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Universidad de Chile

Facultad de Ciencias Qumicas y Farmacuticas


Departamento de Ciencia de los Alimentos y Tecnologa Qumica
Procesos de Conservacin por Bajas Temperaturas
Semestre primavera 2017

Congelacin bajo presin: Un nuevo mtodo para la


criopreservacin

Freezing under pressure: A new method for


cryopreservation Nickolas Greer (USA, 2014)

Alumno: Mara Jos Ramrez V.


Docente: Roberto Lemus M.
Ayudante: Leyla Sanhueza
Resumen

La capacidad de preservar clulas, tejidos y rganos con un dao mnimo durante un


perodo de tiempo prolongado es esencial para los avances en medicina e investigacin. Los
mtodos actuales para la criopreservacin se basan en el uso de altas concentraciones (hasta
60% v / v) de agentes crioprotectores (CPA) que son txicos para las clulas vivas. Se
investig el efecto de la presin y una baja concentracin de sulfxido de dimetilo (Me2SO) o
glicerol, en la hemlisis de glbulos rojos humanos (GR) despus de la congelacin y
descongelacin. Se aplic presin durante el enfriamiento y congelacin de los glbulos rojos
y se alcanz un mnimo de hemlisis a aproximadamente 120 MPa. El 5% v / v de Me2SO o
8% v / v de concentracin de glicerol en combinacin con 120 MPa de presin fue suficiente
para obtener un 8% o menos de hemlisis de glbulos rojos despus de enfriar a una
velocidad de 35 C / min o 160 C / min. Los resultados preliminares sugieren que el mtodo
puede ayudar a resolver el problema de toxicidad de los CPA.
Introduccin

El agua es un componente esencial de la vida. El cuerpo humano tiene un 65% de agua,


aproximadamente. Al congelarse a la presin ambiente, el agua se transforma en cristales de
hielo relativamente grandes y afilados, causando dao mecnico a las clulas y los tejidos. La
formacin de hielo tambin causa una concentracin excesiva de sales, deshidratacin y
trastornos del equilibrio osmtico, que a menudo conducen a la muerte celular.

Toxicidad crioprotectora
Los agentes crioprotectores (CPA) se desarrollaron para sustituir una porcin de agua dentro
y alrededor de las clulas, reduciendo el tamao de los cristales de hielo y limitando la
concentracin excesiva de sales durante la congelacin. Desafortunadamente, los CPA son
txicos para las clulas vivas, los tejidos y los rganos (bioinyecciones) y la toxicidad de los
CPA aumenta con la concentracin y el tiempo de contacto en estado lquido. Los CPA se
unen a las protenas y otras molculas, interrumpen mltiples vas bioqumicas dentro de las
clulas y causan desequilibrio osmtico [9]. Adems, muchos tejidos y rganos tienen una
permeabilidad limitada incluso para los CPA ms penetrantes, como Me2SO, lo que dificulta
la carga de altas concentraciones de CPA y lleva mucho tiempo. Por lo tanto, es necesario
desarrollar mtodos alternativos para la criopreservacin con una concentracin de CPA ms
baja o libres de CPA para abordar la creciente demanda de criopreservacin de muestras
biolgicas de calidad.

La congelacin bajo presin para la preparacin de muestras de microscopa electrnica.


La congelacin bajo presin no es un concepto nuevo. Desde la dcada de 1970, un mtodo
de congelacin bajo presin alrededor de 210 MPa (mtodo HPF) se usa ampliamente para
la preparacin de muestras para microscopa electrnica. El mtodo HPFe funciona bien para
preservar la ultraestructura de las clulas con las siguientes limitaciones: los desarrolladores
del mtodo HPFe afirman que el mtodo funciona bien para congelar muestras de hasta 0,5
mm de espesor con velocidades de enfriamiento relativamente rpidas (> 60,000C / min).
Con menores velocidades de enfriamiento, los cristales de hielo se hacen visibles con un
microscopio electrnico y la porcin vitrificada del agua se vuelve progresivamente ms
pequea. Se detectaron varios polimorfos (formas) de hielo dentro de las muestras
preparadas usando el mtodo HPFe [14,5,18]. Incluyen hielo vtreo (no cristalino, amorfo), as
como formas de hielo cristalino: Ih (hielo hexagonal), Ic y III. La tasa de enfriamiento rpido (>
60,000C / min) y la presencia de inhibidores de hielo (biomolculas y CPA) dentro de las
muestras biolgicas representan el componente vtreo, mientras que es ms probable que el
hielo cristalino se forme donde la velocidad de enfriamiento fue ms lenta (ms profundo en
la bio muestra) o donde tuvo lugar la nucleacin espontnea del hielo. El mtodo HPFe ayuda
a conservar muestras sin cristales de hielo visibles cuando se observa con un microscopio
electrnico. Dado que el lmite de resolucin de los microscopios electrnicos modernos
utilizados para la investigacin biolgica es <10 nm, los cristales de hielo detectados por la
difraccin de rayos X deben ser menores que 10 nm.

Efecto de la presin hidrulica sobre la viabilidad de muestras biolgicas sin congelacin


La alta presin hidrulica puede ser daina para las muestras biolgicas y el dao inducido
por la presin aumenta con el tiempo pasado bajo presin. El equipo de Armand Karow
investig sobre la tolerancia a la presin de los rganos de los mamferos y descubri que los
corazones de rata pueden tolerar una alta presin hidrulica de hasta 100 MPa (15,000 psi)
durante hasta 10 minutos sin cambios aparentes. Tambin encontraron que los riones de los
perros pueden tolerar 100 MPa durante un mximo de 2 minutos y los animales sobrevivieron
durante al menos 4 semanas despus de la reimplantacin de los riones. Otro grupo de
investigacin demostr que los corazones de perro pueden sobrevivir a 100 MPa durante
hasta 30 minutos. Estos datos implican que la presin hasta 100 MPa aplicada durante un
corto perodo de tiempo (hasta 2 a 30 minutos) es relativamente inofensiva para algunos
rganos.

Propiedades baroprotectoras de los CPA.


Algunos CPA poseen una propiedad inesperada. Pueden proteger las bio-muestras del
impacto negativo de la alta presin [7]. El grupo Fahy descubri que las altas concentraciones
de CPA pueden proteger la corteza renal del conejo de la exposicin prolongada (30-60 min)
a alta presin sin congelacin [6, 7]. Dado que el impacto negativo de la alta presin se
acumula con el tiempo pasado bajo presin [12, 13], las bajas concentraciones de CPA (por
ejemplo, 5% de Me2SO) tambin pueden ser suficientes para proteger las muestras biolgicas
de corto plazo (2-3 min) expuestas a alta presin.
Materiales y mtodos

Para probar la hiptesis anterior sobre los glbulos rojos humanos (RBC), se desarrollaron
mtodos y aparatos que se presentan a continuacin.

Modelo biolgico.
Los glbulos rojos se eligieron como un modelo para desarrollar y probar el mtodo preliminar.
A diferencia de los tejidos y rganos complejos, es relativamente fcil analizar y cuantificar los
daos a los glbulos rojos, que generalmente se realiza mediante la medicin de la
hemoglobina libre y la morfologa celular. Los glbulos rojos no tienen ncleo, ADN o ARN y,
por lo tanto, carecen de capacidad de reparacin de membranas, lo que hace que sus
membranas sean ms sensibles a los daos cuando se comparan con los tipos de clulas
nucleadas con capacidades avanzadas de reparacin de membranas. Dado que el dao a las
membranas celulares es un resultado directo de la formacin de cristales de hielo, la
reparacin de las membranas por las clulas puede ser indeseable para probar los mtodos
de criopreservacin. Si el mtodo funciona en glbulos rojos, entonces hay una buena
probabilidad de que tambin funcione en muestras biolgicas ms complejas.

Preparacin de suspensin de glbulos rojos.


Dos donantes humanos proporcionaron sangre para este estudio. La sangre venosa completa
se extrajo de manera estndar despus de 12 h de forma rpida y se almacen a +4 C en
los contenedores BD Vacutainer REF 367841 forrados con 3,6 mg de K2 EDTA para evitar
la coagulacin (2 ml de sangre entera por contenedor). El hematocrito (Hct) estuvo dentro del
40-45%. Se utiliz la sangre dentro de 4 das desde la extraccin. Se probaron tres tipos de
bio-muestras: (1) sangre completa; (2) sangre completa con 5% v / v de Me2SO; (3) sangre
completa con glicerol al 8% v / v. Las suspensiones celulares se obtuvieron centrifugando
sangre completa a 3200 RPM durante 3 min, permitiendo la separacin del plasma
(sobrenadante) y RBC (precipitado). Se aadi Me2SO o glicerol al plasma. Los glbulos rojos
se resuspendieron en plasma para producir 5% v / v de Me2SO o 8% de concentracin de
glicerol v / v en sangre completa. El Me2SO y el glicerol se adquirieron de Sigma (St. Louis,
MO).
Congelacin bajo presin.
Para la generacin de presin se utiliz un generador manual de alta presin (bomba). La
bomba fue fabricada por High Pressure Equipment Co, Erie, PA, EE. UU. (HiP) utilizando una
bomba hidrulica manual HiP 37-5.75-60 como componente principal. La presin se midi con
un medidor de 140 MPa (Pressure Products Industries, Warminster, PA, EUA). Para presiones
superiores a 140 MPa se us un medidor de 350 MPa (Astra Products, Ivyland, PA, EUA). Se
us un tubo de alta presin HiP 60-HM4-10 (tubo) para contener y congelar las suspensiones
celulares bajo presin (Fig. 1). El tubo (acero inoxidable 316, 1,6 mm I.D., 6,35 mm de
dimetro, 20 cm de longitud) se fij a una jeringa de 1 ml utilizando un adaptador de tubo de
plstico. Se introdujeron alrededor de 300 l de suspensin celular en el tubo (Fig. 1). Un
tapn de goma (caucho de silicona, 1,78 mm de dimetro, 6,5 mm de largo) se cubri con
vaselina blanca USP y se insert 35-45 mm de profundidad en el extremo abierto del tubo. El
extremo opuesto del tubo se cerr con un tapn (Butech # 60CA4, Haskel, Burbank, CA, EUA).
La precisin del control de la presin
fue de 2-3% o +/- 3 MPa a nivel de
120 MPa. Para la congelacin a
presin ambiente (0.1 MPa) no se
realiz presurizacin de la
suspensin celular. Para todas las
dems presiones, el tubo se conect
a la bomba y se presuriz hasta la
presin de prueba. El tubo se orient
verticalmente y se sumergi en un
recipiente lleno con 2 litros de
refrigerante de alcohol isoproplico a
-75C (Fig. 1). Despus de 3 minutos
en el refrigerante, se cay la presin
en la bomba. El tubo se desconect
de la bomba y se sumergi en un
bao de agua de +32 C. La
suspensin celular se calent a
presin ambiente.
Tasas de enfriamiento.
Para obtener una velocidad de enfriamiento de 160 C / min de la suspensin celular, el tubo
se sumergi en alcohol a -75 C con una velocidad de 2 mm / s.
Para obtener una velocidad de enfriamiento de 35 C / min de la suspensin celular, el tubo
se envolvi con una pelcula de polietileno de 15 mm de largo x 15 cm de ancho y 0,015 mm
de espesor (15 capas) y se sumergi en alcohol a -75 C con 1 mm / s velocidad. La tasa de
calentamiento para todas las suspensiones celulares fue de 950 C / min. Las velocidades de
enfriamiento y calentamiento anteriores son tasas promedio de cambio de temperatura en el
intervalo de 0 a -50 C. Como no hay una forma fcil de medir las velocidades de enfriamiento
dentro del tubo bajo presin, las tasas de cambio de temperatura se midieron a la presin
ambiental en el medio y dentro del tubo lleno de solucin salina usando una termocupla
Omega TT-T-36-36.

Anlisis de suspensin de RBCs


En un individuo sano, los glbulos rojos ocupan 40-45% del volumen total de sangre. Cuando
los glbulos rojos se daan liberan hemoglobina. Mediante la medicin de la hemoglobina
libre, se puede determinar el grado de dao a los glbulos rojos (hemlisis). La concentracin
de hemoglobina libre se utiliza a menudo para estimar la hemlisis de los glbulos rojos
durante la criopreservacin [16]. La hemlisis se calcul como el porcentaje de la hemoglobina
libre en las suspensiones de glbulos rojos despus de la criopreservacin usando la siguiente
ecuacin:
% de hemlisis = [(100-Hct) x sobrenadante Hgb] / Hgb total

La suspensin celular se extruy del tubo empujando el tapn de goma con un alambre de
acero inoxidable (1,37 mm de dimetro, 21 cm de largo). Alrededor de 90L de suspensin
de clulas, obtenida de la porcin media del tubo, se centrifugaron a 3200 RPM durante 3 min.
La concentracin de hemoglobina en el sobrenadante se midi usando el analizador
HemoCue Hb 201+ (HemoCue AB, Suecia). Se calibr el analizador y se confirm su precisin
con los controles estndar de hemoglobina trilivel (Stanbio, Boerne, TX) y la siguiente prueba
de linealidad. Una muestra de sangre completa con concentracin de hemoglobina de 13,2 g
/ dL (dentro de los lmites normales para la sangre humana) se diluy 1: 1, 1: 4, 1: 9 y 1:19 en
una solucin salina isotnica para obtener las siguientes concentraciones de hemoglobina:
50%, 25%, 10% y 5%. El contenido de hemoglobina en las soluciones resultantes se midi
con el analizador y se grafic. Los resultados de la prueba fueron lineales con una desviacin
insignificante de una lnea recta.
Resultados

El efecto de la presin sobre la hemlisis de los glbulos rojos.


La Fig. 2 muestra el efecto de la presin hidrulica en la hemlisis de los glbulos rojos
despus de enfriar / congelar muestras de sangre completa a cinco niveles de presin: 0,1,
70, 120, 160, 200 MPa. Se alcanz el mnimo en hemlisis (28.2 2.6%) a 120 MPa. No se
observaron menores diferencias morfolgicas entre los RBCs de control (Fig. 3A) y RBC
congelados por debajo de 120 MPa y descongelados a presin ambiente (Fig. 3B).

El efecto de la presin, la velocidad de enfriamiento y la baja concentracin de CPA


Se realiz otro conjunto de experimentos para comparar el efecto de la presin, la velocidad
de enfriamiento y la baja concentracin de CPA en la hemlisis de los glbulos rojos. Los RBC
se enfriaron / congelaron a dos velocidades de enfriamiento: 35 C / min y 160 C / min
mientras se compriman a dos niveles de presin: 0.1 MPa (presin ambiente) y 120 MPa
(Figuras 4 y 5). Se probaron tres tipos de suspensiones celulares: (1) sangre completa; (2)
sangre completa con 5% v / v de Me2SO; (3) sangre completa con glicerol al 8% v / v. La Fig.
4 muestra el efecto de 120 MPa en la hemlisis de los glbulos rojos. Las muestras de sangre
se enfriaron a una velocidad de 160 C / min. Los glbulos rojos congelados a 0.1
MPa (presin ambiente) se hemolizaron en su mayora despus del ciclo de
criopreservacin. Este fue un resultado esperado para la criopreservacin de glbulos rojos a
presin ambiental. Sin embargo, 5% de Me2SO en combinacin con 120 MPa disminuy la
hemlisis de los glbulos rojos a 5 1.2%. La Fig. 5 muestra el efecto de 120 MPa en la
hemlisis de glbulos rojos en sangre completa con 5% de Me2SO o 8% de glicerol. Las
muestras de sangre se enfriaron a la velocidad de 35 C / min. Los glbulos rojos, congelados
a 0.1 MPa, fueron hemolizados principalmente despus del ciclo de criopreservacin. Una
baja concentracin de CPA en combinacin con 120 MPa disminuy la hemlisis de los
glbulos rojos hasta 7.6 1.4% para Me2SO y 4.2 1.2% para glicerol.
Discusin

Se investig el efecto de la presin hidrulica, aplicada durante el enfriamiento y la


congelacin, en la hemlisis de los glbulos rojos despus de la descongelacin. Se alcanz
el mnimo en hemlisis (28.2 2.6%) a 120 MPa. El aumento de la hemlisis despus de la
congelacin a 160 MPa y 200 MPa, puede explicarse por el impacto negativo de la presin
elevada.

El efecto de la presin sobre la nucleacin del cristal de hielo.


El contenido de agua de la sangre total es 83% v / v. De acuerdo con el diagrama de Bridgman
para las transiciones de fase de agua bajo presin [2], a 120 MPa de hielo, la nucleacin
comienza a -12 C ms o menos. La temperatura de nucleacin del hielo dentro del tubo (Fig.
1) se midi con la termocupla a presin ambiental y se encontr que era de alrededor de 0
C para la sangre completa. El enfriamiento excesivo del agua es improbable en muestras de
sangre enfriadas lentamente dentro del tubo debido a mltiples sitios de nucleacin (RBC).
Por lo tanto, es probable que la temperatura de nucleacin del hielo en la sangre a 120 MPa
sea cercana al agua pura (-12 C). Para entender este proceso, sirve visualizar la nucleacin
simultnea de mltiples cristales de hielo en las membranas de glbulos rojos y las paredes
internas del tubo en el lmite lquido-slido (Fig. 1) durante la congelacin.

El efecto de la presin sobre el crecimiento del cristal de hielo.


La tasa de crecimiento del cristal de hielo depende de los siguientes tres factores: nivel de
presin, velocidad de enfriamiento y composicin de muestras biolgicas. El efecto de la
presin hidrulica sobre el crecimiento del cristal de hielo dentro de las bio-muestras no se
comprende completamente. El efecto de la presin puede ser
explicado al observar los cambios de densidad y viscosidad del agua lquida bajo presin. Por
ejemplo, bajo una presin de 120 MPa a 0 C la densidad del agua aumenta en
aproximadamente 5.4% con respecto a la presin ambiente. La viscosidad del agua en el
punto de transicin lquido-slido a 120 MPa y -12 C es significativamente mayor (2,5 mPas),
en comparacin con la viscosidad del agua en el punto de transicin lquido-slido a presin
ambiente y 0 C (1,7 mPas ) [4,11]. La adicin de crioprotectores como la sacarosa al agua
en combinacin con la presin aumenta an ms la viscosidad de la solucin [11]. Los cristales
de hielo tienen estructuras ordenadas de molculas de agua. A la presin ambiente, el
movimiento de las molculas de agua en lquidos es relativamente libre. Cualquier molcula
de agua muy cerca de un cristal de hielo en crecimiento tiene una alta probabilidad de
convertirse en una parte del cristal. Por otro lado, bajo alta presin hidrulica, las molculas
de agua se comprimen (entrelazan) entre s y su movimiento se restringe, lo que reduce la
probabilidad de que una molcula de agua se convierta en parte del cristal de hielo y se inhiba
la tasa de crecimiento del cristal. La alta hemlisis despus de la congelacin a presin
ambiente (Fig. 2) se debe principalmente a las tensiones mecnicas y osmticas creadas por
los cristales de hielo en las proximidades de las membranas de los glbulos rojos.
Los cristales de hielo formados a 120 MPa pueden ser ms pequeos, pueden atrapar solutos
de manera ms eficiente y pueden tener una superficie ms lisa cuando se comparan con los
cristales de hielo formados a presin ambiente, reduciendo as las tensiones osmticas y
mecnicas a las membranas celulares. Adems, los CPA combinados con la presin pueden
reducir an ms el tamao de los cristales de hielo
e incluso convertir una porcin de agua en una forma vtrea (sin cristal) durante la congelacin
rpida. Se necesitan estudios de microscopa electrnica de muestras biolgicas congeladas
para determinar el destino exacto de las molculas de agua y los cristales de hielo.

Se pueden encontrar evidencias indirectas de la inhibicin del crecimiento del cristal de hielo
por presin en los estudios de HPFe [3,5,14,18]. El tamao de los cristales de hielo
individuales formados por debajo de 200 MPa con una velocidad de enfriamiento de> 60,000
C / min es a menudo <10 nm (el lmite de resolucin de los microscopios electrnicos) [5,3]
y el tamao de los cristales de hielo parece aumentar con una reduccin de velocidad de
enfriamiento de las muestras. Se necesitan ms estudios definitivos sobre la tasa de
crecimiento de los cristales de hielo bajo presin.

Tasas de enfriamiento.
El hielo intracelular es uno de los principales factores perjudiciales para las membranas de
RBC a presin ambiental. La velocidad de enfriamiento de 160 C / min es lo suficientemente
rpida como para que los RBC no tengan tiempo de perder agua lquida durante el
enfriamiento y el agua lquida se convierte en hielo intracelular. Por lo tanto, los cristales de
hielo intracelular formados bajo presin dentro de los glbulos rojos cuando se enfran a una
velocidad de 160 C / min tienen que ser significativamente ms pequeos y / o tener una
forma diferente en comparacin con cristales de hielo intracelulares formados a presin
ambiente.
El enfriamiento de la sangre completa con 5% de Me2SO a una velocidad de 160 C / min
result en una hemlisis ms baja (5 1,2%) en comparacin con el enfriamiento a una
velocidad de 35 C / min (7,6 1,4%) (Figuras 4 y 5). Las mayores velocidades de
enfriamiento pueden dar como resultado pequeos cristales de hielo y pueden explicar la
menor hemlisis de los glbulos rojos. Adems, hay otras dos razones por las cuales la
velocidad de enfriamiento de las muestras biolgicas debe maximizarse cuando se congela
con CPA bajo presin elevada. Primero, los CPA son txicos para las clulas vivas y la
toxicidad aumenta con el tiempo que pasa en contacto con el CPA lquido. En segundo lugar,
la presin superior a 100 MPa puede ser letal para los rganos mamferos si se aplica durante
ms de 2 min y el impacto negativo de la presin aumenta con el aumento de presin y el
tiempo empleado bajo presin [12,13].
Utilizando tcnicas de enfriamiento rpido, es posible congelar grandes muestras de biomasa
(20+ mm de espesor) en 1-2 minutos, limitando o eliminando el impacto de la alta presin
hidrulica y la toxicidad de CPA antes de la congelacin. Cuando la bio muestra est en estado
congelado (slido), tanto la presin hidrulica como los CPA tienen poco o ningn efecto en
las muestras biolgicas. Por lo tanto, la velocidad de enfriamiento de las muestras biolgicas
debe maximizarse para reducir el tiempo empleado bajo la presin, la exposicin a los CPA
lquidos y el tamao de los cristales de hielo.
Se investigaron las velocidades de enfriamiento de 35 C / min y 160 C / min porque se
aproximan a las velocidades de enfriamiento ms rpidas que se pueden lograr en la
superficie (160 C / min) y en el centro (35 C / min) de muchas muestras biolgicas grandes,
como unidades de sangre (400 ml) y rganos (rin) debido a la conductividad trmica limitada
de las muestras biolgicas. Las velocidades de enfriamiento anteriores se pueden obtener
sumergiendo las muestras biolgicas en nitrgeno lquido o por contacto con placas de metal
fro. La hemlisis baja despus del enfriamiento con dos velocidades de enfriamiento muy
diferentes permite mantener la hemlisis bajo control en todo el volumen de una unidad de
sangre y puede abrir la posibilidad de una criopreservacin exitosa de rganos, como el
corazn y el rin.

El efecto de la baja concentracin de CPA.


Los resultados anteriores indican que el efecto crioprotector de la presin puede amplificarse
en Me2SO al 5% o glicerol al 8% (Figuras 4 y 5). Las bajas concentraciones de CPA
combinadas con una presin de 120 MPa fueron suficientes para proteger las membranas
celulares de los daos mecnicos y osmticos durante la formacin de hielo. Parece que la
baja concentracin de CPA inhibe an ms el crecimiento del cristal de hielo, dando como
resultado cristales de hielo an ms pequeos y un componente vitrificado de agua ms
grande en comparacin con la congelacin usando presin sola.

Aplicaciones futuras
A pesar de que el mtodo aprobado por la FDA para la criopreservacin de glbulos rojos
[16,21] a menudo resulta <15% de procesamiento antes de la descongelacin, requiere un
40% de glicerol combinado con un procesamiento costoso y largo usando equipos
especializados [21]. Por otro lado, el 8% de glicerol es mucho menos txico que el 40% [9] y
la adicin y eliminacin del 8% de glicerol se puede hacer relativamente rpido en 1-2 pasos
simples. Por lo tanto, la reduccin de la concentracin de CPA no solo reduce la toxicidad,
sino que tambin simplifica el procesamiento de las muestras biolgicas.
A pesar de mltiples intentos, los cientficos no han podido criopreservar y restablecer las
funciones normales de bio-muestras complejas, como tejidos y rganos de mamferos. Los
protocolos de criopreservacin se basan en el uso de: (1) protocolos optimizados de
enfriamiento y calentamiento, que son imposibles de lograr en la mayora de los tejidos y
rganos debido a la baja conductividad trmica de los tejidos biolgicos; y / o (2) alta
concentracin de CPA, que son txicos para las clulas y son difciles de distribuir dentro de
los tejidos y rganos. Inevitablemente, habr demasiados CPA en algunos lugares
(demasiado txicos) y no lo suficiente en otros (demasiados cristales de hielo). Por otro lado,
la presin hidrulica, aplicada a la muestra biolgica, puede distribuirse de manera rpida e
igual a lo largo de todo el volumen de la muestra biolgica, creando condiciones favorables
para la criopreservacin, que no pueden realizarse a presin ambiente.
Conclusin

Aunque no se sabe cmo la presin previene el dao de los cristales de hielo, los resultados
anteriores sobre la hemlisis de los glbulos rojos indican que el tamao, la forma y la
distribucin de los cristales de hielo, formados a 120 MPa en combinacin con una
concentracin relativamente baja de Me2SO o glicerol, tienen poco o ningn efecto sobre la
integridad de las membranas de RBC en comparacin con los cristales de hielo formados a
presin ambiental (Figuras 4 y 5). La presin parece ser un amplificador de las propiedades
crioprotectoras de los CPA y puede reducir la concentracin de CPA necesarios para la
conservacin y recuperacin de muestras biolgicas viables. Dado que los tejidos y los
rganos son altamente susceptibles a la toxicidad de los CPA [10, 9], el desarrollo del mtodo
de bajo CPA puede ser otro paso hacia la criopreservacin exitosa de los tejidos y rganos.
Se necesita ms investigacin para optimizar el mtodo y determinar si es clnicamente
aplicable.
Referencias