REPORTE CIENTFICO

Introduccin
Tanto en la Universidad como fuera de ella, sin importar el tema, es importante que
expreses tus ideas o argumentos de manera clara y fcil de seguir, tanto en forma
oral como escrita. Actualmente, tanto las empresas como las instituciones
educativas y de investigacin buscan que su personal tenga habilidades adecuadas
de comunicacin.
Reflexiona:
Cmo utilizas diariamente tus habilidades para comunicarte?
Cmo se te facilita ms comunicarte con los dems, de manera oral o escrita?
Cules son tus fortalezas en el aspecto de la comunicacin?
Cules son tus debilidades? Cmo crees que puedes superarlas?

En el desarrollo de las ciencias, la comunicacin de las observaciones, resultados

y propuestas es fundamental para continuar construyendo el conocimiento. Los
cientficos comunican sus resultados y conclusiones de distintas maneras, por
ejemplo, conferencias, congresos y, principalmente, utilizando reportes cientficos.
El reporte cientfico no slo informa sobre los resultados de una investigacin, sino
tambin recopila la informacin previa del campo de investigacin, propone nuevas
ideas o modelos basados en los resultados, da cuenta de las limitaciones o
problemas en la investigacin, analiza los avances tecnolgicos que pueden ayudar
a replantear la direccin de una investigacin o llevar a la resolucin de un problema
en particular y tambin plantea nuevas preguntas que surgen a partir de los datos
obtenidos.
De hecho, uno de los objetivos fundamentales de la ciencia es la de dar respuesta
a las preguntas surgidas de la observacin, utilizando como base la literatura
cercana al tema de estudio, es decir, los conocimientos que otros cientficos han
generado sobre el tema.
Las hiptesis
Uno de los aspectos fundamentales para realizar una investigacin es plantear una
hiptesis.
Reflexiona:
Para qu crees que les sirven las hiptesis a los cientficos?
En qu crees que se basan los cientficos para plantear sus hiptesis?
Qu crees que ocurre cuando, despus de los experimentos, la hiptesis resulta
ser falsa?
Una hiptesis puede construirse en varios niveles. En su nivel ms simple, es la
prediccin de lo que se espera que ocurra en un experimento, mientras que en
niveles ms complejos, las hiptesis se utilizan para probar ideas o modelos muy
sofisticados que involucran muchos experimentos y un gran equipo
multidisciplinario.
En el caso del laboratorio de Bioqumica, generalmente plantears hiptesis
sencillas, es decir, debers predecir el resultado de los experimentos que realices y
fundamentar por qu piensas que ocurrirn de esa manera.
Para construir las hiptesis debes utilizar frases cortas en las que menciones las
variables que se estn manipulando y cmo se relacionan entre ellas, as como las
mediciones que se realizarn. Las hiptesis siempre deben plantearse en trminos
que puedas medir, para poder decir si se cumplieron o no. Adicionalmente, la
hiptesis incluye aquella informacin que previamente obtuvimos o conocemos
respecto a la investigacin, es decir, el fundamento que utilizamos para poder
realizar la prediccin. Para ayudarnos a construir la hiptesis generalmente se
utilizan las preposiciones si y entonces. Examinemos el siguiente ejemplo:
Si sentimos que la garganta nos duele, nos planteamos:
Si tengo dolor de garganta entonces podra deberse a que tengo una
infeccin en la garganta debida a bacterias o virus, o bien porque gritamos
mucho el da anterior.
Sin embargo, la anterior hiptesis no toma en cuenta lo que tenemos como
conocimiento previo. Al replantearla podemos decir:
Si s que el resfriado es contagioso y no estuve en contacto con alguien que
estuviera enfermo, y adems fui a un juego de ftbol en donde grit mucho,
entonces es probable que esto ltimo me causara el dolor de garganta.
A pesar de que mejor, la hiptesis no establece como se validar o no la prediccin,
es decir, no estamos proponiendo un experimento para medir si nuestra prediccin
se cumple. Entonces se podra mejorar diciendo:
Si no tengo fiebre o sntomas de una infeccin en la garganta, pero s una
inflamacin en la garganta, entonces el cultivo de exudado farngeo y otros
estudios clnicos darn negativo para una infeccin bacteriana o viral, por lo
que la inflamacin se deber a un uso excesivo de las cuerdas vocales.
En resumen, la hiptesis es una parte importante en una investigacin y como se
mostr, debe ser cuidadosamente planteada ya que considera el problema que se
est investigando, el conocimiento previo y el diseo del experimento.
Adicionalmente, al contrastar la hiptesis con los resultados se llega a conclusiones
vlidas, que permiten replantear las hiptesis y/o reportar lo encontrado.
Figura 1.1. Diagrama que representa el mtodo cientfico. Es importante recordar que el llamado
mtodo cientfico no es una serie de pasos a seguir, sino una estrategia flexible que no
necesariamente debe seguir este orden. Utilizamos este esquema porque es til para entender
cmo se puede dar sentido y estructura a una investigacin cuando debemos escribir un reporte
cientfico.
Reporte cientfico
Como se coment con anterioridad, el principal propsito de escribir un reporte cientfico es el
de comunicar la informacin que ha sido compilada como resultado de la investigacin, la
experimentacin y el anlisis de los datos. Estos reportes generalmente se publican en revistas
cientficas arbitradas, es decir, en revistas en las que los cientficos ms reconocidos en cierto
campo revisan todos los trabajos y valoran si deben publicarse o no. Los reportes cientficos
cubren una gran variedad de tpicos pero usualmente se enfocan en transmitir la informacin
con un propsito claro y para una audiencia especfica. Un buen reporte es un documento
preciso, objetivo y completo. Debe tambin estar bien escrito, claramente estructurado y ser
ameno, para que el lector mantenga la atencin en l. Generalmente, el valor de una
investigacin se evala a travs del reporte, es decir, el reporte escrito es el nico producto
tangible de cientos de horas de trabajo. Es por esto que el reporte debe ser de gran calidad.

Frecuentemente, los reportes presentan las siguientes secciones: resumen del contenido,
introduccin o antecedentes, mtodos, resultados, discusin, conclusiones, recomendaciones
o perspectivas y referencias. La inclusin de recomendaciones generalmente ocurre en reportes
para la industria y son determinantes para la toma de decisiones por parte de los directivos. A
continuacin se da una breve descripcin de cada una de las secciones que conforman un
reporte cientfico.

Resumen. Su funcin es presentar un avance del contenido del reporte de una manera en la
que el lector juzgue si le interesa leer el reporte completo. Se incluyen los antecedentes ms
relevantes, una frase sobre el objetivo del proyecto, una descripcin corta de los mtodos que
se usaron, los principales resultados y las conclusiones o implicaciones de los resultados. El
resumen normalmente se escribe como un solo prrafo de 100 a 200 palabras.

Introduccin. Contiene la informacin necesaria para que el lector conozca por qu es

importante el reporte, as como de qu trata. La informacin que se utiliza en la introduccin
se basa en la literatura cientfica publicada con anterioridad y va de lo general a lo especfico,
esto es, se comienza primero desde un contexto amplio del tema, lo que facilita entender los
conceptos y la importancia del tpico de la investigacin en un rea particular de estudio.
Despus, se hace un resumen de investigaciones anteriores, propias o de otros investigadores
(literatura especfica) para ayudar a justificar la presente investigacin, es decir, se le comunica
al lector qu se sabe y qu no se sabe sobre el tema en cuestin. Esto lleva directamente a una
seccin en la que se plantean las preguntas de investigacin del trabajo, es decir, las hiptesis.
En algunas publicaciones se requiere que la parte final de la introduccin contenga los objetivos
del estudio.

Mtodos. El propsito de esta seccin es describir precisamente los materiales y mtodos

usados para realizar los experimentos, siempre con suficiente detalle para que alguien ms
pueda reproducirlos. Algunas veces se debe justificar por qu se us un mtodo en particular,
ya que puede haber una variedad de mtodos alternativos para responder una pregunta o
investigar un fenmeno. La seccin de mtodos debe escribirse en pasado, ya que describe lo
que se hizo.
Resultados. En esta seccin se describen pero no se explican los resultados, es
decir, slo presenta los hechos que sern analizados posteriormente en el reporte.
La seccin de resultados debe ser clara y precisa y generalmente contiene figuras,
como diagramas, tablas, grficas, cuadros o mapas que pueden ser muy tiles para
mostrar o enfatizar la informacin en un reporte. Las figuras deben ser usadas para
compilar los datos de una manera ordenada, son una herramienta til para ayudar
a los lectores a entender datos complejos o numerosos.
Los investigadores deben disear cuidadosamente sus figuras de manera que
presenten la informacin de manera sencilla y clara. Es esencial que las figuras
estn integradas correctamente en el cuerpo del reporte, que se indiquen
claramente en el texto (con la numeracin asignada) cuando se mencionen y
siempre deben explicarse. Un error comn es mencionar la figura y slo decir que
los datos se encuentran en ella. Lo correcto es explicarle al lector cules datos son
relevantes en la figura, cmo se relacionan dichos datos con lo descrito en otras
figuras o utilizar los datos que en ella se presentan para justificar por qu se realiz
el siguiente experimento que se presenta en el reporte. La descripcin de esta
seccin al igual que la de mtodos se hace en pasado.
Discusin. La seccin de discusin tiene dos objetivos principales: 1) explicar los
resultados del estudio con base en la literatura cientfica existente y 2) evaluar si lo
encontrado en el estudio tiene un significado prctico, biolgico, y/o est relacionado
con otro fenmeno. Para ello se necesita: a) interpretar y explicar los resultados; b)
evaluar si las preguntas que se plantearon en la hiptesis han sido contestadas; c)
mostrar cmo los resultados de la investigacin se relacionan con los que han sido
reportados anteriormente; d) calificar y evaluar la importancia y significado de los
resultados, esto es, si los resultados son estadsticamente significativos, o si existi
algn defecto en el diseo o en el procedimiento que pudo afectar el resultado; e)
plantear nuevas preguntas o determinar si se abrieron nuevas reas de inters. La
descripcin de sta seccin se hace en presente.
Conclusiones. Esta seccin puede ser incluida como parte de la discusin o bien
como una seccin aparte. Establece de manera clara y concisa cul es la relevancia
del trabajo y sus implicaciones.
Referencias. Es necesario incluir una lista de referencias, las cuales deben estar
citadas en el cuerpo del reporte. Las referencias se pueden colocar en una lista por
orden alfabtico, o numeradas de acuerdo a como fueron apareciendo en el texto.
Cada referencia debe contener toda la informacin bibliogrfica. Existen diversas
formas de citar la literatura consultada, como la APA, Harvard o Chicago, entre
otras. Cada publicacin tiene distintos requisitos para presentar las referencias.
Referencias
Day, Robert A. How to Write and Publish a Scientific Paper. 4th edition. Phoenix, AZ: Oryx Press, 1994.

Williams, Joseph M. Style: Ten Lessons in Clarity and Grace. 6th edition. New York: Longman, 2000.
PARTE II: REVISIN DE MTODOS ESPECTROSCPICOS Y ELABORACIN
DE CURVA ESTNDAR DE PROTENA
Introduccin
El espectrofotmetro es un instrumento ampliamente utilizado en el anlisis
cualitativo y cuantitativo de molculas biolgicas. Esto quiere decir que este
instrumento nos ayuda a determinar cules sustancias (protenas, lpidos,
carbohidratos, cidos nucleicos, entre otras), estn presentes en una disolucin y
en qu cantidad. Los espectrofotmetros pueden emitir radiaciones de diferentes
longitudes de onda tanto en el ultravioleta como en el visible.
Muchas sustancias absorben radiacin a diferente longitud de onda (puede ser en
el espectro visible o en el ultravioleta), por tanto, cuando determinamos a qu
longitud de onda absorbe una sustancia desconocida, podemos tener idea de qu
tipo de molcula se trata. Esta misma propiedad se utiliza para cuantificar la
sustancia: a mayor cantidad de radiacin absorbida, mayor concentracin de sta.
Si la sustancia no absorbe radiacin en el ultravioleta o el visible, puede modificarse
qumicamente para producir un compuesto que s absorba en estas longitudes de
onda. A este tipo de mediciones se les conoce como indirectas.
Leyes que rigen la espectrofotometra
Cuando un haz luminoso de intensidad P0 pasa a travs de una solucin, parte de
ste se absorbe, por lo tanto la intensidad de la radiacin emergente P es menor al
incidente P0. La relacin entre ambos se denomina transmitancia, T:
T= P/P0. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . (1)
La cantidad de luz absorbida es proporcional al nmero N de iones o molculas
capaces de absorber energa; por lo tanto, T disminuye a medida que la
concentracin aumenta.
Ley de Lambert y Beer, conocida generalmente como Ley de Beer, considera que
al dividirse la solucin en pequeas secciones, en cada una de ellas se absorber
una pequea cantidad de radiacin P, que es proporcional a N. Tomando en cuenta
que N es directamente proporcional a la concentracin y si la longitud por la que
pasa el haz de luz (longitud de la celda) es constante, podemos llegar a la ecuacin
general:
-log P/ P0= abc . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (2)
Donde:
c es la concentracin
b es la longitud de la celda o paso ptico
a es la constante de proporcionalidad llamada absortividad o coeficiente de extincin 10
La absortividad o coeficiente de extincin mide qu tanto una sustancia absorbe
la radiacin a una longitud de onda determinada. Es una caracterstica propia de
cada especie qumica y depende de su estructura. El valor de la absortividad para
un compuesto vara con la longitud de onda.
A la relacin -log P/ P0 se le denomina absorbancia de la solucin (A) y es
especfica para una longitud de onda dada (). Por tanto, la ecuacin final que define
a la ley de Beer queda de la siguiente manera:
A= abc . . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . (3)
Es importante mencionar que se le coloca el superndice a la absorbancia A y a la
constante de proporcionalidad a porque dependen de la longitud de onda (ec. 3). Si
la concentracin se expresa en molaridad, entonces se denomina a la constante de
proporcionalidad coeficiente de absortividad molar o coeficiente de extincin ().
Convencionalmente, el paso de la luz en las celdas de laboratorio es de 1 cm, por
lo que las unidades de son cm-1mol-1L. Hay que destacar que A es adimensional,
ya que por definicin es un ndice.
Podemos construir una grfica para observar cmo vara la absorbancia de una
especie en solucin a una longitud de onda dada en funcin de su concentracin. A
esta grfica se le llama curva de calibracin o curva estndar y para construirla
se mide la absorbancia de varias soluciones de concentracin conocida, llamadas
disoluciones estndar. Es una lnea recta y de acuerdo con la ecuacin 3 la
pendiente es b.

Conociendo y la longitud del paso de la luz b, la concentracin de la sustancia en

cualquier otra muestra puede ser determinada usando la Ley de Lambert-Beer. La
cuantificacin de la especie debe realizarse a la longitud de mxima absorcin.
La ley de Lambert-Beer para cuantificar compuestos se utiliza de manera rutinaria
en el laboratorio de bioqumica. Una de sus aplicaciones principales es para
determinar la concentracin de protenas en una solucin.
Determinacin de la concentracin de protenas
Dos aplicaciones comunes de la determinacin de la concentracin de protenas
son: 1) para reportar la actividad especfica de una enzima (esto es la velocidad a
la que una cantidad definida de enzima forma productos o usa el sustrato por
unidad de tiempo) y 2) para hacer un cargado homogneo de protena en geles de
poliacrilamida-SDS.
Existen varios mtodos para medir protenas totales, y la eleccin de cul utilizar
depende de su aplicacin. Por ejemplo, para el clculo de la actividad enzimtica,
se requiere tener exactitud en los resultados, mientras que para colocar
cantidades iguales de protena en un gel de poliacrilamida-SDS, la precisin es
ms importante.
Cuantificacin de protenas por el mtodo colorimtrico de Lowry. Cuando a
un pptido o protena en disolucin bsica se le hace reaccionar con cobre se
forma un compuesto colorido por coordinacin entre los nitrgenos del pptido con
el ion metlico. En el mtodo de Lowry, el reactivo de Folin-Ciocalteu (mezcla de
fosfomolibdato y fosfotungstato) se aade para incrementar la cantidad de color
desarrollado. El aumento en el color ocurre cuando el complejo de cobre
tetradentado transfiere los electrones al complejo fosfomolibdato/ fosfotungstato,
reaccin que produce una coloracin azul que se lee a 750 nm. Esta reduccin del
reactivo de Folin-Ciocalteu ocurre solamente con los residuos de tirosina y
triptfano de la protena.
La determinacin de protenas con el mtodo de Lowry tiene varias ventajas: es un
ensayo 10 a 20 veces ms sensible que la medicin de la absorcin ultravioleta de
las protenas (280 nm), es varias veces ms sensible que la deteccin con
ninhidrina y 100 veces ms sensible que la reaccin de Biuret. Sin embargo, hay
algunas desventajas del mtodo como son que el color vara dependiendo de la
protena que se determina y que hay varios reactivos usados en la obtencin de
protenas que interfieren con la reaccin.
Referencias
Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY.
Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69.
Peterson GL. 1977. A simplification of the protein assay method of Lowry et al.
which is more generally applicable. Analytical Biochemistry 83, 346-356.
Wang Y, Wade H, Wong E-T, Li YC, Rodewald LW, Wahl GM 2007. Quantitative
analyses reveal the importance of regulated Hdmx degradation for P53 activation.
PNAS 104 (30), 12365-12370.
2. ESTRUCTURA Y PROPIEDADES DE PROTENAS.
Purificacin de la enzima lactato deshidrogenasa de msculo esqueltico de
pollo. PARTES I Y II DEL PROTOCOLO.
Introduccin
Todos los tejidos contienen miles de protenas que difieren en tamao, forma y
carga. Algunas tienen actividad enzimtica y otras cumplen otras funciones (por
ejemplo, estructurales). Una condicin esencial para el estudio de la estructura y
funcin de una protena especfica es su purificacin a partir de los tejidos. Hay
varios aspectos que deben considerarse para seleccionar un mtodo para purificar
una protena, como por ejemplo, para qu se usar la protena (e.g. si es una
enzima, si determinaremos su actividad, o si queremos conocer la secuencia de sus
aminocidos o su conformacin en el espacio), cules son sus caractersticas
(tamao, carga, solubilidad, hidrofilicidad y funcin biolgica), la cantidad que se
requiere purificar y el costo. Por lo tanto, no hay un procedimiento nico para la
purificacin de protenas, aunque s podemos seguir una gua bsica para realizar
la purificacin de forma sistemtica. Dicha gua toma en consideracin lo siguiente:
A. Definir los objetivos de la purificacin. Grado de pureza, cantidad y nivel de
actividad requeridos.
B. Seleccionar la muestra biolgica de inicio. Depender de la localizacin de la
protena, puede estar tanto en compartimentos extracelulares o intracelulares.
C. Desarrollar una tcnica de anlisis. Esta tcnica se utilizar para la
determinacin rpida de la pureza, actividad o contenido total de protena. Un
mtodo frecuentemente utilizado para evaluar la pureza es la separacin de la
protena mediante electroforesis, que se detallar ms adelante.
D. Minimizar la manipulacin de la muestra. Evitar los procedimientos largos, ya
que se corre el riesgo de perder la actividad biolgica de la protena y/o reducir el
rendimiento.
E. Remover los posibles contaminantes al inicio del proceso. Un ejemplo son
las proteasas, que pueden degradar la protena de inters.
F. Reducir el uso de aditivos. El uso de muchos y diversos aditivos como sales y
amortiguadores en cada paso puede llevar a la prdida de la actividad de la enzima
y aumentar los costos de la purificacin. Se deben seleccionar y usar slo los
aditivos necesarios.
G. Usar una tcnica diferente en cada paso. Esto es porque la sucesiva repeticin
de un mismo paso no mejora la pureza de la preparacin pero s disminuye el
contenido proteico. Para seleccionar la tcnica adecuada en cada paso se deben
tomar en cuenta las propiedades fisicoqumicas de la protena como tamao, carga,
hidrofobicidad y especificidad por ligandos.
H. Minimizar el nmero de pasos. En cada paso de purificacin se pierde protena
y tiempo. Generalmente se utilizan entre 5 y 8 pasos de purificacin para obtener
un enriquecimiento alto de la preparacin proteica.
Un protocolo tpico de purificacin de una protena intracelular utiliza varias tcnicas
(detalladas ms adelante), que pueden incluir:
1 fase: Ruptura de las membranas celulares, centrifugacin diferencial o
centrifugacin usando gradiente de densidad (para separar protenas de las
partculas subcelulares, o bien, de agregados de diferente peso molecular).
2 fase: Puede incluir la precipitacin selectiva de protenas por la adicin de sales
o disolventes miscibles en agua.
3 fase: Se remueven las protenas contaminantes utilizando la separacin basada
en la carga, tamao y afinidad de la protena.
A continuacin se describen brevemente las tres fases del proceso y algunas
tcnicas para purificar una protena.
SELECCIN DE LA FUENTE DE LA PROTENA. Las fuentes de la protena
pueden ser muy variadas: microorganismos, tejidos, cultivos celulares, clulas
transformantes1, entre otras. La eleccin de la procedencia de la protena debe
basarse en criterios tales como el tipo de protena, la facilidad para obtener
cantidades suficientes de biomasa, la cantidad de la protena de inters en el tejido
o clula, y cualquier propiedad peculiar de la protena escogida (como su carga,
masa o afinidad por ciertos sustratos), que ayudar en su estabilizacin y su
aislamiento. En algunos casos, el investigador necesita forzosamente utilizar un
tejido en particular, an cuando la cantidad del tejido y de la protena es escaso. La
recomendacin para estos casos es realizar un ensayo piloto con una fuente de
protena distinta a la requerida, pero que tenga propiedades similares.
PRIMERA FASE.
El objetivo inicial de la purificacin es la obtencin del homogeneizado o extracto
crudo y su clarificacin o concentracin. La homogeneizacin es un proceso donde
las clulas y los tejidos son lisados o rotos en fragmentos lo suficientemente
pequeos para dar lugar a una suspensin uniforme y estable llamada
homogeneizado. Los equipos con los que se realiza la homogeneizacin son
diversos y comprenden desde el mortero hasta las ondas ultrasnicas pasando por
la licuadora. El mtodo a utilizar para obtener el homogeneizado depende de la
dificultad que presente el material biolgico para romperse. Igualmente importante
al mtodo de homogeneizacin es la seleccin de la solucin de homogeneizacin,
puesto que ser el medio al que estar expuesta la protena y en el que se pueden
adicionar componentes para ajustar el pH, la fuerza inica, inhibidores de proteasas
o algn estabilizador de la protena.
Posteriormente, para eliminar los contaminantes o clarificar la muestra se puede
recurrir al proceso de centrifugacin. La centrifugacin utiliza la fuerza de gravedad
para separar los diferentes componentes del homogeneizado (como restos de tejido
u organelos, por ejemplo), basndose en su tamao, forma y densidad. Despus de
la centrifugacin, algunas de las partculas ms pesadas, que normalmente
permanecan en suspensin, se sedimentan.
Es importante conocer la fuerza centrfuga a la que someteremos la muestra, ya
que de sta depende el tamao (o la densidad) de los componentes que se
sedimentarn y los que quedarn en suspensin. La fuerza centrfuga relativa (RCF)
se calcula con la siguiente ecuacin:

1 Clulas a las que se les introdujo un gene que codifica una protena proveniente
de otro organismo, a travs del uso de tcnicas de biologa molecular
Donde RPM son las revoluciones por minuto de un rotor con un radio r (expresada
en mm). El radio usado es la distancia del centro del eje del rotor a la posicin
intermedia del tubo.
La fuerza centrfuga creada puede ser tan pequea como 600 Xg (600 veces la
gravedad) o tan grande como 300,000 Xg. En el primer caso se sedimentan
fragmentos de tejido, clulas intactas y ncleos, entre otros. Si la fuerza aplicada es
intermedia (13,000 Xg), podemos separar los organelos celulares y, cuando la
fuerza es muy grande (100,000 Xg), la mayor parte de las molculas solubles que
componen el citosol permanecen en solucin y las molculas aglomeradas en las
membranas sedimentan (denominada fraccin microsomal). Como puedes ver,
dependiendo de la fuerza aplicada, la sedimentacin vara. Esto implica que
podemos realizar un proceso llamado centrifugacin diferencial, en el que el
homogeneizado se somete a una serie de centrifugaciones a distintas fuerzas para
ir desechando gradualmente los contaminantes de la muestra y avanzar en la
purificacin de la protena de inters.
SEGUNDA FASE
El objetivo principal es remover los contaminantes ms pequeos, de una forma
especfica. stos pueden ser protenas, cidos nucleicos, toxinas y virus. Uno de
los mtodos ms utilizados para eliminar protenas contaminantes es la
precipitacin. Para que una protena precipite debemos modificar el ambiente que
le rodea, debido a que los grupos cargados en la superficie de una protena pueden
interaccionar tanto con las molculas de agua como con los iones que se
encuentran en solucin.
Existen varias estrategias para precipitar a las protenas tales como cambio de pH,
incremento en la temperatura, adicin de disolventes, de molculas cargadas, etc.
El mtodo ms comnmente empleado es la precipitacin por salado con
(NH4)2SO4.
Las protenas globulares aumentan su solubilidad al incrementar la concentracin
de iones, fenmeno denominado de salting in. Pero cuando se eleva en exceso
la concentracin de iones, disminuye la solubilidad de las protenas y precipitan
(salting out). La mayor parte de las protenas presentan en su superficie una capa
de agua (capa de solvatacin) que al incrementar la concentracin de los iones
disminuye. El mecanismo de salting-out se basa en la exclusin del cosolvente, es
decir la sal establece puentes de hidrgeno con el agua y al hacerlo sustrae el agua
de la protena. Por lo anterior, la conformacin de la protena se modifica para evitar
la exposicin de sus residuos apolares con el solvente, dando como resultado
nuevas interacciones y por lo tanto lleva a la formacin de plegamientos o
asociaciones nuevas que pueden llevar a su precipitacin. El mtodo del salting out
es uno de los ms utilizados en la purificacin de protenas, ya que permite
deshacerse de una gran cantidad de contaminantes de una forma econmica. Es
por esto que se han diseado tablas y frmulas en las que se pueden determinar
las cantidades de (NH4)2SO4 slido o en solucin, que se deben aadir a una
mezcla de protenas para obtener una concentracin dada de sal. La precipitacin
de una protena a una concentracin dada de sal depende las propias
caractersticas inicas y de contenido de residuos polares, por lo que cada protena
precipita a cierta concentracin y tipo de sal. Para establecer est concentracin se
deben de realizar pruebas. Adems, se tiene que determinar si la protena
permanece activa o pierde su actividad biolgica al ser precipitada.
Despus de la precipitacin hay que retirar el agente precipitante, que es
comnmente la sal. Una manera es diluir la solucin para reducir la concentracin
del compuesto, otras formas pueden ser la dilisis, la ultrafiltracin o bien, el paso
por una columna de exclusin molecular. A continuacin se describen brevemente
estas tcnicas.
La dilisis suele llevarse a cabo colocando la muestra en un tubo de dilisis, que
es una membrana semipermeable de celulosa o celofn con un tamao de poro
determinado. Se coloca la muestra dentro del tubo de dilisis y ste se sumerge en
una solucin que contiene al menos 30 veces ms volumen que la muestra a
dializar. Lo anterior aumenta las probabilidades de que la alta concentracin de sal
en el tubo migre hacia la solucin en la que se encuentra baada el tubo y cuando
se alcance el equilibrio, la concentracin de sal en la muestra y la solucin de dilisis
sea muy baja. Existen dos desventajas de la dilisis: el costo de la membrana de
dilisis y que el proceso incluye la agitacin del tubo de dilisis a 4C durante toda la
noche.
Por su parte, la filtracin en gel no tiene el problema del tiempo. Una columna
empacada con Sefadex-G25 puede usarse para eliminar molculas de peso
molecular menores a 5000 daltones. La muestra se coloca en la columna, y al aadir
el amortiguador de elucin, las molculas de menor tamao se meten entre los
poros de la matriz de Sefadex y se retienen all, mientras que las grandes no se
retienen y salen ms rpidamente de la columna. Posteriormente eluyen o salen las
de peso molecular menor. En un simple paso la muestra se desala, concentra,
cambia de amortiguador y pierde protenas o molculas contaminantes.
TERCERA FASE
El objetivo de esta fase es obtener una protena pura o con mnimas trazas de
contaminantes proteicos. Para alcanzar el objetivo se utilizan uno o la combinacin
de varios mtodos cromatogrficos, como la cromatografa de exclusin molecular,
de intercambio inico, interaccin hidrofbica y de afinidad. A continuacin slo se
describen las dos tcnicas que se usarn en el laboratorio.
La cromatografa de intercambio inico es una tcnica que separa las
biomolculas de acuerdo con su carga. Los grupos cargados sobre la superficie de
una protena interaccionan con los grupos con carga opuesta de la fase
estacionaria.
La purificacin de protenas con este tipo de cromatografa se basa en que la carga
electrosttica de las protenas depende del pH en el que se encuentran. El pH en el
que se iguala el nmero de cargas positivas y las negativas se llama punto
isoelctrico o pI y es diferente para cada protena. A valores de pH menores al pI,
la carga neta de una protena es positiva, por lo que puede unirse fuertemente a
una resina con cargas negativas o intercambiador catinico. Por el contrario, a un
pH mayor al pI, la protena tendr carga negativa y ser capaz de unirse a
intercambiadores de tipo aninico que contienen grupos cargados positivamente
(Figura 2.1). Cuando una protena tiene muchas cargas positivas o negativas, la
fuerza con que se une a la columna es mayor que si tiene pocas cargas. Para eluir
a la protena de inters se utilizan soluciones que modifican el pH o la concentracin
de sales en la resina. Estas sales tambin pueden interactuar con la resina,
reemplazando a las protenas que estn adheridas a ella. Debido a que la
separacin de las protenas de la matriz utilizando sales ocurre en orden de menor
a mayor fuerza de unin (dependiendo de qu tan cargada est la protena), es
comn eluir a las protenas usando un gradiente de concentracin de sales en orden
creciente de concentracin.
Figura 2.1.Separacin por cromatografa de intercambio inico. Los soportes o
resinas de cromatografa pueden estar cargados positiva o negativamente. De esta
carga depende cules son las molculas que interaccionarn con la resina.
Cromatografa de afinidad. Si la protena a purificar tiene una afinidad especfica
por un ligando como un cofactor, un anticuerpo o un ion metlico, esa propiedad
puede usarse para purificarla. Por ejemplo, para purificar a una deshidrogenasa es
comn usar al cofactor de la enzima, el NAD+ o bien un compuesto que presente
alguna similitud a ste (Figura 2.2).
Cuando la muestra atraviesa la columna de afinidad, la protena de inters se unir
al ligando, mientras que el resto saldr de la columna. Este tipo de separacin,
basada en el reconocimiento biolgico, es muy especfica y elimina muchos
contaminantes.

Figura 2.2. Comparacin entre las molculas de Cibacrn blue 3GA y el NAD+. A) Los colorantes de triazina
como el Cibacrn blue 3GA son comnmente acoplados a resinas de agarosa para utilizarse en ensayos de
purificacin por cromatografa de afinidad. La molcula es estable, fcil de remover, barata y varias compaas
las tienen disponibles para realizar purificaciones de protenas que unen nucletidos de piridina B) NAD+.
Referencias
Allen T, Mark W. 2004. Desalting, Concentration, and Buffer Exchange by dialysis
and ultrafiltration. Current protocols in protein science 4.4.1-4.4.15. John Wiley &
Sons Inc, New York, USA.
Castle DJ. 2004. Overview of cell fractionation. Current protocols in protein science
4.1.1-4.1.9. John Wiley & Sons Inc, New York, USA.
Devlin TM. Textbook of biochemistry with clinical correlations. Cuarta edicin.
1997. John Wiley & Sons Inc, New York, USA. Pp 69-85. Localizacin QP514.T4
Protein purification Handbook. 1999. Amhersham Pharmacia Biotech AB. Uppsala,
Sweden. Code number 18-1132-29 Pp 94.
Salem J. 2001. Enzymes: purification. Encyclopedia of life sciences. John Wiley &
Sons Ltd. Pp 1-7. Consultar la pgina www.els.net
Sheehan D, OSullivan S. 2001. Ion exchange chromatography. Encyclopedia of
life sciences. John Wiley & Sons Ltd. Pp 1-4. Consultar la pgina www.els.net
Voet D, Voet JG. Biochemistry. Segunda edicin. 1995. John Wiley & Sons Inc,
New York, USA. Pp 71-104
Sitio del que se tomo parte de la metodologa para la extraccin de la lactato
deshidrogenasa de pollo
http://www.acad.carleton.edu/curricular/BIOL/classes/bio380/lab_protocol.html
autor: John Tymoczko y actualizada por Rebecca Bryant

Sitios recomendados para

1. Aprender sobre las caractersticas y propiedades de las protenas
http://depa.pquim.unam.mx/proteinas/estructura/index.html pgina desarrollada
por el Dr. Rogelio Rodrguez Sotres.

2. Calcular la concentracin de sulfato de amonio a aadir a una muestra.

http://www.encorbio.com/protocols/AM-SO4.htm
http://www.proteinchemist.com/cgi-bin/s2.pl

3. Calcular la fuerza centrfuga de un rotor. Convierte rpm a Xg o vicerversa.

http://www.gmi-inc.com/archivedpages/Rotor%20RCF%20Calculator.htm

4. Macro-Prep Ion Exchange Supports. Instruction manual (2000).

Biorad www.bio-rad.com

5. Aprender sobre cromatografa

http://www.ub.es/biocel/wbc/tecnicas/cromatografia.htm

6. Realizar una autoevaluacin sobre los fundamentos de la cromatografa

http://www4.ujaen.es/~acarrera/TBQ_HotPot/T3_TBQ_VF/T3_TBQ_VF.htm
Parte III. Monitoreo del proceso de purificacin.
A. Determinacin de la concentracin de protenas

Introduccin
Para evaluar de manera cuantitativa el xito de una purificacin de protenas es
necesario conocer dos parmetros en cada paso del proceso de purificacin: el
rendimiento y el grado de pureza.
El rendimiento es un parmetro expresado en porcentaje que se obtiene de medir
la actividad biolgica de la protena de inters en cada paso de la purificacin. El
100% corresponde a la actividad del extracto inicial.
El grado de pureza se refiere al incremento en pureza a lo largo del proceso. Este
valor se obtiene de dividir la actividad especfica de cada paso entre la actividad
especfica del paso inicial de purificacin. El ndice da el valor de 1 para el extracto
inicial.
Para obtener el valor de la actividad especfica (que se encuentra generalmente
expresado en Unidades/ mg protena) es necesario contar con a) una tcnica que
determine la concentracin de protenas totales en la muestra, y b) una tcnica que
especficamente detecte o mida la cantidad de la protena blanco o de inters
(unidades de actividad). En casos raros, la protena blanco es fcil de detectar,
porque es colorida (mioglobina), porque es fluorescente (protena verde
fluorescente) o porque tiene propiedades espectroscpicas caractersticas. Cuando
la protena es una enzima, como la lactato deshidrogenasa, se puede realizar un
ensayo enzimtico especfico para determinar si estamos llevando a cabo la
purificacin de manera adecuada. Esta actividad se realizar en el curso y se
encuentra descrita en la seccin 3 del manual. Para las protenas que no son
enzimas, el ensayo se basa en medir la actividad biolgica de la protena (si existe
interaccin protena-protena pueden determinarse cambios espectroscpicos
intrnsecos a las protenas involucradas o bien de molculas unidas covalentemente
como fluorforos) o bien en la deteccin de la protena con anticuerpos (si stos
estn disponibles).
En esta seccin se realizar la determinacin de protenas de cada una de las
fracciones obtenidas durante el protocolo de purificacin de la lactato
deshidrogenasa de msculo esqueltico de pollo. Este paso es necesario para
determinar la actividad especfica de la protena de inters. Adems debemos
conocer la concentracin de protenas porque llevaremos a cabo el corrimiento
electrofortico de todas las fracciones obtenidas de la purificacin y debemos
colocar cantidades iguales de protena en el gel para llevar a cabo la comparacin.
Investiga:
Qu es un fluorforo?
Cuantificacin de protenas por medicin de absorbancia a 280 nm.
El uso de la absorbancia en la regin ultravioleta para medir la concentracin de
protena es posiblemente el mtodo ms simple y rpido para determinar la
concentracin de protenas, aunque puede producir resultados poco exactos, sobre
todo cuando se tiene una mezcla de protenas y cidos nucleicos. Sin embargo, las
ventajas de emplearlo son: a) la muestra no se destruye durante la determinacin;
b) no es necesario producir una curva de calibracin; c) no utiliza reactivos
adicionales; y d) no requiere esperar tiempos de incubacin. Se debe contar con un
espectrofotmetro que mida en el intervalo de longitud de onda del UV y con celdas
de cuarzo o metacrilato grado UV o poliestireno grado ptico.
La cuantificacin de protena por la medida de la absorcin a 280 nm depende de
la presencia de los aminocidos aromticos tirosina (Tyr) y triptfano (Trp). Un alto
orden de estructuracin o plegamiento de la protena puede modificar la contribucin
de estos aminocidos en la absorbitividad molar del pptido o protena y, en
consecuencia, la absorbancia es sensible a cambios en el pH y fuerza inica del
medio. El uso ms comn del ensayo de absorbancia es el monitoreo de las
fracciones provenientes de las cromatografas, o cuando se requiere una estimacin
rpida de la concentracin de protenas an cuando no sea exacta.
Para calcular la concentracin de protenas de la muestra se usar la ecuacin de
Lambert y Beer y el coeficiente de extincin molar de la albmina de suero bovino
(BSA). Dependiendo en qu unidades se desee expresar la concentracin se
emplear un valor diferente de coeficiente de extincin, por ejemplo, para darlo en
molaridad se emplea 43 824 M-1 cm-1; cuando se desea reportar en g/L se usa
el coeficiente de extincin dado en porcentaje ( en la ecuacin 4), que es de 6.6
para una solucin de BSA al 1% (10 mg/mL) y se emplea la frmula 4 para
determinar la concentracin de la muestra.
Cuantificacin de protenas por un mtodo colorimtrico.
La determinacin de protenas por el mtodo de Bradford es ampliamente
usada ya que es simple, rpida, barata y sensible. Es necesario construir una curva
de calibracin para determinar la concentracin de las muestras. El mtodo se basa
en la unin especfica del colorante azul de Coomassie brillante G250 (CBBG) a los
residuos de Arg, Trp, Tyr, His y Phe de las protenas. El CBBG se une a los residuos
de las protenas produciendo una absorbancia mxima a 595 nm, mientras que el
colorante libre tiene una absorbancia mxima a 470 nm. A diferencia del mtodo de
Lowry (otra tcnica colorimtrica para determinar protenas) que es muy sensible a
la composicin de la solucin que acompaa a las protenas, el mtodo de Bradford
slo es afectado por algunos detergentes. Una de las desventajas de este mtodo
es que el colorante CBBG se une fuertemente a las celdas de cuarzo. Por esto se
recomienda usar celdas de vidrio o de polipropileno. Al usar celdas de polipropileno
se facilita su limpieza con un poco de alcohol.
Referencias
Maniatis T, Fritsch EF, Sambrook J. 1982. Molecular cloning a laboratory manual.
Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Springs Harbor, NY.
Stoscheck CM. Quantitation of Protein. 1990. Methods in Enzymology 182, 50-69.
Pgina web para consultar mtodos para determinar protenas:
http://www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/protein/protcurve.html.