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INTRODUCCION

OBJETIVOS:

La HPLC o en espaol Cromatografa liquida de alta resolucin ha tenido una creciente


difusin desde comienzos de la dcada de los 70, y hoy presenta una de las herramientas mas
empleadas en el laboratorio analtico moderno, ya sea a la investigacin bsica o aplicada,
industrial, biolgico.

LA CROMATOGRAFIA:

La Cromatografa es un mtodo principalmente para la separacin de los componentes de una


muestra, en lo cual los componentes se distribuyen en dos fases, una de las cuales es estacionaria,
mientras la otra se mueve es decir fase mvil, la fase estacionaria puede ser un slido, un liquido
retenido sobre un slido o un gel

La fase estacionaria puede ser extendida como una capa o distribuida como una pelcula, la fase
mvil puede ser liquida o gaseosa

MODALIDADES DE LA CROMATOGRAFIA

Clasificamos las modalidades cromatografas en funcin de varios parmetros:

La naturaleza de la fase mvil. Si la fase mvil es un gas, la modalidad cromatografica se


denomina gaseosa (GC) y si es un liquido, cromatografa liquida (LC). A este ultimo grupo
pertenecen la cromatografa en capa delgada (TLC), La cromatografa liquida en columna
abierta, y la cromatografa de alta performance (HPLC), aunque las modalidades sean
distintas, los principios son los mismos en todos los casos.

La cromatografa gaseosa se emplea para separar mezclas que contienen compuestos orgnicos
voltiles, pero suele presentar varias dificultades si las sustancias a analizar no son voltiles. La
diferencia fundamental entre (HPLC) Y (GC) se encuentra en el tipo de detectores y en la influencia
de la fase mvil

La naturaleza de la fase estacionaria. Si la fase estacionaria es un solido y la fase mvil un


liquido la cromatografa se denomina cromatografa liquido-solido (LSG). Anlogamente
existirn una cromatografa liquido-liquido (LLC), gas-liquido (GLC) y gas-solido (GC)
El fenmeno que ocurre dentro de la columna. As, la cromatografa puede clasificarse en
varias modalidades de afinidad y tamao molecular. En las modalidades de afinidad de
analito interacta directa o indirectamente a travs del solvente con la fase estacionaria
mientras que en las separaciones por tamao molecular no existe (al menos tericamente)
ninguna interaccin con la fase estacionaria.
La cantidad de muestra aplicada. Si la cromatografa seleccionada para una separacin no
destruye la muestra, es posible recuperar el analito separado de su matriz, a la salida de la
columna. Aumentando la cantidad de muestra es posible obtener desde microgramos
hasta kilogramos de una sustancia pura en una sola corrida.

FORMAS DE CROMATOGRAFIA LIQUIDA

Podemos clasificar la cromatografa liquida de la siguiente forma.

Cromatografa Liquido-Solido (LLC) o de absorcin. Este mtodo emplea una fase estacionaria
polar, tpicamente silicagel, y una fase mvil no polar

Cromatografia liquido-liquido (LLC) o de particin. En esta modalidad, las molculas del soluto se
distribuyen entre dos lquidos: uno es la fase mvil, y el otro la fase estacionaria, que se encuentra
homogneamente dispersa en un soporte solido, finalmente dividido. Sin embargo varios
inconvenientes especialmente derivados del tipo de fijacin de la fase estacionaria al soporte,
estos inconvenientes se deban a la necesidad de pre saturar la fase mvil con la fase estacionaria,
la imposibilidad de efectuar gradientes de elucin, de programar caudales o temperatura para
evitar el desprendimiento de la fase estacionaria.

Cromatografa de Fase Ligada (BPC). Las virtudes de la LLC eran claras, tanto como sus
limitaciones, por ello resulta razonable el tipo de unin de la fase estacionaria a su soporte.
Hacindola perdurable por medio de una unin qumica covalente

Cromatografa de intercambio inico (IEC). En este caso se emplean rellenos en los cuales la
partcula esta compuesta por un polmero o silicagel, en cada caso unidas a un grupo funcional
anionico o cationico (tpicamente sulfonico para el intercambio de cationes, amonio cuaternario
para intercambio de aniones). La seleccin del tipo de grupo funcional permite escoger entre
intercambiadores dbiles y fuertes

Cromatografa de exclusin por tamao (SEC). Esta modalidad emplea materiales de porosidad
controlada, que funciona como un filtro y clasifica las molculas de la muestra segn un orden
decreciente de tamao molecular, ( las molculas mas grandes son las primeras en eluir y las mas
pequeas son las ultimas), puede evaluarse el peso molecular de un compuesto desconocido .
INSTRUMENTAL

INTRODUCCION:

La cromatografa se ha desarrollado a gran escala en los ltimos aos, en especial en lo referente


al desarrollo de las nuevas fases estacionarias compuesto por bombas que permiten entregar en
un solo instrumento caudales muy estables que vara entre el microlitro y varios mililitros,
detectores con celdas intercambiables en las cuales el volumen puede escogerse, generalmente
entre uno o dos uL, vlvulas accionadas por microprocesadores que permiten direccionar la fase
mvil para automatizar procesos.

RESERVORIO DE LA FASE MOVIL:

El reservorio es el recipiente que contiene la fase mvil, puede ubicarse dentro de la caja negra de
un equipo integrado o externamente modula. Puede emplearse
como reservorio de fase mvil o cualquier frasco de laboratorio de buena calidad (de vidrio o
polmero resistente), con una tapa adecuada para prevenir el ingreso de partculas ambientales
del sistema,

Los sistemas que necesitan procesos de desgasificacin continua estn provistos de una tapa
especialmente diseada para tal fin, en la cual podemos encontrar un orificio para la entrada del
gas inerte de desgasificacin, otro para la salida del solvente y una vlvula que permite una
presin positiva del gas sobre el solvente venteando el exceso

TUBERIAS:

La fase mvil empleada en HPLC debe circular por tuberas que conectan al reservorio del solvente
con la bomba, la bomba con el inyector, este con uno o mas detectores conectados en serie, y
eventualmente con un colector de fracciones o vlvulas de distribucin. Es evidente que esas
tuberas deben ser inertes, y de acuerdo a su ubicacin al sistema cromatografico, resistente a
altas presiones. As se emplean tubos de acero inoxidable (316 o 304) o polmeros o tefln, las
tuberas de acero 316 y el tefln son las mas usadas,

Las tuberas de acero se utilizan para conectar los componentes sometidos a alta presin (entre
bomba e inyector, inyector y columna, columna y detector y entre detectores conectados en serie)
y los materiales polimricos para conectar los componentes donde la presin es atmosfrica o
ligeramente superior (reservorio del solvente,-bomba, ultimo detector-frasco de desperdicios).

Las tuberas de acero tienen un dimetro externo estandarizado: 1/16 pulgadas. Sin embargo su
dimetro interno es variable y se selecciona la de seccin mas fina para conectar los instrumentos
los cuales circula la muestra (entre inyector y detector, de modo de no provocar dilucin de la
muestra) y de la seccin mas gruesa para conectar aquellos componentes del sistema por los que
no circula la muestra, y por los cuales un dimetro interno delgado solo aumentara la presin del
sistema.

UNIONES:

Las uniones permiten conectar las tuvieras y con ellas, los distintos componentes del sistema
cromatografico.

Las uniones deben reunir determinadas caractersticas, entre ellas:

Deben ser inertes a la fases mviles y muestras


Deben cerrar hermticamente
No deben contribuir en forma notable el ensanchamiento de banda extracolumnar por
presencia de volmenes muertos

BOMBA:

Las bombas de HPLC impulsan la fase mvil proveniente del reservorio del solvente hacia el
inyector, y desde all hacia la columna. Su caudal de trabajo puede ser muy variable segn la escala
de trabajo escogida. Existen bombas capaces de entregar caudales muy pequeos.

MATERIALES DE CONSTRUCCION:

Las bombas estn construidas de materiales muy resistentes como al ataque qumico como el
desgaste mecnico. Los componentes en contacto con el solvente son acero inoxidable, rub y
tefln. En general el acero inoxidable se utiliza como cuerpo de toda bomba, para la construccin
de tuberas, conectores y cabezales de los pistones.

CARACTERISTICAS DE LAS BOMBAS:

Las bombas de HPLC tienen las siguientes caractersticas:

1. Caudal. Los equipos convencionales operan con caudales entre 0.1 y 10.0 mL/min y trabajan
con presiones de hasta 6000 PSI.

2. Exactitud en el caudal. La exactitud en la medicin del caudal se refiere a la divergencia entre


caudal de trabajo establecido y el caudal real entregado. Puede determinarse midiendo el
volumen del liquido entregado en un intervalo de tiempo preestablecido. La importancia de la
exactitud del caudal reside en la importancia que pueda darse a la exactitud en la determinacin
de los tiempos de retencin de las sustancias a cuantificar, parmetro que no es muy importante
en algunos casos.

3. Ruido. Se refiere a las variaciones denominadas pulsaciones que presentan las bombas del tipo
reciprocante y que conducen a variaciones en el caudal de solvente entregado en intervalos cortos
de tiempo. Se origina en la detencin del caudal de liquido durante los movimientos habituales de
la bomba ( apertura-cierre de vlvulas o movimiento de los pistones ). A pesar de que cierto nivel
de ruido es habitual, deficiencias de en el sistema de bombeo como vlvulas tapadas, burbujas de
aire intensifican notoriamente su valor.

4. Deriva. La deriva es un cambio continuo (positivo o negativo) en la entrega de solvente que se


produce en intervalos de tiempo muy largos. La deriva en el caudal conduce a diferencias en las
reas de los picos durante operaciones automticas en periodos de tiempo muy largo. Para
minimizar el efecto de la deriva sobre los resultados cuantitativos se suele efectuar una nueva
calibracin del equipo con estndares apropiados luego de la inyeccin de cada serie de 5 a 10
muestras.

5. Sistema de corte. Es conveniente que la bomba posea sistemas de corte de caudal


cuando se superen valores limites de presin

SISTEMAS DE GRADIENTE:

La HPLC isocrtica es capaz de separar un nmero limitado de picos, normalmente 10 o 12, para
sistemas ms complejos o cuando la polaridad de los componentes a separa es muy diferente.
El gradiente de solventes es comparable es comparable a la programacin de temperaturas en
cromatografa gaseosa. En GC se varia la temperatura en funcin del tiempo. En HPLC se varia la
composicin de la fase mvil, comenzando la elucin con un solvente dbil y aumentando
progresivamente la proporcin del componente fuerte. Esta variacin se puede seguir un perfil
lineal, cncavo, convexo una mezcla de estos perfiles en un mismo cromatograma. El gradiente de
solventes se grada por el intervalo de variacin, es decir, por la velocidad de cambio del solvente
dbil al fuerte.

INYECTORES:

El inyector es el dispositivo que permite introducir la muestra en solucin sin interrumpir el caudal
de solvente a travs del sistema. El inyector debe reunir una serie de caractersticas importantes,
entre ellas.

Debe ser fcil de operar.


Debe ser inerte al ataque qumico y capaz de soportar altas presiones.
Debe ser preciso en cuanto a la cantidad de muestra introducida en el sistema.
No debe provocar diluciones importantes de la solucin inyectada.
En casos especiales puede requerir operar a altas temperaturas.

Actualmente la totalidad de los inyectores de HPLC son vlvulas que orientan el caudal hacia la
columna, pasando o no segn su posicin, a travs de un loop en el cual se introduce la solucin a
inyectar.

INYECTORES AUTOMTICOS:

Las vlvulas de inyeccin de seis vas, pueden accionarse elctrica o neumticamente y se utilizan
a la construccin de inyectores automticos. La precisin obtenida con estos inyectores es en
general superior a la de mtodos manuales. Las vlvulas se accionan con motores elctricos y por
medios neumticos ya sea por aire comprimido, nitrgeno o helio.

VALVULAS DE INTERCAMBIO:

Las vlvulas de intercambio se emplean para agilizar o automatizar operaciones: preparacin de


las muestras, cambio de columnas, enriquecimiento de trazas, cromatografa de reciclo y
operacin de contracorriente. Es posible utilizar vlvulas de 6 o mas vas similares a las descritas
para la inyeccin de las muestras u otras de diseo especial.

DETECTORES:

El detector es la parte del equipo cromatogrfico que permite ver y ubicar en tiempo y espacio la
posicin de cada componente de una muestra a la salida de la columna cromatografica. Los
detectores deben reunir ciertas caractersticas ampliamente tratadas, entre ellas:

Tener un amplio rango dinmico de respuesta.


Poseer una respuesta lineal.
No contribuir al ensanchamiento de banda extracolumnar.
Responder a todos los solutos.
Tener la sensibilidad apropiada
Poseer una buena relacin seal/ruido
No destruir la muestra
Tener una constante de tiempo baja

Los detectores pueden clasificarse en generales y selectivos. Los detectores generales miden el
cambio de alguna propiedad fsica de la fase mvil que contiene el analito en comparacin con la
misma fase mvil pura. Ejemplos tpicos son el detector de ndice de refraccin y el de
conductividad. Los detectores selectivos son aquellos sensibles a alguna propiedad propia del
soluto, Por ejemplo el detector UV, que producir una seal proporcional a la absorbancia del
soluto a una longitud de onda dada.

DETECTORES GENERALES:

Detectores de ndice de refraccin. Este detector mide la diferencia de ndice de refraccin entre
el solvente puro y el solvente que contiene la muestra. Es un detector universal (ya que es
altamente improbable que el ndice de refraccin del soluto sea similar al del solvente) y no
destructivo. Como contra partida es muy poco sensible, lo cual limita su campo de aplicacin y es
muy afectado por cambios de temperatura.

Existen tres tipos de diferentes de detectores de ndice de refraccin: Fresnel, Deflexin,


interferomtrico

Fresnel. Es un detector diferencial que utiliza dos celdas, una de medicin que es atravesada por el
eludo de la columna, y una celda de referencia por lo cual fluye la fase mvil pura.
Deflexin. Es un detector diferencial que a diferencia del fresnel, solo usa una prisma para todo el
rango de ndices de refraccin, pero empleando celdas de mayor tamao, del orden de los 8 a 10
uL

Interferomtrico. La luz emitida pro la fuente luminosa se polariza y se divide en dos haces por un
divisor de onda. Luego se focalizan ambas ondas y atraviesan la celda de referencia y la de medida.
Finalmente se recombinan por una segunda lente y por un divisor de onda para llegar al
fotomultiplicador.

DETECTORES SELECTIVOS:

Detector UV. Es el detector mas usado en HPLC. Posee buena sensibilidad y rango lineal, y permite
detectar analitos en el orden de los nanogramos. No es destructivo y puede emplearse con
gradientes de solventes, con la nica limitacin de que estos sean transparentes en la longitud de
onda. Es un detector muy poco sensible a los cambios de caudal y temperatura. El detector UV
opera en el rango 190 a 350 nm y en algunos equipos se pueden extender a la zona del visible del
espectro 350 a 700 nm recibiendo as el nombre de detector UV/Visible. Existen dos tipos de
detectores UV

DETECTOR DE FLUORESCENCIA:

El detector de fluorescencia se utiliza para el anlisis de sustancias que presentan fluorescencia


natural o conferida por derivatizacion con un reactivo fluorognico. Su alta sensibilidad y
selectividad lo convierte en un detector adecuado para el anlisis de trazas, la selectividad se debe
a dos factores:

Existen pocas sustancias de fluorescencia nativa y las reacciones de derivatizacin.


Implican la presencia de un grupo funcional en la molcula de analito
Se utilizan dos longitudes de onda, una de excitacin y otra de emisin. Al excitar la
muestra a una dada longitud de onda varios componentes de la muestra podran absorber
energa, pero pocos emitirn adems a la longitud de onda elegida .

DETECTOR ELECTROQUIMICO:

Es un detector muy sensible, unas 1000 veces mas sensibles que el detector UV, y altamente
selectivo. La selectividad se debe, no solo a que detecta compuestos capaces de ser oxidados y
reducidos.

La deteccin de compuestos electro-oxidables o electro-reducibles ocurre en la superficie de un


electrodo interpuesto en el paso del eluido en la columna. Este detector emplea tres electrodos: el
electrodo de trabajo, el de referencia, y el auxiliar. La reaccin redox es inducida en el electrodo
de trabajo. Su principal limitacin esta dada por el tipo de fase mvil a emplear, que
necesariamente debe ser conductiva, limitando su campo de aplicacin a la cromatografa de fase
reversa e intercambio inico. Por otra parte, es evidente su naturaleza destructiva respecto del
analito
SISTEMA DE TOMA Y PROCESAMIENTO DE DATOS:

El resultado del ensayo cromatogrfico es por un lado la obtencin de fracciones separadas de los
componentes de la muestra, y por el otro, la de un grafico o cromatograma, de cuya
interpretacin pueden extraerse conclusiones cualitativas y cuantitativas. Este registro y la
eventual manipulacin se obtienen a partir de la seal del detector por medio de un sistema de
toma y procesamiento de datos, entre los que podemos citar:

Registrador grafico
Integrador, que permiten que no solo obtener un registro grafico
Computadora