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Introduccin
Tanto en la Universidad como fuera de ella, sin importar el tema, es importante que
expreses tus ideas o argumentos de manera clara y fcil de seguir, tanto en forma
oral como escrita. Actualmente, tanto las empresas como las instituciones
educativas y de investigacin buscan que su personal tenga habilidades adecuadas
de comunicacin.
Reflexiona:
Cmo utilizas diariamente tus habilidades para comunicarte?
Cmo se te facilita ms comunicarte con los dems, de manera oral o escrita?
Cules son tus fortalezas en el aspecto de la comunicacin?
Cules son tus debilidades? Cmo crees que puedes superarlas?
Frecuentemente, los reportes presentan las siguientes secciones: resumen del contenido,
introduccin o antecedentes, mtodos, resultados, discusin, conclusiones, recomendaciones
o perspectivas y referencias. La inclusin de recomendaciones generalmente ocurre en reportes
para la industria y son determinantes para la toma de decisiones por parte de los directivos. A
continuacin se da una breve descripcin de cada una de las secciones que conforman un
reporte cientfico.
Resumen. Su funcin es presentar un avance del contenido del reporte de una manera en la
que el lector juzgue si le interesa leer el reporte completo. Se incluyen los antecedentes ms
relevantes, una frase sobre el objetivo del proyecto, una descripcin corta de los mtodos que
se usaron, los principales resultados y las conclusiones o implicaciones de los resultados. El
resumen normalmente se escribe como un solo prrafo de 100 a 200 palabras.
Williams, Joseph M. Style: Ten Lessons in Clarity and Grace. 6th edition. New York: Longman, 2000.
PARTE II: REVISIN DE MTODOS ESPECTROSCPICOS Y ELABORACIN
DE CURVA ESTNDAR DE PROTENA
Introduccin
El espectrofotmetro es un instrumento ampliamente utilizado en el anlisis
cualitativo y cuantitativo de molculas biolgicas. Esto quiere decir que este
instrumento nos ayuda a determinar cules sustancias (protenas, lpidos,
carbohidratos, cidos nucleicos, entre otras), estn presentes en una disolucin y
en qu cantidad. Los espectrofotmetros pueden emitir radiaciones de diferentes
longitudes de onda tanto en el ultravioleta como en el visible.
Muchas sustancias absorben radiacin a diferente longitud de onda (puede ser en
el espectro visible o en el ultravioleta), por tanto, cuando determinamos a qu
longitud de onda absorbe una sustancia desconocida, podemos tener idea de qu
tipo de molcula se trata. Esta misma propiedad se utiliza para cuantificar la
sustancia: a mayor cantidad de radiacin absorbida, mayor concentracin de sta.
Si la sustancia no absorbe radiacin en el ultravioleta o el visible, puede modificarse
qumicamente para producir un compuesto que s absorba en estas longitudes de
onda. A este tipo de mediciones se les conoce como indirectas.
Leyes que rigen la espectrofotometra
Cuando un haz luminoso de intensidad P0 pasa a travs de una solucin, parte de
ste se absorbe, por lo tanto la intensidad de la radiacin emergente P es menor al
incidente P0. La relacin entre ambos se denomina transmitancia, T:
T= P/P0. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (1)
La cantidad de luz absorbida es proporcional al nmero N de iones o molculas
capaces de absorber energa; por lo tanto, T disminuye a medida que la
concentracin aumenta.
Ley de Lambert y Beer, conocida generalmente como Ley de Beer, considera que
al dividirse la solucin en pequeas secciones, en cada una de ellas se absorber
una pequea cantidad de radiacin P, que es proporcional a N. Tomando en cuenta
que N es directamente proporcional a la concentracin y si la longitud por la que
pasa el haz de luz (longitud de la celda) es constante, podemos llegar a la ecuacin
general:
-log P/ P0= abc . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (2)
Donde:
c es la concentracin
b es la longitud de la celda o paso ptico
a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad o coeficiente de extincin 10
La absortividad o coeficiente de extincin mide qu tanto una sustancia absorbe
la radiacin a una longitud de onda determinada. Es una caracterstica propia de
cada especie qumica y depende de su estructura. El valor de la absortividad para
un compuesto vara con la longitud de onda.
A la relacin -log P/ P0 se le denomina absorbancia de la solucin (A) y es
especfica para una longitud de onda dada (). Por tanto, la ecuacin final que define
a la ley de Beer queda de la siguiente manera:
A= abc . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (3)
Es importante mencionar que se le coloca el superndice a la absorbancia A y a la
constante de proporcionalidad a porque dependen de la longitud de onda (ec. 3). Si
la concentracin se expresa en molaridad, entonces se denomina a la constante de
proporcionalidad coeficiente de absortividad molar o coeficiente de extincin ().
Convencionalmente, el paso de la luz en las celdas de laboratorio es de 1 cm, por
lo que las unidades de son cm-1mol-1L. Hay que destacar que A es adimensional,
ya que por definicin es un ndice.
Podemos construir una grfica para observar cmo vara la absorbancia de una
especie en solucin a una longitud de onda dada en funcin de su concentracin. A
esta grfica se le llama curva de calibracin o curva estndar y para construirla
se mide la absorbancia de varias soluciones de concentracin conocida, llamadas
disoluciones estndar. Es una lnea recta y de acuerdo con la ecuacin 3 la
pendiente es b.
1 Clulas a las que se les introdujo un gene que codifica una protena proveniente
de otro organismo, a travs del uso de tcnicas de biologa molecular
Donde RPM son las revoluciones por minuto de un rotor con un radio r (expresada
en mm). El radio usado es la distancia del centro del eje del rotor a la posicin
intermedia del tubo.
La fuerza centrfuga creada puede ser tan pequea como 600 Xg (600 veces la
gravedad) o tan grande como 300,000 Xg. En el primer caso se sedimentan
fragmentos de tejido, clulas intactas y ncleos, entre otros. Si la fuerza aplicada es
intermedia (13,000 Xg), podemos separar los organelos celulares y, cuando la
fuerza es muy grande (100,000 Xg), la mayor parte de las molculas solubles que
componen el citosol permanecen en solucin y las molculas aglomeradas en las
membranas sedimentan (denominada fraccin microsomal). Como puedes ver,
dependiendo de la fuerza aplicada, la sedimentacin vara. Esto implica que
podemos realizar un proceso llamado centrifugacin diferencial, en el que el
homogeneizado se somete a una serie de centrifugaciones a distintas fuerzas para
ir desechando gradualmente los contaminantes de la muestra y avanzar en la
purificacin de la protena de inters.
SEGUNDA FASE
El objetivo principal es remover los contaminantes ms pequeos, de una forma
especfica. stos pueden ser protenas, cidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de
los mtodos ms utilizados para eliminar protenas contaminantes es la
precipitacin. Para que una protena precipite debemos modificar el ambiente que
le rodea, debido a que los grupos cargados en la superficie de una protena pueden
interaccionar tanto con las molculas de agua como con los iones que se
encuentran en solucin.
Existen varias estrategias para precipitar a las protenas tales como cambio de pH,
incremento en la temperatura, adicin de disolventes, de molculas cargadas, etc.
El mtodo ms comnmente empleado es la precipitacin por salado con
(NH4)2SO4.
Las protenas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentracin
de iones, fenmeno denominado de salting in. Pero cuando se eleva en exceso
la concentracin de iones, disminuye la solubilidad de las protenas y precipitan
(salting out). La mayor parte de las protenas presentan en su superficie una capa
de agua (capa de solvatacin) que al incrementar la concentracin de los iones
disminuye. El mecanismo de salting-out se basa en la exclusin del cosolvente, es
decir la sal establece puentes de hidrgeno con el agua y al hacerlo sustrae el agua
de la protena. Por lo anterior, la conformacin de la protena se modifica para evitar
la exposicin de sus residuos apolares con el solvente, dando como resultado
nuevas interacciones y por lo tanto lleva a la formacin de plegamientos o
asociaciones nuevas que pueden llevar a su precipitacin. El mtodo del salting out
es uno de los ms utilizados en la purificacin de protenas, ya que permite
deshacerse de una gran cantidad de contaminantes de una forma econmica. Es
por esto que se han diseado tablas y frmulas en las que se pueden determinar
las cantidades de (NH4)2SO4 slido o en solucin, que se deben aadir a una
mezcla de protenas para obtener una concentracin dada de sal. La precipitacin
de una protena a una concentracin dada de sal depende las propias
caractersticas inicas y de contenido de residuos polares, por lo que cada protena
precipita a cierta concentracin y tipo de sal. Para establecer est concentracin se
deben de realizar pruebas. Adems, se tiene que determinar si la protena
permanece activa o pierde su actividad biolgica al ser precipitada.
Despus de la precipitacin hay que retirar el agente precipitante, que es
comnmente la sal. Una manera es diluir la solucin para reducir la concentracin
del compuesto, otras formas pueden ser la dilisis, la ultrafiltracin o bien, el paso
por una columna de exclusin molecular. A continuacin se describen brevemente
estas tcnicas.
La dilisis suele llevarse a cabo colocando la muestra en un tubo de dilisis, que
es una membrana semipermeable de celulosa o celofn con un tamao de poro
determinado. Se coloca la muestra dentro del tubo de dilisis y ste se sumerge en
una solucin que contiene al menos 30 veces ms volumen que la muestra a
dializar. Lo anterior aumenta las probabilidades de que la alta concentracin de sal
en el tubo migre hacia la solucin en la que se encuentra baada el tubo y cuando
se alcance el equilibrio, la concentracin de sal en la muestra y la solucin de dilisis
sea muy baja. Existen dos desventajas de la dilisis: el costo de la membrana de
dilisis y que el proceso incluye la agitacin del tubo de dilisis a 4C durante toda la
noche.
Por su parte, la filtracin en gel no tiene el problema del tiempo. Una columna
empacada con Sefadex-G25 puede usarse para eliminar molculas de peso
molecular menores a 5000 daltones. La muestra se coloca en la columna, y al aadir
el amortiguador de elucin, las molculas de menor tamao se meten entre los
poros de la matriz de Sefadex y se retienen all, mientras que las grandes no se
retienen y salen ms rpidamente de la columna. Posteriormente eluyen o salen las
de peso molecular menor. En un simple paso la muestra se desala, concentra,
cambia de amortiguador y pierde protenas o molculas contaminantes.
TERCERA FASE
El objetivo de esta fase es obtener una protena pura o con mnimas trazas de
contaminantes proteicos. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinacin
de varios mtodos cromatogrficos, como la cromatografa de exclusin molecular,
de intercambio inico, interaccin hidrofbica y de afinidad. A continuacin slo se
describen las dos tcnicas que se usarn en el laboratorio.
La cromatografa de intercambio inico es una tcnica que separa las
biomolculas de acuerdo con su carga. Los grupos cargados sobre la superficie de
una protena interaccionan con los grupos con carga opuesta de la fase
estacionaria.
La purificacin de protenas con este tipo de cromatografa se basa en que la carga
electrosttica de las protenas depende del pH en el que se encuentran. El pH en el
que se iguala el nmero de cargas positivas y las negativas se llama punto
isoelctrico o pI y es diferente para cada protena. A valores de pH menores al pI,
la carga neta de una protena es positiva, por lo que puede unirse fuertemente a
una resina con cargas negativas o intercambiador catinico. Por el contrario, a un
pH mayor al pI, la protena tendr carga negativa y ser capaz de unirse a
intercambiadores de tipo aninico que contienen grupos cargados positivamente
(Figura 2.1). Cuando una protena tiene muchas cargas positivas o negativas, la
fuerza con que se une a la columna es mayor que si tiene pocas cargas. Para eluir
a la protena de inters se utilizan soluciones que modifican el pH o la concentracin
de sales en la resina. Estas sales tambin pueden interactuar con la resina,
reemplazando a las protenas que estn adheridas a ella. Debido a que la
separacin de las protenas de la matriz utilizando sales ocurre en orden de menor
a mayor fuerza de unin (dependiendo de qu tan cargada est la protena), es
comn eluir a las protenas usando un gradiente de concentracin de sales en orden
creciente de concentracin.
Figura 2.1.Separacin por cromatografa de intercambio inico. Los soportes o
resinas de cromatografa pueden estar cargados positiva o negativamente. De esta
carga depende cules son las molculas que interaccionarn con la resina.
Cromatografa de afinidad. Si la protena a purificar tiene una afinidad especfica
por un ligando como un cofactor, un anticuerpo o un ion metlico, esa propiedad
puede usarse para purificarla. Por ejemplo, para purificar a una deshidrogenasa es
comn usar al cofactor de la enzima, el NAD+ o bien un compuesto que presente
alguna similitud a ste (Figura 2.2).
Cuando la muestra atraviesa la columna de afinidad, la protena de inters se unir
al ligando, mientras que el resto saldr de la columna. Este tipo de separacin,
basada en el reconocimiento biolgico, es muy especfica y elimina muchos
contaminantes.
Figura 2.2. Comparacin entre las molculas de Cibacrn blue 3GA y el NAD+. A) Los colorantes de triazina
como el Cibacrn blue 3GA son comnmente acoplados a resinas de agarosa para utilizarse en ensayos de
purificacin por cromatografa de afinidad. La molcula es estable, fcil de remover, barata y varias compaas
las tienen disponibles para realizar purificaciones de protenas que unen nucletidos de piridina B) NAD+.
Referencias
Allen T, Mark W. 2004. Desalting, Concentration, and Buffer Exchange by dialysis
and ultrafiltration. Current protocols in protein science 4.4.1-4.4.15. John Wiley &
Sons Inc, New York, USA.
Castle DJ. 2004. Overview of cell fractionation. Current protocols in protein science
4.1.1-4.1.9. John Wiley & Sons Inc, New York, USA.
Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edicin.
1997. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localizacin QP514.T4
Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala,
Sweden. Code number 18-1132-29 Pp 94.
Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley &
Sons Ltd. Pp 1-7. Consultar la pgina www.els.net
Sheehan D, OSullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of
life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la pgina www.els.net
Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edicin. 1995. John Wiley & Sons Inc,
New York, USA. Pp 71-104
Sitio del que se tomo parte de la metodologa para la extraccin de la lactato
deshidrogenasa de pollo
http://www.acad.carleton.edu/curricular/BIOL/classes/bio380/lab_protocol.html
autor: John Tymoczko y actualizada por Rebecca Bryant
Introduccin
Para evaluar de manera cuantitativa el xito de una purificacin de protenas es
necesario conocer dos parmetros en cada paso del proceso de purificacin: el
rendimiento y el grado de pureza.
El rendimiento es un parmetro expresado en porcentaje que se obtiene de medir
la actividad biolgica de la protena de inters en cada paso de la purificacin. El
100% corresponde a la actividad del extracto inicial.
El grado de pureza se refiere al incremento en pureza a lo largo del proceso. Este
valor se obtiene de dividir la actividad especfica de cada paso entre la actividad
especfica del paso inicial de purificacin. El ndice da el valor de 1 para el extracto
inicial.
Para obtener el valor de la actividad especfica (que se encuentra generalmente
expresado en Unidades/ mg protena) es necesario contar con a) una tcnica que
determine la concentracin de protenas totales en la muestra, y b) una tcnica que
especficamente detecte o mida la cantidad de la protena blanco o de inters
(unidades de actividad). En casos raros, la protena blanco es fcil de detectar,
porque es colorida (mioglobina), porque es fluorescente (protena verde
fluorescente) o porque tiene propiedades espectroscpicas caractersticas. Cuando
la protena es una enzima, como la lactato deshidrogenasa, se puede realizar un
ensayo enzimtico especfico para determinar si estamos llevando a cabo la
purificacin de manera adecuada. Esta actividad se realizar en el curso y se
encuentra descrita en la seccin 3 del manual. Para las protenas que no son
enzimas, el ensayo se basa en medir la actividad biolgica de la protena (si existe
interaccin protena-protena pueden determinarse cambios espectroscpicos
intrnsecos a las protenas involucradas o bien de molculas unidas covalentemente
como fluorforos) o bien en la deteccin de la protena con anticuerpos (si stos
estn disponibles).
En esta seccin se realizar la determinacin de protenas de cada una de las
fracciones obtenidas durante el protocolo de purificacin de la lactato
deshidrogenasa de msculo esqueltico de pollo. Este paso es necesario para
determinar la actividad especfica de la protena de inters. Adems debemos
conocer la concentracin de protenas porque llevaremos a cabo el corrimiento
electrofortico de todas las fracciones obtenidas de la purificacin y debemos
colocar cantidades iguales de protena en el gel para llevar a cabo la comparacin.
Investiga:
Qu es un fluorforo?
Cuantificacin de protenas por medicin de absorbancia a 280 nm.
El uso de la absorbancia en la regin ultravioleta para medir la concentracin de
protena es posiblemente el mtodo ms simple y rpido para determinar la
concentracin de protenas, aunque puede producir resultados poco exactos, sobre
todo cuando se tiene una mezcla de protenas y cidos nucleicos. Sin embargo, las
ventajas de emplearlo son: a) la muestra no se destruye durante la determinacin;
b) no es necesario producir una curva de calibracin; c) no utiliza reactivos
adicionales; y d) no requiere esperar tiempos de incubacin. Se debe contar con un
espectrofotmetro que mida en el intervalo de longitud de onda del UV y con celdas
de cuarzo o metacrilato grado UV o poliestireno grado ptico.
La cuantificacin de protena por la medida de la absorcin a 280 nm depende de
la presencia de los aminocidos aromticos tirosina (Tyr) y triptfano (Trp). Un alto
orden de estructuracin o plegamiento de la protena puede modificar la contribucin
de estos aminocidos en la absorbitividad molar del pptido o protena y, en
consecuencia, la absorbancia es sensible a cambios en el pH y fuerza inica del
medio. El uso ms comn del ensayo de absorbancia es el monitoreo de las
fracciones provenientes de las cromatografas, o cuando se requiere una estimacin
rpida de la concentracin de protenas an cuando no sea exacta.
Para calcular la concentracin de protenas de la muestra se usar la ecuacin de
Lambert y Beer y el coeficiente de extincin molar de la albmina de suero bovino
(BSA). Dependiendo en qu unidades se desee expresar la concentracin se
emplear un valor diferente de coeficiente de extincin, por ejemplo, para darlo en
molaridad se emplea 43 824 M-1 cm-1; cuando se desea reportar en g/L se usa
el coeficiente de extincin dado en porcentaje ( en la ecuacin 4), que es de 6.6
para una solucin de BSA al 1% (10 mg/mL) y se emplea la frmula 4 para
determinar la concentracin de la muestra.
Cuantificacin de protenas por un mtodo colorimtrico.
La determinacin de protenas por el mtodo de Bradford es ampliamente
usada ya que es simple, rpida, barata y sensible. Es necesario construir una curva
de calibracin para determinar la concentracin de las muestras. El mtodo se basa
en la unin especfica del colorante azul de Coomassie brillante G250 (CBBG) a los
residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las protenas. El CBBG se une a los residuos
de las protenas produciendo una absorbancia mxima a 595 nm, mientras que el
colorante libre tiene una absorbancia mxima a 470 nm. A diferencia del mtodo de
Lowry (otra tcnica colorimtrica para determinar protenas) que es muy sensible a
la composicin de la solucin que acompaa a las protenas, el mtodo de Bradford
slo es afectado por algunos detergentes. Una de las desventajas de este mtodo
es que el colorante CBBG se une fuertemente a las celdas de cuarzo. Por esto se
recomienda usar celdas de vidrio o de polipropileno. Al usar celdas de polipropileno
se facilita su limpieza con un poco de alcohol.
Referencias
Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY.
Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69.
Pgina web para consultar mtodos para determinar protenas:
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/protcurve.html.