentes formas
de vida siendo de hbito terrestre, epifita y litfita, se encuentran
distribuidos en todos los trpicos de Amrica , viviendo desde los
900 a 2000 msnm.

5.2.5. Propagacin in vitro de orqudeas

Arditti (1990 citado en Glvez, 2005) Menciona que las tcnicas de

propagacin in vitro de orqudeas deben seguir los siguientes
procesos de acuerdo al tipo de semilla obtenida para su germinacin
in vitro:
 Por semillas provenientes de cpsula dehiscente

Se utiliza semillas de cpsulas dehiscentes, las semillas son

esterilizadas con una solucin de hipoclorito de sodio en
concentraciones de 0,5 a 1,0% por 10 - 30 minutos, dependiendo
del tipo de semilla, para favorecer su esterilizacin es conveniente
usar un agente que rompa la tensin superficial de la solucin
esterilizante (Tween 20), es un agente que permite el mejor
contacto del esterilizante con la semilla, se utiliza a razn de 2
gotas/100 ml o reemplazado por detergente casero, como
Hipoclorito de calcio y sodio.

Por semillas provenientes de cpsula no dehiscente (cpsula

verde)

La cpsula es separada de la planta madre, se eliminan las partes

que no sern necesarias o que pueden ser una fuente de
contaminacin (restos de ptalos y de columna), se enjuaga con
agua y detergente y se sumerge por unos segundos en alcohol
etlico al 75%, luego se esteriliza sumergindola en una solucin
de Hipoclorito de calcio al 2 - 4% por 20 minutos.

La siembra se hace directamente sin necesidad de enjuague, para

abrir la cpsula se hacen dos cortes longitudinales a lo largo de la
sutura de dehiscencia y dos cortes transversales se retiran el
pedazo de cpsula seleccionado y se procede a la siembra.

propagacin in vitro
Se retiran el pedazo de cpsula seleccionado y se procede a la
siembra in vitro.

5.3. Definicin de trminos

7.6.1. Cultivo In Vitro
Cultivo in vitro (cultivo en vidrio) estn influenciadas por el ambiente
fsico, qumico y gaseoso de los recipientes. Por tanto el estudio y
control del ambiente de los cultivos tambin incidir positivamamente
en la optimizacin de los procedimientos de micropropagacin (Kozai,
Oki y Fujiwara, 1992).
7.6.2. Micro propagacin
Es una tcnica, desarrollada para la produccin en masa de plantas,
que ha sido utilizada con xito desde los aos 60. La principal ventaja
de esta tcnica estriba en la multiplicacin rpida de material clonal
libre de enfermedades, (Caal, Rodriguez, Fernandez, Sanchez y
Majada 2001).

7.6.3. Auxinas
Son un grupo de hormonas vegetales naturales que regulan muchos
aspectos del desarrollo y crecimiento de plantas. La forma
predominante en las plantas es el cido indol actico (IAA), muy
activo en bioensayos y presente comnmente en concentraciones
nanomolares. Otras formas naturales de auxinas son el cido 4-cloro-
indolactico (4-Cl-IAA), cido fenilactico (PAA), cido indol butrico
(IBA) y el cido indol propinico (Jordn y Casaretto, 2006).

7.6.4. Giberalinas (GAs)

Son hormonas de crecimiento diterpenoides tetracclicos involucrados
en varios procesos de desarrollo en vegetales. Su efecto en plantas
se descubre en los aos 30, cuando cientficos japoneses aislaron
una sustancia promotora del crecimiento a partir de cultivos de
hongos que parasitaban plantas de arroz causando la enfermedad del
bakanoe o subida de las plantas. El compuesto activo se aisl del
hongo Gibberella fujikoroi por Eichi Kurosawa en 1926 por lo que se
denomin giberelina. El efecto del hongo sobre las plantas afectadas
consista en un notable incremento en altura aunque con fuerte
merma en la produccin de grano (Jordn y Casaretto, 2006).

7.6.5. Biotecnologa
Thieman (2010) menciona que se define como el uso de organismos
vivos, o los productos de los mismos, para el beneficio humano (o el
beneficio de su entorno) con el fin de desarrollar un producto o
resolver un problema.
 7.6.6. Explante
Azcon-Bieto y Taln (2008) mencionan que es un fragmento de
planta que se prepara de forma asptica para su cultivo in vitro en un
medio nutritivo.

5.4. Marco legal

Ley N 26834, Ley de reas Naturales Protegidas del 17.JUN.97, norma
los aspectos relacionados con la gestin de las reas Naturales
Protegidas y su conservacin de conformidad con el Artculo 68 de la
Constitucin Poltica del Per (PERUANO, 1997).

Ley N 26839 (1997) Ley sobre la Conservacin y Aprovechamiento

Sostenible de la Diversidad Biolgica, del 08.JUL.97, seala que el
Estado es soberano en la adopcin de medidas para la conservacin y
utilizacin sostenible de la diversidad biolgica.

Ley N 27308 (2001) Ley Forestal y de Fauna Silvestre del 15.JUL.2000,

tiene por objeto normar, regular y supervisar el uso sostenible y la
conservacin de los recursos forestales y de fauna silvestre del pas.

VI. FORMULACIN DE HIPTESIS

La dosis 1.5 mg x L-1 de AUXINA en medio basal es el apropiado para la
propagacin in vitro de Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom &
Fernandez.

VII. METODOLOGA
9.1. Caractersticas del lugar
El trabajo se realizara en el laboratorio de Agronoma Tropical de la
Facultad de ciencias Agrarias - UNCP, ubicada en el distrito de Ro
Negro.

a). UBICACIN POLITICA:

Distrito : Rio Negro
Provincia : Satipo
Departamento : Junn
 b). UBICACIN GEOGRFICA
Coordenadas UTM : E 541581
Altitud : N 8764267
Altitud : 635 msnm
Temperatura : 22 C
Precipitacin Anual : 2 200 mm
Humedad Relativa : 60%
Clima : Sub tropical hmedo
Suelo : Fuertemente cido

9.2. Variables

a) factores o variables que permanecen constantes. Los aspectos

que se citan son considerados como generales para toda la
investigacin.
Medio de cultivo
pH
temperatura
Luz
Fotoperiodo
Tamao de explante
Variedad
Cantidad del medio de cultivo

b) Factores o variables a controlar: (factores que variarn)

Factor A (reguladores de crecimiento)
a1: AIA (cido indol-3-actico)
a2: GA3 (cido giberlico)

Factor B (dosis)
b1 : 0 mg x L-1 de medio de cultivo
b2 : 0,5 mg x L-1 de medio de cultivo
b3 : 0,7 mg x L-1 de medio de cultivo
b4 : 1 mg x L-1 de medio de cultivo
b5 : 1,5 mg x L-1 de medio de cultivo
 c) Variables en las que se medirn las respuestas

Unidad de Instrumentos o
Variable dependiente Mtodo
medida Equipos
Porcentaje de
Por ciento Contadas Ninguno
Germinacin
Numero de
Unidades Contadas Ninguno
protocormos
Numero de rizoides en
Unidades Contadas Ninguno
vitroplantas
Numero de hojas de
Unidades Contadas ninguno
vitroplantas
Calendario y
Das de aparicin del
da Contadas cuaderno de
primordio foliar
apuntes
Longitud de Escalmetro y
mm Medicin
vitroplantas regla

9.3. Poblacin y Muestra

7.3.1. Poblacin

Ser de 3 semillas en una Unidad Experimental por cada

tratamiento, habiendo 10 tratamientos con 4 repeticiones,
teniendo un total de 120 semillas en todo el experimento.

7.3.2. Muestra

Ser de 2 semillas en una Unidad Experimental por cada

tratamiento, habiendo 10 tratamientos con 4 repeticiones,
teniendo un total de 80 semillas en todo el experimento.

Cada UNIDAD EXPERIMENTAL estar constituida por 3

semillas en un medio de cultivo de 10 ml en un frasco de 250 ml.
9.4. Plan de ejecucin
limpieza y desinfeccin del laboratorio
Se realizara la limpieza de todos los ambientes del laboratorio y
luego se desinfectara con una mezcla de leja 250 ml en cinco litros
de agua.

Esterilizacin de los materiales

La esterilizacin de los materiales se realizara en el autoclave. La
esterilizacin es a 250C durante 15 minutos, luego se apaga el
autoclave y se espera que baje la presin a 0C para destapar y
sacar los materiales esterilizados. el medio de cultivo se esterilizar
en el autoclave por un periodo de 20 min a una temperatura de 121
C y una presin de 2 kg/cm2.

Medio asimbitico y condiciones de cultivo

El medio de cultivo basal ser MS en concentraciones de macro y
micronutrientes al 100% (Murashigue y Skoog, 1962). El Na2EDTA
y el FeSO47H2O se disuelven por separados cada uno en 200ml
de agua destilada. Se calienta la solucin de Na2EDTA y poco a
poco se agrega la solucin de FeSO47H2O, calentando y agitando
continuamente hasta obtener un color amarillo. Se deja enfriar y se
ajusta a 1000ml con agua destilada. El calor y la mezcla en dilucin
dan lugar a un complejo FeEDTA ms estable.

Es conveniente preparar Stocks por separado de cada una de las

vitaminas en caso de modificaciones. Por ejemplo es muy comn
utilizar nicamente Tiamina 1mg/L.
Preparacin de cido indol actico (AIA) y cido Giberlico
(GA3)
Solucin concentrada delos 2 reguladores: 1000 ppm c/u.
Pesar 0.2 g del regulador y disolver bien con algunas gotas de
alcohol aadir 200 ml de agua destilada.
Guardar en un frasco debidamente rotulado y conservar a 0C
Se recomienda esterilizar por filtracin.
Un ml de la solucin concentrada (1000 ppm) contiene 1 mg
del regulador.
 Desinfeccin y siembra de semilla
Para la desinfeccin y siembra de las semillas se utilizara el
mtodo de la jeringuilla, el mtodo consiste en colocar algunas
de ellas en una jeringa estril de 5 ml con un filtro de tela.
Las semillas se sumergiran en la solucin de etanol al 70%
durante 30 segundos, luego sern sometidas a la solucin de
hipoclorito de sodio (NaOCl) al 1.0% con 2 gotas deTween-20
(agente tensio-activo) durante cinco minutos en agitacin
constante.
Se realizaran cinco lavados con agua desionizada estril.
Se retirara el filtro de la jeringa para llevar acabo la siembra en
condiciones aspticas en una cmara de flujo laminar.
Se cultivaran 3 semillas en cada frasco de 250 ml del medio de
cultivo.

9.5. Evaluacin de variables

Son del tipo cuantitativo y cualitativo, esto quiere decir que las
respuestas obtenidas variarn en cada tratamiento.

Germinacin de semillas: Se contar el nmero de semillas

germinadas por cada UE a los 30das despus de la siembra,
para determinar las medias de semillas germinadas con cada
regulador de crecimiento y su respectiva dosis, para su anlisis
respectivo y determinacin con cul de los reguladores es
viable la germinacin.
Numero de protocormos: Se evaluara por el mtodo de
conteo a partir de los 30 primeros das de haber sembrado en el
medio lquido de multiplicacin y cada 15 das hasta el final del
experimento.
Numero de rizoides en vitroplantas: Se contara el nmero de
races de cada vitroplanta al final del experimento.
Numero de hojas: Se evaluara a partir de los 15 primeros das
de haber multiplicado, se contara los nmeros de hojas cada 15
das hasta al final de la fase.
Das de aparicin de la primera hoja: Se evaluara a partir de
la emergencia de la primera hoja en todo el experimento.
 Longitud de vitroplantas: Haciendo uso de una regla de 20
cm y un escalmetro para dar mayor precisin se medir la
longitud de la vitroplanta en mm al final del experimento.

7.6. PRUEBA ESTADSTICA

7.6.1. Modelo de las observaciones
DCA con arreglo factorial 2x5, el modelo aditivo lineal a utilizar
ser:
Yij = U + Ai+Bj+(AB)ij+ Eij
Donde:
U = Media poblacional
Ai = Efecto de los reguladores de crecimiento
Bj = Dosis
(AB)ij = interaccin de los reguladores de crecimiento con las
dosis
Eij = Error experimental

7.6.2. Diseo experimental

El tipo de diseo a utilizar para sta investigacin ser el Diseo
Completamente al Azar (DCA), con arreglo factorial de (2x5),
siendo los factores a probar:
Factor A:
Niveles (Reguladores de Crecimiento)
a1 : AIA (auxina)
a2 : GA3 (giberalinas)

Factor B:
Niveles (dosis)
b1 : 0 mg x L-1 de medio de cultivo
b2 : 0,5 mg x L-1 de medio de cultivo
b3 : 0,7 mg x L-1 de medio de cultivo
b4 : 1 mg x L-1 de medio de cultivo
b5 : 1,5 mg x L-1 de medio de cultivo
Cuadro 01: combinacin de los niveles A y B

Reguladores de Dosis (mg)

crecimiento 0 0.5 0.7 1 1.5
AIA 0 0,5 0,7 1 1,5
GA3 0 0,5 0,7 1 1,5

Cuadro 02: tratamientos y dosificaciones de reguladores de

crecimiento.

TRATAMIENTOS Reguladores de Dosis

crecimiento (mg x L-1 de Medio
de cultivo)

T1 cido indol-3-actico (AIA) 0,0

T2 cido indol-3-actico (AIA) 0,5
T3 cido indol-3-actico (AIA) 0,7
T4 cido indol-3-actico (AIA) 1,0
T5 cido indol-3-actico (AIA) 1,5
T6 cido giberlico (GA3) 0,0
T7 cido giberlico (GA3) 0,5
T8 cido giberlico (GA3) 0,7
T9 cido giberlico (GA3) 1,0
T10 cido giberlico (GA3) 1,5

7.6.3. Prueba estadstica

Para el anlisis estadstico se empleara la prueba de anlisis de

varianza a un nivel de significacin = 0,05.

Para la comparacin de medias entre tratamientos se utilizara la

prueba de significacin de Tukey a un nivel de significacin =
0,05. Para el procesamiento y anlisis de datos se empleara el
paquete estadstico SPSS.
 7.7. Croquis

Caractersticas del experimento para las fases de multiplicacin y

enraizamiento:

N de tratamientos : 10 Volumen de los frascos

: 250 ml
N de repeticiones :4 Ancho de calles
: 1 cm
N de unidades experimentales (UE) : 40 Distancia entre frascos
: 1cm
N de explantes por (UE) :3 rea que se ocupara
: 0.25 m2
N de explantes por experimento : 120
VIII. CRONOGRAMA

Actividad Meses 2017

AB MA JU JUL AG SE OC NO DI EN FE MA
Semana 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4 1 2 3 4
Elaboracin del x x x x x x x x x x
proyecto
Aprobacin del x
proyecto
Reconocimiento x x x
de equipos,
materiales e
insumos
Limpieza y x
desinfeccin del
laboratorio
Esterilizacin x x
de materiales
Obtencin del x
material
biolgico
PRIMER x
INFORME
Preparacin del x
medio de
cultivo
Explante y x x x x
desinfeccin
Introduccin de x

los explantes

Toma de datos x x

SEGUNDO x
INFORME
Enraizamiento x x x x

Procesamiento x x x x
y anlisis de
datos
Tabulacin y x x x x
representacin
de resultados
Redaccin y x x
presentacin
de tesis
IX. ELABORACIN DE DATOS

9.1. Refinamiento de Datos.

VARIABLE UNIDAD DE
MTODO REFINADO REFINAMIENTO
DEPENDIENTE MEDIDA
Porcentaje de Anlisis
Porciento % Contadas arcsen
Germinacin critico
Numero de Anlisis
protocormos
Unidad Contadas
critico
Numero de rizoides Anlisis
en vitroplantas
Unidad Contadas
critico
Anlisis
Numero de hojas Unidad Contadas
critico
Das de aparicin Anlisis
Unidad Contadas
del primordio foliar critico

Longitud de
mm Medicin Anlisis Ninguna
vitroplantas
crtico

9.2. Sistematizacin de datos

Cuadro de ANVA para realizar los clculos de los datos de investigacin en
un arreglo factorial de 2x5

FUENTE DE GL SC CM F exp
VARIABILIDAD
Efecto A: Reguladores 1 SCA CMA SCA/SCE
de Crecimiento
Efecto B: Dosis 4 SCB CMB SCB/SCE
Interaccin (AB) 4 SC(AB) CM(AB) SCAB/SCE
Error 30 SCE CME
Total 39 SCtotal

9.3. Prueba TUKEY

Prueba de comparacin de medias tukey se aplica cuando f es significativa
mediante la siguiente formula.

A.L.S. ( T ) = q(p1, n2 )

Dnde:

A.L.S. ( T ) = W: amplitud del lmite de significacin de tukey

q : valor tabular que se encuentra en la tabla de tukey con el nmero de
tratamientos y los grados de libertad del error experimental
n2: grados de libertad del error del experimental.
CME: cuadrado medio del error.
n: nmero de repeticiones.

 Tabla 04. Comparacin de medias segn tukey.

Orden de medio tratamientos valor significacin

01 Tn a
02 . a
03 . a
04 . .
. .
. .
.
10

X. FINANCIAMIENTO
Recurso propio del ejecutor del proyecto.

XI. PRESUPUESTO

COSTO COSTO
RUBRO UNIDAD CANTIDAD UNITARIO TOTAL
S/. S/.
INSUMOS PARA LA EJECUCIN DEL
PROYECTO
Compra de medio MS de PROBIOTEK S.A.
Sales Principales (Macronutrientes)
Nitrato de amonio (NH4NO3) g 83 1.37 113.00
Cloruro de calcio (CaCl2 2H2O) g 88 0.41 36.50
Sulfato de magnesio (MgSO4 7H2O) g 74 0.55 40.83
Fosfato de potasio (KH2PO4 ) g 34 0.56 19.15
Nitrato de potasio (KNO3) g 95 0.75 71.57
Sales Menores (Micronutrientes)
cido brico (H3BO3) g 1.24 0.51 0.64
Cloruro de cobalto (CoCl2 6H2O) g 0.05 7.26 0. 36
Sulfato cprico (CuSO4 5H2O) g 0.05 0.41 0. 21
Sulfato ferroso (FeSO4 7H2O) g 5.57 0.68 3.79
Sulfato de manganeso (MnSO4 4H2O) g 3.45 1.41 4.86
Yoduro de potasio (KI) g 0.166 2.05 0.34
Molibdato de sodio (Na2MoO4 2H2O) g 0.05 2.49 0.12
Sulfato de zinc (ZnSO4 7H2O) g 1.72 0.42 0.72
Na2 EDTA.H2O g 7.46 2.13 15.89

Vitaminas
Mioinositol g 1 10.88 10.88
cido Nicotnico g 0.1 3.76 0.38
Piridoxina HCl g 0.4 45.28 18.11
Tiamina HCl g 0.02 11.00 0.22
Glicina g 0.4 3.96 1.58
Edamina (opcional) g 1 3.96 3.96
Sacarosa g 10 0.30 3.00
Tetrazolio g 50 0.30 15.00
cido clorhdrico l 1 20.00 20.00
Agua estril l 5 2.00 10.00
Agua destilada l 5 1.00 5.00
Alcohol industrial l 0.75 17.50 13.13
Hidrxido de sodio kg 1 22.00 22.00
Leja NaOCl (clorox) l 1 3.00 3.00
Jabn lquido l 1 13.00 13.00
Semillas g 200 0.50 100.00
GA3 g 5 18 90
AIA g 5 18 90

Sub total
726.70
COSTO COSTO
MATERIALES UNIDAD CANTIDAD UNITARIO TOTAL
S/. S/.
Cepillo de dientes Unidad 1 1.50 1.50
Papel graf Unidad 5 0.30 1.50
Papel toalla Unidad 2 2.00 4.00
Papel aluminio Unidad 3 3.00 9.00
Plstico para embalaje Rollo 1 10.00 10.00
Bistur Unidad 3 1.50 4.50
Bandejas de germinacin Unidad 15 2.00 30.00
Plstico m 1 1.00 1.00
Sub total 61.50
MATERIALES PARA EVALUACIN
Regla 20 cm Unidad 3 1.00 3.00
Escalmetro graduado unidad 1 7.00 7.00
Papel toalla Unidad 1 2.00 2.00
Sub total 12.00
MATERIALES DE ESCRITORIO
Papel bond A4 Millar 1 30.00 30.00
CD Unidad 5 1.00 5.00
Folder Unidad 10 0.50 5.00
USB 8G Unidad 1 34.00 34.00
Cuaderno de campo A4 Unidad 1 3.50 3.50
Lapiceros Unidad 3 0.50 1.50
Lapiz Unidad 1 1.00 1.00
Sub total 80.00
MANO DE OBRA
Limpieza y desinfeccin Jornal 0.5 30.00 15.00
Esterelizacin Jornal 0.5 30.00 15.00
Preparacin de medio de cultivo Jornal 1 30.00 30.00
Desinfeccin de explante Jornal 0.25 30.00 7.50
Actividades en introduccin Jornal 0.5 30.00 15.00
Actividades en multiplicacin Jornal 0.5 30.00 15.00
Actividades en enrraizamiento Jornal 0.5 30.00 15.00
Evaluacin de % de Germinacin Jornal 0.5 30.00 15.00
Evaluacin de n de protocormos Jornal 1 30.00 30.00
Evaluacin de n de rizoides en vitroplantas Jornal 1 30.00 30.00
Evaluacin de n de hojas de vitroplantas Jornal 1 30.00 30.00
Ev. de los dias de aparicion de la primera hoja Jornal 1 30.00 30.00
Evaluacin de las longitudes de vitroplantas Jornal 1 30.00 30.00
Longitud de la vitroplanta (LVT) Jornal 1 30.00 30.00
Sub total 257.50
COSTO
VEHICUL COSTO
GASTOS EN TRANSPORTE LUGARES IDA Y
O TOTAL
VUELTA
Moyobamb
Adquicicin de semillas Bus 320.00 320.00
a
Maz - R.
transporte al lugar del experimento Moto lin 150.00 150.00
Neg.
Transporte de insumos Motokar Satipo 3.00 3.00
Compra de materiales de laboratorio Motokar Satipo 3.00 3.00
Sub total 476.00
SERVICIOS
Impresiones Unidad 540 0.30 162.00
fotocopias Unidad 300 0.10 30.00
Espiralados Unidad 3 2.50 7.50
Empastado Unidad 3 20.00 60.00
Quemado de CD Unidad 3 2.00 6.00
Servicios de internet Horas 50 1.00 50.00
Sub total 116.00
TRMITES ADMINISTRATIVOS
Gastos en tramites hasta la sustentacin 646.00
sub total 646.00
IMPREVISTOS 10% 249.67
TOTAL 2,689.37
XII. REFERENCIA BIBLIOGRFICA

Azcon-Bieto, J. T., & Taln, M. M. (2008): Fundamentos de Fisiologa

Vegetal. Editorial McGraw-Hill Interamericana. Madrid, Espaa.

Avila Daz, I. y Salgado Garciglia. Propagacion y mantemiento in vitro de

orqudeas mexicanas, para colaborar en su conservacin. UMSNH. Mxico

Briceo Snchez, I. I. (2004). Propagacin vegetativa, fenologa y comercio

de seis especies del gnero Cattleya Lindl (Orchidaceae). (Tesis de
Maestria). UNMSM. Lima-Per.
Recuperado de:
http://cybertesis.unmsm.edu.pe/bitstream/cybertesis/1584/1/Briceno_si.pdf

Caal, M. J., Rodrguez, R., Fernndez, B., Snchez-Tames, R., & Majada, J.
P. (2001). Fisiologa del cultivo in vitro. Biotecnologa vegetal, 1(1).

Daz, I. ., & Garciglia, R. S. (2006). Propagacin y mantenimiento in vitro de

orqudeas mexicanas, para colaborar en su conservacin. Biolgicas Revista
de la DES Ciencias Biolgico Agropecuarias Universidad Michoacana de San
Nicols de Hidalgo, 8(1), 138-149.
Recuperado de:
http://biologicas.umich.mx/index.php/biologicas/article/view/9

Galvez Panduro, R. A. (2005). Desarrollo de protocolo para la propagacin in

vitro de Phragmipedium kovachii Atwood, Dalstrm & Fernndez
(Orchidaceae) a partir de semillas. (Tesis de grado). UNSM. Tarapoto-Per.
Recuperado de:
https://f721dad5-a-site/inibico/publicaciones/tesis/tesis-VITRODELPhra

Jordn, M., & Casaretto, J. (2006). Hormonas y reguladores del crecimiento:

auxinas, giberelinas y citocininas. Squeo, F, A., & Cardemil, L.(eds.).
Fisiologa Vegetal, 1-28. Recuperado de:
http://www.biouls.cl/librofv/web/pdf_word/Capitulo%2015.pdf

Kozai, T., Oki, H. y Fujiwara, K. (1992). Photosynthetic characteristics

of Cymbidium plantlet in vitro. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 22:205-211.
 Hatton, R. (2003). OCHID DIGEST. Volumen 67. Editorial Board. Oxford
Road san Marino EEUU. Pp 216, 248 252. Ley, N. 26834

Ley, N. 26839. (1997). Ley sobre la Conservacin y Aprovechamiento

Sostenible de la Diversidad Biolgica de Per, publicada en la Gaceta, (134).

Ley, N. 27308. (2001). Ley forestal y de fauna silvestre.

Len, M. (1995). Conservacin de Especies Peruanas de Orqudeas

Utilizando Tcnicas de Cultivo de Tejidos In Vitro. (Tesis de grado).
UNALM. Lima-Per. Pp 14 - 15. Recuperado de:
https://f721dad5-a-62cb3a1a-s-tILaTpkqFEfZNBpxqzo_5-f&attredirects=0

Loreto Reza, M.E. (2016) Optimizacin de medio de cultivo para crecimiento

de orqudeas a partir de semillas. (Tesis de grado). IPN Mexico. Pp. 24

14. Levitus, G., Echenique, V., Rubinstein, C., Hopp, E., & Mroginski, L. (2010).
Biotecnologia y Mejoramiento vegetal II. Instituto Nacional de Tecnologa
Agropecuaria, Argentina.
Recuperado de:
http://argenbio.org/adc/uploads/Libro_INTA_II/Indice_e_introduccion.pdf

15. Manrique, J. P. (2006). Efecto del medio bsico, carbn activado, cido
giberlico y calidad de luz en la germinacin in vitro de Masdevallia
auropurpurea Reich. Revista Cientfica, (9), 117-141. Recuperado de:
http://revistas.udistrital.edu.co/ojs/index.php/revcie/article/download/354/534

16. PERUANO, E. (1997). Ley de Areas Naturales Protegidas Ley N

26834. Normas Legales, 15(6215), 150721.

16. Salazar Mercado, S. A. (2012). Germinacin asimbitica de semillas y

desarrollo in vitro de plntulas de Cattleya mendelii Dombrain
(Orchidaceae). Acta Agronmica, 61(1), 69-78.
Recuperado de:
http://www.revistas.unal.edu.co/index.php/acta_agronomica/article/view/3246
3
17. Sedano, G. (2015). Propagacin in vitro de orqudeas y otras ornamentales.
Revista Mexicana de Ciencias Agrcolas. Pp. 5.
Recuperado de http://www.redalyc.org/pdf/2631/263139243061.pdf

18. Surez-Quijada, I., Hernndez-Altamirano, M., Chvez-vila, V., Sandoval-

Zapotilla, E., & Martnez-Palacios, A. (2007). Propagacin in vitro y
aclimatizacin de Euchile mariae (Ames) Withner
(Orchidaceae). Lankesteriana, 7(1-2).
http://revistas.ucr.ac.cr/index.php/lankesteriana/article/view/19609/19693

19. Thieman, W. J., & Palladino, M. A. (2010). Introduccin a la biotecnologa.

Pearson Educacin.
 XIII. MATRIZ DE CONSISTENCIA

PROPAGACIN IN VITRO DE Phragmipedium Kovachii Atwood, Dastrom & Fernandez.

FORMULACIN DEL
HIPTESIS OBJETIVOS VARIABLES METODOLOGA
PROBLEMA
-1
Cul es la dosis de La dosis 1.5 mg x L GENERAL INDEPENDIENTE (Estudio) TIPO DE INVESTIGACIN
reguladores de de AUXINA en medio Determinar la dosis de Investigacin bsica (se llevar a cabo en laboratorio)
crecimiento (Auxinas y basal es el apropiado reguladores de crecimiento Reguladores de NIVEL DE INVESTIGACIN
Giberalinas) en la para la propagacin (Auxinas y Giberalinas) en la Crecimiento Explicativo
propagacin in vitro de propagacin in vitro de DISEO DE INVESTIGACIN
in vitro de
Phragmipedium Phragmipedium Kovachii AIA (auxina) Experimental
Kovachii Atwood, Phragmipedium Atwood, Dastrom & Fernandez. POBLACIN Y MUESTRA
Kovachii Atwood, GA3 (giberalinas) POBLACIN
Dastrom &
Fernandez? Dastrom & Estar constituida por 10 tratamientos y 4 repeticiones
Fernandez. ESPECFICO DEPENDIENTE
haciendo un total de 40 frascos de 25 ml cada uno con
Precisar la dosis de 10 ml de medio de cultivo y 3 semillas. Teniendo un
SOPORTE reguladores de crecimiento total de 120 semillas en todo el experimento.
(Auxinas y Giberalinas) en la Porcentaje de MUESTRA
vila y Salgado (2006) SOPORTE germinacin in vitro de Germinacin La muestra estar constituida por dos semillas elegidas
manifiestan que el Phragmipedium Kovachii
Loreto (2016) menciona al azar en una unidad experimental siendo un total de
desarrollo de plntulas Atwood, Dastrom & Fernandez.
en la conclusin de su 80 semillas en todo el experimento.
in vitro para su
proyecto de MODELO DE LAS OBSERVACIONES
conservacin, fuentes
investigacin titulado DCA con arreglo factorial 2x5, el modelo aditivo lineal a
de explantes para la
Optimizacin de medio Evaluar el efecto de las dosis DEPENDIENTE utilizar ser:
micropropagacin y
de cultivo para de reguladores de crecimiento Yij = u + Ai+Bj+(AB)ij+ Eij
plntulas que estn
crecimiento de (Auxinas y Giberalinas) en la Numero de protocormos Donde:
aptas para ser
orqudeas a partir de formacin de protocormos y u = Media poblacional
cultivadas ex vitro; se
ha implementado el semillas que en rizoides in vitro de Numero de rizoides en Ai = Efecto de los reguladores de crecimiento
semillas de Barkeria Phragmipedium Kovachii vitroplantas Bj = Dosis
medio de cultivo MS
Obovata, se logr la Atwood, Dastrom & Fernandez. (AB)ij = interaccin de los reguladores de crecimiento
con reguladores de
generacin de con las dosis
crecimiento.
estructuras tipo Tasar el efecto de las dosis de DEPENDIENTE Eij = Error experimental
protocormos y reguladores de crecimiento
desarrollo de plntulas, (Auxinas y Giberalinas) en la Numero de hojas PRUEBA ESTADSTICA
utilizando el medio aparicin de la primera hoja in El tipo de diseo a utilizar para sta investigacin sera
nutritivo MS con vitro de Phragmipedium Das de aparicin del el Diseo Completamente al Azar (DCA), con arreglo
reguladores de Kovachii Atwood, Dastrom & primordio foliar factorial de (2x5).
crecimiento Fernandez. Para el anlisis estadstico se empleara la prueba de
ANVA (Analisis de varianza) y la prueba estadstica de
(ANA/BA/GA3) a los 3 Longitud de vitroplantas TUKEY a un nivel de sugnificacin de = 0,05.
meses.
PROCEDIMIENTO
Se evaluara en forma peridica y con criterio para cada
variable.