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Lorenzo Gonzlez
En segundo lugar, al Dr D. Juan Carlos litera del Portal, al que debo el inicio de
mi andadura por el Departamento de Fisiologa Animal. Seda dificil expresar lo mucho que
ha supuesto para mi su constante estmulo y valiosa ayuda en la realizacin del presente
trabajo.
1
Eh
2.- FECUNDACION.
ji
Eh
2.4.4.4.- Tiempo 49
2.4.4.5.- Medios 49
2.4.4.6.- Osmolaridad 50
2.4.4.7.- Variaciones individuales 50
2.4.4.8.- Sustancias que influyen en
It capacitacin ja vito 51
a. Glicosaminoglicanos
- 51
b.- Factores de motilidad 52
c.- lonforas 52
d.- Cafeina 52
e. Nucleridos cficicos
- 52
f - Pmreinas del estro 53
g.- PAF 53
2.4.4.9.- Clulas del cmulo 53
iii
Eh
1.1. MATERIAL 73
1.1.1.- EQUIPO 73
1.1.2.- MEDIOS DE CULTIVO 76
1.1.2.1.- Medio de transporte 76
1.1.2.2.- Medio de lavado 76
1.1.2.3.- Medio de maduracin 76
1.1.3.- PREPARACION DE LOS MEDIOS 78
1.2.- METODOS . . 78
1.2.1.- OBTENCION DE LOS OVARIOS 78
1.2.2.- OBTENCION DE LOS OOCITOS 79
1.2.2.a.- Seleccin 80
1.2.2.b.- Clasificacin 81
1.2.3.- CONDICIONES DE MADURACION IN VITRO 81
1.2.4.- EXPERIENCIAS DE MADURCION IN VITRO ... 82
1.- Experimento 1 82
2.- Experimento 2 83
3.- Experimento 3 85
iv
Nt
2.- FECIJNDACION IN VITRO 86
2.1.- MATERIAL 86
2.1.1.- EQUIPO 86
2.1.2.- MEDIOS DE FECUNDACION IN VITRO 86
2.1.2.1.- Medio de avado de espennat 87
2.1.2.2.- Medio de lavado de occitos 87
2.1.23.- Medio de fecundacin 87
2.1.3.- PREPARACION DE LOS MEDIOS 88
2.2.- METODOS 88
2.1.2.- OBTENCION DEL SEMEN 88
2.2.2.- PREPARACION DEL SEMEN 89
1.- Descongelado 89
II. Sep. frrzc. mvil
- 90
hL Lavado
- 91
IV.- Induccin a la ~ 92
2.2.3.- PREPARACION DE LOS OOCITOS 92
2.2.4.- CONDICIONES DE INSEMINACION 92
2.2.5.- PRUEBAS DE FECUNDACION IN VITR O 93
1.- Experimento 1 93
2.- Experimento 2 93
y
Eh
IV.- RESULTADOS . . 101
1.- Recuperacin de cocitos 102
vi
ABREVIATURAS.
2
oocitos inmaduros bovinos pueden madurar ci un cultivo in vila> bajo condiciones
adecuadas, pero, es cierto que, todava, existen mecanismos no aclarados en la
maduracin de los oocitos que permiten que, los que han madurado in vivo, puedan
fecundarse mejor que los que lo han hecho in vitro (Leibfried-Rutledge e: aL, 1986).
Esto es debido, probablemente, a la existencia de factores hormonales o foliculares
intraovricos que no son aliadidos a los medios y que intervienen decisivamente en
la maduracin completa del oocito.
A lo largo de los afios, se han estudimk los factores que favorecen el proceso
de la maduracin iii vitro; en este sentido, los medios de maduracin se han
suplementado con hormonas o compuestos sricos. Las primeras se utilizan debido
a que las gonadotropinas (FSH y LH) y algunas hormonas esteroides (estradiol 178)
tienen un papel fundamental en el desarrollo del folculo y en la maduracin del
oocito, habindose empleado por multitud dc autores (Rae y Foote, 1975; Moor y
Trounson, 1977; Fukui e: aL, 1982; RaIl a al., 1983, etc.). La suplementacin
srica tambin se ha empleado de una manen rutinaria en los medios de maduracin
iii vftro, con objeto de ofrecer una fuente proteica y energtica al oocito durante la
maduracin (Leibfried y First, 1979). El suero fetal bovino ha sido el ms utilizado
aunque, Sanbuissho y Threlfall indicaron ci 1989 que, la utilizacin de suero de
vaca en estro, en los mismos medios, aumentaba las cifras de maduracin y la
capacidad de fecundacin de los oocitos.
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en las membranas celulares (Vlodasky el al., 1978) y por un sistema de mensajeros
celulares (Hill 1989).
Durante estos ltimos aflos, numerosos estudios seflalan que los factores de
crecimiento participan en el control meitico del oocito. En este sentido, Dekel y
Serizly (1985), Feng er aL (1988) y Downs (1989) demostraron la capacidad de
algunos de estos factores para reactivar la meiosis de oocitos de rata y rata y, de
esta manera, conseguir la maduracin in vitm de los mismos.
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REVISION
BIBLIOGRAFICA
1.- MADURACION DE OOCITOS.
1.1.1.- Cronologa.
6
1.1.2.- Oognesis.
El nmero de gametos que poseen las hembras domsticas est fijado desde
el mismo momento de su nacimiento, y sern, durante toda la vida del animal, los
nicos capaces de ser fecundados (Zuckermann, 1962). En la vida embrionaria
comienza la cognesis o formacin del gameto femenino. A partir de unas clulas
indiferencimias se producen las clulas germinaes primordiales (Eddy e: aL, 1981;
Byskov, 1982). Estas, por migracin, llegarn a la cresta genital, donde se formar
la futura gnada (Gondos, 1978). Las celulas primordiales se multiplican
mitticamente y una parte de stas se diferenciarn y formarn las oogonias, clulas
base a partir de las que se formar el oocito o gameto femenino.
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subdivide en otras (leptotene, zigotene, paquitene, diplotene, dictiotene y diacinesis),
caracterizadas por amplios cambios del material cromosmico (recombinaciones,
sobrecruzamientos etc.). El hecho ms importante de la Profase 1 es, que al llegar
al estadio de dictiotene, o dictiato, el oocito detiene tanto la meiosis como su
crecimiento, hecho que coincide, generalmente, con el momento del nacimiento
(Baker y Franchi, 1967). El estadio de dictiotene se caracteriza por la presencia de
un ncleo prominente que recibe el nombre de vescula germinal (GV) (Franchi a
aL, 1962). (Vase el Esquema 1).
QOGENESIS EN LA VACA
Nacimiento
Fecundacin
0 4045 80 110 130 280
Das II
1 >g
t Atresla y Degeneracin
L~t.nflne
e
Zigocene Paqufltne ~lots GV.
o>
m14 M-l
NUWt1
Diversos autores han sugerido que la detencin del oocito en dictiato se debe
a varios factores: contacto con las clulas que rodean al oocito (Olmo y Smith,
1964), presencia de un factor que detiene la maduracin (MPS) (Ryskov, 1982),
actuacin de clulas germinales ectpicas de las glndulas adrenales (Zamboni, 1970)
o, incluso, cambios de las propiedades de la superficie del oocito.
8
De esta manera, el ovario de la hembra recin nacida presenta su
organognesis terminada, conteniendo muchos occitos, detenidos nuclearmente en
la primera divisin de la meiosis (oocitos primarios) y rodeados por el estroma
epitelial ovrico formando folculos primordiales (Franchi el aL, 1962). Esta
cantidad de oocitos ser la nica fuente de gametos femeninos capaces de ser
fecundados en toda la vida de la hembra (de 200.000 a 500.000), aunque de hecho
slo una pequesima parte de ellos vayan realmente a ovular.
1.1.3.- Foliculognesis.
Thibault el al. (1987) sostienen que, en este estadio, las clulas foliculares
que rodean el oocito no tienen efecto de inhibicin sobre el crecimiento del mismo
y, por lo tanto, a partir de entonces y favorecidas por las gonadotropinas
hipofisarias, las mitosis de las clulas epiteliales que rodean el oocito y el
crecimiento del mismo, concurren paralelamente. Las clulas epiteliales se
multiplican y crecen disponindose en varias capas constituyendo el folculo 20 o
pre-antral. Las secrecciones de estas clulas producen mucopolisacridos, por
influencias hormonales, que se dispondrn alrededor del oocito formando una
membrana llamada zona pelcida (ZP).
Mientras todo esto ocurre, el ncleo del oocito sigue en reposo, pero la
actividad citoplsmica es intensa, cargndose de productos nutritivos, que son
suministrados a travs de las clulas que rodean el oocito. Alrededor del folculo se
disponen unas estructuras de tejido conjuntivo que se entrelazan a modo de barrera,
constituyendo las tecas, que completarn su formacin en el siguiente estadio
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folicular. Las clulas foliculares responden al estmulo de la FSH hipofisaria
secretando sustancias (metabolitos, hormonas esteroides etc.), que se van a acumular
en el folculo formando una cavidad llamada antro folicular, lo que coastituye el
folculo antral (Zuckerniann, 1962). En el momento en que las clulas foliculares
son capaces de responder al estmulo de la FSH, con sntesis hormonal, se
denominan clulas de la granulosa.
lo
La maduracin citopidamica incluye una sucesin de transformaciones de los
orgnulos del oocito, fundamentalmente de mitocondrias (Thibault e: aL, 1987),
grnulos corticales (Cran y Cheng, 1986) y retculo endoplsmico liso y rugoso
(Hyttel e: al., 1986; Hyttel, 1988), todas ellas necesarias, para el progreso de la
maduracin y el bloqueo de la poliespermia. Thibault y Gerard (1973) tambin
sealan que se producen protenas de nueva sntesis, como el factor del crecimiento
del proncleo masculino (MPGF) y el factor promotor de la maduracin (MPF)
(Masui y Market, 1971).
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Esquema 2. Descripcin morfolgica de los estadios meidticos durante la maduracin de los occitos
bovinot.
16-18 ANA-TELOFASE Los cromosomas se segregacin hacia los polos del huso
acromtico.
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ya que los oocitos permanecen fecundables un corto periodo de tiempo de no m~s
de 10-12 horas, pasado el cual pueden sufrir divisiones espontAneas partenogenticas.
Son oocitos inmaduros. Hay dos tipos de oocitos pre-ovulatorios, los quecasi
han completado su maduracin y les falta, por lo tanto, un corto espacio de tiempo
para terminar la misma y aquellos oocitos foliculares que son totalmente inmaduros.
Los oocitos pre-ovulatorios se obtienen mediante la puncin de los folculos
ovricos. El grado de maduracin de los oocitos recogidos es dependiente del
mtodo de recogida empleado;
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1.3.- FACTORES QUE INFLUYEN EN LA MDIJRACION IN VITRO.
Por otro lado, la edad ptima del animal para obtener oocitos, con vistas a
su maduracin in vitro, no est bien determinada, ya que hay autores que sealan
las mismas posibilidades de maduracin para los oocitos provenientes de terneras,
novillas o vacas adultas desde 3 aos en adelante (Katska y Smorag, 1984). Sin
embargo, la mayora de los autores prefieren ovarios provenientes de novillas,
puesto que las posibilidades de encontrar folculos atrsicos y oocitos degenerados
son significativamente menores que en vacas de ms edad (Gordon, 1990).
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1.3.1.b.- Seleccidn del folculo.
Por otro lado, Lonnergan e: al? (1992) sealan que los folculos, con un
dimetro de entre 2 y 6 mm, permiten una tasa de recuperacin de oocitos (n0 de
oocitos obtenidos/n0 de folculos aspirados) aptos para el cultivo mayor que en los
folculos de mayor tamano.
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1978) de donde se recogen. Posteriormente, se pasan varias veces por pns de
lavado (Leibfried y First, 1980; Fukui y Sakuma, 1980; Xu e: al., 1987; Fukui,
1990) con objeto de eliminar elementos foliculares, que impiden o dificultan la
maduracin (liquido folicular, clulas de descamacin, sangre, adherencias etc.).
ji) aspecto y morfologa del cmulo celular que le rodea, del que Leibfried
y First (1979), Xu e: aL (1987) y De Loos a aL (1992) afirman que no debe
encontrarse expandido ni disperso sino compacto y sin aglutinaciones.
Laurincknic (1992) sealan que se produce una mayor tasa de maduracin in
vitro cuando se seleccionan oocitos que presentan las clulas de la corona
radiada claramente diferenciadas del resto del cmulo celular que modea al
oocito.
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los oocitos con cmulo completo en dos tipos, 1 y II, segn la compactacin
de sus capas. Finalmente, hay autores que dividen los oocitos hasta en 6
grupos (Lonnergan e: aL, 1991).
de los oocitos in viti-o es tal que, segn algunos autores, condiciona el xito de los
sistemas de fecundacin y el posterior desarrollo itt viiro de los embriones (Rose y
Bavister, 1992).
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1.- Suero. El oocito necesita un aporte exgeno de nitrgeno de origen
proteico, que no puede formar por si mismo, por lo que el medio de cultivo se
suplementa con suero sanguneo-Suero Fetal Bovino (SFB) y Suero de Vaca en Estro
(SVE), o con alguno de sus derivados como la Albmina Srica Bovina (BSA).
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Ohno, 1989); sin embargo Xu e: al. (1987) y Schellander es aL (1990), demuestran
que el SVE favorece notablemente la maduracin in viti-o, utilizando concentraciones
del 20%, que adems, producen expansin completa del cmulo celular. Pero Kim
es al. (1990), sealan que la concentracion ms efectiva, en los sistemas de
maduracin y fecundacin itt vitro, es del 10% de SVE y/y en el medio de
maduracin.
Por otro lado, en los sistemas de maduracin iii vitro, tambin es necesario
controlar las condiciones fisicoqumicas del medio, fundamentalmente en lo referente
a la temperatura, osmolaridad, pH, atmsfera gaseosa y duracin del cultivo in viti-o:
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Respecto a la temperatura, Katska y Smorag (1985) indican que la
maduracin de oocitos bovinos no se produce 5 0C por debajo de la
temperatura corporal normal de la especie. Por otro lado, mrgenes de
temperatura entre 37 y 410C, permiten la maduracin a vi:ro de los oocitos
bovinos (Lenz es al., 1983), aunque la temperatura ptima es de 3VC,
coincidiendo con la temperatura corporal de la especie (Lenz es al., 1983;
Leibfried-Rutledge eta!., 1987).
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Fukui es aL, 1982; Wiemer e: aL, 1991) y 5% CO2, 5% % y 90% N2
(Younis e:al?, 1989; Pavlov e: aL, 1990), en ambos casos, con una humedad
relativa cercana al 100%. Jones (1979), seala que la presin del C%, en el
lquido folicular bovino, se sita en valores del 5% y adems indica que el
oocito necesita condiciones anaerobias, para su crecimiento y desarrollo
normal. Como ya se ha dicho el CO2 es regulador del pH junto con el
bicarbonato. Hay muy pocos estudios que indiquen las ventajas de incluir en
el sistema de maduracin una tensin de oxigeno determinada; es ms,
Gwatkin y Haidri (1973) indican que concentraciones de 02 del 20%
producen la inhibicin de la maduracin iii vllro del oocito de hamster,
mientras que Tsafriri y Channing (1975) sealan que la presencia de altas
concentraciones de oxigeno interfieren los procesos de maduracin in vi:ro.
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intercambio gaseoso continuo. El primero no tiene inters ya que no permite el
intercambio gaseoso, necesario para la maduracin de los oocitos, mientras que
dentro del segundo grupo se pueden citar dos tipos: los sistemas abierto y cerrado.
Diversos autores han indicado una cierta ventaja cuando se somete la placa
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de cultivo a una ligera oscilacin constante durante el periodo de maduracin. Este
movimiento tiene por objeto favorecer la difusin de los componentes del medio y,
sobre todo, de las hormonas (Musse, 1990; Pavlov es al., 1992).
1.- Lquido folicular. Algunos autores (Chang, 1955; Sreenan es al., 1970),
sealan que la adicin de lquido folicular (LF), al medio de maduracin, inhibe la
meiosis en oocitos de coneja y vaca. Tsafriri y Channing (1975) describen una
sustancia proteica, de 2000 Da de peso molecular, presente en el LF porcino. Este
compuesto, denominado OMI (inhibidor de la maduracin del oociso) provoca la
inhibicin de la maduracin iii viti-o de los oocitos, aunque este efecto es reversible
si se aade LH al medio. El OMI no es especfico de especie, ya que LF de distintas
especies inhiben la maduracin de los oocitos de otras y, adems, acta slamente
a travs de las clulas del cmulo (Tsafriri y Bar-Ami, 1982). Por otro lado, la
presencia y accin del OMI son muy discutidas, debido a la falta de una base
bioqumica clara que demuestre su existencia (Leibfried y First, 1980). Adems, se
ha demostrado recientemente que la hipoxantina y adenosina, presentes en el LF, se
comportan tambin como inhibidores de la maduracin iii vitro (Sirard el al., 1992).
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bajo peso molecular (Tsafriri y Channing, 1975), pptidos pequeos (Sato y Koide,
1984) o nucctidos (Downs e: al?, 1989). Leibfried y First (1980) indican que el
LF filtrado y esterilizado provoca slo una leve inhibicin temporal en la
maduracin cuando se aade al medio en una proporcin del 50% y/y. Sirard y First
(1988) demuestran que hay una relacin dosis-respuesta al aadir LF al medio,
establecindose una inhibicin patente de la maduracin del occito con
concentraciones superiores al 50% de LF y/y.
Sirard es al. (1992) sealan que el efecto inhibidor, sobre el oocito, se ejerce
por sustancias presentes en el propio LF y que este efecto se hace a travs de las
clulas del cmulo.
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demostrado en varias especies animales, como en la cerda (Motlik y Fulka, 1986),
oveja (Staigmiller y Moar, 1989) y vaca (Critser eta!., 1986; Fukui, 1990).
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La hormona luteinizante (LH) ha demostrado tener efectos positivos en los
sistemas de maduracin in visro. Shalgui es aL (1979) indican que la LH mejora la
maduracin citoplsmica del oocito; Zuelke y Brackett, (1990) sealan que la
presencia de Liii, en el medio de cultivo in vitro, provoca una mayor oxidacin
mitocondrial de la glucosa, en los oocitos bovinos, lo cual favorece la maduracin
de los mismos.
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).b.- Esferoides. Las acciones que ejercen estas hormonas en el proceso de
maduracin in vitro no son an bien conocidas del todo, aunque se sabe que el pico
de la LH conduce in vivo a un aumento de estrgenos, en el folculo preovulatorio.
Sin embargo, cuando se aaden esteroides a un medio de maduracin de oocitos br
viti-o, algunos autores no describen cambios importantes en la maduracin de oocitos
de vaca, rata y cerda (1safriri, 1978; Lu y Gordon, 1987; Gordon, 19%).
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ejercen las hormonas esteroides, en la maduracin ha vftro en general, es debida a
modificaciones o incorporaciones de nuevas protenas al oocito.
Por ltimo, otros autores destacan incluso que cuando los medios de
maduracin se suplementan con hormonas, stas no tienen los efectos esperados
sobre la maduracin y la fecundacin e indican que la adicin de SVE presenta
mejores resultados (Gordon, 1990). Probablemente, esto sea debido a que, en este
suero, las hormonas se presentan a concentraciones similares a las fisiolgicas, cosa
que no ocurre al aadirlas exgenamente en los sistemas de maduracin ha viti-o (Lu
y Gordon 1987; Lu es al., 1987; Gordon, 1990; Schellander es al., 1990).
2.- Sistema AMPe. Desde hace algunos aos, se admite que el sistema que
regula los niveles de adenosn mono fosfato cclico (AMPc), en el interior del
oocito, es el encargado de mantener su ncleo en reposo meitico (GV). Esto es as,
al menos en animales de laboratorio (Downs es aL, 1989) y parece que el AMPc
juega el mismo papel, aunque no de manera exclusiva, en otras especies (Moor y
Gandolfl, 1987; Sirard es al., 1990). En este mecanismo de regulacin parecen
actuar varios f~ctores cuyas acciones se describen seguidamente.
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Hay dos enzimas que actan aumentado a disminuyendo las concentraciones
del AMPc. La adenilwo-ciclasa origina una elevacin de los niveles del AMPc
intracelular, mientras que lafosfodiessei-asa (PDE) acta disminuyndola.
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Por otro lado, se ha observado, en el oocito bovino y en el de oveja, que las
altas concentraciones de AMPc intracelulares no son las nicas encargadas de
mantener la detencin meitica. Los anlogos del AMLPc y los otros inhibidores de
la meiosis anteriormente citados, slo pueden inhibir temporalmente la maduracin
o bloqueara, en el estadio de Metafase 1 (BalI e: aL, 1984; Moor y Gando]fI, 1987).
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presenta un ncleo grande, situado perifricamente, rodeado de la membrana nuclear
y con un nucleolo apenas visible, en los oocitos bovinos (Hyttel a aL, 1986; dc
Laos e al., 1992). Este estado nuclear se corresponde con el estadio de dictiato
meitico (GV>.
31
Los cambios citoplsmicos a lo largo de este periodo se resumen en una
elevada actividad de sntesis proteica y una reordenacin de los sistemas de
microtbulos, debido a la intensa actividad cromosmica (Hyttel el a!., 1986).
Adems, tambin existe un agrupamiento de las mitocondrias y los grnulos
corticales que comienzan a situarse perifricamente (Ducibella e: a!., 1988).
32
Estos fenmenos cronolgicos, descritos en la maduracin se corresponden
tanto en los oocitos madurados itt vivo como iii vitro (Kruip es al., 1983; Ryttel,
1988). Las diferencias ms notables entre ambos tipos de maduracin, estriban
fundanienta]mente en que los oocitos madurados ha vitro sufren por un lado, un
retraso en la migracin de los grnulos corticales a la periferia del oocito (Cran,
1989; Hyttel e: al., 1986) y por otro, presentan un mayor nmero de prolongaciones
celulares, provenientes de las clulas de la corona radiada, en el EPV (de Loos e:
aL, 1992).
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2.- FECUNDACION.
34
Durante el paso por el tracto femenino, los espermatozoides se liberan del
plasma seminal que les acompaa en el momento de la eyaculacin (Yanagimachi,
1988).
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2.2.- CAPACITACION ESPERMATICA.
Austin (1951) indica que el espermatozoide debe sufrir algn proceso, antes
de penetrar en la zona pelcida del oocito y que ste ocurre en el tracto genital de
la hembra. Algunas semanas ms tarde, Chang (1951) publica una conclusin
idntica. Por lo tanto, la capacitacin consiste, al menos en parte, en la retirada
gradual del material que recubre la regin acrosmica del espermatozoide. De esta
manera, se dejan libres los receptores de los espermatozoides para que puedan
interaccionar con las sustancias del oviducto, las capas externas del cmulo celular
o con los propios receptores que posee la zona pelcida del oocito.
36
las etapas anteriores. A su vez, se incorporan nuevas macromolculas o se modifican
las ya existentes; entre stas, destaca la integracin o modificacin de glicoproteinas
acrosmicas por parte de enzimas presentes en el lquido epididimal, como la
galactosil-transferasa.
Bedford (1969) seala que las regiones del tracto genital femenino difieren
en su potencial, para capacitar el espermatozoide. Mientras que la capacitacin
puede tener lugar en el tero (Austin, 1951), se produce ms rpidamente cuando
sucede en el oviducto (Bedford, 1969). Adems, la capacitacin espermtica varia
segn el estado endocrino de la hembra, ya que altos niveles de estrgenos
plasmticos favorecen la capacitacin, mientras que elevadas concentraciones de
progesterona la inhiben. De acuerdo con esto, Anderson es al. (1992) sealan que
en el momento del estro se produce en el oviducto una protena desconocida que
favorece la capacitacin del espermatozoide bovino. Por otro lado, Herz es al.
(1985) sealan que el espermatozoide de toro sufre la reaccin acrosmica en la
ampolla del oviducto ipsilateral del ovario que ha ovulado, en la mayora de las
ocasiones, y que adems se produce en un momento cercano o justo despus de la
ovulacin.
37
fosfolpidos, aumento de la permeabilidad a los iones de calcio, interaccin con
glicosaminoglicanos y, por ltimo, la reaccin acrosmica (Yanagimachi, 1988;
Fayrer-Hoskens y Caudle, 1991).
In vivo el oocito pierde gran parte de las clulas del cmulo, despus de la
ovulacin o en su recorrido por el oviducto (Crozet, 1984). Por lo tanto, el
espermatozoide al acercarse al oocito contacta ntimamente con las pocas clulas del
cmulo que quedan y con la superficie de la zona pelcida. En este momento se
produce la RA.
Hialuronidasa Arilawinidasa
Acrosina. fi-N-acetilhexosaminidasa
Proacrosina 8-Galactosidasa
Esterasas fi-Glucuronidasa
Neuroaminidasas L-Fucosidasa
Fosfatasas Fosfolipasa C
Fosfolipasa A Petidil-peptidasa
Arilsulfatasa Ornitina-decai-boxilasa
Colagenasa
38
.
penetracin del espermatozoide en el interior del oocito, ya que para ello se necesita
la liberacin de las enzimas acrosomales (Talbot, 1985).
39
espermatozoides in viro sean los mismos que in vivo. En cualquier caso, aunque se
han sealado en parte anteriormente, parece que los procesos intrnsecos de la
capacitacin y RA son, de manera esquemtica, los siguientes:
2.3.- FECLINDACION.
40
niveles de calcio. Este aumento del calcio provoca la estimulacida de la
protein-quinasa C, que acta liberando el contenido de los GC al espacio
perivitelino (enzimas proteolticas, glucoproteinas y ovoperoxidasa Cran,
1989). El tiempo que tarda en completarse este proceso es muy variable,
desde un mnimo de 8 minutos en el hamster (Gwatkin es al., 1973) y hasta
2 3 horas en la vaca (Hyttel, 1988; Vase el esquema 3).
PM DM SM Nf
(A
(bj
(cl
(dI
41
En el mecanismo que impide la polispermia taimbien intervienen activamente
las ZP. En concreto, adems de otras acciones, ciertas enzimas de los grnulos
corticales inactivan, en la zona pelcida, las funciones de las ZP2 y ZP3, con lo que
los espermatozoides no pueden fijarse a la misma ni sufrir la RA (Bleil y
Wassarman, 1983; Wassarman, 1988).
42
y comienza el desarrolo embrionano.
43
En estos primeros trabajos se sientan las claves del futuro xito de las
tcnicas de FIV: por un lado, se seala la necesidad de que los espermatozoides se
capaciten antes del contacto con el gameto femenino (Austin, 1951; Chang, 1951),
y, por otro, se desarrollan tcnicas sencillas de tincin que permiten evidenciar la
fecundacin de los oocitos (Chang, 1951).
Han tenido que pasar varios aos para lograr resultados, en otras especies,
como los obtenidos por Chang en el conejo: Toyoda y Chang (1974) en la rata;
Steptoe y Edwards (1978) en humana y Cheng es aL (1986) en la oveja y la cerda.
Este retraso fue debido a que los mismos procedimientos no se pueden extrapolar a
otras especies animales, por las caractersticas especificas de cada una de ellas.
Adems, Brackett er al. (1982) sealan que todos los avances conseguidos, en las
tcnicas de FIV, son el resultado de la investigacin sobre la maduracin del oocito,
sobre la capacitacin del espermatozoide y sobre el desarrollo embrionario posterior
a la FIV.
Los fenmenos de FIV, en el ganado bovino, han sido estudiados por muchos
autores (Srecnan, 1970; Hunter es aL, 1972; Shea eral., 1976; Iritani y Niwa, 1977;
Newcomb es al., 1978) hasta culminar, como se ha indicado, en el xito obtenido
por Brackett es al., (1982).
En general segn First y Parrish (1987), todos los sistemas de FIV requieren
los siguientes puntos:
44
1.- Utilizacin de un sistema que asegure la maduracin del oocito.
Los oocitos que se utilizan para la FIV provienen de dos fuentes esenciales,
madurados itt vivo e itt viti-o (VER PUNTO 2.1).
Sin embargo, esta metodologa tiene dos inconvenientes: uno de ellos es que
exige un aparataje y especializacin adecuada, ya que hay que averiguar el momento
exacto de la ovulacin, bien para adelantarnos a ella (oocitos preovulatorios) o para
recoger los oocitos inmediatamente despus (post-ovulatorios). First y Parrish (1987)
indican que retrasos de ms de dos horas, tras la ovulacin de los oocitos, se
traducen en una tasa de partenognesis, excesivamente alta. El otro inconveniente
es que el nmero de oocitos obtenidos por hembra es impredecible y siempre est
45
limitado a la respuesta al tratamiento de superovulacin (Toyoda, 1989). De hecho,
siempre que las vacas son sometidas a tratamientos de superovulacin, el nmero de
oocitos recogidos ofrece cifras entre 5 y 10, por animal (Lambert es al., 1986;
Leibfried-Rutledge e: aL, 1986).
46
Por su parte, Yanagimachi (1988) indica que la membrana plasmtica de los
espermatozoides eyaculados se comporta de manera ms estable que la de los que
provienen del epididimo, los cuales, segn First y Parrish (1988) tienen dificultades
para sufrir la reaccin acrosmica si no existe un tratamiento previo de 30 minutos
con plasma seminal.
Todo ello hace pensar que ambos tipos de espermatozoides son vlidos para
producir la fecundacin itt vitro. De hecho, muchos autores han utilizado
espermatozoides, de origen epididimal, para sus sistemas de FIV (Bal es aL, 1983;
Lenz es al., 1983) as como espermatozoides procedentes de eyaculado (Iritani es al.,
1977; Parrisli es aL, 1985).
Sin embargo, estas tcnicas no han tenido xito en los rumiantes, teniendo
en cuenta, adems, que en los animales de laboratorio se emplean espermatozoides
epididimales, mientras que en rumiantes se utiliza preferentemente eyaculado fresco
47
o congelado. Los espermatozoides epididimales pueden capacitarse con simples
soluciones salinas (Bal es al., 1983; Lenz es aL, 1983) mientras que los
espermatozoides eyaculados necesitan, adems, la accin de ciertos agentes que
ayuden a la capacitacin (Parrish es aL, 1986; Fi-st y Parrish, 1988).
d.- Medio capacitador TALP, que se basa en una seleccin previa de los
espermatozoides y en la inclusin de glicosaminoglicanos u otras sustancias,
en el medio de capacitacin (Parrish eral., 1986; Fukui, 1990; Pavlov er aL,
1992).
48
2.4.4.- FACTORES QUE INFLUYEN EN LA CAPACITACION IN
VITRO DEL ESPERMATOZOIDE.
49
En cuanto a algunos de los componentes de los medios, la mayor~
de ellos llevan una suplementacin de B.S.A., que favorece la capacitacin,
ya que elimina colesterol y cidos grasos de la membrana plasmtica, los
cuales impiden la capacitacin (Go y Wolf, 1985) adems de mantener ]a
motilidad espermtica.
50
1990). En el caso del semen congelado, algunos autores utilizan pajuelas de
varios toros (Parrish e: al., 1986) o emplean semen de un nico toro de
fecundidad contrastada (Ohgoda el al., 1988; Fukui, 1990).
51
La capacitacin por heparina se inhibe en presencia de
concentraciones superiores a 5 mM de glucosa, aunque este efecto es
reversible si los espermatozoides se incuban con dosis de 200 gg/ml de
heparmna o se aade AMPc (First y Parrish, 1988).
52
capacitacin produciendo un efecto positivo, ya que la regulacin del
intercambio inico, en la membrana del espermatozoide, est mediado por
un mecanismo de fosforilacin. En este mecanismo, interviene activamente
la concentracin intracelular de AMPc (Parrish et al., 1988). Otros autores
sin embargo, indican que la adicin exclusiva de AMPc, o sus derivados (8-
Br-AMP), no aumenta las tasas de capacitacin de espermatozoides bovinos
(Critser e: aL, 1986).
4.8.g. Factor activador de las plaquetas (PAF). Parece ser que este factor
incide positivamente en el conjunto de la capacitacin, favoreciendo la
reaccin acrosmica y aumentando la motilidad de los espermatozoides
bovinos (Fukuda y Roudebush, 1992).
4.9.- Clulas del cmulo. Gwatkin es al.> (1972) sealan que la presencia
de las clulas del cmulo juega un papel fundamental en la capacitacin de
espermatozoides de hamster itt viti-o. En la especie bovina, el efecto de las
clulas del cmulo ha sido evaluado respecto al conjunto del sistema
maduracin/fecundacin itt viti-o teniendo en cuenta el efecto del cmulo
sobre la propia maduracin del oocito y sobre los fenmenos de capacitacin
(Critser e: aL, 1986; Thibault es aL, 1987; Shioya es aL, 1988).
Especficamente, Fukui (1990) indica que la zona pelcida de los oocitos,
con cmulo o denudados, es capaz de inducir la reaccin acrosmica. El
mismo autor seala que los ndices de espermatozoides capacitados y
reaccionados aumentan, significativamente, cuando los oocitos estn
completamente rodeados de las clulas del cmulo, respecto a los oocitos
denudados.
53
2.4.5.- CONDICIONES DE INSEMINACION.
54
Younis es aL, 1989; Fukui, 1990; Rose y Bavister, 1992; Pavlov e: aL,
1992).
55
la accin de la heparina. Otros autores sealan, sin embargo, que
concentraciones de 12 mM de glucosa pueden afiadirse al medio de
fecundacin siempre y cuando se utilizan concentraciones de heparina sdica
20 veces mayores a las normales (Fukui, 1990).
56
Algunos autores, tambin, sealan como criterio vlido la visualizacin de
cabezas espermticas o del proncleo masculino, en distintos grados de
decondensacin, siempre acompaado del proncleo femenino (Ohgoda e: aL, 1988).
Segn los diversos autores, las causas de que se produzcan estas alteraciones
son de diferente naturaleza, y, entre ellas, se destacan las siguientes:
57
2.4.7.- APLICACIONES DE LAS TECNICAS DE FECUNDACION IN
VITRO.
58
3.- FACTORES DE CRECIMIENTO
3.1.- INTRODUCCION.
59
Se han descubierto, hasta la fecha, ms de veinte factores implicados en
mecanismos fisiolgicos tan diferentes como la regulacin de la multiplicacin y
desarrollo de varios tipos celulares, de las funciones inmunitarias y de la
proliferacin y maduracin de clulas sanguneas de las series eritroctica y
linfoctica.
Por otro lado, desde hace, relativamente, pocos aos se ha comprobado que
ciertos FC favorecen la maduracin ha viti-o de oocitos de rata y ratn (Aberdan y
Deckel, 1985; Deckel y Serizly, 1985; Downs, 1989; Pellicer et aL, 1989), hecho
contrastado tambin en otros animales domsticos (Sanbuissho es al., 1990; Das es
al., 1991 y 1992; Illera e: aL, 1992; Sommer es al., 1992; Coskum es aL, 1992).
60
3.2.- FACTOR DE CRECIMIENTO EPIDERMICO (EGE).
61
gonadotropinas y esteroides ovricos (Mondschein y Shomberg, 1981; St. Arnaud
es aL, 1983; Feng es aL, 1987).
62
El EGF acta sobre la maduracin del oocito eliminando las causas que lo
mantienen en reposo meitico, en el estadio de dictiato de la profase 1 (Vescula
Germinal). Las causas que mantienen la detencin meitica del oocito son varias;
entre ellas se indica que la presencia de las prolongaciones intercelulares, entre las
clulas del cmulo y el oocito, que atraviesan la zona pelcida de ste, provocan un
paso de AMPc desde el cmulo al interior del oocito (Hilsenjo e: aL, 1978; Shultz
es al., 1983; Eppig es al., 1983) y estas altas concentraciones de AMPe dentro del
oocito mantienen detenida la meiosis (GV). Moor (1980) indicaron que la activacin
de la meiosis (hecho observable por la desaparicin de la Vescula Germinal) se
inicia con una desconexin entre el oocito y las clulas del cmulo que le rodean.
Este suceso se ha observado en ratona (Eppig, 1982), rata (Deckel y Serizly, 1985),
oveja (Moor y Gandolfl, 1987), cerda (Motlik, 1989) y vaca (Hyttel es aL, 1987).
63
acta defosforilando un componente del factor promotor de la maduracin del oocito
(MPF) (Newport y Kirschner, 1984).
Los estudios sobre la accin ejercida por el EGE sobre los oocitos,
demuestran claramente que la accin de este factor de crecimiento no se ejerce
directamente, sino que se efecta siempre a travs del cmulo celular (Downs,
1988), ya que con oocitos denudados no se observa una respuesta significativa de la
maduracin in vitro cuando se exponen al EGF (Dekel y Serizly, 1985; Sambuissho
et al, 1990; Coskum ex aL, 1992; Das es al., 1992).
64
El IGF-1, tambin denominado Somatomedina C, esun polipptido bsico,
con un p.m. de 7.649 (Rochestein, 1982), presenta una estructura espacial semejante
a la insulina (una cadena peptdica entrecruzada con tres puentes disulfuro), aunque
presenta regiones con residuos aminoacdicos diferentes (Fig. 2). La similitud con
la insulina hace que se produzcan reacciones cruzadas entre ambos (Blundeil y
Humble, 1980) y tambin entre IGF-1 e IGF-2. El IGF-1 circulante en sangre se
encuentra unido a una protena transportadora.
DN
a,
j .11
KW
Al igual que con el EGF, la unin del IGF- 1 con su receptor provoca
acciones de fosforilizacin (Sasaki es al,, 1985). Czech (1982) comprob que la
afinidad del receptor tena el siguiente orden: IGF-1 > IGF-2 > insulina.
65
Se han encontrado receptores para el IGF-1 en gran cantidad de tjidos y
tipos celulares: libroblastos humanos, msculo de ratn, hgado y pncreas, etc.,
entre otros (DErcole y Underwood, 1981; Rosenfleld y Dollar, 1982).
66
acciones ejercidas por la FSH (Hsu y Hammond, 1987). Hammond e: al. (1988)
indican que la produccin y accin del IGF-1 est estimulada por la presencia de
hormonas gonadotropas y ovricas. Por otro lado, la concentracin de IGF-l, en el
lquido folicular, aumenta con el tamalio del folculo (Driancourt, 1991).
Los efectos del IGF-l estn mediados por receptores especficos existentes
en las clulas de la granulosa (Baranao y Hammond, 1984; Adashi es al., 1988).
Entre otras acciones, el IGF-l estimula la actividad de la adenilato ciclasa y la
induccin de la creacin de receptores para LH, en la clula granulosa (Adashi es
al., 1988); por otro lado, la accin favorecedora del IGF-l sobre estas clulas se
pone de manifiesto al ser capaz de estimular la produccin de estradiol, a partir de
andrgenos de origen tecal (Hernndez e: al., 1988).
Por tanto, el IGF-l, secretado por las clulas de la granulosa, potencia los
efectos de la FSH en la aromatizacin y estimulacin de la sntesis de andrgenos
tecales. Adems, la secreccin de IGF-1 ovrica se estimula con niveles crecientes
de gonadotropinas (FSH y LII), pudindose as ampliar las acciones de estas
hormonas a nivel local (Hsu y Hammond, 1987).
67
El IGF-1 y el IGF-2 tienen un efecto positivo sobre la maduracin in vitro
de oocitos de rata (Feng ex al., 1988), a concentraciones de 50 ng/ml. Estos mismos
autores indican que, por el contrario, la insulina no produce accin alguna en este
sentido. Downs (1989) tambin describe una leve accin positiva del JGF-l sobre
oocitos de ratn utilizando concentraciones entre 0,1 y 100 ng/ml.
Existe una gran semejanza estructural y funcional del TGF-a con el EGF;
tanto es as, que incluso se une a los mismos receptores del RiF (Massagu, 1983;
Brucker a al., 1991). El TGF-a se produce en las clulas tecales ovricas y regula
procesos ovricos con acciones mitognicas similares al EGF.
68
El mecanismo de actuacin del TGF-B se ejecuta por una va, no bien
conocida todava, distinta a la de la activacin de una protein-quinasa que es la
comn en el resto de los factores de crecimiento, descritos anteriormente.
Feng es al. (1988) indican un efecto claramente positivo del TGF-B sobre la
maduracin iii visro de oocitos de rata, ejerciendo su accin a travs del cmulo.
Estos mismos autores sealan que la adicin de TGF-B y EGF estimula la
maduracin de los oocitos siempre que el TGF-B se encuentre en pequeas
cantidades, ya que, de lo contrario, a concentraciones mayores a 100 nM, suprime
el efecto del EGF.
Sin embargo, Downs (1989) seala que el TGF-13 no tiene una accin
favorecedora sobre la maduracin iii vftro.
69
reorganiza los filamentos de actina en la mitosis, activa la proliferacin celular de
los tipos celulares que derivan embriolgicamente del mesodermo, como los
fibroblastos, clulas gliales y clulas de la granulosa (Devel y Huang, 1984).
Rappolee es a.!. (1988) y Mercola y Siles (1988) han detectado la presencia de
receptores de membrana para el PDGF en los oocitos de ratn y de ana.
Kimelmann y Kirchner (1987) indican que el ARN-m que codifica parte del
FGF ya se encuentra en estadios embrionarios tempranos. En el adulto, el FGF est
distribuido en muchos rganos como las glndulas adrenales, el ovario, el hgado y
la hipfisis.
70
3.7.- FACTOR DE CRECIMIENTO NERVIOSO (NGP.
Fu aislado por primera vez de la glndula submaxilar del ratn y del veneno
de ciertas serpientes, presentan un p.m. de 26.500 y de 13.000, respectivamente
(Cali ssano e: al., 1984). Presenta receptores de alta y baja afinidad en la membrana
celular y tambin en la membrana nuclear (Yankner y Shooter, 1979).
71
MATERIAL Y
METODOS
MATERIAL Y METODOS.
1. MADURACION IN VITAO.
1.1.- MATERIAL.
1.1.1.- EQUIPO.
Los ingredientes que componen los medios de cultivo se pesan en una balanza
de precisin (Mettler H 72). Para preparar los medios y para el lavado del material
se emplea agua bidestilada y desionizada (WaterPro, Labconco).
73
desactivar ciertas protenas del complemento que tienen efectos negativos en los
sistemas de cultivo in vftro.
74
El transporte de los ovarios desde el matadero hasta el laboratorio se efecta
en un termo (Valira) de 2,5 1 de capacidad, para mantener la temperatura adecuada
y para su diseccin y limpieza se emplean tijeras Pean rectas, previamente
esterilizadas en el autoclave.
75
1.1.2.- MEDIOS DE CULTIVO Y COMPOSICION.
1 Medio de transporte.
NaC 8,000
XCI 0,200
Na
2l{PO, 1,150
KWPO, 0,200
CaCI2 (Anhidr) 0,100
MgCI2+ 6H20 0,100
SFB 2%
Penicilina 100 hL/ml
Estreptomicina 10 mg/ml
Para el lavado de los oocitos se emplea, como medio base, el M-]99 con
sales de Earle (Sigma), (Tabla 2); se le aade 1-Glutamina (20 mM, Gibco),
antibiticos (100 UI/m de penicilina y 10 mg/ml de estreptomicina), 2% de SFR y
sales de Hepes (25 mM, Sigma).
76
Tanto los sueros, como los factores de crecimiento, se incorporan a los medios el
mismo da del cultivo in idtro. Los medios se equilibran, antes de su utilizacin,
durante dos horas como mnimo en la incubadora de CO2.
Sales minerales
77
1.1.3.- PREPARACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO.
Los dos tipos de sueros que se emplean son el SVE y el SFR. El primero se
obtuvo de vacas, 7 horas despus del inicio de los signos psicosomticos del estro
(Kruip, 1988). La sangre, tras su extraccin, se dej reposar en tubos estriles
durante 48 horas a 40C, manteniendo un ngulo de 450, con el fin de obtener el
suero. El SFR lo suministran firmas comerciales ya preparado (Cultek). Ambos tipos
de suero se inactivan al bao mara a 560<?, durante 30 minutos.
Los factores del crecimiento utilizados, EGF (0,1 mg, Sigma Chemical Co.)
e IGF-I (10 xg, Boehringer Mannhein), se solubilizan con 5 mide M-199, sin suero,
se diluyen y alicuotan en tubos plsticos estriles (Eppendorf).
78
1.2.- METODOS.
Una vez en el laboratorio se lavan tres veces con PBS, para eliminar sangre
y adherencias. Para mantener la temperatura de los ovarios, durante su procesado,
se colocan en un vaso de precipitado (con 500 ml de PBS) en el bao termosttico
a 380<?.
79
lavado <LI) y, seguidamente, se cambian de una placa de lavado a otra (LI-L2-L3-
LA y LS); cada una de las placas de lavado tiene 2 ml de medio. Este procedimiento
tiene por objeto eliminar las impurezas que llevan adheridas los oocitos antes de
seleccionarlos y colocarlos en el medio de maduracin.
El paso de los oocitos por las distintas placas de lavado se debe realizar
rpidamente, ya que los gametos femeninos son extremadamente sensibles a los
cambios de temperatura y pH.
80
1.2.2.b.- Clasificacin de los ooctos.
81
1.2.3.- CONDICIONES DEL CULTIVO DE MADURACION.
82
de iniciar el cultivo de maduracin ita vitro.
Tratamiento 1: M-199.
Tratamiento 2: M-199 + EGF (50 ng/mi).
Tratamiento 3: M-199 + IGF-l (100 ng/mI).
83
Grupo III con SVE.
Tratamiento 1: M-199.
Tratamiento 2: M-199 + EGE (20 ng/mI).
Tratamiento 3: 34-199 + EGF (50 ng/mI>.
Tratamiento 4: M-199 + IGF-1 (100 ng/mI).
Tratamiento 5: M-199 + EGF (50 ng/mI) + IGF-1 (100 ng/mI).
84
En este experimento se utilizaron los tres tipos morfolgicos de oocitos (tipos
A, B y C) segn la clasificacin descrita anteriormente (punto 1.2.2.b>.
Con el fin de estudiar adems las acciones de los sueros y los FC, se
emplearon, en la maduracin de cada grupo, los 15 medios descritos en el
experimento anterior.
Se evaluaron un total de L794 oocitos del tipo A, 1.573 del tipo B y 1.607
del tipo C.
85
2. FECUNDACION IN VITRO.
2.1.- MATERIAL.
2.1.1.- EQUIPO.
86
1. Medio de lavado y capacitacin de espermatozoides (SpennTU.
Este medio se ajusta a pH 7,6 <ajustado con 7,5% y/y de bicarbonato sdico,
Younis e: aL, 1989) y una osmolaridad de 295 5 mOs/L. Para la capacitacin de
los espermatozoides se emple el mismo medio, pero suplementado con 100 sg/ml
de heparina sdica (Sigma).
Despus de] periodo de maduracin, los oocitos se lavaron tres veces con este
medio que tiene un pH de 7,4 y 265 5 mOs/L. -
Lavado y Lavado
Ingrediente Unidades Capacitacin oocitos Fecundacin
87
Soluciones stocks
2.2.- METODOS
88
.
Como comprobacin, se descongelaron (390C durante 20 segundos) y
contrastaron algunas pajuelas de las destinadas a utilizar para la FIV, utilizando el
Hamilton Motility Analizer-2000 (Censyra, Colmenar Viejo, Madrid) que
proporcion los siguientes datos:
89
toma una muestra y se comprueba la motilidad de los espermatozoides, en el
microscopio, que no debe ser menor del 60-70%.
90
IV. Induccin a la capacitacin. Uegados a este punto, los espermatozoides
se mantienen 15 minutos en la incubadora de CC, con el fin de &cilitar la
capacitacin y la reaccin acrosmica, favorecidas por la heparina. Durante este
tiempo se efectdan los clculos para averiguar Ja concentracin de espermatozoides.
El recuento de los espermatozoides se efecta mediante una cmara de recuento tipo
Brker, utilizando el siguiente procedimiento:
M es el n0 de esperm.(z)/cuadro (u/25).
50.000/25x106
91
Todos estos clculos tienen como finalidad conseguir que se aada a
las gotas de fecundacin un volumen muy pequeo (entre 2 y 3 1>, para no
cambiar las condiciones fisicoqumicas del medio de fecundacin, ya que ste
est dispuesto en microgotas y, por lo tanto, tiene un volumen muy pequeo
(50~1).
92
2.2.5.- PRUEBAS DE FECUNDACION IN VITRO.
Con el fin de conocer la influencia que las capas del cmulo tienen sobre la
fecundacin, los oocitos fueron distribuidos para la FIV en tres categoras (A, B y
C; punto 1.2.2.b), de acuerdo con la clasificacin seguida segn el nmero de capas
del cmulo.
93
3. FIJACION Y TINCION.
E SIliCONA
e IflITO
LATERAL flOflTAL
94
El siguiente paso es la introduccin del portaobjetos en una cubeta de cristal
con la mezcla fijadora (metanol absoluto-cido actico glacial, 3:1, Merck),
mantenindolos as durante 48 h.
Pasado este periodo de tiempo, las preparaciones estn listas para su Uncin.
El colorante utilizado es la orceina actica (Merk) que se prepara disolviendo 2 g del
colorante en 45 ml de cido actico glacial llevando la mezcla a ebullicin. Una vez
disuelto el colorante, la solucin se enfra completndose el volumen con agua
desionizada y bidestilada en una proporcin 4,5: 5,5. La solucin final se filtra (0,2
de dimetro de poro) antes de almacenara. Conservando la solucin a 40C se puede
utilizar durante tres meses.
95
4.- EVALUACION DE LOS RESULTADOS.
O (No expansin 3
96
Los oocitos valorados por la expansin de su cmulo se fijan y se tillen con
orceina actica para visualizar su estado de maduracin nuclear.
97
del huso acromtico. A veces se puede observar la membrana del primer corp~isculo
polar, aunque el huso acromtico est todava presente.
Penetrados (PEN). Se incluyen a su vez, en este grupo, los oocitos que han
sido penetrados por espermatozoides, distinguindose entre estos los dos criterios
siguientes:
98
un proncleo y una caben de espermatozoide en proceso de
descondensacin. A los oocitos que presentaron esta configuracin se
les denomina fecundados (FEO.
99
1% dc expansin de los oodftos en
100
RESULTADOS
4.- RESULTADOS.
Recuperacin de oocitos.
N ovarios. 131
N folculos aspirados 1.162
N0 folc/ovario s.e.m 8,3 0,9
N0 oocitos recuperados 778
% recuperan. sean. 67,5 3,4
N0 occitos seleccionados (%) 474 (40,7)
Tipo A (50 188 (39,6)
Tipo B (50 150 (32,2)
Tipo C (50 136 (28,3)
N0 oocitos ovario (A+B+C) 3,6
N occitos/ovario (A+B) 2,5
102
De todos estos oocitos recuperados, se seleccionarofl, como aptos para el
cultivo de maduracin iii vitro un 40,7%, divididos en los tres grupos morfolgicos
descritos en el material y mtodos (A, B y C). Para el tipo A, se obtuvo un 39,6%
del total de oocitos recuperados, para el tipo iB del 32,2%, y para el C, el 28,3%.
N ovarios. 630
0 folculos aspirados 4.925
N
N folc/ovario s.e.rn. 7,81,1
N oocitos seleccionados 1.096
Tipo A 1.096
N0 oocitos/ovario (A) 1,7
103
TABLA 6. Recuperacdn de occitas en los experimentos 2 y 3.
N ovarios. 1.962
N folculos aspirados 16.206
W folk/ovario s.e.m. 8,3 0,9
N oocitos seleccionados 6.471
Tipo A (%) 2.326 (35,9%)
Tipo B <%) 2.073 (32,1%)
Tipo C (%) 1.607 <31,9%)
N0 occitos/ovario (A+B+C) 3,2
W oocitos/ovario (A+B) 2,2
104
mnima en el grupo control, aunque aument cuando se utiliz en los tratamientos
con los sueros, obteniendo el valor mximo con el SVE.
105
U
ti 6666 ~6 666 ddc
4~1 -FI +1 +1 +1 ~~ 41 +1 44 +1 +1 +1 +1
o
u o ,- CJ ~ r CJ OJ CM CM &
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(t~ 8c c c
106
Tabla 8.- Nivel de significacin entre los tratamientos de
maduracin in vitro en la expansin del cmulo celular
ME~OT2 T3 T4 TS T6 T7 T8 T9T1OT11T12
Ti * * ** - *** * *** * * **
T2 - - - - - * - - - *
T3 - - * - ** - - - *
T4 - - - - - - - *
T5 * *** - * *
T6 *
T7 * - * - **
T8
T9 *
1
11 *
ir
p<0,OO1; ** p<0,O1 * pcO,05; - P>O05
100
60
40
20
o
Ti 2 3 4 5 6 7 TE TE TO 11 12
m 96 EXPANSION ++~-
107
Tabla 9.- Porcentaje de cocitos expandidos y madurados
en los tratamientos de maduracin n vitro
n=378
IGE-1 (89) 48(54,1 8,1) 57(62,8 7,7)
108
Grfico 1 .- Expansin del cumulo y maduracin in
vitro en los tratamientos de maduracin
loo
go
60
40
20
o
CONT EGF JGF + CONT EGF IGF + CONT E~F GE
M EDI 0~
% EXPANSION U % MADURACION
109
Experimento 2. Efecto de las clulas del cmulo, los factores de
crecimiento y los tipos de sueros en la maduracin in vitro.
Los mejores resultados de maduracin, para los oocitos del tipo B (71,5%
y 69,9%), se consiguieron con el tratamiento 15 (SVEEGF+IGF-1)y con el
tratamiento 14 (SVE+IGF-1), respectivamente. El mayor porcentaje de maduracin
para oocitos del tipo C (49,7% y 48,9%) se alcanz utilizando el tratamiento 9
(SFB+IGF-l) y el tratamiento 15 (SVE+EGFIGF-l),respectivamente.
110
Tabla 1 0,- Estadios de maduracin (% S,E,M,)
en los
tratamientos de maduracin in vitro en loo oocitoe de tipo A
n Deg. GV Ml Mii
111
Tabla 11.- Estadios de maduracin (% S.E.M.) en los
tratamientos de maduracin in vitro en los oocitos tipo B
n Deg. GV Mi Mil
TO 100 7,3 +
_ 1,8 1,8 + 1,9 30,8 +29 60,1 1,2
711 97 9,5 +
__ 1,1 9,2 + 2,2 31,3 3,6 50,0 1,9
712 99 4,7 +
_ 1,3 7,1 + 1,9 36,4 ~30 51,8 3,5
713 69 4,3 +
_ 2,0 3,8 + 2,6 37,4 ~21 54,5 +44
112
Tabla 12.- Estadios de maduracin (% S.E.M.) en los
tratamientos de maduracin in vitro en los ooctos tipo O
n Deg. Gv Ml MII
T8 99 6,6 +
_ 2,5 7,6 1,7 40,8 5,1 45,0 2,4
114 8,2 +
_ 1,0 14,5 + 1,6 27,6 1,3 49,7 +28
TO 140 6,5 +
_ 0,9 5,8 0,8 41 4 + 7,5 46,3 1,6
T 13 66 5,5 +
_ 2,5 58+ 1,9_ 51,1 +42 37,6 + 7,2
T 14 116 8,4 +
_ 1,6 77+ 1,5 37,9 2,7 46,0 +49
113
A) Efecto de las clulas del cmulo.
La Tabla 15 seala las variaciones que existieron entre los tipos 13 y C. Estos
fueron ms evidentes, sobre todo, en los tratamientos que incorporaron EGFIGF-1
(tratamientos 5,10 y 15).
114
Tabla 13.- Efecto de las clulas del cmulo en
los tratamientos de maduracin in vitro
entre los occitos A y 8
12 404+3,5 432~3,3
T3 533+4,4 566~2,2 *
T4 487~4,1 472~52
T5 603~3,7 553+1,6
16 417~4,1 419~1,8
17 623~2,2 543+3,9
18 659~1,4 568~5,0 *
TQ 582~4,6 633~3,6
TO 776~22 601 ~12 **
115
Tabla 14.- Efecto de las clulas del cmulo en
los tratamientos de maduracin in vitro
entre los ooctos tipo A y C
T4 487+4,1 45,43~ *
LS 603+3,7 41,6ZO **
Te 417~4,1 372~2,6 *
T7 623~22 416+4,6 **
T8 659~1,4 450~2,4
TQ 582~4,6 497~2,8
To 776~2,2 463~t6
Tu 456~4,4 389~22 *
116
Tabla 15.- Efecto de las clulas del cmulo en
los tratamientos de maduracin in vitro
entre los oocitos de tipo B y C
117
B) Efecto de los FC.
118
Tabla 16.- Nivel de significacin entre los tratamientos de
maduracin in vitro de oocitos de tipo A
CONTROL T2 T3 T4 T5
Ti * *
72 *
73
74 *
SFB T7 T8 79 710
t6 ** *** **
77
78 **
19 **
712 * **
713 * **
T 14 **
oc
en
60
40
20
o
TI 12 13 14 15 TC 7 8 TS 110 TU 142 143 114 145
E %MADUPAC~ON
119
Tabla 17.- Nivel de significacin entre los tratamientos de
maduracin in vitro de oocitos de tipo B
CONTROL 12 13 14 15
Ti ** *** *
12 ** **
13
14
SFB 17 18 19 110
16 * * ***
17
18 *
19 *
112 * *
113 * *
114
pcO001 ** pc0,01 * pc0,05- p>0,05
ico
90
60
40
20
0
TI T2 13 4 5 TO 17 19 9 TIC III 112 13 14 15
O % MADURACION
120
Tabla 18.- Nivel de significacin entre los tratamientos de
maduracin in vitro de oocitos de tipo O
CONTROL 12 TS T4 15
Ti - -
T2
13
14
SFB T7 T8 19 110
16 . * ** *
17
18
19
112 * *
113 *
114
** * pcO,0D1 ** pcO,O1 * pcO,05- p>O,05
loo
80
60
4947
45,5 45, 46
42,3
40
20
o
Ti T2 T3 T4 5 6 7 18 19 TO 11 112 13 T14 TIS
E % DE MADURACION
121
el que tuvo EGE 20, mientras que, en los oocitos tipo B y C, el que incluy 1GW!
(T 14) fue el que present un valor ms elevado.
En los oocitos del tipo A (Tabla 19), el porcentaje de maduracin fue mayor
en el grupo de tratamientos con SFR que en el grupo sin suero (grupo control). Esta
diferencia fue significativa cuando se utiliz EGF 20, EGF 50 y EGF+JGF-1. En
el grupo con SVE, todos los tratamientos presentaron un ndice de maduracin
mayor que en el grupo control, siendo estas diferencias significativas en todos los
casos. La comparacin entre los dos grupos de tratamientos que incluyeron sueros,
SFR frente al SVE, no present diferencias significativas, salvo en el caso del
tratamiento con EGF 20, que present mayores porcentajes de maduracin in vitro
cuando se utiliz combinado con SF13.
122
Como demuestra la Tabla 21, los oocitos tipo C no mostraron ninguna
diferencia significativa cuando se utiliz cualquier tipo de suero, ni entre los
tratamientos del gmpo control y los de los grupos con sueros, ni entre los grupos
con sueros entre s, a excepci6n de un leve aumento del porcentaje de maduracin
en el tratamiento con SVE+EGF+IGF-l respecto al mismo tratamiento sin suero.
123
Tabla 19.- Nivel de significacin del efecto de los sueros
en los tratamientos de maduracin in vitro en los
oocitos tipo A ($6 S.E.M.)
124
Tabla 20.- Nivel de significacin del efecto de los sueros
en los tratamientos de maduracin in vitro en los
occitos tipo B ($6 S.E.M.)
125
Tabla 21.- Nivel de significacin del efecto de los sueros
en los tratamientos de maduracin in vitro en los
oocitos tipo c ($6 S.E.M.)
126
u.)
1
1-
Cf,
1
o,
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1~
Du~
(flO -~
00 2:
..~ o-..
b.o0
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Sc sc
o
(o o-
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5$
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1-
~0
E
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1
-c
ca
1
o
<o o,o o
127
PRUEBAS DE FECUNDACION PI l/iTR~
% Pre M-ll. Es el porcentaje del cociente entre los oocitos que, al trmino
-
128
56 Poliespennia. - Expresa el cociente entre el nmero de oocitos
poliesprmicos y el de los oocitos designados maduros.
La Tabla 25, indica la significacin estadstica del efecto del suero y los
factores de crecimiento en la fecundacin. Como se puede ver, en los oocitos de los
tipos A y 13, el porcentaje de fecundacin aument, muy significativamente, cuando
los oocitos maduraron en presencia de sueros y factores de crecimiento, frente a los
oocitos madurados en el medio control, sin suero ni factores de crecimiento. La
diferencias, entre los distintos tipos de sueros, slo fueron significativas en uno de
los parmetros evaluados (poliespermia) cuando se utiliz SFR como suero, pero
slamente en los oocitos con cmulo celular.
129
o rc~co~0coc~c~cq
~ -c~ojtco
0
+Ic. +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1
W!lcoco ooc<~co
-cJ
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a) LOCJ
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&cc~&~-i&c
+1 +lcJ +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1
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L0 CO CQCDCJrCJN
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- -
1 +1+1+1+1+1+1+1+1
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130
o
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C CO Lfl~r CJrLOCO
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C/D o Jrr-CJCNJ0CJ
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131
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+1 +1 +1 rrc5JC<~&
+1 +1 +1 +1 +1 +1
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>Cc~jr~. &iKcNjcj
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WS%C~J~tCNJ
o
+1 +Ica +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1 +1
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132
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u- u- o u- O u- u- u-
-J o
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E z O m z z m m
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o Co O u- o u- O LL O u- O u-
a, Dei, O Co o en en o Co o Co O Co Gen
(u
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en Z Co Z CO = Z A
O ~ 5O
a, o ~ O O ~ O
o, E O m 0 W 5 0 W 5 o-
ca sc LU < u- Lii
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4-
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C 4
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1- Co Co Co o
o
O
1- O
H O o-
y
O O O o-
o O O 4
O O O 4<
4
133
>
,
II
134
Tabla 26.- Nvel de significacin del efecto del
cmulo celular en la poliespermia ($6 S.E.M.)
en los oocitos madurados in vitro
% POLIESPERMIA
35
30
25
20
lo
o
CONTROL SFB SVE
U TIPOA U TIPOS U TIPOC
135
Tabla 27.- Nivel de significacin del efecto del
cmulo celular en la penetracin ($6 S.E.M.) en
los cocitos madurados in vitro
96 PENETRACON
80
80
40
20
o
CONTROL epa SVE
ETIPOA~TIPOB ?311P00
136
Tabla 28.- Nivel de significacin del efecto del
cmulo celular en la fecundacin ($6 S.E.M.) de
ooctos madurados in vitro
96 FECUNDACION
70
60
50
40
30
20
10
o
CONTROL SPB + FC SVE +FC
TIPOA!STIPOB ~3TIPOC
137
DISCUSION
5.- DISCUSION.
Por otro lado, los suplementos proteicas de los medios tambin han
demostrado jugar un papel importante en estos sistemas de cultivo, establecindose
que la presencia de las macromolculas aportadas por el suero, son muy beneficiosas
para el desarrollo y maduracin del oocito (Xu a aL, 1986; Sanbuissho y Threlfall,
1989). Los papeles que puedan jugar estos dos grupos de componentes, factores de
crecimiento y sueros, en los sistemas de maduracin y fecundacin in virro de
oocitos bovinos, son un paso ms para aclarar, en lo posible, los mecanismos que
intervienen en estos procesos.
139
1.- OBTENCION DE OVARIOS Y OOCITOS.
La obtencin de los ovarios desde que los animales fueron sacrificados fue
lo ms rpida posible y, desde este momento, se intent mantener la temperatura
constante (ya que las oscilaciones trmicas pueden daar a los oocitos, First y
Panish, 1987) en todos los pasos de los procesos de maduracin y fecundacin Pi
virro. Por esta razn, se transportaron los ovarios en un termo con PBS a 380C, de
acuerdo a lo que sealan otros autores (First y Parrish, 1987). El tiempo empleado
en trasladar los ovarios hasta el laboratorio tambin es un parmetro importante y
la mayora de los trabajos publicados hacen referencia a un tiempo inferior a las 5
horas (Katska y Smorag, 1984; First y Parrish, 1987); en nuestro caso, por estar el
matadero relativamente cercano a nuestro laboratorio, se tardaba, normalmente, un
tiempo inferior a la hora y media desde la obtencin de los ovarios hasta llegar al
laboratorio. Cuando los ovarios van a permanecer un tiempo almacenados antes de
su utilizacin -por ejemplo si el matadero se encuentra muy lejos del laboratorio- es
preferible conservarlos a 20C, ya que, se ha demostrado que mantenindolos a
390C o 40C se producan peores resultados de maduracin y fecundacido que a
200C (Yang el aL, 1990).
140
El traslado de los ovarios se efecta normalmente en soluciones salinas con
una suplementacin de antibiticos, para evitar en lo posible la proliferacin
bacteriana. Otros autores han empleado simples soluciones salinas fisiolgicas para
este traslado (Leibfried-Rutledge et al., 1987; Sirard, 1989) pero en cualquier caso
siempre suplementada con antibiticos. En nuestro trabajo se prefiri hacerlo con
PBS a 38-390C ya que, adems de la temperatura, juzgamos importante la opacidad
tampn de esta solucin para impedir oscilaciones bruscas del pH.
141
:11
lo menos posible desde que se obtienen los ovarios hasta que los oocitos se
introducen en el medio de maduracin. Por otro lado, la ventaja que supone la
diseccin de folculos en la totalidad del ovario y, de este modo, conseguir un mayor
nmero de oocitos, queda neutralizada frente a la tcnica de la aspiracin de
folculos, aunque sean superficiales, al sealar, varios autores que, los oocitos
obtenidos por diseccin, tienen una capacidad de madurar y desarrollarse in viti-o
menor que los procedentes de la puncin y aspiracin folicular (Arlotto e: aL, 1990;
Taikagi a aL, 1992).
Como medio de lavado de los oocitos se emple el mismo medio (M- 199)
que en la maduracin Pi vitro posterior, suplementado con un pequeo volumen de
SFB (2%) y con sales de HEPES (25 mM); la presencia de suero tuvo por objeto
asegurar el aporte proteico de los oocitos durante el tiempo que se tard en lavarlos
y seleccionarlos mientras que, las sales de HEPES, tuvieron por objeto mantener el
pH del medio dentro de los valores fisiolgicos, ya que, sin CO2, estas sales tienen
142
un comportamiento tampn mejor que el del bicarbonato sdico, que es el que se
utiliza en el medio de maduracin.
143
embargo, estos mismos autores, no llevaron a cabo una seleccin posterior de los
oocitos, para descartar aquellos que no sean aptos para la maduracin, hecho que en
nuestro estudio se consider fundamental ya que, prcticamente todos los autores,
sealan que la seleccin de los oocitos antes de la maduracin in viti-o es muy
importante para asegurar el xito de la misma (Leibfried y First, 1979; Fukui y
Sakuma, 1980; First y Parrish, 1987; Gordon, 1990; Herlerr e: aL, 1992).
144
La clasificacinde los oocitos para la maduracin in viti-o se hizo de acuerdo
al nmero de capas que present el cmulo celular. Se efectu de esta manera para
tratar de evaluar, en lo posible, si la seleccin de los oocitos, en base a esta cualidad
morfolgica y dependiendo de las caractersticas del medio de cultivo empleado,
poda influir tanto en la maduracin como en la fecundacin br viti-o. Este objetivo
ha sido estudiado por diversos autores, aunque con algunas variaciones respecto a
la clasificacin del cmulo celular y la composicin de los medios de cultivo
empleados en nuestra experimentacin <u ti al., 1986; Lonergan e: al., 1991; De
Laos e: al., 1992). En cualquier caso, los oocitos, cualesquiera que fuera el tipo de
cmulo celular, fueron seleccionados en base a la integridad del cmulo y
citoplasma, cuestin que la mayora de los autores establecen prioritaria y
fundamental antes de comenzar el cultivo de maduracin in vfrro (~<u et al., 1986
y 1987; Shioya el al., 1988; Younis e: aL, 1989; Lonergan e: aL, 1991; De Laos
e: al., 1992; Herlerr el aL, 1992).
145
microgotas; el volumen fue de 50 1 por su facilidad de manejo y se utilizaron
placas Petri de 9 cm de dimetro, en lugar de las placas de 3 cm empleadas por
otros autores, ya que, podan contener un mayor nmero de microgotas de acuerdo
con el nmero de oocitos empleado, sin ser excesivamente grandes para manejarlas.
dos horas, por lo menos, antes del comienzo de los periodos de cultivo. Este tiempo,
que en algunas ocasiones incluso fue mayor, asegur que el medio de cultivo
adquiriera -se equilibrara- las caractersticas de temperatura y atmsfera gaseosa del
ambiente que le rodeaba; de esta manera se procur que, los oocitos y los
espermatozoides, no sufrieran cambios bruscos de sus condiciones fisicoqumicas.
Se dispusieron un nmero de 5 oocitos por microgota que, de acuerdo con otros
autores (Shioya e: al., 1988; Rose y Bavister, 1992), permiti un aporte de los
componentes de los medios adecuado a cada oocito.
Adems del medio bsico de cultivo (M-199), los distintos tratamientos a los
que se sometieron los oocitos para su maduracin Pi vitro, estaban suplementados
con sueros y factores de crecimiento (exceptuando el tratamiento 1 que slamente
se formul con M-199), en unas cantidades que, seguidamente, se van a indicar:
146
Rutledge et al., 1986; Sanbuissho y Ibrelfal, 1989; mm, 1990) que, dentro de unos
lmites de variacin deI 10% al 20%, sealaban que la dosis ms efectiva era un
10% y/y de suero en el medio. Sanbuissho y Threlfall (1989) sealaron que es ms
lgico utilizar en los sistemas de maduracin SVE que el SFR ya que, en
condiciones Pi vivo, el oocito recibe durante la maduracin el apone de sustancias
nutritivas maternas de origen srico.
147
se eligi esta concentracin en el medio de maduracin En W para que, como en
el caso del EGF, se imitan en lo posible las concentraciones que el IGF-l presenta
En vivo. En estudios recientes donde se ha utilizado IGF-l como componente del
medio de maduracin (Herler et aL, 1992), se emple una dosis de 50 ng/m,
aunque en dicho trabajo, se escogi dicha concentracin de acuerdo a su influencia
sobre los cultivos de clulas granulosas, no en relacin a estudios de maduracin in
viti-o de oocitos y, adems, slamente se evalu la influencia de dicho factor sobre
la expansin del cmulo celular y sobre el desarrollo embrionario posterior, pero no
sobre la maduracin y la fecundacin En viti-o antes del comienzo del desarrollo
embrionario.
148
e.- Criterios de maduracin iii viti-o.
149
En condiciones in viw, las clulas del cmulo comienzan su expansin
despus del pico de las gonadotropinas, justo antes de la ovulacin. En los oocitos
bovinos, esta expansin comienza debido a la actuacin de la FSH, que efecta su
accin mediante un mecanismo en el que est implicado el AMPc. La importancia
dada a la expansin del cmulo celular se debe a que estas clulas actan como
intermediarios de la accin ejercida por las gonadotropinas, hormonas esteroides,
factores de crecimiento y otros compuestos intrafoliculares que, mediados por
mensajeros celulares (AMPc, calmodulina, Ca2~), ejercen acciones sobre el oocito
(Hyttel, 1988; Gonqalves y Graves, 1992).
Algunos autores, sealan que esta similitud entre expansin del cmulo y
maduracin del oocito, puede ser un indicador de la maduracin del mismo. En
nuestro trabajo, se ha medido la influencia que los sueros y factores de crecimiento,
conjunta y separadamente, tienen sobre el grado de expansin del cmulo celular,
para despus indicar la relacin existente entre ste y la maduracin del oocito.
Los autores que han estudiado este proceso han clasificado la expansin
sufrida de vahos tipos: Hensleigh y Hunter (1983> lo hacen en tres categoras de
acuerdo al grado de expansin del cmulo (1 a 3) comparado con la expansin de
los oocitos madurados in vivo a los que dan un valor de 4. Behnke (1987) lo hace
en tres categoras. Downs (1988) seala 5 tipos de expansin (de O a 5) de acuerdo
150
al tamao del cmulo. Musse (1990) clasifica la expansin del cmulo en 4
categoras (de O a 3) de acuerdo a su grado de mucificacin. En nuestro trabajo se
clasific la expansin del cmulo celular de acuerdo a la relacin entre ste y el
tamao del oocito, de modo que la expansin mxima (+ + +) fue aquella que
present un dimetro de ms de tres veces el del oocito, similar al criterio de
Behnke (1987).
151
pero no sealan si ese valor es de expansin mxima o slamente de expansin del
cmulo (Schellander e: al., 1990); en este ltimo supuesto, el valor alcanzado en
nuestro trabajo, en dicho medio, fue del 86,3%.
Otros autores han evaluado el grado de expansin del cmulo celular cuando
sometieron los oocitos a un medio de maduracin iii vftro con suero y hormonas
gonadotropas (FSH y LH). Olson e: al. (1990) obtuvieron un 64% de expansin
mxima, al utilizar SFR y FSH, mientras que Annstrong e: al. (1991), tambin con
FSH, consiguieron un 100%, pero no sealaron que grado de la misma alcanz el
cmulo celular; sin embargo, Zuelke y Brackett (1990) demostraron que
suplementado el medio con LH, la expansin producida fue mucho menor a la
inducida por la FSH, pero el oocito no perda su capacidad de madurar En viti-o.
Younis y Rrackett (1992) indicaron que el medio de maduracin suplementado con
SFR + TSH permiti lograr un 64% de expansin mxima, con lo que mostraron
que la TSH tambin tuvo un efecto positivo en la expansin del cmulo de oocitos
bovinos frente a los tratamientos sin esta hormona. En la especie porcina, Musse
(1990) obtuvo los mayores ndices de expansin del cmulo celular cuando utiliz,
en el medio de maduracin, una suplementacin de suero de cerda en estro (10%),
FSH (5 gg/ml) y LH (1 Lg/ml).
152
como cuando el medio llev SFB o SVE. Las diferencias, entre los dos factores de
crecimiento utilizados, se evidenciaron ms en el gmpo de tratamientos que no
incluyeron sueros. En ellos, el EGF present el valor ms alto, 46,5% de expansin
mxima, mientras que el IGF-1 mostr un valor sensiblemente inferior (28,7%),
aunque provoc una expansin total (suma de los criterios +, + + +++ +) mayor
que la del control. La adicin conjunta de los dos factores de crecimiento mostr una
expansin mxima inferior a la que produjo el EGF slo (42,8% frente al 46,5%),
pero el total de los oocitos con expansin del cmulo s que fue mayor.
153
menores a los de nuestro trabajo, aunque creemos que ello puede ser debido a que
utilizaron en sus medios de maduracin 50 ng/ml de IGF-l, la mitad de la
concentracin que se utiliz en este trabajo.
154
existi una relacin estrecha con el Indice de expansin. Curiosamente, estos
tratamientos son adems los que, dentro de su mismo grupo, presentaron los Indices
de expansin y maduracin ms altos.
155
especialmente la adicin conjunta de ambos factores con sueros. El conjunto de
nuestro experimento nos hace estar de acuerdo con los autores que indican que la
expansin del cmulo no es un parmetro absolutamente vlido de la maduracin in
vitro del oocito, sobre todo al utilizar lGF-l, pero por otro lado, al emplear otros
tratamientos si se encontr cierta relacin entre la expansin y la maduracin. Por
todo ello y en esas determinadas circunstancias, parece adecuado afirmar que, la
valoracin de la expansin del cmulo celular, es un parmetro fiable y, sobre todo,
permite que, sin destruir el oocito por medio de las tcnicas de fijacin y tincin,
se pueda obtener una aproximacin del comportamiento que han tenido tras el
periodo de maduracin in vitro.
Este hecho tiene especial importancia cuando los oocitos madurados in vim
estn destinados a los sistemas de fecundacin itt vitro y, por lo tanto, no pueden
destruirse para averiguar su estado de maduracin; de hecho, uno de los factores que
tienen en cuenta ciertos autores a la hora de elegir oocitos para FIV, despus del
periodo de maduracin itt vitro, es el grado de expansin del cmulo celular (Rail
a al., 1983; Behnke, 1987; Sanbuissho y Threlfall, 1989; Farin, 1991; Pavlov es
al., 1992).
156
3.- MADURACION Al VITRO.
157
En los oocitos del uzo A, los datos de maduracin in vitro obtenidos en los
tratamientos controles (T-l, T-6 y T-1 1) fueron los siguientes:
158
utiliza, como fuente proteica, suero de origen sanguneo, SFR o suero en estro
homlogo de la especie, como en el ratn (Eppig, 1989) o en el cerdo (Musse,
1990; Coy, 1992).
Los datos obtenidos en el tratamiento con SVE (45,6%) fue ms alto que el
presentado con SFR y, sobre todo, con el control. Este valor fue ms bajo que el
69,9% que presentaron Sanbuissho y Threlfall (1989) y el 59,2% de Younis el al.
(1989). Probablemente, las diferencias que se pueden observar con los resultados de
otros autores, pueden deberse al mtodo de obtencin y preparacin del suero ya
que, por ejemplo, Schellander e: al. (1990) obtienen el suero de vacas sometidas a
tratamientos de superovulacin, lo cual, modifica las concentraciones hormonales del
suero. Por otro lado, tampoco sealan la aptitud ni la dieta de los animales utilizados
para obtener el suero, lo cual puede tambin, influir en las concentraciones
hormonales de LH, progesterona y estradiol sobre todo (Folman er al?, 1983).
159
hormona puede influir tambin en el aumento de los resultados de maduracin
cuando se utiliza SVE.
160
Xu e al. en 1986, este hecho se deba, probablemente, a que las pocas clulas que
existen en estos oocitos pueden trasladar cienos componentes sricos al interior del
occito y, aunque no se aumenta e] nmero de oocitos maduros, s que permite un
menor porcentaje de degeneracin.
Las Tablas 19, 20 y 21 muestran el efecto de las clulas del cmulo en los
porcentajes de maduracin iii vitro, dependiendo del tipo de oocito y del tratamiento
empleado. En todas ellas lo que ms resalta es la gran diferencia que existi entre
los oocitos que tenan todo o parte del cmulo celular y los oocitos denudados. En
concreto, los porcentajes de maduracin fueron considerablemente mayores, excepto
el tratamiento con 20 ng/ml de EGF sin suero, en los oocitos del tipo A frente a los
del tipo C, especialmente, en los medios que llevaron los dos tipos de FC a la vez
y 50 ng/ml de EGF. El comportamiento entre los oocitos del tipo R y C es similar
al indicado anteriormente, aunque las diferencias no son tan acusadas ni se
produjeron en todos los tratamientos.
La razn de este efecto puede ser, de acuerdo con lo sealado por varios
autores (Downs e: al., 1988; Sirard et al., 1992) que los compuestos que mantienen
detenida la meiosis provienen del cmulo celular y pasan al oocito gracias a las
uniones existentes entre ste y las clulas que le rodean. Cuando llega una sustancia
que interrumpe ese flujo de compuestos inhibidores hacia el oocito, esta
comunicacin cmulo-oocito se corta y el oocito se encuentra libre para reanudar la
meiosis. Por lo tanto, en los oocitos denudados, al no existir cmulo celular, no se
pueden ejercer esas acciones, debiendo estar a merced de los estmulos transmitidos
por receptores de la propia membrana del oocito (Downs el al., 1988) o por las
pocas clulas de granulosa que rodean al gameto y puedan ejercer pequeos efectos
estimulatorios sobre la maduracin. Las acciones ms especficas de los factores de
crecimiento se discutirn en las pginas siguientes.
161
Accin de los factores de crecimiento en la IVM.
los que no se utiliz suero, en los oocitos de tipo A, con cmulo celular completo
(Tabla 10), el tratamiento con 20 ng/ml de EGF fue el que peor compoflamiento
tuvo y prcticamente no se diferenci del tratamiento control (40,4% y 36,5%,
respectivamente). El tratamiento con 50 ng/ml de EGF s tuvo, por el contrario
diferencias significativas frente al control (53,3% frente a 36,5%). Este hecho
coincide con un efecto dosis-respuesta para el EGF, que ya ha sido sealado por
162
varios autores, uno de ellos en la maduracin de oocitos de ratona (Downs, 1989)
y el otro, con oocitos bovinos (Sanbuissho e: al., 1990). En ambos casos, de igual
manera que en nuestro trabajo, al utilizar dosis de EGE cercanas a los 50 ng/mI, se
observ un mayor Indice de maduracin y de GVRD; este hecho sin embargo
contrasta con la concentracin utilizada por Sommer e: al. (1992) en la maduracin
itt vitro de oocitos porcinos, donde seliala que 10 ng/ml e incluso menores, ejercen
mejores acciones que dosis ms altas. Estos mismos autores fundamentan su eleccin
en que, a dicha concentracin, se produce una mayor incorporacin de aminocidos
al interior del oocito porcino; sin embargo, otros autores que tambin han trabajado
en la misma especie, sealaron que la dosis ms adecuada para conseguir la
maduracin itt vitro fue de 50 ng/ml (Illera e: al., 1992).
Los porcentajes de maduracin obtenidos con el EGF son similares a los que
obtuvieron en oocitos bovinos, con la misma dosis aunque con un medio distinto
(Ham F-12), otros autores. En concreto, Sanbuissho e: al. (1990) obtuvieron un 85%
de GVBD frente al 85,2% de nuestro trabajo, mientras que Coskum el al. (1991)
obtuvieron un valor de maduracin ms alto que en nuestro estudio (79%) tambin
con un medio de cultivo distinto (DME/F-12). Los mayores porcentajes de
maduracin de oocitos en la bibliografa consultada corresponden a los ofrecidos por
Deckel y Serizly (1985) y Downs (1989), ambos con valores del 100% de GVRD,
en oocitos de rata y ratona, respectivamente. Este porcentaje tan alto pudo deberse
a dos causas: la alta especificidad entre el EGF utilizado (estos autores escogieron
EGF de origen murino) que, adems de este valor de maduracin, permiti un valor
de expansin del cmulo celular cercano tambin al 100%, y tambin pudo ser
debido a que en el mecanismo de detencin/activacin meitica del oocito de estas
especies animales, el AMPc juega un papel esencial; esto no ocurre as en la especie
bovina (Sirard 1992) donde, adems del AMPc, otra serie de sustancias se
comportan como inhibidores potentes de la reanudacin meitica (adenosina,
hipoxantina) sobre las que, probablemente, el EGF no acta de igual manera.
163
1986); este compuesto pasa, a travs de las uniones intercelulares, al cocito y lo
mantiene en reposo meitico. Cuando se interrumpen estas uniones, se corta el flujo
de AMPc, activndose una seal que implica la entrada del oocito en meiosis. Este
mecanismo de actuacin se apoya en que, como seala Downs (1989), el EGF es el
FC que produce una mayor expansin del cmulo, de manera an~Ioga a la FSH; de
esta manera, al igual que indic Pellicer e al. (1989), la actuacin del EGF puede
comenzar interrumpiendo la accin de esta hormona sobre el cmulo celular, bien
directamente o utilizando su mismo mecanismo de actuacin, obteniendo como
resultado una disminucin en las concentraciones de AMPc. Adems, el EGF
tambin presenta ciertas acciones similares a las de la LH, tal y como afirman
Deckel y Serizly (1985), una de cuyas acciones sobre la maduracin del oocito, entre
otras, consiste precisamente en interrumpir las comunicaciones entre el cmulo
celular y el oocito.
164
posterior, aunque en su trabajo ofrecen slamente datos sobre el desarrollo
embrionario temprano. Estos mismos autores sealan que este factor de crecimiento
puede actuar mediante las clulas de la granulosa o directamente en el oocito. En
nuestro trabajo, de la misma manera que lo sealado por Downs (1989> en los
oocitos de ratona, observamos un menor efecto en la maduracin cuando se utiliz
IGF-1 frente al EGF, pero el porcentaje de maduracin que obtuvo este autor <66%
de GVBD) fue menor que el conseguido en nuestro trabajo (79% de GVRD) con
idnticas concentraciones de IGF-1. En la rata, Feng eta!. (1988) lograron un 70%
de GVBD, aunque utilizaron 50 ng/ml de IGF-1.
La accin por la que el IGF-l acta sobre la maduracin del oocito no est
todava aclarada. Adashi eta!. (1988) seal que este factor decrecimiento, actuaba
a nivel del cmulo celular inhibiendo la actividad del AMPc e induciendo la creacin
de receptores para la LH, de manera parecida a la FSH; pero parece que el IGF-1
ejerce fundamentalmente su actividad directamente sobre el mismo oocito,
interviniendo en la regulacin de procesos de transcripcin de ADN y de sntesis de
protenas citoplsmicas, que, por otro lado, todava son desconocidas (Zumstein y
Stiles, 1987). Recientemente, Hainant er al. (1991), han sealado que tambin el
IGF-l defosforiliza un componente proteico del MPF, lo que puede explicar su papel
en la maduracin.
165
vitro de oocitos, salvo una comunicacin personal de Illera <1992) en oocitos
porcinos. En la bibliografa consultada, Feng e al. (1988), utilizaron conjuntamente
IGF- 1 y TGFB en el medio de maduracin de oocitos de rata, obteniendo un leve
efecto positivo. En el ovario los factores de crecimiento aculan de manera
coordinada (Hill, 1989) para producir los correspondientes efectos biolgicos y, por
lo tanto, es lgico pensar que, la suma de dos factores de crecimiento de acciones
no antagnicas, puede aumentar los valores de maduracin y fecundacin itt vftro;
de esta manera, el efecto ejercido por ambos factores podra explicarse por una suma
de sus mecanismos de accin, a nivel de cmulo celular (EGF) y directamente sobre
el propio oocito (IGF-l). Recientemente, Angervo el al. (1992) indicaron que la
presencia de EGF estimula la produccin de una protena relacionada con el IGF- 1
por parte de las clulas de la granu]osa. Este hecho, que es tiempo dependiente y
tarda unas 24 horas en completarse, podra explicar tambin el efecto producido por
ambos FC ya que, en nuestro trabajo y en lo comunicado por Illera (1992), el
tiempo de maduracin de los oocitos es de 24 y 42 horas, lo que da lugar a que se
ejerza un efecto positivo por esta causa.
Por otro lado, nuestros resultados (Tabla 10) indicaron que 50 ng/ml de EGF
provoc la maduracin itt vitro mejor que cuando se utiliza medio con sueros (SFR
y SVE), que en nuestro estudio fue: con EGF 53,3%, con SFB 4 1,7% y con SVE
45,6%. Cuando se utilizaron ambos FC, los valores tambin superaron los datos
anteriormente mencionados eincluso a los tratamientos que llevaron suero ms algn
factor de crecimiento (IGF-1+SFB y EGF 20+SVE, 48,7% y 53,3%,
respectivamente).
166
tratamientos. Este hecho particular, podra explicarse porque la acci& de los dos
factores de crecimiento necesita de un cmulo celular completo y, por esto, ya que
la dosis de EGF empleada en ambos casos es idntica, puede que el IGF-l no pueda
actuar o que exista algn tipo de bloqueo o competencia en los mecanismos de
actuacin de ambos factores. En cualquier caso, la utilizacin de 50 ng/ml de EGF,
slo o con IGF- 1, super los tratamientos controles con SFR y SVE, con lo que se
demuestra que, en este tipo de oocitos, el tratamiento con RIF produce un
porcentaje mayor de maduracin ti viro que los medios que contienen slamente
sueros.
167
b. Tratamientos con SFR.
-
En los oocios del tipo A, todos los tratamientos que incluan FC tuvieron
porcentajes de maduracin significativamente ms altos que el tratamiento control
(slamente con SFB), segn se demuestra en la Tabla 13. El valor mximo de todo
el trabajo se alcanz al utilizar la adicin conjunta de los FC (77,6% de maduracin
y 92% de GVBD) y slamente un 2,9% de los oocitos no tuvieron ningn estmulo
y permanecieron en estadio de GV. Los dos tratamientos con EGF fueron superiores
al que llev IGF-1, que slamente super al tratamiento control.
Estos datos demuestran claramente que el SFB junto con los factores de
crecimiento aumentan significativamente los ndices de maduracin ir vro respecto
al grupo de tratamientos sin suero, como se indica en la Tabla 16. En todos los
tratamientos, los valores fueron ms altos cuando se incluy SFB en el medio de
maduracin.
Las difencias entre los medios del grupo con SFB y los mismos medios pero
del grupo sin sueros, estn reflejadas en la Tabla 17, en ella se demuestra que todos
los tratamientos tuvieron valores mayores cuando se utiliz SFB, aunque slamente
significativos en el tratamiento con la adicin conjunta de ambos factores de
crecimiento.
Ett los oocftos del tipo C slamente el tratamiento con IGF-1 y con ambos
FC a la vez fueron ligeramente superiores a los dems, aunque los valores
168
estuvieron muy prximos entre si (45 %-40,7%). Este ligero aumento pudo
ocasionarse debido a las clulas del cmulo que algunos oocitos presentaban, que
pudieron inducir algn estimulo positivo. Un comportamiento similar a este, aunque
utilizando un medio con hCG y estradiol, fue descrito por Xu el al. (1986). Los
valores de maduracin en este tipo de oocitos, no presentaron diferencias cuando se
compararon los tratamientos del grupo sin suero y los del grupo con SFB.
De otra parte, los datos obtenidos en nuestro trabajo mostraron que el IGF-l
present un mejor porcentaje de maduracin en el tratamiento con SVE que con el
SFR; en este sentido Ganong (1991), seala que existen relaciones entre las acciones
de la TSE y el IGF-1; por otro lado, el SVE empleado en nuestro trabajo, tiene
mayor cantidad de TSH que el suero fetal (2,8 pU/ml frente a 1,3 pU/m,
respectivamente), por lo tanto, estos datos, pueden justificar el aumento del
porcentaje de maduracin producido por el IGF- 1 + SVE que cuando se utiliza IGF-
1 + SFB. Adems, uno de los efectos que produce el IGF-l en las clulas de
169
granulosa es aumentar el nmero de receptores para la LH, como han seilalado
tambin Herlerr el aL (1992). Por esta razn, al utilizar SVE, que tiene mayor
concentracin de LH que el SFB, tal y como indicaron Younis el al. (1989), se
produjo un aumento en los valores de maduracin itt virro. Estos resultados del IGF-
1 se observaron slamente en los oocitos con capas completas de cmulo celular (A
y B), pero no en los denudados (C) ya que, la accin en la maduracin del oocito
producida por la LH, necesita del cmulo celular para efectuarse, tal y como han
sealado autores que slamente emplearon LE en sus medios de maduracin
(Brackett e al., 1991).
Ett los oocitos del tipo fi los mejores valores de maduracin se lograron con
la adicin a la vez de ambos factores de crecimiento (71,5%), que fueron ms altos
que el resto de los tratamientos, de manera anloga a lo que sucedi en los oocitos
del tipo A; sin embargo, y de la misma manera que ocurra en el grupo de
tratamientos con SFR, el siguiente tratamiento en producir mejor resultado de
maduracin ir vino es el que ]lev IGF-l, debido, probablemente, a las mismas
razones explicadas anteriormente. El grupo de medios con SVE mostr mayores
porcentajes de maduracin, respecto del grupo con SFB, en los tratamientos sin
factores de crecimiento, IGF-l y con los dos FC conjuntamente.
170
De acuerdo con Downs e al. (1988) las hormonas, sobre todo la LH y FSH,
actan sobre el oocito mediante mecanismos parecidos y mediados por el cmulo
celular. Este mismo autor seala que, el AMPCZ, uno de los inhibidores ms potentes
de la reanudacin meitica, esta generado por las clulas del cmulo, no por el
oocito; ademas demostr que, despus de adminstrar hormonas, los oocitos
maduraron y en el cmulo celular se produjo un aumento de las concentraciones de
AMPc, con lo que cuando se interrumpe el paso de AMPc al oocito, debido a la
accin de hormonas presentes en el medio de maduracin, este puede madurar. Por
ello, autores que han utilizado oocitos bovinos sin cmulo celular en medios de
cultivo con hormonas y sueros (Leibfried y First, 1979; Xu el al., 1986) han
demostrado que, este tipo de oocitos, tienen muy comprometida su capacidad para
reanudar la meiosis, siendo sus resultados de maduracin, menores que los
mostrados por oocitos con el cmulo completo.
171
Hasta el momento, la mayora de los estudios sobre la maduracin itt vino
de oocitos bovinos se efectuaban suplementando los medios de cultivo con sueros
(SFR y SVE) y con hormonas, esencialmente LH, FSH y estradiol 178 (BalI e: aL,
1983; Hensleigh y Hunter, 1985; Younis e: aL, 1989). Estos autores evaluaron el
efecto de esta suplementacin hormonal en la maduracin nuclear (Fukui e al.,
1982, Xu e: al., 1986) y en la fecundacin ir vitro (Funakashi y Fukui, 1985;
Hensleigh y Hunter, 1985; Younis e: al., 1989).
Esta cierta similitud entre los efectos producidos por los factores de
crecimiento y las hormonas sobre la maduracin puede deberse a que, como
sealaron Downs e: al. (1988), ciertos mecanismos de actuacin celular son
anlogos, sobre todo los relativos al papel jugado por el AMPc; por ello, parece
172
claro que, estos dos tipos de reguladores ovricos, que itt vivo probablemente ejercen
funciones sinrgicas (Hill et al., 1989), utilicen parecidos mecanismos de actuacin
celular, aunque la utilizacin de los FC suponga una mayor especificidad de la
accin sobre el cmulo celular (EGF) y sobre el citoplasma (IGF-l) del oocito que
la accin hormonal.
Por todo lo expuesto, se puede decir que el papel que los factores de
crecimiento juegan, principalmente, en la maduracin itt vivo del oocito bovino,
puede trasladarse a los sistemas de maduracin ir vitro, presentando resultados en
los porcentajes de maduracin anlogos que cuando se utilizan, para el mismo fin,
hormonas o cocultivos con clulas granulosas.
173
a.- Metodologa.
174
Rutledge eta!., 1989; Fukui, 1989; Fukui, 1990).
175
b.- Criterios de fecundaci6n 1,, vw.
176
penetracin similar (69,3%). Este tipo de oocito es el que normalmente emplean la
mayora de autores en sus medios de fecundacin y desarrollo itt vitro. Hay que
hacer notar desde un principio que, en la bibliografa consultada, no existi ningn
trabajo con resultados sobre la fecundacin itt vi:ro de oocitos bovinos madurados
br vro en presencia de factores de crecimiento y sueros, por lo tanto, los resultados
obtenidos se compararti con los que otros autores han obtenido con otros sistemas
de maduracin y fecundacin.
177
la granulosa.
Los ooci:os del tipo B presentaron valores de penetracin ms bajos que los
del tipo A, existiendo diferencias ms acusadas entre los oocitos que maduraron con
SFB+FC (59,5%) y los que lo hicieron con SVE+FC (50,5%). Hay pocos trabajos
que evalen la maduracin y fecundacin itt itro en este tipo de oocito, xi pocas
capas del cmulo celular desde el comienzo del cultivo de maduracin; la mayora
de los autores que valoraron la penetracin espermtica en este tipo de oocitos, lo
hicieron quitndole parte del cmulo, pero despus del periodo de maduracin, con
lo que el oocito madur realmente con el cmulo completo. Shioya el aL (1988)
sealaron, en estos ooctos, un porcentaje de penetracin muy elevado (85,8%),
similar incluso a los obtenidos con oocitos con cmulo completo. Kim y Park (1992)
obtuvieron tambin valores ms elevados (74%) que los alcanzados en nuestro
trabajo.
Los valores de penetracin en los oocItos del tipo C fueron mucho ms bajos
que los de los oocitos con cmulo. El mayor porcentaje (32%) se present en los
oocitos madurados con SFB+FC. Los autores que fecundaron itt virro occitos de
este tipo obtienen, en todos los casos consultados, porcentajes ms altos que los
obtenidos en este trabajo: BalI e: al. (1983), 57%; Younis y Brackett (1992), 50%
y Kim y Park (1990), 48%; aunque estos autores tambin quitaron las capas del
cmulo de los oocitos despus de la maduracin itt vitro, con lo que no evaluaron
correctamente la capacidad del propio oocito denudado y, de esta manera, los
porcentajes de fecundacin son ms altos debido a que las cifras de maduracin de
estos oocitos son considerablemente mayores que cuando se cultivan desde un
principio ya denudados, como en nuestro trabajo.
178
(Leibfried-Rutledge e: al., 1986). Otros autores que utilizaron tambin sueros,
hormonas y cocultivos de granulosa (Lutterbach e: aL, 1987; Fukui y Ono, 1989)
o sueros y hormonas (Stubbings el al.> 1988; Kim e: aL, 1990) presentaron
porcentajes similares, mientras que, Coskum e: al. (1991) obtuvieron un ndice de
fecundacin del 58% utilizando en el medio de maduracin 50 ng/ml de EGF. Olios
autores, sin embargo, utilizando hormonas y sueros para la maduracin y la misma
tcnica de capacitacin que nuestro trabajo, obtuvieron unas mayores cifras de
fecundaciones normales (Lu e: aL, 1987; Lu y Gordon, 1988; Schellander et al.,
1990; Fukui, 1990) aunque la mayora de ellos, salvo excepciones, obtuvieron
porcentajes que no sobrepasaron el 65%, lo cual hace que la diferencia con nuestros
resultados no sea considerable.
c. Poliespermia de los oocitos. Tanto en los oociros del tipo A como en los
-
del tipo B, los porcentajes de poliespermia fueron mayores en los tratamientos con
suero fetal que los que llevaron suero en estro, con diferencias que casi doblaban el
valor de las cifras obtenidas con este ltimo (27,1% frente a 13,7% y 28,6 frente
a 15,8, para los oocitos A y B, respectivamente). Estos valores son menores que los
que obtuvieron Pavlov el al. (1992) y similares a los presentados por Coskum e: al.
(1991) al utilizar EGF en el medio de maduracin. Otros autores han sealado el
porcentaje de polispermia en valores cercanos al 15% (BalI e: al., 1983; First y
179
Parrish, 1987) mientras que Iritani et al. (1984) mostraron una cifra de poliespermia
del 0%. Este dato es, a nuestro entender, demasiado bajo, ya que, aunque la especie
bovina no alcanza valores de poliespermia tan elevados como en otros oocitos como
los porcinos, ]a mayora de los autores, incluso en trabajos muy recientes, sealan
normal la obtencin de porcentajes de poliespermia cercanos al 15-20% (Fukui y
Ono, 1989; Coskum ej aL, 1991; Pavlov et aL, 1992). Quizs este hecho se deba
a que, aquellos autores, utilizaron KRB-m como medio de maduracin suplementado
sin sueros, sino slamente con BSA. Shioya e: al. (1988) utilizando un medio de
capacitacin con cafena, suero fetal y hormonas obtuvieron un indice de
poliespermia del 14,3% en oocitos del tipo C, anlogo al 15,8% obtenido en nuestro
trabajo con SVE+FC. Sin embargo, estos mismos autores describen que con oocitos
denudados tuvieron un 0% de poliespermia, que nos parece excesivamente bajo, ya
que en los oocitos denudados empleados en nuestro trabajo, al igual que lo que
seala Fukui (1990), presentaron porcentajes de poliespermia.
con problemas de poliespermia mucho mayores que la bovina- Yoshida e: al. (1992)
180
sealaron que la suplementacin del medio con glutatin reduce la polispermia
debido a que, este compuesto, interviene en la maduracin citoplsmica y asegura
una mayor eficacia en la liberacin del contenido de los grnulos corticales (GC) y
bloqueando el paso de los espermatozoides.
Por otro lado, los resultados de fecundacin obtenidos en nuestro trabajo con
181
SFB+FC (43,3%) son mis altos que los obtenidos por Fukushima y Fukui (1985)
y Schellander et al. (1990) aunque algo ms bajos que los de Younis e: al. (1989).
Todos ellos utilizaron SFB y hormonas en el medio de maduracin de los oocitos.
Las diferencias con los datos ofrecidos por otros autores, son mayores al valorar los
resultados obtenidos cuando se utiliz SVE ya que, en nuestro trabajo, se obtuvo un
55,8% de fecundacin frente a un 36% de Fukushima y Fukui (1985), 41% dc Fukui
y Ono (1989) y 50% tambin de Fukui y Ono, pero utilizando adems dc ECS,
hormonas (FSH. LH y estradiol) y cocultivo con clulas de la granulosa. Estos
resultados indican que la maduracin de los oocitos con SVE+FC permite una
fecundacin normal de los oocitos, o cuando menos similar, a la que se obtiene
cuando se suplementan los medios de maduracin con hormonas y cocultivos de
granulosa.
Las diferencias entre los distintos oocitos, segn el nmero de capas del
cmulo celular que le rodean, se exponen en las Tablas 26, 27 y 28 del captulo de
RESULTADOS. En ellas se observa que, excepto en los tratamientos control, en los
que prcticamente no existi diferencia entre los porcentajes de fecundacin,
penetracin y polispermia entre los tres tipos de oocitos, cuando se suplement el
medio de cultivo con suero y factores de crecimiento, las diferencias entre los
oocitos con y sin cmulo celular fueron muy importantes. En los tres parmetros
evaluados existe una gran diferencia entre los oocitos A y B respecto de los C. Este
hecho est de acuerdo con los autores que indican que, la existencia del cmulo
celular, es un factor muy importante para que se puedan producir correctamente los
procesos que facultan al espermatozoide para penetrar el oocito (Yanagimachi,
1988). Respecto a este punto, Gwatkin el al. (1972) demostraron, en el oocito de
hamster que, en el proceso de capacitacin, el cmulo celular tiene un papel
fundamental. En estudios de este tipo realizados en oocitos de rata Niwa y Chang
(1974), observaron que no existieron diferencias en las cifras de penetracin y
poliespermia entre oocitos con y sin cmulo celular; estos mismos autores reconocen
182
que este hecho no es comn en la mayora de las especies. En diversos trabajos se
ha sealado que las clulas del cmulo pueden actuar como barrera contra el gran
nmero de espermatozoides que rodean al oocito durante la fecundacin y, sobre
todo, favoreciendo la seleccin, capacitacin y reaccin acrosmica de los mismos
(Yanagimachi, 1988). Sin embargo, Bal el al. (1983) sealaron que el cmulo
celular y la expansin de ste favorecen notablemente la fecundacin, pero lo ms
importante, segn su criterio, es que el cmulo transmita o induzca, via cmulo
celular, la actuacin de un factor similar al MPGF, descrito hace alios por Thibault
el al. (1977), que es, segn estos autores, el verdadero responsable de que se pueda
producir la fecundacin correctamente.
En oocitos bovinos otros autores (Lu e: al., 1987; Fukui y Ono, 1989)
expusieron oocitos denudados, mecnicamente o por medio de un tratamiento con
hialuronidasa, a la accin de espermatozoides con el fin de averiguar si aumentaban
las cifras de penetracin y fecundacin iii litro. Sin embargo, en los resultados de
estos autores, como en los mostrados en el presente trabajo, no slamente no
aumentaron las cifras de fecundacin normal, sino que tampoco lo hicieron las de
penetracin. Adems, por otro lado, existieron penetraciones de espermatozoides e
incluso un pequeo porcentaje de fecundacin normal; este dato permite asegurar
que la zona pelcida de los oocitos denudados puede inducir la RA en el
espermatozoide. De alguna manera, puede que la suplementacin del medio de
maduracin con factores de crecimiento, confiera al oocito capacidad para ser
fecundado, aunque, las pruebas experimentales demuestran que la principal accin
183
de los factores de crecimiento, junto con la suplementacin srica, se produce en
oocitos con cmulo.
Respecto a las diferencias entre los dos tipos de oocitos con cmulo (A y B),
Leibfried y First (1979) y Fukui (1990), seilalararon diferencias en los porcentajes
de fecundacin. Sin embargo, en nuestro trabajo no existieron unas desigualdades
tan marcadas como las sefialadas por estos autores. Probablemente, esto sea debido
a que, estos autores, no maduraron estos tres tipos de oocitos desde el principio del
cultivo, sino que, despus del mismo, eliminaron parte de las capas del cmulo. Este
hecho hace que slamente evalen la influencia del mtodo de capacitacin y
fecundacin itt i:ro y, por ello, no tienen en cuenta las condiciones de maduracin
de los oocitos de este tipo especfico.
184
1 clula), sealaron que, el IGF-l, era efectivo en el desarrollo embrionario,
despus de la maduracin y fecundacin in Uro. De la misma manera, Coskum e:
al. (1991) sealaron que los oocitos madurados con EGF eran capaces de
desarrollarse sin cocultivos celulares, hasta el estadio de 8 celulas. Todos estos datos
permiten asegurar que los factores de crecimiento juegan un papel importante en
estos procesos del desarrollo embrionario temprano.
185
CONCLUSIONES
CONCLUSIONES
b) LA PROPIA MADURACION Y,
c) SU FECUNDACION IN VITRO.
187
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INDICE DE FOTOGRAFAS.
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