I N T R O D U C C I Ó N

H I S T Ó R I C A A L L O S V I R U S

E S T U D I O

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a) UN ANTIGUO PROBLEMA EN LA PATOLOGÍA DE LOS SERES VIVOS El términó virología ha sido incorporado al vocabulario durante las últimas décadas. La primera revista científica dedicada exclusivamente al campo de la virología: Archiv für die Gesamte Virusforschung, hoy conocida como Archives of Virology, empezó su publicación en 1939. El primer texto dedicado sólo a la virología: General Virology, de Salvatore Luria, fue publicado en 1953. Sin embargo, los virus han estado acompañando al hombre durante toda su historia y el término virus tiene muchos siglos de existencia, aunque su uso y connotaciones han variado notablemente a lo largo del tiempo. Se puede decir, en forma un tanto arbitraria, que los orígenes de la disciplina científica hoy día conocida como virología apenas se remontan a las décadas finales del siglo XIX. Pero considerando aspectos epidemiológicos* y semiológicos** dentro del registro histórico, encontramos que enfermedades como la rabia han sido descritas y registradas meticulosamente por más de dos mil años. En el caso particular de la rabia, su misterioso origen, su capacidad para transformar a un perro domesticado en bestia feroz, su largo e impreciso periodo de incubación y los dramáticos síntomas que preceden al final fatal de esta enfermedad en los humanos, constituyen un cuadro pavoroso y a la vez irresistible, que ha merecido la atención de los escritores y pensadores de la Antigüedad. Si se comparan las antiguas descripciones hechas por cronistas griegos y romanos con los casos más recientes de rabia tanto en animales como en humanos, encontramos que desde el punto de vista clínico el virus de la rabia no ha cambiado a lo largo de los siglos. Esta característica lo distingue de otros virus patógenos (capaces de producir enfermedad), confiriéndole una posición única en la historia de la medicina. Diferentes ideas acerca de la causa y el origen de la rabia han sido concebidas en diferentes épocas. Una de las primeras descripciones de la rabia que han sobrevivido hasta nuestros días es la de Aristóteles. "la rabia vuelve loco al animal, y cualquier especie de animal, con excepción del hombre, será contaminado con esta enfermedad si es mordido por un perro rabioso. La enfermedad es fatal para el propio perro y cualquier otro animal mordido por éste, con excepción del hombre". Autores posteriores muchos de los cuales dudaron en cuestionar la credibilidad del gran filósofo griego, se mostraron sorprendidos por la referencia de Aristóteles a la supuesta insusceptibilidad del ser humano para ser contaminado por la rabia. Así, algunos autores propusieron que originalmente el agente causal de la rabia no podía contagiar al hombre y solamente al cabo de los siglos el misterioso agente causal de esta enfermedad había adquirido la capacidad de afectar al ser humano. Sin embargo, el médico renacentista Girolamo Fracastoro hizo notar que Aristóteles solamente quería recalcar el hecho de que no todos aquellos humanos mordidos por un perro rabioso desarrollarían la enfermedad en forma obligatoria.

Una descripción de la rabia más precisa y detallada fue proporcionada en el libro De medicina, escrito por Celso, un médico que vivió en el siglo I, en el apogeo del Imperio romano. En particular, hay una frase en el texto de Celso que ha llamado poderosamente la atención de los historiadores de la medicina: "...especialmente en los casos en que el perro es rabioso, el virus debe ser drenado con una ventosa de vidrio..." Por supuesto nadie se atrevería a pensar que Celso identificó al agente de la rabia como un virus en el sentido moderno del término. Sin embargo, es importante hacer notar que Celso utilizó el término virus para denotar al agente causal de la rabia, mientras que en el mismo texto utilizó la palabra venenum para describir la ponzoña de las serpientes. Es probable que tal distinción no haya sido accidental, sobre todo si consideramos que el término latino virus puede significar veneno o también líquido viscoso. Por lo tanto, quizá Celso estaba advertido de que el agente de la rabia era transmitido por medio de la saliva viscosa del perro rabioso. Después de Celso, el término virus se utilizó durante siglos en forma casual como sinónimo de ponzoña o veneno, hasta que a finales del siglo XVIII adquirió claramente el significado de un agente infeccioso, debido a la creciente advertencia general de que existen muchas enfermedades contagiosas y transmisibles. La gradual aceptación del término virus en la literatura médica corrió paralela con el desarrollo de los conceptos de infección y contagio, los cuales deben su origen al estudio de una enfermedad también de naturaleza viral, pero que, a diferencia de la rabia, ha tenido enorme influencia sobre el curso de la historia social y política de la humanidad: la viruela. En términos de la devastación causada en las sociedades medievales, la viruela es solamente comparable con la peste bubónica. Sin embargo, la historia temprana de la viruela presenta grandes dificultades para el historiador de la medicina, ya que, a diferencia de la rabia, es muy difícil establecer un diagnóstico diferencial entre la viruela y otras enfermedades eruptivas de tipo febril, como el sarampión, la varicela o la escarlatina, a partir de las descripciones proporcionadas por los cronistas de la Antigüedad. Pero no cabe duda de que los conquistadores españoles contaron con un inesperado, silencioso y mortal aliado que contribuyó notablemente al éxito de Cortés y a la pronta caída de Tenochtitlán. Un soldado de la expedición de Pánfilo de Narváez arribó a México enfermo de viruela, enfermedad hasta entonces desconocida en Mesoamérica. La falta de inmunidad natural a la viruela permitió que ésta se extendiera rápidamente entre la población indígena con desastrosas consecuencias para la misma. En pocas semanas miles de indígenas sucumbieron a la viruela; recordemos que el propio Cuitláhuac, penúltimo emperador azteca, falleció por causa de esta enfermedad. Recientes estimaciones epidemiológicas han llevado a postular que durante los primeros veinticinco años posteriores a la Conquista más de un tercio de la población indígena sucumbió a la viruela. Es probable que tal devastación natural haya contribuido en forma radical al establecimiento del régimen colonial, explicando también en parte por qué imperios tan poderosos y organizados como el azteca y el inca fueron borrados del mapa, sin mayor oposición, en unos cuantos años. Durante los siglos XVII y XVIII ocurrieron en Europa severas epidemias de viruela, posiblemente debidas a la aparición de nuevas cepas del virus. Médicos y sabios que testimoniaron estas epidemias pudieron darse cuenta de que algún factor esencial era transmitido de persona a persona y de casa en casa. En la antigua China, mucho antes de nuestra era, ocurrieron los primeros intentos para proteger a los individuos contra

la viruela. Así, los chinos desarrollaron la práctica conocida como variolación, la cual consiste en la inoculación de individuos sanos con fluidos obtenidos de las vesículas eruptivas de las personas afectadas por casos leves de viruela. En 1721, Mary Worfley Montagu, esposa del embajador británico en Turquía, introdujo la variolación en Gran Bretaña. Dicho procedimiento resultaba muy peligroso, ya que con frecuencia los individuos inoculados desarrollaban la enfermedad y morían a consecuencia de ella, en lugar de ser protegidos contra la viruela. Los problemas causados por las severas epidemias de viruela y la controversia en relación con la variolación fueron la base de mucha bibliografía médica producida en el siglo XVIII. Algunos autores se permitieron especular sobre la naturaleza del agente transmisible causa del contagio, al cual se denominó virus cada vez con mayor frecuencia. En 1730, Thomas Fuller publicó un pequeño libro sobre las fiebres eruptivas (que incluyen la viruela). Ahí escribió: "La forma principal y más común de contraer las fiebres contagiosas, como la viruela y el sarampión, es por medio de infección, o sea, recibiendo a través del aliento o de los poros de la piel los corpúsculos virosos peculiares a la crianza de dichas enfermedades." Por su parte, Angelo Gatti, el gran precursor de Jenner, publicó sus reflexiones sobre la variolación en 1764. Sus observaciones en relación con la naturaleza de la infección y con la necesidad de encontrar un método para atenuar "el virus varioloso", fueron de carácter profético. Sin embargo, Gatti murió en enero de 1798, antes de haber podido conocer el modesto panfleto publicado en el mismo año por el médico británico Edward Jenner, en el cual comunicaba su descubrimiento de que la inoculación con el virus de la vacuna (o sea, con los fluidos obtenidos de las lesiones de la viruela bovina), era capaz de prevenir la infección de la viruela en seres humanos. El descubrimiento de la vacuna es uno de los sucesos más importantes no sólo en la historia de la medicina, sino también en la historia de las sociedades humanas. A pesar de este descubrimiento, se requirieron casi doscientos años para lograr la erradicación de la viruela. A principios del siglo XIX, el término virus se encontraba bien establecido en la bibliografía médica, aunque era utilizado para describir una gran variedad de agentes infecciosos. Este uso persistió durante toda la época del surgimiento de la bacteriología médica, o sea, los primeros dos tercios del siglo XIX. Claude Bernard erigió una infraestructura para la medicina experimental, apoyada en la tradición filosófica de Descartes y Pascal. Por ejemplo, Bernard citó los resultados obtenidos a través de la simple observación en el caso de la garrapata y su relación con enfermedades de la piel. Según Bernard, la misma metodología aplicada en la observación directa de las garrapatas podía ser aplicada para explorar la validez de las teorías que presumían la existencia de ...el virus, una criatura de la razón. Así, Claude Davaine empezó en 1860 a utilizar una combinación de experimentación y observación para rastrear aquello a lo cual se refirió sucesivamente como el virus, el agente tóxico y finalmente, el bacteridium del ántrax. A falta de filtros artificiales adecuados, Davaine demostró la diferencia entre sangre infectada y no infectada por el ántrax, utilizando como filtro la placenta del cerdo. Sin embargo, en algunos experimentos de Davaine el agente del ántrax era capaz de atravesar el filtro placentario. Robert Koch descubrió en 1876 que el bacilo del ántrax a veces forma pequeñas esporas capaces de atravesar la membrana placentaria.

Mientras tanto, Chauveau empezó a trabajar en la identificación del agente de la viruela, utilizando métodos de filtración. Pero no pudo obtener resultados definitivos, por lo cual fue el primero en hacer una distinción entre enfermedades virulentas, causadas por virus, y enfermedades contagiosas, en las cuales era transmitido un microbio o parásito bien conocido. Por lo tanto, el término virus fue restringido a denotar una misteriosa entidad infecciosa capaz de ejercer su efecto patogénico solamente por medio de la asociación en solución de ciertos elementos o partículas de naturaleza desconocida. Chauveau identificó estos cuerpos elementales (granulations élémentaires) como el origen de la actividad patogénica, introduciendo así un término que sobreviviría durante décadas. En los años 1865-1866, ocurrió en la Gran Bretaña un desastroso brote de una enfermedad llamada ictericia hemática bovina o peste del ganado, la cual exterminó una gran cantidad de animales. El médico John Gamgee había urgido, sin éxito, a las autoridades para que impusieran una cuarentena y programas de matanza controlada para evitar la diseminación de la enfermedad. A raíz de su fracaso, Gamgee abandonó el país no sin antes publicar un libro con sus observaciones sobre esta enfermedad; ahí escríbió: Al igual que la mayoría de las ponzoñas animales, el virus de la peste del ganado se reproduce con maravillosa rapidez en los cuerpos de los animales enfermos, de los cuales es también liberado. Tanto el aliento de la res enferma aspirado por un animal sano, como lo productos sólidos de la enfermedad, parecen tener la capacidad de inducir el padecimiento y los antídotos son aplicados demasiado tarde cuando se intenta alcanzar la ponzoña presente en el sistema animal. No conozco ningún antídoto capaz de ser usado internamente en los animales enfermos... Me temo que nunca lograremos alcanzar el virus una vez que éste se encuentra en el animal vivo. Tales palabras desalentadas merecen ser recordadas considerando los escasos avances logrados hasta la fecha en el tratamiento de las enfermedades virales. La etiología u origen del ántrax fue cabalmente entendida gracias al advenimiento de una herramienta que se volvió invaluable en los estudios bacteriológicos, misma que dio lugar al surgimiento a fines del siglo XIX del concepto de virus como entidad filtrable. Al parecer, placas de cerámica blanca no esmaltada y conectadas a una bomba de vacío capaz de ejercer succión fueron utilizadas en trabajos bacteriológicos por primera vez en 1870, por Edwin Klebs. Seis años después, Louis Pasteur utilizó para el mismo propósito filtros hechos con la llamada goma de París. Así, Pasteur, en colaboración con Joubet, aisló el bacilo del ántrax y adoptó la palabra microbio inventada por Séedillot en 1878, de manera que Pasteur declaró: todo virus es un microbio, haciendo caso omiso de la distinción hecha por Chauveau entre enfermedades virulentas y enfermedades contagiosas. A partir de entonces y a través del trabajo pionero sobre las vacunas contra el ántrax, el cólera aviario y la rabia, Pasteur y todos aquellos involucrados en estudios patológicos utilizaron el termino virus para denotar cualquier agente infeccioso (ya fuera o no fuera éste de naturaleza bacteriana) capaz de producir inmunidad después de la convalecencia del organismo afectado por el propio agente infeccioso.

Pasteur buscó afanosamente y en vano el agente causal de la rabia. Sin embargo, no existe evidencia de que haya sospechado que dicho agente era esencialmente diferente de los otros microbios patógenos que había logrado caracterizar a lo largo de su vida. En 1897, dos discípulos de Robert Koch encabezaron un estudio sobre el origen de la fiebre aftosa del ganado vacuno. Dichos investigadores demostraron que el agente causal de esta enfermedad era de naturaleza filtrable, o sea, capaz de atravesar los filtros bacteriológicos más finos disponibles en aquel entonces. Loeffler y Frosch observaron que este agente filtrable podía ser pasado de un animal a otro a pesar de que cada pasaje implicaba una gran dilución en la concentración del propio agente filtrable. Por lo tanto, Loeffler y Frosch llegaron a la conclusión de que el agente infeccioso podía reproducirse en los animales infectados, descartándose de esta manera la posibilidad de que se tratara de una toxina, y concluyeron que se trataba de un microbio muy pequeño. No es de sorprender que los bacteriólogos médicos se negaran a buscar una explicación que estaba por fuera del concepto de microbio patógeno. Por otra parte, es notable que un microbiólogo botánico fuera capaz de sugerir, unos cuantos meses después de haberse publicado los resultados de Loeffler y Frosch, una explicación que finalmente resultó correcta en relación con estudios y observaciones similares realizados respecto al agente causal de una enfermedad vegetal conocida como mosaico del tabaco.

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a) ÁCIDOS NUCLEICOS EL ÁCIDO nucleico de un virus contiene la información específica y el potencial operacional para modificar la maquinaria de la célula infectada y para dirigirla hacia la producción específica de los componentes de las nuevas partículas virales. Los ácidos nucleicos son macromoléculas constituidas por cadenas de nucleótidos, los cuales a su vez están constituidos por una base nitrogenada asociada a un azúcar del grupo de las pentosas y a uno o más grupos de fosfatos. La base nitrogenada puede derivarse de la purina o de la pirimidina. Las dos bases púricas más importantes son la adenina y la guanina. Las tres bases pirimídicas más importantes son la citosina, el uracilo y la timina (figura 1.6). En un ribonucleótido el azúcar presente es la ribosa, mientras que en un desoxirribonucleótido el azúcar presente es la desoxirribosa. Los nucleósidos son análogos a los nucleótidos, pero carecen de grupos fosfato (figura I.7)

Figura II.1a. Segmentos de una cadena de desoxirribonucleótidos o ADN (a la izquierda) y de una cadena de ribonucleótidos o ARN (a la derecha). Las notaciones condensadas son ilustradas junto a cada polinucleótido.

Figura II.1b. Formas de representación esquemática del ADN. (a) Esquema que muestra la polaridad de las cadenas de desoxirribonucleótidos y el apareamiento de bases. (b) Esquema que muestra la estructura en doble hélice y los parámetros helicoidales de la molécula.

Los ácidos nucleicos pueden existir en forma de cadena sencilla o de cadena doble. Las bases nitrogenadas presentes en una cadena pueden aparearse con las bases de la cadena opuesta por medio de un tipo de enlace químico conocido como puente de hidrógeno. Las características químicas y estructurales de las bases nitrogenadas hacen que el apareamiento ocurra entre la guanina y la citosina, y entre la adenina y la timina o el uracilo. Generalmente, el ácido ribonucleico (ARN) es de cadena sencilla, aunque también puede existir en forma de cadena doble. Las bases normalmente presentes en el ARN son la adenina, la citosina, la guanina y el uracilo. El ácido desoxirribonucleico por lo general existe en forma de cadena doble formando la famosa estructura en doble hélice. Normalmente el ADN contiene las bases adenina, guanina, citosina y timina (figuras II. (a) y (b)). Los ácidos nucleicos de cadena doble, como el ADN, pueden ser desnaturalizados, o sea, sus cadenas pueden ser separadas por medio de un tratamiento con álcali o por medio de elevar la temperatura, pues los puentes de hidrógeno son rotos por calor y el pH elevado (alcalino). Si una molécula de ADN es sometida a desnaturalización térmica, las cadenas complementarias tienden a separarse conforme se eleva la temperatura. Sin embargo, estas cadenas tenderán a aparearse de nuevo tan pronto la temperatura desciende a 25°C o menos. Cuando se añade a esta mezcla de reacción una molécula de ARN, cuya secuencia es complementaria a cualquiera de las cadenas del ADN desnaturalizado, es posible obtener híbridos ADN-ARN. Cuando las macromoléculas del tipo del ARN y el ADN son sometidas a centrifugación en presencia de una solución concentrada de sales pesadas como el cloruro de cesio (CsCl), las fuerzas opuestas de sedimentación y difusión producen un gradiente de concentración de la sal, generando un aumento continuo de la densidad en dirección

de la fuerza centrífuga. Las macromoléculas presentes en semejante gradiente son impulsadas por la fuerza centrífuga hasta la región donde la densidad de la solución salina es igual a la densidad de flotación característica de cada tipo de macromolécula.Cuando existen varias especies de macromoléculas dentro del gradiente, cada especie formará una estrecha banda en la posición donde la densidad del CsCl es igual a la densidad de flotación de la especie molecular en cuestión. Las cinco posibles clases de ácido nucleico: ADN de cadena doble, ADN de cadena sencilla, ARN de cadena sencilla, ARN de cadena doble, híbridos ADN-ARN, pueden ser separadas por medio de centrifugación en gradientes de CsCI. Por otra parte, es posible introducir marcadores de densidad en los ácidos nucleicos, haciendo crecer la fuente del ácido nucleico (virus, bacteria, célula, etc.) en un medio que contenga isótopos pesados de algún elemento que puede ser incorporado en la estructura de los ácidos nucleicos ( N, O, H), o análogos de las bases nitrogenadas como el 5.bromouracilo, cuyo peso molecular es mayor que el de la timina normalmente presente en el ADN. De esta manera, el nuevo ácido nucleico tiene una densidad de flotación mayor que la del ácido nucleico normal equivalente, y esta característica puede ser de gran utilidad cuando se desea establecer el destino final de una macromécula en particular.
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Existen cuatro posibles tipos de ácido nucleico viral: ADN de cadena sencilla, ADN de cadena doble, ARN de cadena sencilla y ARN de cadena doble. Virus que contienen cualquiera de estos tipos de ácido nucleico pueden ser encontrados tanto entre los fagos como entre los virus que infectan a plantas o animales. El ADN de algunos bacteriófagos se caracteriza por contener bases raras que substituyen alguna o algunas de las bases normalmente presentes en el ADN. Por ejemplo, el fago PBSl tiene uracilo (normalmente presente en el ARN) en lugar de timina mientras que los fagos T2, T4 y T6 tienen en su ADN hidroximetilcitosina en lugar de citosina. La presencia de estas bases raras permite distinguir con relativa facilidad entre el ácido nucleico viral y aquel correspondiente a la célula hospedera.

Figura II.2. Formación de dímeros y círculos de ADN del fago después de una incubación bajo condiciones que favorecen la circulación del ADN. En la figura se muestran las secuencias de bases que constituyen los extremos o términos pegajosos.

El ADN de cadena doble presente en algunos virus (como el fago λ ), se caractenza por tener segmentos de cadena sencilla en ambos extremos de la molécula. Debido a que son complementarias las secuencias de nucleótidos presentes en ambos extremos, resulta posible que entren en contacto para formar puentes de hidrógeno dando origen a moléculas circulares de ADN o a dímeros formados por dos moléculas longitudinales de ADN unidas por sus extremos (figura II.2.). Estos extremos de cadena sencilla presentes en una molécula de ácido nucleico que por lo demás es de cadena doble, son denominados como extremos pegajosos o cohesivos. Cuando es desnaturalizado el ADN de algunos virus, como los adenovirus, se observa que cada una de las cadenas de ADN es capaz de formar un círculo por separado. Esto implica que son complementarias las secuencias de nucleótidos presentes en ambos extremos de cada cadena y por lo tanto deben tener la misma secuencia, pero repetida en sentido inverso (figura 11.3.). A este tipo de secuencias se les conoce como repeticiones invertidas. Algunos virus contienen ácido nucleico que está circularizado en forma natural. Este tipo de ácido nucleico es insensible a la acción degradante de enzimas como la exonucleasa III, que tienen la capacidad de digerir moléculas de

ácido nucleico que poseen un extremo libre, lo cual no ocurre en las moléculas circulares. El ADN naturalmente circular puede ser de cadena sencilla como en el fago ØXI74, o de cadena doble, como en el virus SV4O. Existe evidencia de que algunos virus ARN que producen infecciones en vegetales como el limonero y la papa contienen moléculas circulares de ARN. La secuencia de los nucleótidos presentes en las cadenas o bandas de los ácidos nucleicos constituye la base del código genético. Cada codón (o letra del código) es definido por una tripleta de nucleótidos que, a través del proceso conocido como traducción es interpretada como una letra que corresponde a uno de los veinte aminoácidos diferentes que constituyen las proteínas. En términos generales, la secuencia de codones que constituyen un gene codifican la secuencia de aminoácidos que constituyen una proteína en particular.

FIGURA II.3. Las secuencias de nucleótidos que corresponden a repeticiones invertidas permiten que se formen regiones de cadena doble debidas a reasociación intramolecular. Cuando las repeticiones se encuentran muy próximas entre sí, se forma una horquilla doble con extremo de cadena sencilla. La última columna en el diagrama muestra la apariencia de estas estructuras producidas por la reasocación de las repeticiones invertidas, cuando son observadas al microscopio electrónico: las regiones de cadena doble se distinguen por su mayor grosor

En los últimos diez años se han desarrollado una variedad de técnicas y métodos que permiten determinar la secuencia de nucleótidos en cualquier tipo de ácido nucleico. La primera secuencia completa de un ARN viral fue determinada en el fago MS2 por el grupo de Walter Fiers en 1976. En 1977, Fred Sanger y colaboradores publicaron la secuencia completa del genoma del fagoØXl74, constituido por ADN de cadena

sencilla. Posteriormente, muchos otros genomas virales de mayor tamaño y complejidad han sido secuenciados en parte o en su totalidad. Una vez que se conoce la secuencia del genoma viral es posible establecer la forma como están organizados los genes presentes en el ácido nucleico. Los avances de la biología molecular han permitido determinar la naturaleza de las secuencias de nucleótidos que actúan como signos de puntuación en la lectura de la información genética. Normalmente en los genomas de bacterias, plantas y animales cada gene abarca uno o varios segmentos del ácido nucleico, estos segmentos están separados de los segmentos correspondientes a los genes adyacentes. En el caso de los virus, los genomas virales resultan ser muy pequeños cuando se les compara con los genomas de las bacterias más simples; esto implica que los virus tienen una capacidad muy limitada para contener información genética. Sin embargo, algunos virus han desarrollado estrategias para obtener una máxima capacidad de almacenamiento de la información genética. Una de estas estrategias consiste en la traslapación de genes, de manera que un segmento del ácido nucleico puede contener la secuencia de nucleótidos correspondiente a la totalidad del gene A y a la vez contener la secuencia inicial correspondiente al gene B, mismo que se continúa en otra región del ácido nucleico posterior al término del gene A. La otra estrategia consiste en la superposición de genes, de manera que el segmento del ácido nucleico que corresponde al gene C incluye también al gene D que codifica una proteína más pequeña que la codificada por el gene C. Esta multiplicidad de marcos de lectura característica de algunos genomas virales implica la necesidad de una compleja regulación y coordinación de la expresión genética en esos virus (figura II.4.).

Figura II.4. Mapa genético del ADN del virus SV40 que contiene 5 243 pares de bases. La región temprana (transcrita en el sentido opuesto de las manecillas del reloj) es ilustrada en gris, y la región tardía (transcrita en el sentido de las manecillas del reloj) es ilustrada en negro. El origen de replicación es marcado Ori.

b) LA FUNCIÓN PROTECTORA Y MORFOLÓGICA DE LAS PROTEÍNAS VIRALES El análisis de partículas virales purificadas muestra que con tienen entre 50 y 90% de proteína. Si consideramos que los ácidos nucleicos en solución son susceptibles de ser

fácilmente fragmentados o degradados, podemos asumir que el componente proteico de los virus tiene fundamentalmente un papel protector. Una tripleta de nucleótidos (codón) tiene un peso molecular promedio de alrededor de 1000 daltones y sólo codifica un aminoácido cuyo peso molecular promedio es de aproximadamente 100 daltones. Por lo tanto, un ácido nucleico puede especificar cuando mucho una décima parte de su peso molecular en proteína. Con mucha frecuencia los virus contienen más de un 50% de su peso en forma de proteína; esto sugiere que deben estar presentes varias copias de una misma proteína de bajo peso molecular, ya que se requiere de menos material genético para especificar un solo tipo de molécula de proteína la cual puede ser usada como subunidad para construir la cubierta del virus. Sin embargo, no es esencial que la cubierta del virus esté formada por subunidades idénticas, siempre y cuando los pesos moleculares combinados de los diferentes tipos de subunidades sean suficientemente pequeños en relación con el peso molecular de la molécula del ácido nucleico viral. La construcción de las partículas virales a partir de subunidades estructurales incrementa la estabilidad genética del propio virus, ya que al reducirse el tamaño de las subunidades estructurales se reduce la posibilidad de que ocurran mutaciones nocivas en el gene que codifica dicha subunidad. El fenómeno de autoensamble es particularmente relevante para los virus y otros sistemas biológicos debido a sus atributos de economía y eficiencia. Por ejemplo, en la industria de la construcción ha sido posible abatir los costos e incrementar la eficiencia utilizando unidades prefabricadas que a su vez son ensambladas en forma rápida y barata en el sitio de construcción. Esto involucra dos procesos: la fabricación de unidades básicas y el ensamble de las mismas para formar edificaciones complejas. En el caso de los sistemas biológicos, la fabricación de unidades es análoga a la síntesis de moléculas de proteína a partir de aminoácidos. Esta síntesis depende de las instrucciones contenidas en la secuencia de nucleótidos presentes en los ácidos nucleicos. El proceso de ensamble es independiente de instrucciones externas ya que la información necesaria para construir los complejos moleculares está incluida dentro de los propios componentes individuales. El mecanismo de autoensamble tiene la ventaja de que puede ser controlado en cada nivel de organización. Por ejemplo, las subunidades defectuosas son eliminadas automáticamente durante el proceso de ensamble, de manera que estructuras complejas son construidas con exactitud y eficiencia. En el caso particular de los virus, las moléculas de proteína que constituyen las subunidades de la cápside interaccionan con la cadena o cadenas del ácido nucleico viral para formar una partícula viral. El proceso depende de la formación de enlaces entre las subunidades y al igual que en el proceso de cristalización, la regularidad de la estructura final es consecuencia de factores termodinámicos que obligan a formar un máximo número de uniones no covalentes entre las subunidades. Sin embargo, en un cristal todas las moléculas se encuentran en ambientes similares, mientras que tal situación rara vez ocurre en el caso de estructuras hechas a partir de subunidades de proteína. Una proteína es una macromolécula compuesta por una variedad de moléculas individuales denominadas aminoácidos. Los aminoácidos se encuentran unidos por enlaces químicos conocidos como uniones o enlaces peptídicos; por lo tanto, toda proteína puede ser considerada como una cadena polipeptídica, la cual tendrá una conformación espacial o estructura terciaria que depende directamente de la composición de los aminoácidos presentes en dicha proteína. Debido a su

composición química; los aminoácidos se dividen en neutros, hidrofóbicos e hidrofílicos. Así, cuando una proteína se encuentra rodeada completamente por un medio acuoso, los grupos hidrofóbicos tienden a juntarse en el interior de la molécula de proteína, mientras que los grupos hidrofílicos tienden a permanecer en la superficie de la molécula, haciendo contacto con el medio. Estas interacciones determinan la conformación espacial de la proteína. En el caso del virus del mosaico del tabaco (VMT), una proteína compuesta por 158 aminoácidos constituye la subunidad básica a partir de la cual se construye la cápside del virus. En dicha proteína cuando menos la mitad de los aminoácidos presentes en el interior de la macromolécula son de tipo hidrofóbico, mientras que en la superficie de la misma hay tan sólo cuatro grupos hidrofóbicos en un segmento constituido por 24 residuos de aminoácidos. Por lo tanto, se puede decir que los mismos principios fisicoquímicos que rigen el desarrollo de la estructura terciaria y cuaternaria de las proteínas son causa de la organización de las cápsides virales. Las múltiples uniones formadas durante la agregación de las subunidades de proteína contribuyen al enmascaramiento de sitios potencialmente susceptibles a la acción de enzimas capaces de degradar proteínas; de esta manera las proteínas de la cápside viral adquieren también mayor resistencia al calor y otros agentes físicos. Es bien sabido que las suspensiones de partículas virales pueden ser mantenidas por largos periodos en el laboratorio esto implica que dichas partículas constituyen estructuras estables. Una condición necesaria para lograr la estabilidad de cualquier estructura consiste en que la estructura se encuentre en su estado de mínima energía libre; esto se logra estableciendo un máximo número de uniones entre las subunidades que constituyen dicha estructura. Debido a que las subunidades de la cubierta viral son relativamente asimétricas, se requiere que estén dispuestas o ensambladas en forma simétrica para que pueda formarse el mayor número de uniones entre dichas subunidades. Existe un número limitado de formas que permiten el ensamble simétrico de subunidades asimétricas. c) VIRUS FILAMENTOSOS Una posible forma de generar una estructura simétrica tridimensional a partir de componentes asimétricos como las proteínas consiste en distribuir las proteínas alrededor de una circunferencia de manera que formen un disco. Apilando un gran número de discos se obtiene una estructura tridimensional con una cavidad interna apropiada para albergar la molécula del ácido nucleico (figura II.5.). Un ejemplo de virus filamentosos está dado por el virus del mosaico del tabaco. El examen detallado del VMT muestra que las subunidades de proteína no están dispuestas en forma de anillos sino en forma helicoidal. Esto resulta lógico considerando que el ARN del VMT tiene una forma helicoidal y, por lo tanto, al disponer las subunidades de proteína en forma helicoidal es posible formar el mayor número de uniones entre las subunidades de proteína y el ácido nucleico. Todos los virus filamentosos estudiados hasta la fecha muestran una estructura helicoidal indicando que el ácido nucleico es el factor esencial que rige este tipo de arreglo estructural.

Figura II.5.(a) Disposición de componentes asimétricos idénticos alrededor de una circunferencia para lograr una estructura simétrica. (b) Segmentos de una partícula de virus de mosaico del tabaco que muestra las subunidades de proteína formando una estructura helicoidal. El ARN se localiza en un surco helicoidal formado por las subunidades de proteína.

d) VIRUS ESFÉRICOS También se puede obtener una partícula simétrica disponiendo las subunidades de proteína alrededor de los vértices o caras de un cuerpo con simetría cúbica como el icosaedro, constituido a partir de 20 triángulos equiláteros. Multiplicando el número de subunidades presentes en cada cara por el número de caras, obtenemos el número mínimo de subunidades que pueden ser acomodadas alrededor de tal cuerpo geométrico. En el caso del icosaedro, el número es de 60 subunidades. Este tipo de arreglo representa una de las pocas formas en que objetos asimétricos pueden ser acomodados en forma simétrica sobre la superficie de una esfera. Las micrografías electrónicas de un gran número de virus diferentes muestran que éstos tienen una silueta esférica que al ser examinada más detalladamente corresponde a una estructura con simetría icosaédrica. Varios de los virus esféricos con simetría icosaédrica contienen más de 60 subunidades de proteína. Por ejemplo los adenovirus contienen aproximadamente 1 500 subunidades en su cubierta (figura II.6.). Sin embargo, Donald Caspar y Aaron Klug han descrito las reglas que gobiernan la estructura de los virus esféricos. Tales reglas fueron inspiradas por el estudio de las estructuras geodésicas diseñadas por el arquitecto norteamericano Buckminster Fuller. En dichas estructuras la superficie de una esfera es subdividida en facetas triangulares, las cuales son arregladas con una simetría icosaédrica. Este método de triangulación de la esfera representa el diseño óptimo para una cubierta cerrada construida a partir de subunidades idénticas unidas en forma regular. Ninguna otra forma de subdividir una superficie cerrada puede proporcionar un grado similar de equivalencia. Este tipo de estructuras tienen un mínimo de energía libre, lo cual explica en parte la abundancia de los virus con simetría icosaédrica.

Figura II.6. Organización de las subunidades de proteína en la cápside del adenovirus.

e) VIRUS CON MÁS DE UN TIPO DE SUBUNIDAD Las micrografías electrónicas de los adenovirus muestran que las 1 500 subunidades de proteína están arregladas en 240 hexámeros y 12 pentámeros, y en cada vértice del virus se proyecta una fibra de proteína. Está bien establecido que las fibras, los pentámeros y hexámeros están constituidos por diferentes tipos de proteínas. Los adenovirus representan el ensamble regular de tres diferentes tipos de proteína. Esto puede lograrse arreglando los pentámeros y las fibras en los vértices del icosaedro, y los hexámeros en las caras del icosaedro. Una forma diferente de arreglo estructural ocurre en los reovirus en los cuales la cápside está constituida a partir de 8 diferentes proteínas dispuestas en dos capas o cubiertas que poseen simetría icosaédrica. Tres de las proteínas están dispuestas en la cubierta externa, y las cinco proteínas restantes en la cubierta interna. f) VIRUS CON ENVOLTURA Muchos de los virus animales más grandes y unos cuantos virus de plantas y bacterias están envueltos por una cubierta membranosa de proximadamente 75Å de grosor. Esta envoltura se deriva en gran parte de las membranas de la célula hospedera y puede ser degradada por medio del tratamiento con detergentes o solventes orgánicos como el éter, ocasionando así la pérdida de la inefectividad del virus. A este tipo de virus también se les conoce como virus sensibles al éter. Los virus de la influenza son representativos de los virus animales con envoltura. Estos virus han sido descritos como pleomórficos (multiformes), aunque las partículas virales en células de animales vivos tienen una forma filamentosa. La apariencia pleomórfica se hace evidente cuando estos virus son cultivados en embriones de pollo. Estos virus poseen debajo de la envoltura una capa o cubierta de proteína llamada proteína M (proteína de la membrana o proteína de la matriz). Dentro de la cubierta formada por la proteína M, pero separado de la misma, se encuentra el componente nucleoproteico constituido por un cilindro flexible de ARN y proteína dispuesta en forma similar a un pasador para el

pelo que ha sido doblado. La estructura de la nucleocápside del virus de la influenza es de tipo helicoidal. Cada uno de los diferentes virus de la influenza codifica cuando menos 4 diferentes proteínas que son ensambladas en el virión, dando origen a diferentes estructuras virales. Algunos virus con envoltura tienen nucleocápsides icosaédricas. Particularmente los virus ARN productores de tumores también conocidos como retrovirus, tienen una nucleoproteína que está superenrollada en forma de una esfera hueca rodeada por la envoltura, la cual se deriva de la membrana celular y es modificada por la inserción de glicoproteínas específicas del virus. g) VIRUS CON MORFOLOGÍA DE CABEZA Y COLA Este tipo de morfología sólo ha sido encontrada en cierto tipo de bacteriófagos y está directamente relacionada con la forma en que tales virus infectan a sus bacterias hospederas. El número de fagos con arquitectura de tipo cabeza-cola es considerable; estos fagos pueden ser subdivididos en fagos de cola corta, fagos de cola larga no contráctil, y fagos con colas contráctiles y complejas que también pueden poseer otro tipo de estructuras como collares, placas basales y fibras (figura II.7.). A pesar de su complejidad estructural, los principios que gobiernan el ensamble de estos fagos son similares a los descritos en relación con otros virus cuya arquitectura es más sencilla. Las cabezas de los fagos tienen usualmente una simetría osaédrica mientras que las colas tienen una simetría helicoidal.

Figura II.7. Representación esquemática de las estructuras de algunos bacteriófagos con cola.

Todas las estructuras presentes, como las placas basales poseen alguna forma de simetría. h) EL PRINCIPIO DE AUTOENSAMBLE

Los virus son construidos de acuerdo con principios de diseño eficientes y, por lo tanto, son capaces de autoensamblarse sin la participación de ningún factor organizador externo. Esto es posible debido a la formación de un gran número de uniones débiles cuando los componentes del virus son colocados en la configuración adecuada por medio de movimientos al azar propiciados por factores termodinámicos. Por ejemplo, si se trata al VMT con una solución concentrada de urea, ocurre una descomposición del virus en subunidades de proteína y ARN. Si se elimina la urea y son incubadas de nuevo las subunidades de proteína en presencia del ARN viral, las macromoléculas se agregan en forma espontánea dando origen a partículas virales infecciosas. Sin embargo, cuando se omite el ARN viral durante el proceso de repolimerización, se obtienen cilindros de proteína, pero en este caso las subunidades están apiladas en forma de discos en lugar de tener una disposición helicoidal. Además, estos cilindros son menos estables que la particula viral completa, lo que señala la importancia del ácido nucleico en la estabilización de la estructura viral. En el caso de algunos virus icosaédricos, ha sido posible realizar también experimentos de reconstrucción o reconstitución in vitro (o sea, en el tubo de ensayo). Sin embargo, modificando las condiciones de estos experimentos, ha sido posible obtener estructuras tubulares y otras variables morfológicas. Esto indica que las propiedades de empacamiento de las proteínas son las que en última instancia determinan la estructura de la partícula viral. El autoensamble resulta económico para los virus, pues no requieren de información genética específica para lograrlo, y además proporciona un método sencillo y eficiente para eliminar subunidades defectuosas producidas durante la replicación de los componentes virales. Sin embargo, algunos bacteriófagos complejos del tipo cabezacola, como el fago T4, muestran cierto grado de control genético en el proceso de ensamblaje; este fenómeno será discutido más adelante.

I I I .

E L

P R O C E S O

D E

I N F E C C I Ó N

V I R A L

LA INFECCIÓN se inicia cuando entran en contacto una partícula viral y una célula susceptible. En el caso de fagos y bacterias en un cultivo en suspensión, la interacción entre ambos ocurre por simple difusión, ya que partículas con el tamaño de bacterias y virus se encuentran en permanente movimiento browniano cuando están en suspensión. En el caso de los virus animales, la difusión es también el factor más importante que afecta la unión con células animales en cultivo, ya que esta asociación es independiente de la temperatura mientras ésta no afecte el movimiento browniano. Probablemente en el caso de la infección en el animal entero existen otros factores que afectan la asociación entre el virus y las células; sin embargo, es muy difícil diseñar experimentos para estudiar la interacción entre virus y células animales in vivo. En el caso de las plantas, la infección viral generalmente es consecuencia de daño mecánico previo, hecho a la planta por factores externos. En otras ocasiones, la infección viral en

plantas es el resultado de la acción de insectos portadores del virus que actúan como vectores del mismo, introduciéndolos en plantas susceptibles. a) ADSORCIÓN La mayoría de los fagos se adsorben (pegan) a la pared celular de las bacterias susceptibles, pero algunos fagos también son capaces de adsorberse a los flagelos, vellosidades (pili) o cápsulas presentes en la superficie de la bacteria hospedera. El caso mejor documentado de adsorción viral está representado por los fagos T2 y T4, los cuales son virus con morfología compleja que incluye una cabeza, cola, placa basal, clavijas y fibras de la cola. La pegada inicial de estos fagos a los receptores presentes en la superficie de la bacteria ocurre por medio de los extremos distales de las fibras de la cola. Estas fibras largas que hacen la primera unión se doblan por en medio, de manera que sus extremos distales hacen contacto con la pared celular a muy corta distancia del punto medio de la partícula viral. Después de ocurrida la adhesión, la partícula viral se aproxima a la superficie de la célula. Cuando la placa basal del fago se encuentra a unos 100Å (angstrom= 10-10m) de la pared celular, se establece contacto entre las pequeñas clavijas de la placa basal y la pared celular, pero no existe evidencia de que la propia placa basal se adhiera a la pared celular (figura III.1.).

Figura III.1. Esquema de los principales eventos en la adsorción del bacteriófago T4 a la pared celular de la bacteria E. coli.(a) el fago libre muestra las fibras y clavijas de la cola. (b)Adhesión de las fibras de la cola. (c) El fago se acerca a la pared celular y las clavijas entran en contacto con la pared celular.

Algunos fagos con cola, como el fago PBSl, se adsorben a los flagelos bacterianos en lugar de a la pared celular. La punta de la cola de este fago tiene una fibra flexible que se adhiere alrededor del filamento del flagelo y entonces el fago se desliza por el filamento hasta alcanzar la base del flagelo. Otros fagos con cola se adsorben a la cápsula de la bacteria. Finalmente, algunos fagos se adhieren a los llamados pili o vellosidades sexuales de las bacterias que contienen el factor sexual "F" o ciertas colicinas (factores de resistencia contra agentes antimicrobianos). Los fagos

filamentosos que contienen ADN de cadena sencilla se adsorben a las puntas de estos pili mientras que los fagos esféricos de ARN se adsorben a los costados de estos pili. En el caso de los virus animales, ha sido posible estudiar cómo se adhieren a las células en cultivo y de esta manera determinar el efecto que tienen la temperatura y la concentración de iones en el medio sobre la adsorción viral. Al igual que en el caso de los fagos, la adhesión parece ser de tipo electrostático y es afectada en forma importante por la presencia de iones en medio de cultivo. Sin embargo, todavía se sabe poco en relación con la naturaleza de los receptores celulares para los virus animales, con excepción de aquellos receptores involucrados en la adsorción de los virus de la poliomielitis, la influenza y el SIDA (síndrome de inmunodeficiencia adquirida). Cuando las células susceptibles al virus de la polio son disociadas al someterlas a congelamiento y subsecuente descongelamiento, liberan una substancia que constituye el receptor celular para el virus. Aparentemente, este receptor es de naturaleza proteica y sus moléculas pueden ser saturadas en presencia de un exceso de partículas virales. Se ha estimado que existen aproximadamente 3 x 10 3 receptores para el poliovirus en la superficie de cada célula susceptible; esto representa un área equivalente al 0.3% de la superficie total de la célula. Las células que carecen de tal receptor específico son inmunes a la infección por poliovirus. Sin embargo, tales células no susceptibles pueden permitir la replicación normal del virus cuando éste es introducido en ellas por métodos artificiales. Cuando se incuban virus de la influenza en presencia de eritrocitos (glóbulos rojos), las células se aglutinan (hemaglutinación) y este fenómeno puede ser utilizado para titular la concentración del virus, simplemente determinando a qué dilución el virus se vuelve incapaz de producir hemaglutinación. Células aglutinadas a 4°C pueden ser calentadas a 37°C, lo cual produce separación de las células y el virus eluido de estas células puede ser utilizado para aglutinar un nuevo lote de células. Sin embargo, las células que previamente estuvieron en contacto con el virus son incapaces de ser reaglutinadas cuando entran en contacto con virus frescos. Esto se debe a la producción y activación de una enzima conocida como enzima destructora del receptor (EDR). Si se aplica una solución de esta enzima al tracto respiratorio de animales experimentales, es posible evitar la infección por el virus de la influenza, ya que el virus no puede adsorberse a las células cuyo receptor específico para el virus ha sido degradado por la acción de la enzima. El receptor para el virus de la influenza se caracteriza por tener una molécula de ácido neuramínico en su extremo distal, el cual forma parte de un pequeño polímero de moléculas de carbohidrato (oligosacárido); este polímero está unido en forma covalente a una proteína insertada en la membrana celular. b) PENETRACIÓN DEL VIRUS El caso mejor estudiado de la penetración de un virus en la célula hospedera está representado por el caso del fago T2. La cola de este fago es contráctil y en su forma extendida consiste de 24 anillos de subunidades que forman una funda que rodea a un elemento central. Cada anillo consta de 6 subunidades pequeñas y 6 subunidades mayores. Después de la adsorción del fago a la pared celular, ocurre una contracción de la cola que resulta en una fusión de las subunidades pequeñas y grandes para dar 12 anillos de 12 subunidades. El núcleo de la cola no es contráctil y por lo tanto es

expulsado e impulsado a través de las capas externas de la bacteria; a continuación, la cabeza del fago se contrae y esto resulta en la inyección del ADN viral en la célula bacteriana. Este proceso posiblemente es facilitado por la presencia de la enzima lisozima en la cola del fago; esta enzima es capaz de digerir las proteínas de las cubiertas bacterianas; además, hay 144 moléculas de adenosina trifosfato (ATP) en la funda de la cola del fago; la energía para la contracción de esta funda proviene de la conversión de la ATP en adenosina difosfato (ADP) por medio de una reacción hidrolítica que libera un grupo fosfato de la ATP (figura 111.2.).

FIGURA III.2. Esquema del mecanismo de penetración del material genético del fago T4 o T2 a través de la pared celular de la bacteria. (a) Las clavijas del fago entran en contacto con la pared celular y la funda se encuentra extendida. (b) La funda de la cola se contrae y el material genético del fago penetra la pared celular; la lisozima presente en el fago digiere la porción de pared celular localizada directamente bajo la partícula viral.

Muchos bacteriófagos carecen de fundas contráctiles y todavía se desconoce el mecanismo detallado por medio del cual penetran en las bacterias. Sin embargo, existe evidencia de que algunos de estos fagos introducen en la célula material proteico además del ácido nucleico. Las células animales carecen de pared celular y sólo están rodeadas por la membrana plasmática que es muy flexible y cambiante en sus componentes estructurales. Las células animales continuamente introducen elementos del medio externo por medio del proceso de pinocitosis y a través de un procedimiento similar, pero inverso, exportan al medio diversas substancias como enzimas, hormonas y neurotransmisores. Los virus animales solamente pueden infectar células que poseen receptores específicos para el virus en particular. Por lo tanto, se requieren diferentes receptores para diferentes tipos de virus. Se conoce con poco detalle el mecanismo preciso por medio del cual los virus penetran en las células animales. Buena parte del problema radica en que la

mayoría de las partículas virales que infectan a una célula son incapaces de iniciar con éxito la multiplicación del virus. Usualmente, estas partículas no infecciosas superan a las partículas infecciosas en proporción de 1000:1, y no existen métodos bioquímicos o microscópicos que puedan distinguir entre ambos tipos de partículas virales antes de que haya ocurrido la infección propiamente dicha. Todos los virus ARN y ADN producen estas partículas defectuosas conocidas como interferentes-defectuosas (ID), las cuales son el resultado de errores en la síntesis de ácido nucleico viral. Estas partículas ID son mutantes que carecen de segmentos de ácido nucleico y por lo tanto son incapaces de reproducirse sin la ayuda de partículas virales normales capaces de suplir la información genética ausente en el genoma de las partículas ID. Por esta razón, la propagación de las partículas ID es óptima cuando las células son infectadas en altas multiplicidades de infección. Las partículas ID deprimen el rendimiento de la progenie viral infecciosa debido a que compiten por ciertos productos sintetizados en cantidades limitadas por las partículas virales infecciosas. Los virus con envoltura pueden penetrar a la célula hospedera por medio de la fusión entre las envolturas virales y la membrana de la célula. Tanto los virus con envoltura como los virus que carecen de ésta pueden ser introducidos a la célula por medio del proceso de pinocitosis (figura III.3.). La fusión de membranas ocasiona la liberación del genoma viral en el citoplasma de la célula, pero en el caso de la pinocitosis el virus entero es contenido en una vesícula formada a partir de la membrana plasmática. Es probable que esta vesícula se fusione a su vez con alguna de las membranas internas de la célula y la cubierta viral es modificada a consecuencia de esta fusión, lo que da lugar a la liberación del ácido nucleico viral. Es importante hacer notar que la penetración del virus y la subsecuente eliminación de las envolturas virales no implican forzosamente la presencia intracelular de ácido nucleico viral desnudo. El ácido nucleico viral puede permanecer unido a las proteínas internas del virus, las cuales pueden incluir enzimas necesarias para la replicación del virus. En el caso de cierto tipo de virus ARN en los cuales el genoma viral sirve directamente como ARN mensajero (el ácido nucleico a partir del cual se sintetizan las proteínas), el ARN viral se asocia con los ribosomas de la célula. Esto ejemplifica el hecho de que el ácido nucleico viral nunca permanece extendido como un verdadero filamento dentro de la célúla, sino que se enrolla y asocia con proteínas de manera que alcanza un estado favorable de mínima energía libre.

FIGURA III.3. Esquema de la penetración y desnudamiento de los virus en células animales. (a) Penetración y desnudamiento por medio de la fusión de las membranas viral y plasmática. (b) Penetración y desnudamiento por pinocitosis seguida por fusión con la membrana citoplasmática interna.

La gran mayoría de los virus animales son muy ineficientes en lograr la penetración de las células susceptibles. Por ejemplo, en infecciones por poliovirus, la mayor parte del ARN viral es degradado como resultado de la interacción entre virus y las células. Esto sugiere que solamente unos cuantos receptores celulares para el virus tienen la capacidad de favorecer la total penetración del genoma viral al interior de las células. En teoría, resulta posible evitar las infecciones virales interfiriendo con los mecanismos de adsorción y penetración del virus. Sin embargo, la mayoría de los receptores están constituidos por proteínas y glicoproteínas que tienen funciones importantes en el funcionamiento normal de la membrana celular y sólo en forma incidental resultan ser de importancia tal para las necesidades del virus. Por lo tanto, estas proteínas no pueden ser eliminadas o modificadas sin afectar a la célula misma. Todavía se sabe muy poco en relación con la química de las proteínas que forman parte de las cubiertas virales y hasta la fecha solamente se conoce una sustancia bien caracterizada capaz de inhibir la adsorción y penetración de un virus sin que, por otra parte, induzca efectos secundarios indeseables. Esta sustancia es la amantadina, que puede evitar ciertos eventos en la penetración del virus de la influenza, pero todavía no se conoce con exactitud su mecanismo de acción.

c) CLASIFICACIÓN FUNCIONAL DE LOS VIRUS Los virus muestran una gran diversidad en su morfología: la estructura de sus ácidos nucleicos, el modo de infección, regulación y desarrollo. Por lo tanto, resulta difícil establecer un concepto clasificador que simplifique el análisis del proceso de replicación (reproducción) viral. Sin embargo, David Baltimore ha propuesto un sistema de clasificación de los virus basado en el modo como éstos expresan sus genes y llevan a cabo la replicación de su material genético. En esta clasificación los virus están divididos en grupos de acuerdo con el modo como llevan a cabo la síntesis del ARN mensajero (ARNm) que dará origen a las proteínas virales. De acuerdo con esta clasificación, todo ARNm es designado como positivo (+) ARN y las cadenas de ADN o de ARN o de ambos que son complementarias en secuencia de nucleótidos a la del ARNm, son denominadas como negativas (-). Aquellas cadenas de nucleótidos cuya secuencia no es complementaria a la del ARNm son denominadas también como positivas (+). Con base en esta terminología, es posible distinguir seis clases de virus: Clase 1: está constituida por todos los virus que tienen un genoma formado por ADN de cadena doble. En esta clase no se aplica la designación +/-, pues diferentes especies de ARN>m se originan a partir de diferentes segmentos de ambas cadenas del ADN viral. Clase II: consta de virus cuyo genoma está constituido por ADN de cadena sencilla, cuya secuencia es exactamente la misma presente en el ARNm. En esta clase de virus, el ADN del genoma debe ser temporalmente convertido a la forma de cadena doble antes de que ocurra la transcripción del ADN en ARNm. Clase III: está compuesta por virus cuyo genoma es ARN de cadena doble. Todos los virus conocidos que forman parte de este grupo tienen genomas segmentados, pero el ARNm es sintetizado solamente a partir de una de las cadenas de ARN presentes en cada fragmento. Clase IV: está representada por los virus con ARN de cadena sencilla cuya secuencia es la misma del ARNm. En estos virus la síntesis de una cadena complementaria al ARN original precede la síntesis del ARN viral. Clase V: está formada por los virus que poseen un genoma de ARN de cadena sencilla, el cual es complementario en su secuencia de bases al ARNm. Clase VI: consta de virus que poseen un genoma de ARN de cadena sencilla y que producen un ADN intermediario durante el proceso de replicación. En algunos miembros de esta clase el ARN del genoma y el ARNm tienen la misma secuencia. d) LA REPLICACIÓN DEL ADN VIRIL El mecanismo por medio del cual una molécula de ADN es duplicada (replicada) in vivo es el mismo, independientemente del origen viral o celular del ADN. A primera vista, la replicación del ADN parece un proceso sencillo: una enzima polimerasa se mueve a lo largo de la molécula de ADN produce dos cadenas hijas a partir del templado constituido por las cadenas de la molécula madre. Este modelo de replicación implica que en cada una de las moléculas hijas existe una cadena derivada de la molécula

original y otra cadena formada por ADN recién sintetizado, o sea, la replicación del ADN es de tipo semiconservativo. Este hecho fue demostrado por Meselson y Stahl a través de un famoso y ahora ya clásico experimento. Debido a su tamaño relativamente pequeño y a la facilidad con que pueden ser manipuladas in vitro, las moléculas del ADN viral han sido frecuentemente utilizadas para estudiar el mecanismo de la síntesis de ADN en general. Toda cadena, lineal de ADN tiene un grupo hidroxilo (OH-) libre en el extremo denominado 3', y un grupo fosfato (PO3=) en el extremo opuesto, denominado 5'. Las dos cadenas de una doble hélice de ADN son antiparalelas, o sea, tienen secuencias complementarias pero que corren e direcciones opuestas. Por lo tanto, una consecuencia del modelo semiconservativo para la replicación del ADN consiste en que una de las cadenas hijas es sintetizada en dirección 3' → 5', mientras que la otra cadenas, hija es sintetizada en dirección 5'→ 3'. Sin embargo, todas las ADN polimerasas, tanto virales como celulares, purificadas hasta la fecha, sintetizan ADN solamente en la dirección 5'→ 3'. Una solución a este problema consiste en que la síntesis de una de las cadenas hijas se realiza en forma continua en dirección 5'→ 3' a lo largo de la cadena madre que sirve como templado, la llamada cadena líder. Mientras que la síntesis de la otra cadena hija ocurre en forma discontinua pero también en dirección 5'→ 3' a lo largo de la otra cadena madre denominada la cadena rezagada. Los fragmentos de ADN producidos por la síntesis discontinua (fragmentos de Okazaki) pueden ser unidos por la acción de una enzima conocida como ADN ligasa. Sin embargo, otro problema en la replicación del ADN consiste en que las ADN polimerasas necesitan la presencia de un fragmento de ácido nucleico que sirva como punto de iniciación para la síntesis de ADN, o sea, no pueden iniciar la síntesis de novo. Por su parte, la ARN polimerasa que sintetiza el ARN no requiere de la presencia de un fragmento iniciador para llevar a cabo la síntesis del polinucleótido. Por lo tanto, la ARN polimerasa puede sintetizar pequeños fragmentos de ARN complementarios a la cadena madre de ADN; dichos fragmentos servirán como puntos de iniciación para la síntesis del ADN que formará parte de la nueva cadena hija. Posteriormente, son degradados los fragmentos de ARN que actuaron como iniciadores, y los fragmentos de ADN resultantes son unidos por acción de la enzima ADN ligasa.

Figura III.4. Esquema de la síntesis discontinua del ADN ambas cadenas son sintetizadas en la dirección 5---3, pero solamente una de las cadenas es sintetizada en forma continua.

Figura III.5 Participación de un primer de ARN o fragmento iniciador en la síntesis de los fragmentos de Okazaki.

El proceso de replicación del ADN tiene un alto grado de fidelidad; esto es esencial para mantener la estabilidad de la información genética contenida en el ADN. Se ha calculado que el índice de error en la fidelidad de copiado equivale a la introducción de

un nucleótido erróneo por cada 10 -10 nucleótidos copiados en forma complementaria. Esta alta fidelidad de copiado se debe a que las ADN polimerasas (cuando menos en bacterias) tienen la capacidad de "editar" el ADN recién sintetizado y corregir los errores en la copia de la secuencia de nucleótidos por medio de una actividad enzimática asociada con la polimerasa; esta actividad conocida como exonucleasa 3' 5' permite romper la unión establecida entre el OH- presente en el extremo 3' de la cadena de ADN y el grupo fosfato presente en la posición 5' del último nucleótido polimerizado (añadido) a la cadena que está siendo sintetizada este último nucleótido es rápidamente eliminado en caso de haber sido introducido por error en la nueva cadena de ADN (figuras III.4 y III.S.).
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Los bacteriófagos T contienen moléculas lineales de ADN de cadena doble, las cuales son replicadas ya sea por la acción de polimerasas específicas a estos fagos o por las polimerasas de la célula hospedera que han sido modificadas en su especificidad a consecuencia de la infección viral. Los productos inmediatos de la replicación del ADN de los fagos T están representados por moléculas concatenadas, las cuales tienen una longitud equivalente hasta cuatro veces el tamaño del ADN original. Estas grandes moléculas pueden ser formadas por la unión de los extremos de moléculas lineales de ADN o por medio de un proceso cíclico llamado círculo rodante que permite la replicación continua de un templado circular para producir estructuras compuestas de múltiples unidades moleculares (figuras III.6 y III.7.). La formación de grandes moléculas concatenadas explica por qué las propiedades estructurales y genéticas de los fagos T sugieren que su mapa genético es circular. En estos fagos el precursor inmediato del ADN viral es una gran molécula; esta molécula es fragmentada por la acción de enzimas nucleasas que dividen la macromolécula en subunidades cuya longitud corresponde a la del ADN original. Esta fragmentación ocurre antes o durante el proceso de encapsidación. Durante la replicación del fago T4 se generan moléculas que poseen secuencias redundantes en sus extremos terminales (ej.: ABC... YZABC). De hecho, en una población de fagos T4 no todas las moléculas de ADN viral empiezan con la misma secuencia, y a pesar de que estas moléculas son lineales, el análisis genético muestra que su mapa genético es circular. Esto es consecuencia de la fragmentación de múltiples cadenas concatenadas, las cuales son reducidas al tamaño correcto para poder ser empacadas en las cabezas de los fagos. El mecanismo de círculo rodante ha sido particularmente estudiado en el caso de algunos fagos, como el fago λ el fago ØXI74.

Figura III.6. Posible mecanismo para la producción de cadenas de ADN compuestas por múltiples unidades

Figura III.7. El mecanismo del círculo rodante.(a) ADN circular. (b) Una endonucleasa hace un corte en la cadena positiva (+). (c) La ADN polimerasa añade nucleótidos en el extremo 3 de la cadena abierta, de manera que produce desplazamiento del extremo 5 . (d) El desplazamiento del extremo 5 se hace más extenso en la medida que la enzima polimerasa recorre el templado de ADN circular (cadena negativa). El resultado es la formación de un ADN con longitud mayor a la normal.

En general, la replicación de los virus ADN utiliza enzimas similares a las involucradas en la replicación del ADN celular y una característica común es la presencia de estructuras circulares temporales cuando menos en algunas de las etapas del proceso de replicación. La abundancia del ADN circular en diferentes tipos de virus sugiere que el círculo representa el formato más importante en la replicación del ADN viral, y la forma lineal de la molécula es una adaptación (particularmente en el caso de los fagos T) que permite efectuar la inyección del ácido nucleico viral a través de la cola del virus. Solamente los fagos con cola tienen genomas lineales, los otros tipos de fago poseen genomas circulares. En los últimos quince años se han logrado importantes avances en el conocimiento de los mecanismos de replicación del ADN en varios tipos de virus animales. La gran variedad en el tamaño y organización de los genomas virales implica una gran diversidad en los detalles asociados con la replicación del ADN en cada tipo de virus en particular. La descripción de tales mecanismos está fuera del enfoque del presente libro y el lector interesado hará bien en consultar la bibliografía proporcionada al final de este libro. Sin embargo, es importante hacer notar que todavía existen múltiples incógnitas respecto a la replicación del ADN tanto en los virus como en las células en general. La autonomía de los virus en cuanto a su capacidad para replicar el ADN viral está en función del tamaño del genoma viral. Algunos virus, como los fagos T los poxvirus (que incluyen al virus de la viruela), Cuentan con genomas suficientemente grandes para codificar entre 100 y 200 genes diferentes. Por lo tanto, estos virus requieren poca participación de la célula hospedera, con excepción de la facilitación de un espacio cerrado, la disponibilidad de la maquinaria celular para la síntesis de proteínas y el

abastecimiento de aminoácidos y nucleótidos que sirven como precursores para la síntesis de proteínas y ácidos nucleicos tanto celulares como virales. Algunos virus, como el Herpes simplex y el virus de la vacuna, son capaces de especificar enzimas como la timidina cinasa que participa en la síntesis de precursores de los ácidos nucleicos y quizá estos virus son capaces también de codificar nuevos tipos de ARN de transferencia que aparecen en las células infectadas. Sin embargo, otros virus, como el fago ØXI74, poseen genomas muy pequeños que no pueden codificar más de diez genes diferentes. Para poder replicar su ADN, estos virus dependen de las moléculas precursoras y la batería de enzimas polimerasas, ligasas, nucleasas, etc., presentes en la célula hospedera. Se conocen varios casos en los cuales un tipo de virus animal no puede replicarse en el interior de algún tipo de células en particular a pesar de haber sido capaz de iniciar la infección en las mismas. Por ejemplo, los adenovirus humanos pueden infectar cultivos de células renales de mono, pero no pueden crecer en estas células. Sin embargo, la coinfección de dichas células con virus SV40 permite la replicación del adenovirus por medio de la formación de una progenie de híbridos SV4Oadenovirus, los cuales contienen diferentes cantidades de sus respectivos genomas unidos en forma covalente. Esto implica que el virus SV4O actúa como auxiliar para la replicación del adenovirus, proporcionando factores que están ausentes en ese tipo de célula hospedera en particular, factores que son necesarios para la replicación del adenovirus. Frecuentemente se observa que la coinfección de una misma célula con dos diferentes mutantes o variedades de un mismo tipo de virus, cada uno de los cuales es defectuoso en alguna función esencial para la replicación del genoma viral, resulta en la producción de progenie viral con capacidad infectiva normal debida a la formación de híbridos entre los dos tipos de mutante, los cuales se complementan cancelando así sus respectivas deficiencias genéticas y funcionales, de manera que estos híbridos pueden desencadenar una infección productiva. Este fenómeno de complementación ha sido usado ampliamente para mapear y caracterizar los genes que codifican proteínas virales ya sean éstas de tipo funcional o estructural. e) SíNTESIS DEL ARN GENÓMICO VIRAL EN LOS VIRUS ARN La síntesis del ARN por parte de los virus ARN involucra la replicación, que puede ser definida como la producción de una progenie de genomas virales (ARN en este caso), y la transcripción que consiste en la producción de ARN cuya secuencia de nucleótidos es complementaria a la del genoma. Debido a que los genomas de los virus ARN pueden ser de sentido positivo (+) o sentido negativo (-) [véase la clasificación de Baltimore], la transcripción en estos virus, a diferencia de lo que ocurre en el caso de los virus ADN, no es siempre sinónimo de la síntesis de ARN mensajero. La mayoría de los virus ARN poseen moléculas de cadena sencilla y por lo tanto la replicación consiste en que una secuencia de ribonucleótidos deerminada debe ser copiada para producir exactamente la misma secuencia, por ejemplo: ACGU ACGU. La información actualmente disponible indica que el apareamiento entre las bases A-U y C-G es la clave para la replicación del ARN viral; por lo tanto, en estos

virus se aplican también los principios fundamentales relacionados con la replicación del ADN, molécula en la cual normalmente existen los apareamientos A-T y C-G. A principios de los años sesenta fueron descubiertos los primeros fagos ARN y casi al mismo tiempo se demostró que los picornavirus, que se caracterizan por tener ARN de cadena sencilla, son capaces de replicarse en células animales en las cuales la síntesis del ADN y su subsecuente transcripción en moléculas de ARN mensajero celular había sido inhibida por la droga actinomicina D, la cual se intercala en la molécula de ADN y de esta manera impide que se separen ambas cadenas de ADN, de manera que las enzimas como la ADN polimerasa y la ARN polimerasa no pueden cumplir con la función de llevar a cabo la replicación o la transcripción de este ADN. En presencia de actinomicina D se detiene la síntesis de ARN celular; por lo tanto, se pueden infectar las células con virus ARN en presencia de precursores radiactivos del ARN (como Huridina) y colectar muestras de estas células a intervalos apropiados después de la infección; estas muestras pueden ser fraccionadas por medio de detergentes y solventes orgánicos de manera que se pueden aislar y analizar las nuevas moléculas de ARN, cuya síntesis ha sido inducida por la infección viral.
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La mayoría de los virus ARN (con excepción de los retrovirus) se pueden replicar en presencia de inhibidores de la síntesis de ADN; este hecho descarta la participación de ADN intermediario en la replicación de estos virus. En 1963, Montagnier y Sanders demostraron la presencia de ARN de cadena doble en células infectadas por el virus de la encefalomiocarditis (EMCV), el cual posee solamente ARN de cadena sencilla. Así, pronto fue establecido que el ARN de cadena doble es una forma intermediaria en la replicación de los virus ARN (con excepción de los retrovirus). Este ARN de cadena doble se denomina forma replicativa (FR) y se caracteriza por ser insensible a la acción de la enzima ribonucleasa (ARNasa), la cual sólo digiere el ARN de cadena sencilla. Posteriormente, ha sido posible aislar otro tipo de ARN intermediario constituido por moléculas de cadena doble cuyos extremos están desapareados originando "colas" de ARN de cadena sencilla. Este ARN constituye el intermediario de replicación (IR). Sin embargo, el FR y el IR parecen tener papeles diferentes en la replicación de diferentes tipos de virus ARN. El fago Qβ representa el modelo mejor estudiado de la síntesis del ARN viral. En este sistema ha sido posible purificar la enzima ARN polimerasa dependiente de ARN, también conocida como la replicasa. Esta enzima tiene gran especificidad por el templado representado por el ARN del fago Q/β . La síntesis de la cadena (-) de ARN complementaria al genoma viral es detectada por la aparición de un nuevo ARN no infeccioso que es resistente a ser digerido por la enzima ARNasa. La aparición de este ARN, que representa a la forma replicativa (FR), coincide con la pérdida de infectividad de las moléculas de ARN viral que sirvieron como templado. La síntesis de esta cadena (-) de ARN es llevada a cabo por la replicasa del fago, la cual está constituida por varias subunidades de proteína, algunas de las cuales son proteínas codificadas por la célula hospedera (como los factores de elongación EF; Tu y Ts, normalmente involucrados en el proceso de síntesis de proteínas) las cuales son incorporadas para formar la llamada holoenzima de la Qβ replicasa. Posteriormente, la síntesis de la nueva cadena (+) de ARN que constituye el nuevo genoma viral es realizada por un complejo formado por 4 moléculas (tetrámero) de la propia Qβ replicasa. Es

importante mencionar que ha sido posible sintetizar in vitro el ARN del fago Qβ a partir del propio ARN viral y trifosfatos de ribonudeótidos incubados en presencia de Qβ la replicasa. El nuevo ARN viral sintetizado in vitro resulta ser tan infectivo y biológicamente competente como el ARN viral sintetizado in vivo dentro de las bacterias infectadas por el fago Qβ . El ARN del fago Qβ es capaz y suficiente para dirigir su propia replicación in vitro; esta propiedad ha sido utilizada para estudiar la evolución de moléculas con capacidad para autorreplicarse. En el tubo de ensayo las moléculas de ARN se encuentran libres de muchas restricciones asociadas con el ciclo de vida del virus. Esta situación es similar a un estado de evolución precelular, cuando los factores ambientales de la selección natural actuaban directamente sobre el material genético en lugar de hacerlo sobre el producto (proteína) codificado por el gene. Sol Spiegelman y colaboradores diseñaron un experimento para determinar qué es lo que ocurre con las moléculas de ARN cuando la única necesidad consiste en que estas moléculas se repliquen tan rápidamente como les sea posible. El producto de la reacción entre la Qβ replicasa y el ARN viral purificado puede actuar como templado para la síntesis de más ARN. Por otra parte, cuanto más larga es una molécula de ARN más tiempo tardará en replicarse. Considerando estos factores, resulta lógico pensar que las nuevas moléculas de ARN podrán replicarse más rápidamente si eliminan información genética que no tiene una importancia esencial para el proceso de replicación, de esta manera las moléculas de ARN pueden disminuir su tamaño y el tiempo necesario para la replicación de las propias moléculas. Por ejemplo, si se añade la enzima Qβ replicasa a una mezcla de reacción constituida por moléculas enteras y medias moléculas de ARN Qβ purificado, la replicación de las medias moléculas se realizará en la mitad del tiempo necesario para replicar las moléculas enteras. Esto resulta en un exceso de medias moléculas que continúan sirviendo como templado para la síntesis de nuevas medias moléculas, generando así un exceso absoluto de moléculas más pequeñas. Spiegelman preparó una mezcla de reacción consistente en ARN Qβ purificado, trifosfatos de los ribonucleótidos apropiados y la enzima Qβ replicasa. Después de una corta incubación, la mezcla de reacción fue diluida 121/2 veces en otro tubo de ensayo que contenía la misma concentración de la enzima replicasa y los ribonucleótidos precursores, pero en ausencia de ARNQβ . Esta secuencia de incubaciones y diluciones fue repetida 75 veces y la duración de las incubaciones fue siendo reducida paulatinamente aunque el factor de dilución fue mantenido constante. Después de la transferencia número 75 fue posible aislar una población de moléculas derivadas del ARN Qβ original, las cuales solamente contenían 17% de la secuencia de nucleótidos presente en el ARN original. Por lo tanto, así se demostró que el tamaño de la molécula de ARN disminuye progresivamente cuando es sometida a este proceso de selección en función de la velocidad de replicación. El único factor que tiene un efecto limitante en el acortamiento de las moléculas de ARN consiste en que las nuevas moléculas deben conservar cuando menos la secuencia de nucleótidos necesaria para que la Q replicasa los reconozca como correspondientes a una molécula de ARNQβ . La replicación del fago Qβ es sólo un ejemplo de las múltiples estrategias de replicación exhibidas por los virus ARN. Una vez más, el lector interesado deberá consultar la bibliografía para conocer detalles sobre la replicación de otros virus ARN.

Una pregunta importante es por qué el ácido nucleico purificado a partir de ciertos tipos de virus tiene capacidad infectiva, mientras que el ácido nucleico purificado a partir de otros virus carece de esta capacidad. La respuesta consiste en que los virus pertenecientes a las clases II, V y VI (de acuerdo con la clasificación de Baltimore), requieren que su información genética sea transcrita en otro tipo de ácido nucleico diferente al presente en el virus original. En la mayoría de los casos, esta transcripción es mediada por enzimas específicas del virus, las cuales están almacenadas en la partícula viral. Ejemplo de estas enzimas son la ARN polimerasa dependiente de ADN, característica del virus de la vacuna; la ARN polimerasa dependiente de ARN, producida por el virus de la estomatitis vesicular y los reovirus; la ADN polimerasa dependiente de ARN característica de los retrovirus. El ácido nucleico purificado a partir de estos virus carecerá de estas enzimas necesarias para la transcripción y subsecuente replicación de dicho ácido nucleico, y las células infectadas no cuentan con enzimas capaces de utilizar estos tipos de ácido nucleico viral como templado. f) LA REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN DE LOS GENES VIRALES Cuando una célula es infectada por un virus, no todos los genes virales son expresados a un mismo tiempo y, por lo tanto, no todas las proteínas virales son sintetizadas al mismo tiempo. La mayoría de estas proteínas virales no son sintetizadas en forma continua. Algunas proteínas virales son sintetizadas durante unos cuantos minutos al principio de la infección, otras son sintetizadas en las etapas tardías de la infección y otras más son sintetizadas durante periodos que equivalen a la mitad del ciclo infeccioso. Cuando se expresa un gene, la información genética presente en la secuencia de nucleótidos del ácido nucleico original es transcrita en una secuencia complementaria constituida por ARN mensajero, la información contenida en este ARN mensajero es traducida en el interior de las estructuras conocidas como ribosomas; en esta traducción interviene otro tipo de ARN conocido como ARN de transferencia (ARNt), del cual existen cuando menos veinte tipos diferentes, cada tipo de ARNt sirve para transportar específicamente uno de los veinte tipos diferentes de aminoácidos que forman parte de las proteínas. La traducción consiste en interpretar los codones constituidos por tripletas de nucleótidos presentes en la secuencia del ARN mensajero (ARNm). Existen 61 codones diferentes que codifican a los 20 aminoácidos diferentes, o sea, que un mismo tipo de aminoácido puede ser designado por más de un codón. Además, existen otros tres codones cuya función es actuar como signos determinación en la síntesis de proteínas. Cada codón (con excepción de aquellos que actúan como signos de terminación) es reconocido por su respectivo anticodón, constituido por una tripleta de nucleótidos con secuencia complementaria a la del codón; este anticodón se encuentra en un extremo de la molécula del ARNt correspondiente. Así, el producto de la traducción está constituido por una cadena de aminoácidos, o sea, una proteína cuya secuencia de aminoácidos es correspondiente a la secuencia de codones presente en el ARNm, secuencia interpretada por los anticodones presentes en los ARNt que actúan como transportadores de los aminoácidos. i) Regulación en los bacteriófagos ADN

El control de la expresión genética puede ocurrir en el nivel de la transcripción, en el nivel de la traduccion o en ambos niveles. En el caso de las bacterias infectadas por fagos ADN, el control de la expresión de los genes virales ocurre fundamentalmente en el nivel de la transcripción. La transcripción del ADN en ARNm es realizada por la enzima ARN polimerasa, la cual en bacterias como la E. coli está formada por cien diferentes cadenas polipeptídicas (proteínas): α, β , β ω σ ; estas proteínas están unidas entre sí por puentes de hidrógeno en la siguiente proporción: α, β , β ω σ La proteína o factor σ puede ser fácilmente separada del resto de la ARN polimerasa que retiene la actividad catalítica encargada de la síntesis del ARNm. El factor s tiene como función el reconocimiento de las señales para la iniciación de la transcripción; estas señales están presentes en las llamadas secuencias promotoras incluidas en el ADN. Durante la infección de una bacteria por fago T7 se forma una serie de moléculas discretas de ARNm, las cuales pueden ser aisladas y caracterizadas. Estas moléculas de ARNm han sido divididas en dos clases: ARNm temprano, el cual consta de 4 especies; y ARNm tardío, que consta de 8 o 9 especies diferentes. En el fago T7 solamente una de las cadenas del ADN viral sirve como templado para la síntesis de ARNm esto indica que los genes de este fago están codificados en la misma cadena de ADN. El gene 1 codifica una ARN polimerasa que es específica para el fago T7; esta polimerasa solamente, consta de una cadena polipeptídica, siendo mucho más sencilla que la ARN polimerasa de la bacteria hospedera. La ARN polimerasa específica del fago T7 es resistente al antibiótico rifampicina, el cual inhibe la actividad de la ARN polimerasa bacteriana. Al iniciarse la infección por el fago T7, la ARN polimerasa bacteriana se encarga de transcribir los llamados genes tempranos del genoma viral. Este primer tipo de ARNm producido es de tipo policistrónico, o sea, incluye en una sola molécula de ARNm el mensaje contenido en varios genes. Sin embargo, una enzima ribonucleasa propia de la célula bacteriana (ARNasa III) corta e saje correspondiente a un solo gene en particular. Como ya fue mencionado, la transcripción del gene 1, y su posterior traducción, resulta en la síntesis de una ARN polimerasa viral que se encarga de transcribir los llamados genes virales tardíos. La transcripción de cada clase o tipo de ARNm viral tardío se inicia en secuencias promotoras localizadas en diferentes puntos del genoma viral. Sin embargo, todas estas clases de mensajes virales terminan en la misma región cercana al extremo 3' del genoma del fago T7. El fago T7 inhibe las funciones sintéticas propias de la célula bacteriana. Una proteína codificada por uno de los genes tardíos del fago T7 es capaz de pegarse a la ARN polimerasa bacteriana y de esta manera inhibe la actividad de esta enzima impidiendo así la síntesis de ARNm bacteriano y eliminando de paso la síntesis de nuevas moléculas de ARNm viral de tipo temprano. El genoma del fago T7 tiene un peso molecular de 25 x 106 daltones y una capacidad de codificación equivalente a 30 genes de tamaño promedio. Hasta la fecha han sido identificados 25 genes de este tipo de virus; estos genes han sido ordenados en un mapa genético lineal en el cual los genes que se expresan en forma temprana están concentrados en el extremo del genoma (ADN) viral. Por lo tanto, considerando que la síntesis de ARNm ocurre en la dirección 5' ® 3', resulta que los transcritos correspondientes a los genes tempranos están concentrados en el extremo 3' del ARNm viral. En el caso de la infección por fago T4, es posible identificar tres clases de ARNm virales en el interior de la bacteria hospedera: ARNm tempranos inmediatos, ARNm tempranos

tardíos y ARNm tardíos. Los ARNm tempranos inmediatos son sintetizados durante el primer minuto de infección. Los ARNm tempranos tardíos son sintetizados a partir de 2 o 3 minutos después de iniciada la infección. Los ARNm tardíos son sintetizados a partir de los 10 minutos de infección. A diferencia de lo que ocurre en el caso del fago T7, la síntesis del ARNm dd fago T4 es sensible al antibiótico rifampicina. Es sabido que este antibiótico afecta a la subunidad β , de la ARN polimerasa, bacteriana; por lo tanto, esta subunidad debe participar en la síntesis del ARNm del fago T4. Experimentos en los cuales la ARN polimerasa bacteriana ha sido marcada radiactivamente antes de la infección por fago T4, indican que las subunidades α y β , de la ARN polimerasa son conservadas durante el ciclo de infección; sin embargo estas subunidades son modificadas. Dos minutos después de iniciada la infección ocurre una modificación de las subunidades de la ARN polimerasa bacteriana por medio de un proceso conocido como adenilación; esto modifica la especificidad de la enzima que suspende la síntesis de ARNm viral de tipo temprano inmediato y empieza a sintetizar ARNm viral de tipo temprano tardío. Existe evidencia de que a los 10 minutos de infección la estructura de la subunidad β ,' es modificada; esto resulta en un nuevo cambio en la especificidad de la ARN polimerasa, la cual empieza a sintetizar ARNm virales tardíos. Existen otros factores que también participan en la regulación de la transcripción del fago T4; entre éstos podemos mencionar: la síntesis de un factor de naturaleza proteica capaz de hacer antagónica la normal terminación de las cadenas de ARNm (factor de antiterminación), este factor permite que la ARN polimerasa bacteriana continúe transcribiendo el ADN viral hasta llegar a los genes distales. También ocurre la síntesis de factores similares al factor s, capaces de reconocer señales de iniciación de la transcripción que no son reconocidas normalmente por el factor o propio de la bacteria hospedera.

Figura III.8. Esquema de una célula bacteriana (procariote).

ii) Regulación en los virus animales

La regulación de la expresión genética de los virus animales puede ocurrir en el nivel de la transcripción, traducción o de ambos procesos, y en un grado que varía entre los diferentes tipos de virus y también durante el ciclo de multiplicación de cada virus en particular. La investigación de los virus animales ha permitido elucidar mecanismos de regulación genética, totalmente diferentes a los presentes en los sistemas bacterianos. En muchos casos todavía se ignora la mayoría de los eventos involucrados en la regulación de los genes virales. Sin embargo, el estudio de los virus animales ha servido como poderosa herramienta para conocer detalles de la biología molecular de las células eucarióticas, o sea, células que se caracterizan por tener núcleo y otros organelos intracelulares a diferencia de las células procarióticas (como las bacterias) que carecen de organelos intracelulares (figuras III.8 y III.9).

Figura III.9. Esquema de una célula animal (eucariote).

iii) Virus ARN El genoma completo del virus de la polio, un tipo de virus ARN, es traducido en una enorme poliproteína con peso molecular de 250 000 daltones. Esta poliproteína es fragmentada por medio de una serie de pasos enzimáticos para dar origen a proteínas funcionales más pequeñas. Este fenómeno de fragmentación postraducción parece ser común en el caso de las células eucarióticas. La fragmentación se inicia cuando la poliproteína todavía está siendo sintetizada y solamente mediante la adición de inhibidores de las proteasas (enzimas que degradan a las proteínas) es posible aislar a la poliproteína íntegra. En teoría, todas las proteínas del poliovirus deberían estar presentes en cantidades equimolares, pero esto no ocurre en la realidad porque al parecer algunas proteínas virales son degradadas en forma selectiva (figura III.10). El virus de la polio es un virus ARN perteneciente a la clase IV de la clasificación de

Baltimore; estos virus se caracterizan por producir un ARNm cuya secuencia es idéntica a la del ARN que constituye el genoma viral; para esto se requiere la síntesis previa de una cadena de ARN con secuencia complementaria a la del ARN del genoma viral. Esta cadena complementaria sirve como templado para la síntesis del ARNm viral. El virus de la polio es capaz de inhibir la síntesis de macromoléculas propias de la célula hospedera, de esta manera todos los recursos y precursores moleculares presentes en la célula son dedicados a la producción de componentes virales y, por lo tanto, no resulta sorprendente que la célula muera a consecuencia de la infección viral. En las células infectadas por el poliovirus una de las proteínas virales introducida a la célula junto con el virión es la causa de que se inicie la inhibición de las funciones celulares. Particularmente es afectada la síntesis del ARN celular que forma parte de los ribosomas, que son las estructuras en las cuales se realiza la síntesis de proteínas. Pero todavía se conocen muy pocos detalles en cuanto a la forma como el poliovirus inhibe la síntesis de proteínas celulares.

Figura III.10. Esquema de la síntesis de las proteínas del virus de la poliomielitis. Los picornavirus hacen sus proteínas funcionales por medio de la traducción del ARN mensajero viral en una cadena continua de aminoácidos (la poliproteína NOO=. durante la síntesis de esta poliproteína se producen cortes primarios que dan origen a las proteínas precursoras N1, NX y N1.5. Ni es fragmentada para formar las proteínas estructurales del virión, mientras que NX y los productos del N1.5 probablemente están involucrados en funciones intracelulares como l a síntesis de ARN viral.

En el caso de los virus ARN pertenecientes a la clase V de Baltimore, los ARNm virales tienen una secuencia complementaria al genoma viral. Los ortomixovirus, que incluyen al virus de la influenza tipo A, se caracterizan por tener genomas segmentados. A partir de cada uno de los ocho segmentos del genoma viral se sintetiza un ARNm que es monocistrónico. Las ocho diferentes proteínas resultantes no están presentes en cantidades equimolares y la proporción relativa de cada proteína cambia durante la

infección. El control de la síntesis de estas proteínas virales es realizado en el nivel de la transcripción. En este tipo de virus es vital que exista una manera de distinguir entre el ARNm(+), que es traducido en proteínas, y el ARN(+), que sirve como templado para la síntesis de nuevos genomas virales constituidos por ARN(-). Recordemos que por convención el ARNm es (+) y todo ácido nucleico de secuencia complementaria a la de dicho ARNm es considerado de polaridad (-). Existe amplia evidencia de que el virus de la influenza sintetiza dos tipos de ARN(+): el ARN(+) que servirá como templado para la síntesis del ARN(-) viral es un fiel complemento de la secuencia de nucleótidos presente en el genoma ARN(-) viral, mientras que el ARNm(+) viral carece de una porción de la secuencia de nucleótidos complementaria al extremo 5´ del ARN(-) correspondiente al genoma viral. Así, el ARNm no puede servir como templado para la síntesis de segmentos completos del genoma viral. Los ortomixovirus son únicos entre los virus ARN debido a que parte de su ciclo de multiplicación se lleva a cabo dentro del núcleo celular. Inmediatamente después de la infección, la partícula viral desnuda es transportada al interior del núcleo celular y en etapas más avanzadas de la infección, algunas proteínas virales recién sintetizadas migran del citoplasma (su lugar de síntesis) hacia el núcleo. El paso de moléculas a través de la membrana nuclear es un proceso altamente selectivo y constituye un nivel de control presente únicamente en las células eucarióticas. iv) Virus ADN Todos los virus ADN, con excepción de los poxvirus, sintetizan su ARNm a partir de una molécula de ADN de cadena doble, la cual se ubica en el núcleo de la célula infectada y, por lo tanto, representa el modelo más cercano para el estudio de la síntesis de ARNm en las células eucarióticas. Las histonas constituyen el principal tipo de proteínas que normalmente se encuentran asociadas con el ADN celular; estas histonas se encuentran también asociadas con el genoma de algunos virus ADN como los papovavirus, lo que subraya la similitud estructural entre la cromatina celular y la cromatina viral. El tamaño de los genomas de los virus ADN animales varía dos órdenes de magnitud, desde los parvovirus, cuyo ADN tiene un peso molecular promedio de 1.5 x 106 daltones, hasta el virus de la vacuna cuyo ADN tiene un peso molecular de 160 x l06daltones. Los virus más grandes son menos dependientes de las funciones de la célula hospedera para multiplicarse y por lo tanto pueden hacerlo aun cuando las células hospederas se encuentran fuera de la fase S del ciclo celular, misma que constituye el periodo normal de duplicación del ADN celular. Los virus pequeños solamente pueden replicarse durante la fase S del ciclo celular; y los virus de tamaño intermedio tienen la capacidad de inducir a la célula para que entre en la fase S. Casi todos los virus ADN tienen la capacidad de transformar células en cultivo, volviéndolas de tipo tumoral (canceroso). Este fenómeno será discutido con detalle más adelante. Sin embargo, es posible especular que la transformación celular puede resultar a consecuencia de una aberración en el mecanismo normal por medio del cual el virus interacciona con los factores celulares que regulan la división celular. También es importante mencionar que gran parte de la información genética contenida en el genoma de los virus ADN más grandes parece duplicar información ya presente y expresada en las células que se encuentran en la fase S del ciclo celular. v) Regulación en los papovavirus

Los papovavirus constituyen un grupo de virus ADN animales. El virus del polioma y el virus de simios SV40 son los papovavirus más estudiados. Estos virus tienen un genoma circular constituido por ADN de cadena doble que codifica proteínas virales tempranas y tardías, las cuales son sintetizadas a partir de la traducción de ARNm virales tempranos y tardíos. El ADN de los papovavirus es transcrito por la ARN polimerasa celular tipo II, la cual normalmente es la encargada de sintetizar el ARNm celular. El ARNm viral de tipo temprano es sintetizado a partir de una cadena de ADN diferente a la que da origen al ARNm tardío. En el virus SV40, la proteína temprana más importante es el antígeno tumoral mayor o T-antígeno; esta proteína viral migra hacia el núcleo celular y supuestamente modifica el ADN celular, de manera que se vuelve susceptible a ser replicado. El virus SV40 también sintetiza otro antígeno tumoral menor o t-antigeno. Por su parte, el virus del polioma sintetiza tres diferentes antígenos tumorales. El papel de estos antígenos en la transformación celular será discutido más adelante. Otras proteínas tempranas codificadas por el virus SV40, pero cuya función se desconoce, son el U-antígeno, que también se ubica en el núcleo celular, y el antígeno de transplante-tumor específico (TSTA), que se ubica en la membrana celular. La fase inicial de la infección viral es seguida por la inducción de la síntesis de enzimas celulares y ADN celular, en forma independiente de las necesidades celulares. A continuación se inicia la síntesis de ADN viral seguida por la síntesis de ARNm viral tardío. Las proteínas tardías son ensambladas con el ADN viral para formar los nuevos viriones. A pesar de que los ARNm tempranos y tardíos son sintetizados a partir de diferentes cadenas del ADN viral, ambos tipos de ARNm están presentes en el núcleo de la célula infectada, incluso en las etapas avanzadas de la infección. Por lo tanto, la síntesis predominante de proteínas virales tardías se logra por medio del transporte selectivo hacia el citoplasma de aquellos transcritos de ARNm viral que corresponden a las proteínas de tipo tardío. vi) Regulación en los adenovirus

Figura III. 11. (a) Producción del ARN mensajero de un adenovirus. (b) El asa de ADN formada por el apareamiento con el ADN genómico puede ser observada mediante el microscopio electrónico y proporciona evidencia de que el ARNm es formado a partir de regiones no contiguas del ADN genómico. En la ilustración solamente está representada una cadena del ADN.

Los adenovirus poseen una cantidad de ADN seis veces mayor que la de los papovavirus. Sin embargo, son muy similares sus estrategias de control genético: síntesis temprana de proteínas virales, replicación del ADN viral, síntesis de proteínas virales tardías. En el caso de los adenovirus, tanto la ARN polimerasa celular tipo II como la tipo III participan en la transcripción de ARNm viral temprano y tardío. El estudio de la replicación de los adenovirus ha contribuido a establecer que el ARNm de ciertos virus es codificado, al igual que el ARNm de las células eucarióticas, por regiones no contiguas del ADN. Esto implica que el transcrito inicial del ARN viral es fragmentado en forma específica y los fragmentos adecuados son unidos por una enzima ARN ligasa (figura III.11). En el núcleo de la célula infectada por el adenovirus ocurren mecanismos de control genético altamente complejos. Además de la fragmentación y ligado del ARNm, existen otros procesos como la poliadenilación, que consiste en la adición de un polímero constituido por 150 a 200 nucleótidos de adenina, al extremo 3' del ARNm. Este fenómeno incrementa la estabilidad del ARNm. Otro proceso es el capping del ARNm viral, el cual consiste en la adición de un nucleótido especial: 7-metil guanosina, al extremo 5' del ARNm. Este nucleótido puede ser hipermetilado posteriormente. El cap protege el extremo 5' del ARNm evitando que sea degradado por enzimas nucleasas o fosfatasas o por ambas, lo cual incrementa la estabilidad del mensaje. También se observa un transporte diferencial del ARNm viral en el nivel de la membrana nuclear; la permeabilidad de esta membrana al ARNm recién sintetizado cambia continuamente durante el proceso de infección, de manera

que el espectro de proteínas virales al ser sintetizadas también cambia en forma continua. vii) Regulación en los herpesvirus Los herpesvirus contienen aproximadamente cuatro veces más ADN que los adenovirus. En los herpesvirus la síntesis de ARNm tardíos es independiente de la síntesis de ADN viral y celular. Así, cuando se inhibe la síntesis de ADN, todavía es posible observar la acumulación de ARNm temprano y tardío en el núcleo celular. Sin embargo, la síntesis de las proteínas virales sigue un riguroso sistema de inducción y represión que ocurre en tres fases. Las proteínas de tipo α son las primeras en ser sintetizadas después del inicio de la infección; estas proteínas α inducen a su vez la síntesis de las proteínas virales β las cuales reprimen la síntesis de las proteínas α e inducen la síntesis de las proteínas virales γ , las cuales a su vez reprimen la síntesis de las proteínas β . La evidencia disponible indica que los mecanismos de control en la síntesis de estas proteínas virales ocurre en el nivel de la traducción y el procesamiento de los ARNm virales dentro del núcleo de la célula infectada. En el caso del virus Herpes simplex tipo 1, existe evidencia reciente de que la infección viral produce un número limitado de rupturas en las cadenas del ADN celular; estas rupturas inducen un cambio en la estructura tridimensional de este ADN celular y en las relaciones o asociaciones que mantiene este ADN celular con el núcleo-esqueleto o estructura subnuclear. El desprendimiento del ADN celular de los sitios de anclaje a la subestructura nuclear se manifiesta entre otras cosas por la inhibición de la síntesis del ARN y ADN celulares. Al parecer, la posición que guardan las asas de ADN celular en relación con la subestructura nuclear tiene un papel muy importante en la potencialidad de este ADN para ser replicado y transcrito. La alteración en la posición del ADN celular inducida por la infección viral puede ser un mecanismo económico y eficiente para lograr la inhibición de la síntesis de macromoléculas celulares. viii) Regulación en los poxvirus Los poxvirus que incluyen al virus de la viruela y de la vacuna son los únicos virus ADN animales que se multiplican en el citoplasma de la célula infectada. También son los virus más grandes y tienen capacidad para codificar 50 veces más genes que los papovavirus. El sitio de la multiplicación viral en el citoplasma se manifiesta por la virtual formación de un "se gundo núcleo". Los viriones de los poxvirus contienen una multitud de enzimas cuyas actividades son un duplicado de aquellas normalmente presentes en el núcleo celular. Estos viriones poseen su propia ARN polimerasa dependiente de ADN al igual que enzimas capaces de adenilar, metilar y añadir cap a los ARNm virales. La presencia de control en el nivel de la traducción es evidente en la síntesis de la enzima viral timidina cinasa, la cual es una proteína temprana cuya síntesis se detiene una vez que aumenta la síntesis de proteínas virales tardías, algunas de las cuales parecen ser la causa de la inhibición de la síntesis de proteínas tempranas como la timidina cinasa. g) EL ENSAMBLAJE DE LOS VIRUS

En las células infectadas por virus tanto las proteínas como los ácidos nucleicos virales son sintetizados por separado y posteriormente ensamblados para formar nuevas partículas virales. Los virus pueden autoensamblarse en un proceso similar a la cristalización, ya que las partículas virales, al igual que los cristales, constituyen estructuras que se encuentran en un estado mínimo de energía libre. Sin embargo, el genoma viral también puede especificar ciertos factores "morfogenéticos" que no contribuyen directamente a formar la estructura del virión, pero son necesarios para el proceso de ensamblaje. El fenómeno de autoensamblaje ocurre en la formación de diversas estructuras biológicas como los flagelos celulares. Sin embargo, el ejemplo mejor estudiado es la reconstitución in vitro del virus del mosaico del tabaco. Este virus consta de un largo filamento helicoidal de ARN que está incluido en una estructura constituida por pequeñas subunidades idénticas de proteína "A"; estas subunidades están dispuestas en forma helicoidal. Las proteínas del VMT forman diferentes tipos de agregados moleculares cuando se encuentran en solución, dependiendo de las condiciones ambientales, particularmente la fuerza iónica y el pH. Las estructuras discoidales son el tipo más común de agregado proteico que ocurre bajo condiciones fisiológicas. Sin embargo, la interacción de los discos de proteína con el ARN viral resulta en la estabilización de la forma helicoidal. Cuando se mezclan subunidades de proteína "A" y ARN viral, la polimerización es lenta y la formación de viriones maduros requiere de casi seis horas. Cuando se mezclan los discos de proteína "A" con ARN viral bajo las mismas condiciones del experimento anterior, la polimerización es rápida y en cinco minutos se ensamblan viriones maduros. El modelo más aceptado para explicar el ensamble del VMT es el asa en movimiento. Este modelo propone que una molécula de ARN en forma de horquilla se inserta, a través del orificio central de un disco formado por subunidades de proteína "A", en el espacio o mandíbula presente entre los dos discos de proteína "A". A consecuencia de esta interacción, los discos son desfasados dando origen a una estructura helicoidal, la cual se perpetúa por medio de la adición de nuevos discos de proteína en la parte superior de la hélice en crecimiento. El asa producida por la tracción del ARN hacia arriba del orificio central de la partícula en crecimiento constituirá el asa en movimiento que se inserta en el orificio del siguiente disco adicional, desfasándolo a su vez y convirtiéndolo en una estructura helicoidal (figura III.12). Este modelo predice que en partículas de VMT ensambladas parcialmente las puntas 5' y 3' del ARN viral deben protuir a través de alguno de los extremos de la partícula viral en formación. Este hecho ha sido confirmado por microscopia electrónica. El ensamble dirigido de los nuevos viriones es característico de virus complejos como los fagos del grupo T. El caso más estudiado es el del fago T4. El primer avance en la elucidación del ensamblaje del fago T4 se obtuvo a partir del estudio de mutantes letales condicionales. Cuando se infecta una cepa no permisiva de E. coli con fagos que tienen mutaciones en cualquiera de sus genes estructurales, no se producen nuevas partículas virales. Sin embargo, cuando se examinan bajo el microscopio electrónico los lisados obtenidos a partir de estas bacterias infectadas con fagos mutantes, se encuentra la presencia de estructuras correspondientes a los componentes del fago. Así, bacterias infectadas con fagos mutantes en el nivel de los genes 34, 35, 36, 37 y 38, acumulan partículas virales que parecen normales, salvo porque carecen de las

fibras de la cola. Por lo tanto, se concluye que estos genes codifican proteas involucradas en el ensamble de las fibras de la cola; la adición de estas fibras es un evento tardío en el ensamble de las nuevas partículas virales. Las fibras se acuman en bacterias infectadas con fagos mutantes en los genes 34, 35, 36 y 38, pero no en los mutantes en el gene 37, por lo que se deduce que este gene 37 codifica la principal proteína estructural de las fibras de la cola del fago. La aplicación de esta metodología a bacterias infectadas con otras cepas diferentes de fagos mutantes permitió identificar la función de muchos otros genes del fago T4y establecer que la cabeza, la cola y las fibras del fago son sintetizadas en forma independiente.

Figura III. 12. Modelo de asa en movimiento para el ensamble del virus del mosaico del tabaco (VMT). La nucleación se inicia con la inserción de una horquilla de ARN viral en el orificio central del primer disco de proteínas tipo "A". El asa se intercala entre dos capas de subunidades y se pega alrededor de la primera vuelta del disco. Como resultado del modo de iniciación, el extremo más largo del ARN viral forma un asa en movimiento a la cual se le añaden rápidamente discos adicionales formados por subunidades de proteína "A".

Figura III.13. Ensamble del bacteriófago T.4

Estudios complementarios realizados in vitro han permitido conocer más detalles del proceso de ensamblaje del fago T4. Por ejemplo, fagos carentes de fibras aislados a partir de bacterias infectadas con mutantes en los genes 34-38 fueron mezclados con un extracto obtenido de bacterias infectadas con una cepa de fagos mutantes en el gene 23, la cual no puede sintetizar cabezas virales. El resultado de este experimento fue la formación in vitro de viriones completos e infectivos, ya que el extracto del mutante en el gene 23 actuó como donador de fibras de la cola, mientras que el otro extracto proporcionó las cabezas del fago. Este tipo de experimento es análogo a los

estudios de complementación genética, pero con la diferencia de que estos últimos se realizan in vivo, o sea, dentro de las células infectadas. La figura III.13 muestra la secuencia de ensamble del fago T4. Los productos de los genes 13 y 14 no están involucrados directamente en el proceso de unión; sin embargo, deben ser funcionales para que pueda ocurrir la unión entre cabezas y colas. Las cabezas se unen a las colas en forma espontánea; por lo tanto, los genes 13 y 14 deben estar involucrados en alguna modificación de las cabezas maduras, la cual es un prerrequisito para la adición de la cola. En contraste, las fibras de la cola no se unen espontáneamente a la placa basal, sino que requieren la participación activa del producto del gene 63 para poder llevar a cabo esta unión. El correcto ensamblaje de muchos virus esféricos y también de algunos fagos con cabeza y cola requiere la participación de proteínas que no están presentes en el virus maduro. A estas proteínas se les conoce como proteínas formadoras del andamio. Por ejemplo, durante el ensamble del fago P22 aproximadamente 250 moléculas de las proteínas del andamio catalizan el ensamble de 420 moléculas de la proteína de la cubierta viral, de manera que estas proteínas forman una procabeza de cubierta doble, la cual contiene ambos tipos de proteína. Cuando ocurre la encapsidación del ADN viral, todas las proteínas formadoras del andamio son expulsadas de la procabeza, de manera que estas proteínas quedan libres para participar en ciclos subsecuentes de ensamble de las procabezas. En el caso del fago T4, la proteína formadora del andamio es el producto del gene 22; esta proteína es removida de la procabeza por medio de una enzima proteolítica (capaz de degradar proteínas) en el momento que ocurre la encapsidación del ADN viral. Durante el ensamblaje de los adenovirus las proteínas formadoras del andamio son eliminadas en el momento que ocurre la encapsidación del ADN viral, pero no se sabe si estas proteínas son destruidas o reutilizadas en el ensamble de otras partículas virales. Existe evidencia de que en el proceso de ensamble de los herpesvirus y los poxvirus se reciclan las proteínas formadoras del andamio. La proteína codificada por el gene B del fago ØXI74 no está presente en el virión maduro, pero participa en forma catalítica en el ensamble del fago. En células infectadas por ØXI74, la proteína del gene F se agrega para formar pentámeros al igual que la proteína del gene G; estos pentámeros reaccionan en presencia del producto del gene B para formar un agregado proteico más complejo, el cual probablemente constituye los vértices de la cápside viral icosaédrica. h) FRAGMENTACIÓN DE PROTEÍNAS VIRALES En la mayoría de los casos estudiados, la formación de viriones maduros requiere la fragmentación de grandes proteínas precursoras una vez que éstas se han ensamblado para formar procabezas o proviriones. Por ejemplo, en la maduración de la cabeza del fago T4, la proteína producto del gene 23 (p23) es fragmentada para generar la proteína p23*, que es 17% más corta que p23. En ausencia del ácido nucleico, las proteínas íntegras forman agregados más estables que las proteínas fragmentadas. Esto es consistente con la observación de que la fragmentación de las proteínas estructurales ocurre justamente antes de la encapsidación del ácido nucleico viral.

En las células infectadas por picornavirus y togavirus ocurren dos tipos de fragmentación postraducción de las proteínas virales. Por ejemplo, el genoma completo del poliovirus es traducido en un solo polipéptido gigante, el cual es fragmentado en tres polipéptidos más pequeños. Uno de estos polipéptidos es la proteína NCVPl o proteína que pertenece a la cápside viral. Esta proteína es precursora de las cuatro proteínas presentes en el virión maduro. NCVPl se deriva de la región 5' del genoma viral y es sintetizada en forma completa antes de ser fragmentada; esto sugiere que es necesario que la proteína NCVPl se pliegue en el espacio para adquirir una conformación tridimensional antes de que ocurra la fragmentación de dicha proteína. La fragmentación de NCVPl da origen a las proteínas VPO, VPl y VP3, las cuales se encuentran asociadas entre sí en el interior de las células infectadas al igual que en las cápsides virales. Después de que el ARN viral es encapsulado, VPO es fragmentada para producir las proteínas del virión denominadas VP2 y VP4. La fragmentación inicial del producto primario de la traducción del genoma viral representa un caso de fragmentación formativa. Este proceso probablemente constituye un mecanismo utilizado por las células animales como substituto para la iniciación interna de la síntesis de proteínas en mensajes policistrónicos (mensajes que contienen la información correspondiente a varios genes). La fragmentación del NCVPl en VPO, VP1 y VP3, y la subsecuente fragmentación de VPO en VP2 y VP4, representan ejemplos de fragmentación morfogenética (figura III.10). i) ENSAMBLE DE LOS VIRUS CON ENVOLTURA Un gran número de virus, particularmente de virus animales, poseen una envoltura lipídica como parte de su estructura. Por ejemplo, los herpesvirus se replican en el núcleo celular y aunque las proteínas virales son sintetizadas en el citoplasma celular, estas proteínas son reintroducidas al núcleo celular. Después del ensamble de la nucleocápside, el virus brota a través de la membrana nuclear y de esta manera adquiere la envoltura. Antes de que ocurra este proceso, la membrana nuclear es modificada por medio de la incorporación de proteínas virales específicas, las cuales son glicosiladas, o sea, se les añaden moléculas de carbohidratos. Sin embargo, la gran mayoría de los virus con envoltura la adquieren a partir de la membrana celular. Se han identificado cuatro eventos principales en la maduración de estos virus. Primero, se forma la nucleocápside en el citoplasma celular. Segundo, ciertas áreas de la membrana celular incorporan glicoproteínas virales. Tercero, la nucleocápside se alinea a lo largo de la superficie interna de la membrana modificada y finalmente brota de la célula. Durante este proceso, ninguna proteína de la membrana celular es incorporada en las partículas virales, aunque la mayor parte de los lípidos presentes en la envoltura viral son derivados de los lípidos normalmente presentes en la membrana de la célula hospedera.

I V .

L I S O G E N I A

POCO tiempo después de que fueron descubiertos los fagos, se aislaron cepas bacterianas que parecían ser portadoras silenciosas de ciertos tipos de fagos. Los líquidos obtenidos a partir de cultivos de estas cepas portadoras mostraban la presencia de fagos; sin embargo, las cepas portadoras no eran sensibles a ser destruidas por el fago que portaban. Por otra parte, cepas de bacterias emparentadas con la cepa portadora resultaban ser sensibles al fago presente en las cepas portadoras. Las cepas de bacterias portadoras de fagos silenciosos o latentes fueron denominadas cepas lisogénicas. A principios de los años cincuenta se descubrió que los fagos son capaces de adsorberse a las bacterias lisogénicas, pero no se produce la subsecuente lisis de estas bacterias. Por otra parte, cuando el fago procedente de una cepa lisogénica es sembrado en una cepa de bacterias sensibles, se pueden aislar en estos cultivos colonias de bacterias que se comportan igual que las cepas lisogénicas. En 1950, André Lwoff cultivó una sola célula procedente de una cepa lisogénica de Bacillus megaterium y observó bajo el microscopio la división de esta bacteria. Posteriormente, Lwoff removió una de las células hijas junto con un poco del medio de cultivo. Este proceso fue repetido varias veces: cada vez que se dividía la célula remanente, era removida una de las células hijas y algo del medio de cultivo; las células hijas y el viejo medio de cultivo fueron sembrados en agar para determinar si daban origen a una población de bacterias lisogénicas y a la presencia de fago en el medio de cultivo. Estos experimentos mostraron que las bacterias lisogénicas pueden crecer y dividirse sin liberar fagos al medio de cultivo. Sin embargo, por alguna razón desconocida, algunos filtrados obtenidos a partir de extractos de bacterias lisogénicas mostraban la presencia de partículas virales, o sea, fagos. Lwoff razonó que en las cepas lisogénicas el fago se encuentra en forma de un precursor no infeccioso al que denominó profago. La lisis de algunas de estas bacterias lisogénicas ocurre solamente cuando estas células han sido estimuladas para producir fagos. Lwoff y colaboradores observaron que la irradiación con luz ultravioleta (U.V.) era capaz de inducir la producción de fagos en una población de bacterias lisogénicas, mismas que eran lisadas en la medida que se incrementaba la concentración de fagos liberados al medio de cultivo. Por lo tanto, una bacteria lisogénica posee la capacidad de heredar el fago a sus descendientes, muy pocos de los cuales se lisarán en forma espontánea. Sin embargo, la mayor parte de la progenie de una bacteria lisogénica puede ser inducida a producir el fago por medio de la irradiación con U.V. o tratamiento con otros factores inductores. Se denomina temperados a los bacteriófagos capaces de existir en forma de profago en el interior de una bacteria hospedera. Después de que el profago ha sido inducido por irradiación, ocurre un breve periodo de eclipse en el cual no se puede detectar la presencia del fago dentro de la bacteria. Sin embargo, es posible detectar la aparición de proteínas y ácido nucleico específicos del fago; estos elementos serán ensamblados para formar los nuevos fagos maduros poco antes de que ocurra la lisis de la bacteria hospedera. En 1951, Esther Lederberg descubrió en forma accidental que la cepa de E. coli K12 era de tipo lisogénico. El fago latente en dicha cepa fue aislado al mezclar E. coli Kl2 con derivados no lisogénicos de esta cepa bacteriana. El fago resultante es ahora conocido como fago y representa el caso más estudiado del fenómeno de lisogenia. Las bacterias infectadas por fagos temperados continúan dividiéndose por varias generaciones y son inmunes o resistentes a ser superinfectadas por el mismo tipo de fago que albergan o por otros fagos pertenecientes a clases emparentadas con el fago

temperado original. Estas bacterias contienen cuando menos una copia íntegra del genoma del fago. Las bacterias infectadas por fagos temperados portan la información genética correspondiente al fago, a través de múltiples divisiones bacterianas, o sea, el genoma del fago es replicado al mismo tiempo que ocurre la replicación del genoma bacteriano; este hecho hace posible que la bacteria original pueda heredar el fago temperado a la subsecuente progenie bacteriana. El genoma del fago λ está constituido por una molécula lineal de ADN de cadena doble; esta molécula posee extremos cohesivos o "pegajosos" debidos a la secuencia de nucleótidos presentes en esa región del genoma viral. Al penetrar en la bacteria, el ADN del fago l se circulariza por la interacción entre los extremos cohesivos de la molécula. Ocasionalmente, este anillo de ADN puede ser integrado en el cromosoma de la bacteria. La integración ocurre en un sitio específico del genoma bacteriano; en ese sitio existe una secuencia de nucleótidos que resulta homóloga a la de una región del genoma del fago denominada att λ . Cuando en forma espontánea se alinean paralelamente estas secuencias homólogas, el círculo del genoma del fago se rompe y la integración se lleva a cabo por medio del entrecruzamiento entre el ADN del fago y el ADN de la bacteria; este entrecruzamiento es mediado por un factor proteico codificado por un gene del fago (int). El fago, una vez integrado, se encuentra como profago y solamente unos cuantos de sus genes son expresados (figura IV.1). Un gene en particular produce una proteína que se comporta como un represor que inactiva la expresión de los otros genes virales. Este represor también actúa como un factor de inmunidad que im pide la superinfección de la misma bacteria por otro fago λ . Un factor crítico para el mantenimiento del estado de profago está representado por la concentración de la proteína represora en el citoplasma bacteriano. Eventos que disminuyen la concentración del represor inducen la expresión del genoma viral completo. Un ejemplo de lo anterior ocurre cuando una bacteria lisogénica masculina, o sea, poseedora del factor de conjugación F (bacteria F+), se conjuga con una bacteria no lisogénica femenina (F-) introduciendo en el citoplasma de la bacteria femenina un fragmento de ADN que incluye al profago. Debido a que en el citoplasma de la célula receptora no existen moléculas del represor para el fago λ , se produce una rápida inducción de la expresión del genoma viral y la subsecuente lisis de la bacteria receptora.

Figura IV. 1.(a) Modelo de Campbell para la inserción del ADN del fago en el cromosoma bacteriano. (b) Mapa genético del fago. (c) Reordenamiento de los genes del fago después de inserción del ADN del fago en el cromosoma bacteriano. Los símbolos gal y trp representan los operones de la galactosa y del triptófano, respectivamente.

La transición entre el estado de profago y la infección productiva de tipo lítico inducen que el ADN viral se separe del cromosoma bacteriano por medio de la formación de una asa de ADN viral, la cual es cortada y liberada del cromosoma por mediación de proteínas codificadas por los genes xis e int del fago. Una vez liberado el genoma viral, los extremos cohesivos se reúnen formando una molécula circular de ADN viral. Algunas veces ocurren errores en el proceso de corte o escisión, de manera que el ADN liberado del cromosoma incluye pequeños segmentos correspondientes al ADN bacteriano adyacente al profago. Por ejemplo, el ADN bacteriano presente a la izquierda del profago se incluye secuencias correspondientes de los genes del operón de la galactosa, los cuales codifican enzimas involucradas en el metabolismo y procesamiento del carbohidrato galactosa. Generalmente, el error en la escisión, mismo que resulta en la inclusión de una porción del genoma bacteriano, también ocasiona una pérdida recíprocamente proporcional del genoma viral. Por ejemplo, cuando por error se incluyen los genes del operón de la galactosa en el ADN liberado, se pierden genes normalmente presentes en el extremo derecho del genoma del fago. El genoma viral defectuoso sirve tomo templado para la replicación del ADN, de manera que los nuevos fagos tendrán genes para la utilización de la galactosa y a la vez carecerán de algunos genes virales que salieron perdidos durante el proceso de escisión. Cuando se infectan con este fago defectuoso bacterias mutantes que tienen un defecto en el operón de la galactosa (bacterias Gal-), en condiciones favorables al proceso de lisogenización, es posible que la inserción del genoma viral en el cromosoma de la bacteria mutante resulte en la adquisición de las funciones para la utilización de la galactosa, previamente ausentes en la bacteria mutante. A este fenómeno se le conoce como transducción y los fagos capaces de inducirlo son denominados fagos transductantes, los cuales tienen la capacidad de introducir en las bacterias infectadas fragmentos de ADN que codifican funciones previamente ausentes en esas bacterias. En general, los fagos transductantes son defectuosos en su propia replicación debido a que carecen de ciertos genes virales necesarios para este proceso. Por lo tanto, estos fagos defectuosos sólo pueden propagarse en presencia de fagos normales (auxiliares) capaces de proporcionar los factores codificados por la región del ADN ausente en los fagos defectuosos.

I N T E R A C C I O N E S E N T R E V I R U S E U C A R I Ó T I C A S

Y

C É L U L A S

EXISTEN varios tipos de interacciones entre los virus y las células eucarióticas mantenidas en cultivo. El estudio de estas interacciones ha permitido comprender ciertos eventos relacionados con el proceso de infección en organismos íntegros. Las infecciones virales en células eucarióticas pueden ser clasificadas en: líticas, persistentes, latentes, transformantes y abortivas. En todos estos tipos de infección, el evento inicial consiste en la interacción entre el virus y el receptor correspondiente presente en la superficie de la célula. Si una célula carece del receptor apropiado para

un virus en particular; entonces es automáticamente resistente a la infección por ese tipo de virus. i) Infecciones líticas: son muy fáciles de estudiar en el laboratorio, ya que la muerte celular y la producción de progenie viral infecciosa pueden ser observadas sin mayor dificultad. Los virus pueden matar a la célula hospedera al inhibir la síntesis de los ácidos nucleicos y proteínas celulares. Sin embargo, con frecuencia la muerte celular ocurre debido a una liberación de enzimas lisosomales que digieren las estructura propias de la célula. La alteración en la regulación del transporte y concentraciones de iones en la célula infectada también puede conducir a la rápida muerte celular. ii) Infecciones persistentes: se caracterizan por la producción continua de virus infecciosos sin que las células hospederas mueran o sean destruidas. Las infecciones persistentes son consecuencia de un delicado equilibrio que a veces se establece entre el virus y su célula hospedera. Por ejemplo, la infección de células de riñón de mono con virus SV5 resulta en la continua producción de partículas virales por más de 30 días. A pesar de que este virus se multiplica siguiendo la cinética de crecimiento en un paso, la cual es característica de las infecciones líticas, el virus no produce daño a las células hospederas debido a que no perturba ni interfiere con la síntesis de ácidos nucleicos y proteínas celulares. Por otra parte, el virus SV5 consume muy pocos de los recursos de la célula hospedera, por ejemplo, la cantidad de ARN viral sintetizado es equivalente a menos del 1% de la síntesis de ARN celular. Sin embargo, el mismo virus SV5 produce infecciones líticas en cultivos de células obtenidas del riñón de hámsteres recién nacidos. Por lo tanto, el curso de la infección depende de las propiedades tanto del virus como de la célula hospedera. En el laboratorio es posible manipular las condiciones en que se desarrolla una infección viral, de manera que la adición de pequeñas cantidades de anticuerpos neutralizantes específicos contra el virus infectante, o la adición de interferón (véase, infra), disminuye la producción de progenie viral o el índice de multiplicación del virus; de esta manera es posible que sobreviva la mayor parte de la población celular a pesar de que unas cuantas células mueran. Las llamadas partículas defectuosas causantes de interferencia (ID) son producidas durante las infecciones virales a consecuencia de errores en la replicación del ácido nucleico viral. Estos errores se manifiestan como supresión de una porción del genoma viral. La propagación de estas partículas virales defectuosas es favorecida cuando se utiliza como inóculo infectante una suspensión con alta multiplicidad de infección, o sea, un inóculo que contiene un exceso absoluto de partículas virales en relación con el número de células a ser infectadas. Las partículas ID dependen para su multiplicación de factores y componentes producidos por virus normales e infecciosos. Por lo tanto, se pueden establecer condiciones artificiales en que las interacciones entre virus infeccioso, partículas ID y células conducen al establecimiento de una infección persistente. iii) Infecciones latentes: en estas infecciones el genoma viral y posiblemente varios productos codificados por este genoma se encuentran presentes en la célula hospedera, pero no producen nuevas partículas virales infectantes. El fenómeno de lisogenia es un ejemplo de infección viral latente en bacterias. En el caso de los virus

animales, algunos virus causantes de tumores son capaces de permanecer latentes. Se puede decir que es la infección en sí la que permanece latente, ya que las propiedades de la célula y el virus son importantes para establecer el estado de latencia. Un virus capaz de producir infecciones latentes en un tipo de células puede producir infecciones líticas en otro tipo de células. En todos los casos de latencia viral bien estudiados hasta la fecha, el virus logra el estado de latencia integrando una copia de su genoma en el genoma de la célula hospedera. Esto asegura que el genoma viral será replicado junto con el ADN cromosomal y, por lo tanto, será transmitido a la progenie celular además de permanecer protegido de la acción degradante de las enzimas nucleasas. Existe una serie de factores externos que pueden reactivar a un virus latente para que éste inicie una infección lítica productiva. Sin embargo, el caso más conocido y de gran importancia en humanos de infección viral latente, está representado por las infecciones por herpesvirus, pero hasta la fecha se conocen muy pocos detalles en relación con las causas y el mecanismo por el cual estos virus son capaces de entrar en el estado latente. iv) Infecciones abortivas: se caracterizan por una reducción en el rendimiento total de partículas virales o en el índice partícula viral/infectividad. Ambas situaciones reflejan una incompatibilidad entre el virus y la célula hospedera. Un defecto en la producción o procesamiento de cualquiera de los componentes necesarios para la multiplicación viral: ARN, ADN o proteína, puede ocasionar una infección abortiva. Por ejemplo, el virus de la influenza aviaria produce infecciones abortivas en las células L de ratón debido a la insuficiente síntesis de ADN viral. Las infecciones de tipo transformante serán discutidas en la sección dedicada a los virus tumorales. Un fenómeno importante asociado con las infecciones virales de células en cultivo es la capacidad de producir fusión celular, dando origen a la formación de células multinucleadas denominadas sincitios. Varios tipos de virus manifiestan esta propiedad y algunos, como el virus de Sendai, son utilizados rutinariamente en el laboratorio para inducir la fusión experimental entre diversos tipos de células.

I N T E R F E R Ó N E I N M U N I D A D A I N F E C C I O N E S V I R A L E S

L A S

EL SISTEMA inmune constituye la principal barrera que poseen los animales superiores para protegerse de las infecciones en general. La inmunidad inespecífica es aquélla que actúa contra cualquier material extraño que invade al organismo; este tipo de inmunidad es innata y en ella participan barreras físicas como la piel y las mebranas mucosas; barreras químicas como el ácido clorhídrico del jugo gástrico o el ácido láctico presente en el sudor; proteínas que inactivan a los agentes infecciosos o destruyen a las células infectadas, como la lisozima presente en las lágrimas y secreciones mucosas, las enzimas del sistema de complemento y los interferones.

Existe también una importante variedad de células que participan en los mecanismos de inmunidad inespecífica: los macrófagos o fagocitos que ingieren y destruyen células y partículas extrañas, al igual que los leucocitos neutrofilos que además son importantes mediadores del proceso de inflamación. Los macrófagos también actúan como células presentadoras de antígenos que estimulan la respuesta inmune específica; los leucocitos basófilos que secretan mediadores químicos que promueven la inflamación con el fin de facilitar el flujo sanguíneo y la accesibilidad de las células inmunitarias en las regiones donde se localiza una infección; los leucocitos eosinófilos que participan en la destrucción de parásitos y de células infectadas por parásitos intracelulares; las células asesinas naturales (NK por "natural killers") que son estudiadas más adelante. Existen dos tipos de inmunidad específica: humoral y celular. La inmunidad humoral es mediada por los anticuerpos o inmunoglobulinas, que son proteínas específicas sintetizadas por las células plasmáticas. Los progenitores inmediatos de estas células son los linfocitos B que son capaces de reaccionar con moléculas extrañas al organismo, llamadas antígenos. Los linfocitos B se originan en la médula ósea a partir de células precursoras. La unión del antígeno con el linfocito B estimula a este último para que se divida y se diferencie dando origen a una gran cantidad de células plasmáticas y células poseedoras de la llamada memoria antigénica. Las células plasmáticas sintetizan y secretan moléculas de anticuerpos, las cuales reacionan en forma específica con el antígeno que originalmente estimuló la producción de dichos anticuerpos. Las células con memoria antigénica no sintetizan anticuerpos pero conservan la capacidad potencial de sintetizar dichos anticuerpos contra un antígeno específico, pues las células con memoria antigénica pueden transformarse, en condiciones adecuadas, en células plasmáticas productoras de anticuerpos específicos. Por esta razón, el sistema inmune de un organismo responde en forma más potente y rápida cuando se encuentra por segunda vez ante la presencia del mismo antígeno. Las inmunoglobulinas se dividen en cinco grupos: IgA, IgG, IgD, IgE e IgM. Estas proteínas actúan directamente uniéndose a componentes del virión y produciendo la neutralización del virus. Sin embargo, las IgG pueden unirse por medio de sus fragmentos Fc a la superficie de otras células del sistema inmune conocidas como macrófagos, los cuales adquieren la capacidad para reconocer los antígenos virales presentes en la superficie de las células infectadas. Las IgM e IgG pueden activar el sistema del complemento que consiste en una cascada de enzimas que liberan componentes capaces de atraer diversos tipos de células del sistema inmune al sitio donde se localiza el anúgeno; estas enzimas también expresan una actividad de fosfolipasa capaz de lisar las células infectadas por el virus.

Esta representación esquemática de una molécula de IgG muestra las cadenas pesadas (H) y las cadenas ligeras(L). Los extremos N de los fragmentos Fab corresponden a las regiones de unión del anticuerpo con su antígeno específico. El fragmento Fc es común a todas las moléculas de IgG independientemente de su especificidad antigénica. Se indican las regiones con secuencias variables (V) y con secuencias constantes de aminoácidos (C). La sigla CHO indica la posición de moléculas de carbohidratos asociados con la proteína IgG; estos puentes disulfuro estabilizan la estructura de la IgG.

La inmunidad celular es mediada en primer lugar por los linfocitos T, los cuales se originan en el timo. La especificidad de los linfocitos B yT está determinada por receptores específicos que están presentes en las membranas de estas células. Estos receptores reconocen motivos estructurales específicos que están presentes en los antígenos; dichos motivos estructurales son conocidos como epitopes y son muy diferentes entre sí. El reconocimiento y ligado de un epitope por parte del receptor celular específico es el evento que determina que sean activados sólo los linfocitos que poseen dichos receptores. Los recepctores específicos presentes en un linfocito B son en realidad inmunoglobulinas que están fijas a la membrana celular y que tienen la misma especificidad que las inmunoglobulinas secretadas por dicho linfocito. En el caso de los linfocitos T, el receptor para epitopes antigénos específicos se denomina receptor de célula T o receptor T y consiste en una proteína que a su vez resulta de la conjunción de dos proteínas diferentes denominadas alfa y beta, respectivamente. Dicho receptor T presenta un extremo variable que determina la especificidad del receptor por un epitope en particular. Cuando el epitope es ligado por el receptor T se produce una señal que estimula al linfocito T para que prolifere y produzca una "clona" o familia de células idénticas que manifiestan la misma

especificidad por el mismo epitope antigénico. Algunas de las células T resultantes serán responsables de contribuir a mantener la memoria inmunológica que permite una respuesta más eficaz y rápida cuando el organismo encuentra al mismo antígeno por segunda vez. Los principales tipos de linfocitos T son: 1) linfocito T auxiliar: este tipo de linfocito prolifera después de haber reconocido y ligado un epitope específico, dando origen a clona de linfocitos auxiliares que producen una variedad de moléculas solubles conocidas como linfocinas cuyo papel consiste en estimular a otras células inmunocompetentes (linfocitos B y T) para que se activen y proliferen. Los linfocitos T axuliares son orquestadores de la respuesta inmune específica; sin la participación de estos linfocitos no es posible la producción de otras células inmunocompetentes que participan en la respuesta inmune específica. 2) linfocito T citotóxico: este tipo de linfocito responde a la activación mediada por el reconocimiento de un epitope específico y la presencia de linfocinas en el medio, dando origen a una clona de células T citotóxicas con capacidad para destruir células que portan antígenos foráneos específicos como son las células infectadas por virus. Los linfocitos T citotóxicos producen también ciertas linfocinas como el interferón gamma, el cual estimula la actividad de los macrófagos. 3) linfocito T supresor: este tipo de linfocito se encarga de disminuir o amortiguar la maginitud de la respuesta inmune y de esta manera controla la respuesta de otras células inmunocompetentes para evitar que sea exagerada. Los linfocitos denominados células asesinas naturales (células NK) son linfocitos grandes con citoplasma granular y son diferentes de los linfocitos T y B. Los linfocitos NK destruyen a células infectadas por cualquier tipo de virus, por lo cual su actividad es inespecífica. Las células NK se adhieren a las células infectadas y liberan gránulos tóxicos que lisan (destruyen) a las células blanco. INTERFERÓN En 1957, Isaacs incubó la membrana corioalantoica de un embrión de pollo en presencia de una suspensión de virus de la influenza que había sido inactivado por medio de tratamiento térmico. Esta membrana fue transferida a una solución amortiguadora y se almacenó por 24 horas. Posteriormente, la membrana fue descartada y la misma solución amortiguadora fue utilizada para incubar una nueva membrana de pollo en presencia de virus infeccioso de la influenza. Isaacs observó que la nueva membrana no permitía el crecimiento del virus y por lo tanto concluyó que algún producto soluble con actividad antiviral había sido liberado en la solución amortiguadora como respuesta a la infección viral de la membrana original. Esta sustancia antiviral fue denominada interferón. Los interferones son proteínas que tienen asociados carbohidratos senciales para su actividad. Por convención, la actividad antiviral del interferón es estimada midiendo la inhibición que éste produce en la incorporación de uridina radiactiva en el ARN viral en células infectadas por un togavirus. La actividad es expresada como la cantidad de

interferón necesaria para reducir en 50% el nivel normal de síntesis de ARN viral; esta cantidad es arbitrariamente definida como una unidad de interferón. Por ejemplo, 1 mg de proteína de interferón purificado tiene actividad antiviral en el orden de 10 9 unidades. Los interferones fueron identificados como proteínas secretadas por células infectadas por virus que son capaces de proteger de la infección viral a otras células, debido a que los interferones estimulan en las células no infectadas la producción de proteínas que inhiben la replicación de diferentes tipos de virus. Sin embargo, hoy en día el término interferón se refiere a varias proteínas que manifiestan esta actividad antiviral aunque no todas estas proteínas son producidas por células infectas por virus. Existen dos tipos principales de interferón. los tipo 1 están representados por el interferón alfa (IFN alfa) y el interferón beta (IFN beta); ambos tienen una actividad biológica muy similar siendo ejemplos de la llamada respuesta inmune inespecífica y sus estructuras moleculares son muy parecidas. El IFN alfa es producido principalmente por los leucocitos infectados por virus, mientras que el IFN beta es producido por fibroblastos infectados por virus. El IFN alfa también estimula la sintésis de proteínas clase 1 del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC- clase 1), estas moléculas están presentes en las membranas de todas las células con núcleo y participan en la presentación de antígenos (en particular de antígenos virales) para que sean reconocidos por el sistema inmune. La figura VI.1 describe el mecanismo de acción antiviral del interferón. Una gran variedad de virus es capaz de inducir la producción de interferón tipo 1; el cual es activo contra un amplio espectro de virus diferentes y no sólo contra el virus inductor. Sin embargo, el interferón parece ser más específico en relación con la especie a partir de la cual se obtienen las células productoras del mismo. Por ejemplo, interferón obtenido a partir de células de ratón es poco eficiente para proteger células de rata, pollo o simio contra la infección viral. La inducción del interferón provoca la liberación de esta molécula y la producción de un estado antiviral en las células que entran en contacto con el interferón. Los genes que codifican a los interferones humanos tipo 1 están ubicados en el cromosoma 9, mientras que el gene del interferón tipo 2 está en el cromosoma 12. Todos los virus que se multiplican activamente son capaces de inducir la producción de interferón y se cree que moléculas de ARN de cadena doble actúan como inductores específicos. El interferón liberado produce.el estado antiviral en otras células por medio de la unión con un receptor presente en la superficie celular. El gene que codifica al receptor para IFN alfa y beta está en el cromosoma 21, mientras que el gene que codifica el receptor para IFN tipo 2 o gamma, está en el cromosoma 6. Se sabe que la presencia de ARN de cadena doble estimula la fosforilación (adición de grupos fosfato) de ciertas proteínas reguladoras; esto impide que estas proteínas participen en el proceso de iniciación de la síntesis de proteínas. Este ARN de cadena doble también activa una ribonucleasa que degrada al ARN mensajero y, por lo tanto, detiene la síntesis de proteínas. Sin embargo, todavía no se conoce con claridad el mecanismo por el cual las actividades inducidas por el interferón son capaces de distinguir ente la síntesis de proteínas celulares y la síntesis de proteínas virales De hecho, la actividad inhibitoria de la síntesis de proteínas parece ser la responsable del efecto antitumoral del interferón, efecto que ha sido claramente demostrado in vitro y en animales experimentales. Sin

embargo, el uso de los diferentes interferones en el tratamiento del cáncer no ha dado los resultados esperados, ya que por lo general los interferones producen efectos secundarios negativos en los pacientes tratados con dosis altas de estos agentes. Hasta la fecha, sólo algunos tipos de cáncer muy raros, como por ejemplo, la leucemia de células pilosas, han sido tratados con éxito mediante el uso de interferón alfa.

Figura VI.1. Mecanismo de acción del interferón: el virus infecta a la célula 1 después de unirse con el receptor (a). La infección viral enciende la maquinaria celular para permitir la replicación del genoma viral (b). La presencia de ácido nucleico viral induce la expresión de genes de interferón (c). El interferón es secretado por la célula infectada y se pega a su receptor específico presente en la membrana de una célula no infectada (d). La unión del interferón con su receptor induce la producción de enzimas que interfieren con la síntesis de proteínas. Una de estas enzimas inhibe la traducción de ARN mensajero viral, mientras que otra enzima estimula la acción de enzimas endonucleasas que degradan el ARN mensajero viral. De esta manera, la célula receptora del interferón queda protegida de la infección viral. Al inducir estas dos acciones enzimáticas que interfieren con la síntesis de proteínas, el interferón inhibe también el crecimiento de las propias células, por ello ha sido utilizado experimentalmente como inhibidor de la proliferación de células cancerosas.

El interferón tipo 2 está representado por el IFN gamma, también denominado inmunointerferón, debido a que es producido por linfocitos activados al entrar en contacto con antígenos durante una respuesta inmune. La principal acción de este tipo de interferón consiste en actuar como una linfocina, es decir, como una molécula capaz de activar otras células del sistema inmune, como son las células asesinas naturales (NK) los macrófagos, y los linfocitos B. De hecho, el IFN gamma puede influir sobre la clase de anticuerpo que es producido por los linfocitos B en el marco de una respuesta inmune. La inducción de este tipo de interferón no depende de la presencia de ARN de cadena doble y al parecer tiene un papel suplementario en la respuesta inducida por el interferón tipo 1. El interferón tipo 2 es particularmente eficaz en el control de infecciones producidas por virus capaces de inhibir la síntesis de ARN y proteínas celulares antes de que haya sido posible la síntesis de interferón tipo 1.

I N T E R A C C I O N E S E N T R E E L V I R U S O R G A N I S M O H O S P E D E R O

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E L

DESDE el punto de vista biológico, los virus pueden ser considerados como parásitos cuya supervivencia depende a su vez de la supervivencia de la especie hospedera. Por lo tanto, es desventajoso para un tipo de virus exterminar o afectar seriamente la capacidad reproductiva del hospedero. Las infecciones virales agudas en animales superiores son por analogía equivalentes a las curvas de crecimiento características de los fagos bacterianos en un solo paso. Sin embargo, las infecciones virales agudas son cuestión de días en lugar de minutos. En las infecciones agudas se produce progenie viral y las células infectadas mueren. Conforme progresa la infección aparecen los signos y síntomas asociados, mismos que hacen evidente la infección viral que previamente se ha estado desarrollando en forma silenciosa durante varios días. El cuadro clínico compuesto por los signos y síntomas propios de la enfermedad, asociado a las pruebas de laboratorio que incluyen procedimientos para aislar y titular el virus involucrado, así como la detección de antígenos virales específicos, permiten establecer el diagnóstico de la infección viral. Probablemente en estas infecciones el interferón tiene un papel importante en la limitación de la diseminación de la infección. La recuperación del organismo afectado es auxiliada por la destrucción de las células infectadas, misma que es llevada a cabo por las células T citotóxicas. Poco después de que se ha establecido la infección viral aparecen células asesinas no específicas, las cuales participan también en la destrucción de las células infectadas. Al final del proceso infeccioso, las partículas virales libres son eliminadas por la acción de los anticuerpos específicos y los macrófagos. En todas las infecciones virales ocurren ciclos de multiplicación viral durante el llamado periodo de incubación, que se caracteriza por ser asintomático. Todo organismo multicelular consiste de varios tipos de células diferenciadas organizadas en tejidos que a su vez forman órganos y sistemas. Los virus infectan y se

multiplican en órganos y tejidos específicos. Las manifestaciones de la enfermedad viral son resultado de las propiedades combinadas del virus y el hospedero. Las infecciones virales más frecuentes son aquellas que se desarrollan en forma asintomática. Estas infecciones solamente pueden ser detectadas por medio de exámenes de laboratorio. Algunos virus causan infecciones silenciosas en el hospedero debido a que logran establecer un equilibrio favorable con dicho hospedero. El ejemplo clásico de infección viral silenciosa está dado por el virus de la poliomielitis, que en más de 90% de los casos produce infecciones asintomáticas. Las infecciones virales crónicas se caracterizan por una continua producción de partículas virales y por la fluctuación en la magnitud y gravedad de los signos y síntomas asociados con la infección. Al parecer, estas infecciones pueden alterar el sistema inmune de manera que éste se vuelve incapaz de impedir la continua multiplicación del virus. El interferón debe ser producido en el sitio, momento y concentración adecuados para que pueda inhibir la infección viral; tal vez algunos virus son capaces de alterar estas condiciones y así obstaculizan la capacidad antiviral del interferón. Por ejemplo, el virus de la hepatitis B, que produce la llamada hepatitis del suero, induce con frecuencia un periodo de infección aguda seguido por una infección crónica que puede durar —con fluctuaciones— por el resto de la vida del individuo afectado. En este padecimiento existen fuertes cantidades de anticuerpos circulantes específicos contra el virus, la precipitación de los complejos antígeno-anticuerpo resultantes puede causar la llamada enfermedad por complejos inmunes. Por lo tanto, los síntomas en este padecimiento crónico derivan también de las proporciones relativas de antígeno viral y anticuerpos contra el mismo. El caso más estudiado de infecciones virales persistentes o latentes en humanos está dado por los herpesvirus. La persistencia de la infección es consecuencia de un equilibrio entre las propiedades del virus y los mecanismos de defensa del hospedero. La ruptura de este equilibrio ocasiona la reactivación del virus y la reaparición del estado agudo de la enfermedad; esta situación ocurre con frecuencia en el caso de pacientes que padecen enfermedades no virales de tipo crónico, mismas que ocasionan una depresión del sistema inmune. La reactivación natural de una infección latente ha sido bien documentada en el caso del Herpes simplex tipo 1 (HSV-1) y del virus de la varicela. Por ejemplo, el HSV-1 produce infecciones agudas que se caracterizan por la aparición de ampllas labiales en las comisuras de la boca (los llamados "fuegos") y fiebre de baja intensidad. Sin embargo, el virus puede emigrar hacia los ganglios localizados en las raíces dorsales de los nervios espinales o craneales que inervan la región donde se inició la infección. El virus puede permanecer latente en estos ganglios nerviosos hasta que factores tan diversos como insolación, tensión emocional o la menstruación lo reactivan por medio de mecanismos desconocidos, de manera que el virus desciende por los nervios sensoriales y hace erupción en forma de una infección aguda que se manifiesta en la piel localizada en el extremo terminal del nervio afectado. Se sabe que la infección prsistente por HSV-1 es mantenida en presencia de grandes cantidades de anticuerpos

específicos contra el virus y una respuesta T celular, posiblemente el equilibrio de estos factores contribuye a mantener el estado de latencia. Existe un grupo especial de virus denominados virus lentos o lentivirus, los cuales están asociados con diferentes padecimientos crónicos que afectan el aparato respiratorio, las articulaciones y los sistemas nervioso, inmune y hematopoyético (productor de células sanguíneas) de humanos y animales. La evolución de estas enfermedades es insidiosa, o sea, progresan en forma irregular a lo largo de un gran periodo de tiempo. Enfermedades como la de Alzheimer (un tipo de demencia senil) y la esclerosis múltiple (una enfermedad desmielinizante del sistema nervioso) han sido asociadas con la presencia de lentivirus, pero todavía está por demostrarse la relación causal directa entre los lentivirus y estas enfermedades. Sin embargo, se ha demostrado que un tipo especial de neumonía y meningoencefalitis que afecta a cabras y borregos es causado por un lentivirus denominado visna-maedi virus, el cual pertenece a una subfamilia de los retrovirus. Por otra parte, el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV o VIH), que está implicado en el desarrollo del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), es un retrovirus emparentado con el visna-maedi virus y, por lo tanto, pertence al grupo de los lentivirus. En los años sesenta, Carlton Gajdusek inició el estudio de una rara enfermedad llamada kuru, la cual es común en la tribu foré que habita en las montañas de Nueva Guinea. El kuru es una enfermedad degenerativa del cerebro y es particularmente común entre los niños y las mujeres de la tribu. Debido a su distribución familiar, por algún tiempo se pensó que el kuru era de origen congénito. Sin embargo, Gajdusek demostró que el kuru podía ser transmitido a otros primates, particularmente a los chimpancés, y por lo tanto se trata de una enfermedad infecciosa. El kuru es transmitido entre los miembros de la tribu foré por medio de un canibalismo ritual que consiste en comer el cerebro de los parientes recién fallecidos, generalmente las mujeres y niños de la tribu son los practicantes de este canibalismo ritual. El descubrimiento del origen del kuru constituye un interesante ejemplo de una contribución de la antropología al campo de la epidemiología. La Enfermedad de Creutzfeld-Jakob (ECJ) es una encefalopatía muy similar al kuru, pero tiene una distribución mundial aunque su ocurrencia es muy rara. Tanto el kuru como la ECJ son muy similares a una enfermedad del ganado lanar conocida como scrapie y que se caracteriza por el hecho de que los animales afectados tienden a tallarse o rascarse contra cualquier objeto. Inicialmente, estas enfermedades fueron atribuidas a un agente infeccioso con las características de un virus lento, pero hace poco se demostró que el agente causal del scrapie no puede ser inactivado por medio del tratamiento con agentes que normalmente inactivan a los virus. Tampoco se ha podido detectar la presencia de ácido nucleico en el agente causal del scrapie que parece ser de naturaleza exclusivamente proteica. Por estas razones, Stanley Pruisner, descubridor del agente causal del scrapie, ha propuesto el término prión para denominar provisionalmente al agente causal del scrapie, cuyas características fisicoquímicas son muy similares a las de los agentes causales del kuru y de la ECJ. Este hallazgo es potenciaImente de enorme importancia, ya que sería el primer caso conocido en que la información genética necesaria para la replicación de un agente infeccioso no está contenida directamente en un ácido nucleico sino en una proteina.

Originalmente fueron propuestas dos hipótesis para explicar la replicación de los priones. La primera consiste en la activación de la transcripción de un supuesto gene celular que codifica la proteína del prión. La segunda consistiría en la supuesta traducción inversa", en la cual una proteína (en este caso la del prión) es capaz de dirigir su propia síntesis. Sin embargo, hasta el momento no existe evidencia directa en apoyo de estos mecanismos. Posteriormente, Brunori y Talbot propusieron un tercer mecanismo para explicar la replicación de los priones sin contradecir los postulados fundamentales de la biología molecular. La evidencia disponible indica que los priones están constituidos por una proteína denominada PrP, cuyo peso molecular varía de 27 000 a 30 000 daltones. Brunori y Talbot propusieron que la PrP podría comportarse como una enzima proteolítica (capaz de digerir proteínas), de manera que la replicación de la PrP es consecuencia del ataque proteolítico de la propia PrP sobre una hipotética proteína precursora denominada pre-PrP, la cual debería estar presente en diferentes tejidos, incluyendo el cerebro, donde desempeña una función normal. Esta replicación proteolítica sería similar a otros casos bien conocidos en los cuales una enzima proteolítica (como la enzima digestiva pepsina) actúa sobre un precursor (como el pepsinógeno) digiriendo una porción del precursor y produciendo así una nueva molécula con actividad proteolítica. La hipótesis de Brunori y Talbot, señala que en las células normales debe detectarse la presencia de un gene (y su respectivo ARN mensajero) que codifica una proteína muy similar a la PrP. A finales de la década de los ochenta, investigadores norteamericanos confirmaron la existencia en las células normales de un gene (denominado Prn-p) que codifica a la proteína del prión (PrP). También se pudo establecer que la PrP normal es una proteína que se ubica en la membrana de las células nerviosas y participa en el transporte de iones a través de dicha membrana. Por otra parte, estudios bioquímicos permitieron establecer que la PrP anormal presente en los cerebros de animales infectados con scrapie (Prp ), difiere de la PrP normal (PrP ) en que es menos soluble y muy resistente a la acción de enzimas proteolíticas. No existe evidencia alguna de que la diferencia entre PrP y PrP se deba a una modificación en la composición química de esta última, por esta razón, varios investigadores han sugerido que la diferencia entre PrP y PrP es consecuencia de un sutil cambio en la conformación espacial de PrP .
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Con base en las observaciones arriba mencionadas y en otros datos bioquímicos que demostraron que la proteína PrP consta de una sola cadena polipeptídica y, por lo tanto, que su estructura espacial no está sujeta a finos cambios regulatorios como es el caso de las proteínas oligoméricas (proteínas que con tan de más de una cadena polipeptídica), propuse en 1992 que la replicación de PrPsc es un proceso similar a la cristalización. En este proceso la Prpsc infecciosa actúa como una "semilla" o "núcleo" de cristalización que facilita la tansformación de la proteína normal PrP en la forma patogénica y anormal PrP . Hasta la fecha, no se conocen los mecanismos que regulan los procesos de cristalización en general. Sin embargo, es un hecho bien establecido que los químicos cristalógrafos utilizan pequeños cristales como "semillas" o "núcleos" que permiten y aceleran la formación de cristales a partir de soluciones supersaturadas de diversas moléculas.
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La hipótesis de Aranda Anzaldo predijo que sería posible replicar la PrP infecciosa en condiciones in vitro y en ausencia de células, por medio de la incubación de la PrP normal en presencia de una cierta cantidad de PrP . Dicha incubación daría como resultado la conversión de PrP normal a la forma PrP que es menos soluble y muy resistente a las enzimas proteolíticas. A finales de 1994, investigadores norteamericanos reportaron la formación de PrP a partir de PrP incubado in vitro (en ausencia de células) en presencia de Prpsc que actuó como "semilla o núcleo" para facilitar dicha transformación, confirmando así la hipótesis arriba mencionada.
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Sin embargo, todavía permanecen muchas incógnitas en relación con los priones y lo mejor es permanecer abiertos a futuras sorpresas; recordemos que los dogmas, incluso los de tipo científico como el llamado "dogma central de la biología molecular" representan declaraciones de tipo universal generalmente basadas en una lógica simplista y una limitada experiencia, por lo cual tarde o temprano dichos dogmas deben sucumbir ante el avance de las ideas y el conocimiento. Una de las rutas más comunes de transmisión viral es la vía respiratoria, que es utilizada no sólo por los virus que producen padecimientos respiratorios sino también por virus que causan infecciones generalizadas como el sarampión y la viruela. El virus, una vez multiplicado, puede infectar otras células o escapar del tracto respiratorio en el aerosol expulsado por medio de la tos, el estornudo o el acto de hablar. Estos aerosoles son inhalados por otros individuos en forma de gotitas infecciosas. Las gotas muy grandes (>10 µ m) tienden a caer al suelo; las muy pequeñas (<0.3µ m) se secan con gran facilidad, lo que resulta en una rápida inactivación de las partículas virales. Por lo tanto, son las gotas de tamaño intermedio las responsables de transmitir la infección viral. Por ejemplo, las vellosidades nasales se encargan de remover las partículas aéreas más grandes y solamente las gotas de un tamaño muy particular tienen la capacidad de penetrar esta barrera. En principio, el aumento de las secreciones pulmonares, nasales y bucales asociado con ciertas infecciones respiratorias, favorece la diseminación de los virus a otros sujetos susceptibles. Sin embargo, existen otros factores de tipo ambiental y climatológico que intervienen en la diseminación de la infección viral. En el caso de la influenza, que es una infección viral particularmente común en los meses de invierno, es posible invocar factores ambientales como la temperatura y la humedad, al igual que factores sociales como el hacinamiento en condiciones de ventilación limitada, que favorecen la diseminación de esta infección. La transmisión del virus por la vía oral-fecal es característica de los enterovirus y ciertos picornavirus, como el virus de la hepatitis A. Todos estos virus infectan al hospedero después de que han sido ingeridos. La diseminación de estos virus es favorecida en condiciones deficientes de sanidad pública e higiene personal. Al mejorar la sanidad pública y ambiental se reduce la incidencia y diseminación de las infecciones por enterovirus. Sin embargo, el exceso en sanidad pública e higiene personal genera situaciones paradójicas. Por ejemplo, el virus de la poliomielitis produce generalmente infecciones digestivas asintomáticas en los niños, pero al incrementarse las condiciones sanitarias ocurre un desplazamiento en la distribución por edades de esta infección viral, la cual, cuando es contraída en la adolescencia, tiene un curso más grave y severo que se manifiesta como poliomielitis paralítica, misma que ocurre muy rara vez entre los individuos infectados a una edad temprana.

Algunos virus son transmitidos por la vía urinaria o genital. Particularmente son de gran importancia médica aquellos virus que pueden ser transmitidos por contacto sexual. El Herpes simplex tipo 2 se transmite casi siempre por contacto sexual y ha sido asociado circunstancialmente con el desarrollo de cáncer del cérvix uterino. En la actualidad, la infección por Herpes simplex tipo 2 constituye la enfermedad venérea más común en los países desarrollados. Por otra parte, el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) es transmitido principalmente por medio del contacto sexual, quizá a través de abrasiones en la piel y en membranas mucosas. Cuando un virus es transmitido de la madre a la progenie a través de la placenta, se dice que la transmisión ocurre en forma vertical, en contraste con la transmisión horizontal, que ocurre entre individuos. Algunos virus que generalmente causan infecciones leves, como el virus de la rubeola, pueden causar deformaciones congénitas en el feto si éste es infectado durante los primeros tres meses de desarrollo embrionario. Algunos virus son transmitidos por medio de un organismo vector; generalmente artrópodos como los mosquitos, los cuales inoculan el virus en individuos susceptibles. El virus puede multiplicarse en el propio vector o ser transmitido en forma pasiva, o sea, el virus no se multiica mientras es acarreado por el organismo vector.

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T U M O R E S

LAS ENFERMEDADES tumorales o proliferativas, ya sean de tipo benigno o maligno (canceroso), han sido objeto de atención durante muchos siglos. En 1739, Lorenz Heister publicó un tratado de cirugía en el cual, refiriéndose al tratamiento quirúrgico de los tumores de la glándula mamaria, hacía hincapié en las precauciones necesarias para evitar la contaminación de los tejidos sanos con la ... sangre infectada por el virus del cáncer. Es claro que Heister utilizó el término virus en el mismo sentido que le daban los médicos de la antigua Roma, o sea, como sinónimo de veneno particularmente de origen animal. Sin embargo, las precauciones recomendadas en el tratado de Heister implicaban que cuando menos algunos tumores son de naturaleza transmisible y, por lo tanto, capaces de ser adquiridos por contagio. Más de un siglo después, en 1854, el médico francés Velpau dedicó un capítulo completo de su tratado sobre el cáncer mamario a la discusión de los posibles orígenes de tal enfermedad, poniendo particular atención en los informes que apoyaban la naturaleza contagiosa del cáncer. Alrededor de 1866, Goujon realizó una serie de experimentos en los cuales implantó secciones de tejido tumoral bajo el epitelio de ratas, cobayos y otros animales, y en algunos casos observó la aparición de pequeños tumores tanto en las zonas adyacentes al implante como en las vísceras del animal experimental. Sin embargo, por aquel entonces no existía ninguna teoría bien estructurada concerniente al posible modo como se efectuaba la transmisión del cáncer. A finales del siglo XIX, experimentos realizados con filtrados libres de células demostraron la posibilidad de transmitir enfermedades como el mosaico del tabaco. Tales experimentos llamaron la atención de varios investigadores médicos que a su vez

intentaron transmitir el cáncer en animales experimentales utilizando filtrados obtenidos a partir de tejidos tumorales. Estos tempranos intentos fracasaron, pero a pesar de esto empezó a extenderse lentamente la idea de que algunos virus filtrables podrían estar involucrados en la etiología (causa u origen de una enfermedad) de algunos tipos de cáncer. En 1908, los patólogos daneses Ellerman y Bang publicaron sus experimentos que demostraban la inducción de leucemias en pollos por medio de un filtrado libre de células. Por otra parte, en los Estados Unidos, Peyton Rous había logrado inducir sarcomas en pollos, utilizando filtrados obtenidos a partir de extractos tumorales pasados a través de filtros impermeables a células y bacterias. El trabajo de Rous, publicado en 1911, fue recibido con escepticismo o absoluto rechazo por la mayoría de sus contemporáneos. Sin embargo, Rous nunca perdió la convicción en la importancia de sus resultados, los cuales eran apoyados indirectamente por el trabajo de Ellerman y Bang, pero a principios de este siglo predominaba una actitud negativa respecto del posible origen infeccioso de ciertos tipos de cáncer y, por otra parte, las leucemias no eran consideradas como una forma de cáncer, por lo cual no existían razones aparentes para establecer conexiones entre el trabajo de Rous y las observaciones de los patólogos daneses. A pesar de esto, Rous continuó sus estudios y posteriormente describió otros tipos de tumores filtrables característicos de gallinas y otras aves de corral. Por fortuna, Rous tuvo una larga vida que le permitió testimoniar el reconocimiento final a su trabajo, simbolizado por el premio Nobel de medicina que le fue otorgado en 1966, o sea, cincuenta y cinco años después de haber publicado aquel informe que estableció por primera vez una sólida asociación entre el virus y la produccion de cáncer en animales. En Londres, durante los años veinte, W. E. Gye realizó un estudio sobre la sarcoma de los pollos; los resultados de este trabajo lo convencieron de que el problema central del cáncer se reduciría finalmente al de una enfermedad transmitida por virus. Esta teoría continuo siendo motivo de anatema para la mayoría de los que se dedicaban al estudio del cáncer, pero algunos colegas de Rous, que también trabajaban en el Instituto Rockefeller; decidieron adoptar una actitud más positiva al respecto. Así, T. M. Rivers se dedicó a estudiar los cambios patológicos observados en una infección común a los conejos, conocida como mixomatosis. Rivers llegó a la conclusión de que esta enfermedad mostraba interesantes paralelismos con el sarcoma de Rous, desde el punto de vista del modo de transmisión. En 1931, R. E. Shope examinó unos pequeños tumores presentes en un conejo recién fallecido. Shope demostró que tales tumores podían ser transmitidos a otros conejos a partir de un filtrado obtenido del tejido tumoral. Para entonces, ya se encontraba bien establecida la existencia de los virus como entidades bien caracterizadas en el nivel fisicoquímico, y estudios inmunológicos permitieron establecer que el virus presente en los filtrados obtenidos por Shope estaba emparentado con el agente causal de la mixomatosis, a pesar de que ambas enfermedades eran diferentes desde el punto de vista clínico y patológico. En 1932, Shope se dedicó a estudiar unos pequeños tumores conocidos como papilomas, que eran observados con frecuencia en conejos silvestres. Dichos papilomas constituyen un tipo de tumor benigno y Shope pudo demostrar que eran causados por un virus filtrable. El nuevo virus podía ser transmitido en serie a través de conejos silvestres y también podía ser transmitido a los conejos domésticos. Sin embargo, no era posible propagar el virus a partir de conejos domésticos; este fenómeno sugirió a Shope que el

virus se encontraba en un estado enmascarado u oculto dentro de la especie doméstica. Rous y Beard continuaron estudiando los papilomas inducidos en los conejos domésticos a partir del virus presente en conejos silvestres, y descubrieron que estos tumores originalmente benignos se convertían en carcinomas malignos en la especie doméstica. En l91l, J. A. Murray había sido el primero en sugerir que factores hereditarios podían influir el desarrollo del cáncer mamario en ratones. Sin embargo, fue en 1936 cuando J. Bittner tuvo la idea de permitir que ratones recién nacidos descendientes de una cepa caracterizada por una baja incidencia de tumores mamarios fueran amamantados por ratonas adultas pertenecientes a una cepa con alta incidencia de carcinomas mamarios. Las observaciones de Bittner lo llevaron a proponer la existencia de un factor presente en la leche materna capaz de influir la inducción del cáncer mamario. El agente transmitido en la leche de las ratonas adultas no era expresado inmediatamente y los ratones afectados permanecían libres de enfermedad hasta que llegaban a una edad media, a partir de la cual empezaban a desarrollar tumores mamarios. Los resultados de Bittner obligaron a replantear ciertas suposiciones iniciales referentes al origen del cáncer. En primer lugar; tumores que parecen tener un origen espontáneo, en realidad son inducidos por un virus. En segundo lugar; es evidente que otros factores, tal vez de naturaleza hormonal, participan en la aparición de dichos tumores. A principios de los años cincuenta, varios investigadores iniciaron estudios sobre las leucemias murinas. Estos estudios permitieron identificar y caracterizar diferentes virus causantes de estas enfermedades. El primer virus causante de una leucemia murina fue descrito por Gross en 1951. Este virus se transmite en forma vertical, o sea, de los progenitores a los hijos en ciertas cepas de ratones conocidas como endogámicas porque el apareamiento ocurre entre ratones descendientes de los mismos progenitores. El virus de Gross resultó ser de manifestación clínica tardía, siendo necesario que los ratones infectados alcanzaran cierta edad y una particular constitución hormonal antes de manifestar cualquier signo de leucemia. Dos años después, Gross descubrió que en realidad estaba estudiando dos virus diferentes y que además de leucemia algunos ratones infectados desarrollaban tumores de las glándulas parótidas. El virus que causa el tumor de las parótidas fue estudiado por Eddy y Stewart, quienes en 1957 descubrieron que este virus incrementaba su virulencia después de haber sido propagado en tejido embrionario de ratones o de simios, adquiriendo de esta manera la capacidad de producir tumores diversos en una variedad de hospederos como ratas, hámsteres y conejos. Este virus fue rebautizado como virus del polioma. Posteriormente, Eddy y colaboradores iniciaron el estudio de un virus de los simios conocido como virus SV40, mismo que causa infecciones latentes y al parecer innocuas en las células renales de ciertas especies de monos. Sin embargo, se encontró que este virus es capaz de producir tumores en hámsteres recién nacidos. Así, el estudio de los virus causantes de la leucemia murina y del virus SV40 indicó que algunos virus pueden encontrarse en estado silencioso o latente dentro de sus hospederos naturales y sólo manifiestan una capacidad para producir tumores (oncogénesis) cuando son introducidos en otras especies animales. Por

ejemplo, varios tipos de adenovirus que usualmente causan infecciones respiratorias en humanos y en apariencia no tienen capacidad oncogénica en el hombre (su hospedero natural), son capaces de inducir tumores en hámsteres y ratas. En 1956, Gierer y Schramm desarrollaron métodos que les permitieron demostrar que la infectividad del virus del mosaico del tabaco residía en el ácido nucleico de este virus, esta metodología fue posteriormente aplicada al estudio de los virus oncogénicos, lo que permitió a Ito demostrar en 1960 que el factor productor de tumores presente en el virus del papiloma residía en el ácido nucleico (ADN) del virus. Virus como los descritos en los párrafos anteriores son conocidos como virus oncogénicos, pero se utiliza una terminología más cautelosa para describir otro grupo de virus que también han sido asociados con la producción de cáncer. Estos virus están representados principalmente por los herpesvirus asociados a tumores que, como el nombre sugiere, han sido encontrados en asociación con varios tipos de tumores tanto en humanos como en una gran variedad de animales. En 1907, Marek describió una enfermedad de pollos y gallinas que afectaba el sistema nervioso de estos animales. En 1929, Pappenheimer y colaboradores encontraron una alta incidencia de tumores linfoides en los ovarios de aves afectadas por la enfermedad de Marek. Después de la segunda Guerra Mundial, la cría de aves de corral alcanzó proporciones masivas y a consecuencia de esto la enfermedad de Marek pareció ganar en virulencia y modificar su curso natural de manera que la aparición rápida de tumores de tipo linfoide en las vísceras de las aves afectadas pasó a ser el principal signo de esta enfermedad. En 1967, Biggs y Churchill fueron capaces de propagar el agente causal de la enfermedad de Marek en cultivos de células y posteriormente lograron aislar el virus que resultó pertenecer al grupo de los herpesvirus. Los efectos citopáticos del virus de Marek son parecidos a los producidos por otros herpesvirus, como el varicela-zoster. En 1969, Churchill y colaboradores produjeron una vacuna a partir de virus de Marek atenuados por medio de la repetida propagación de los mismos en cultivos celulares; esta vacuna fue capaz de proteger a los pollosinoculados, evitando la aparición de los tumores linfoides asociados con la enfermedad de Marek. En 1934, Lucké observó que ciertos carcinomas renales muy comunes en ranas silvestres de los lagos de Nueva Inglaterra podían ser transmitidos por medio de extractos obtenidos a partir de las células tumorales. Estudios posteriores demostraron la persistente asociación de un herpesvirus con las células de los tumores renales. Ciertos experimentos sugieren que este herpesvirus es el agente causal de los tumores, pero no ha podido ser descartada por completo la posibilidad de que algún otro virus o agente sea el verdadero causante de la enfermedad y el herpesvirus asociado con la misma sea un simple pasajero intracelular. En 1968, Meléndez y colaboradores aislaron un herpesvirus a partir de monos ardilla y posteriormente pudieron propagar el virus en cultivos de células procedentes de estos monos que son infectados con frecuencia por el virus en cuestión. Este virus ahora es conocido como Herpesvirus saimiri y es capaz de producir leucemias y linfomas cuando es inoculado en otras especies diferentes al hospedero natural, como lémures y monos araña e incluso en conejos de Nueva Zelanda.

En 1972, el mismo grupo de investigadores logró aislar otro virus, el Herpesvirus ateles, a partir del mono araña, este virus también produce linfomas y leucemias cuando es inoculado en otras especies de monos diferentes al hospedero natural. Denis Burkitt describió en 1962 un tumor caracterizado por un crecimiento del tejido linfoide presente en el maxilar inferior. Este tumor; ahora conocido como linfoma de Burkitt es relativamente frecuente en ciertas regiones ecuatoriales del este de África y también en Nueva Guinea. El tumor ocurre sobre todo en niños de 5 a 12 años y es excepcionalmente raro en otras regiones del mundo. En África y Nueva Guinea el tumor es frecuente en particular entre la población de escasos recursos que habita en áreas donde la malaria causada por el parásito Plasmodium falciparum es endémica. Esta observación hizo pensar que el tumor podría ser causado por un agente infeccioso transmitido por mosquitos al igual que el agente de la malaria, y que la propia malaria podría ser un factor asociado en la inducción del tumor. En 1964, Epstein y colaboradores detectaron un herpesvirus, ahora conocido como virus de Epstein-Barr (EBV), en cultivos de células linfoblásticas obtenidas a partir de un linfoma de Burkitt. Poco tiempo después, en 1966, Henle y Henle demostraron que anticuerpos contra los antígenos característicos del EBV se encuentran presentes cuando menos en 80% de los adultos normales en cualquier parte del mundo. Sin embargo, la presencia de un título elevado de anticuerpos contra EBV en pacientes con linfoma de Burkitt sugiere que este virus es el principal factor causal del tumor. Trabajos posteriores han demostrado que el EBV es el agente causal de una muy común y poco peligrosa enfermedad infecciosa conocida como mononucleosis infecciosa. Los estudios epidemiológicos subsecuentes han reforzado la asociación entre el EBV, el linfoma de Burkitt y otro tipo de cáncer humano: el carcinoma nasofaríngeo, que es prevalente en el sureste de Asia, particularmente entre la población de chinos cantoneses. La restringida distribución geográfica característica de ambos tumores asociados con el EBV sugiere que el virus puede ser el factor causal en ambos tumores, pero que también existen factores de tipo ambiental y étnico involucrados en la aparición de dichos tumores. A principios de los años sesenta, Renato Dulbecco y colaboradores iniciaron el estudio de las interacciones entre los virus oncogénicos y las células hospederas; esto condujo a la caracterización del fenómeno conocido como transformación celular. Las células normales, cuando son cultivadas en el laboratorio, solamente pueden crecer si están adheridas a una superficie sólida; estas células dan origen a monocapas de células cuyo grosor es equivalente al de una sola célula. Las células normales manifiestan la llamada inhibición por contacto, que se caracteriza por una suspensión del crecimiento celular una vez que la célula entra en contacto directo con las otras células que la rodean. Por otra parte, las células normales mueren inevitablemente después de haber sido mantenidas en cultivo por un tiempo determinado. Por el contrario, las células transformadas al estado tumoral muestran una pérdida de la inhibición por contacto y son capaces de crecer en forma apilada, originando focos de diferente grosor en un cultivo de células en monocapa. Estas células transformadas se vuelven capaces de crecer en suspensión prescindiendo de la necesidad de contar con un soporte sólido como condición necesaria para iniciar el crecimiento. Las células transformadas se vuelven "inmortales" y es posible mantenerlas en cultivo por tiempo indefinido. Las células normales requieren de la presencia de suero y otros factores de crecimiento en el medio de cultivo, mientras que las células tumorales o transformadas manifiestan un

menor requerimiento de estos factores. Estas claras diferencias entre las células normales y las células transformadas han servido de base para desarrollar ensayos y métodos experimentales que permiten explorar el proceso o procesos por medio de los cuales ciertos tipos de virus son capaces de producir tumores

L O S

R E T R O V I R U S : L A C L A V E D E O N C O G É N E S I S V I R A L

L A

A PRINCIPIOS de los años sesenta, Howard Temin demostró que era posible inducir con una alta frecuencia mutaciones en el genoma del virus del sarcoma de Rous (RSV) presente en el interior de células infectadas por dicho tipo de virus. Las mutaciones producidas en el genoma viral se manifestaban como cambios en la morfología de las células infectadas y el genoma viral mutante podía ser heredado en forma estable por la subsecuente progenie celular. Esta observación condujo a pensar que la información genética del virus se encontraba presente en una estructura de la célula hospedera capaz de ser heredada en forma regular. Así nació la idea del "provirus" y la especulación de que este hipotético provirus se encontraba integrado en el genoma de la célula hospedera. El principal problema de esta hipótesis consistía en que hasta entonces no se conocía ningún camino por el cual el ARN que constituye el material genético del RSV pudiera ser convertido en ADN y de esta manera ser integrado en el genoma de la célula hospedera. El llamado dogma central de la biología molecular sostenía que la información genética solamente fluye en forma unidireccional: ADN ARN Proteína. Sin embargo, Temin observó que ciertas substancias capaces de intercalarse en la molécula de ADN y bloquear la síntesis de ARN dirigida normalmente por el ADN, eran también capaces de bloquear la síntesis de ARN viral en células infectadas por RSV. Esta observación sugería en forma indirecta la posibilidad de que en este caso la información genética fluía de ARN hacia ADN y de nuevo hacia ARN Proteína. Experimentos posteriores demostraron que era necesaria la síntesis previa de un nuevo tipo de ADN en las células infectadas por RSV para que se produjeran las nuevas partículas virales; por lo tanto, este nuevo tipo de ADN era producido en las células como consecuencia de la infección por RSV. Esta paradójica observación implicaba que de alguna manera desconocida el ARN viral inducía la síntesis de un cierto tipo de ADN, el cual a su vez era necesario para la futura producción de nuevo ARN viral. Con base en estos resultados, Temin póstuló en 1964 la hipótesis del provirus. Esta hipótesis propone que el ARN que constituye el genoma del RSV infectante actúa como templado para dirigir la síntesis de una molécula de ADN que es equivalente al ARN viral original. Este nuevo ADN viral puede integrarse en forma de provirus en el genoma (ADN) de la célula hospedera donde subsecuentemente actuará como templado para la síntesis de nuevo ARN viral que constituirá la progenie del virus infectante (figura IX.I). Durante casi 6 años la hipótesis del provirus permaneció prácticamente ignorada hasta que en 1970 Temin y Baltimore, trabajando por separado y en forma independiente, demostraron la existencia de una actividad enzimática codificada por el genoma del RSV; esta actividad es capaz de dirigir la síntesis de ADN a partir de ARN viral. Esta nueva enzima fue bautizada como transcriptasa inversa y constituyó el eslabón

necesario para explicar el mecanismo de transmisión de la información genética propuesto en la hipótesis del provirus. La prueba formal de esta hipótesis fue obtenida por medio de experimentos de hibridación de ácidos nucleicos en los cuales el ARN viral marcado radiactivamente mostró un mayor índice de hibridación con el ADN de células infectadas que con el ADN de células no infectadas por RSV. Este resultado se debe a que el ADN de las células infectadas contiene secuencias complementarias al ARN viral. Posteriormente, experimentos realizados con ADN obtenido a partir de células infectadas de antemano con RSV, mostraron que es posible transfectar; o sea, introducir el ADN purificado en células no infectadas, mismas que posteriormente darán origen a viriones completos de RSV a partir de la información contenida en el ADN introducido a la célula.

Figura IX.1. Hipótesis del protovirus para el origen de los genes cancerosos y la generación de virus ARN oncogénicos. En el ejemplo ilustrado, el virus del sarcoma de Rous (RSV) es visualizado como si se originara a partir de un virus con bajo potencial oncogénico como el virus de la leucosis aviaria (AVL). Las líneas zigzagueantes anchas indican ADN involucrado en la transferencia de información desde el ADN y de nuevo hacia ADN por medio de la enzima transcriptasa inversa. El ARN del ALV incorpora el ARN transcrito a partir del ADN anormal propio de una célula cancerosa y de esta manera se convierte en el virus oncogénico RSV.

Temin propuso una extensión de la hipótesis del ADN proviral. Esta nueva idea, conocida como la teoría del "protovirus", postula que cuando menos una parte del genoma de los virus oncogénicos ha surgido como consecuencia del proceso evolutivo a partir del ADN de células normales que han sido alteradas por algún agente carcinogénico. La recombinación genética entre el ADN viral y el ADN celular puede resultar en carcinogénesis debido a la inserción del híbrido de ADN viral y celular en un sitio inadecuado dentro del genoma de una céla hasta entonces normal; esto puede propiciar la activación de genes normalmente inactivos en las células adultas. Por su parte, Huebner y Todaro propusieron en 1969 la hipótesis del oncogene. Según esta hipótesis, las células de la mayoría de los vertebrados contienen genomas

correspondientes a virus ARN oncogénicos, incluyendo las secuencias que codifican las actividades que pueden transformar a una célula normal en célula tumoral (oncogenes). De acuerdo con esta hipótesis, las secuencias correspondientes a los oncogenes son transmitidas en forma vertical de los progenitores a la progenie y, por lo tanto, la aparición del cáncer será determinada por la reactivación de esos oncogenes endógenos cuya expresión está normalmente reprimida. Dicha reactivación puede ser inducida por carcinógenos químicos, irradiación, envejecimiento celular o una combinación de todos estos factores. Esta teoría ofrece una explicación para la frecuentemente observada transmisión vertical de ciertos virus animales y la interacción cooperativa entre irradiación, carcinógenos químicos, infecciones crónicas y los virus oncogénicos en la producción de transformación celular. Las dos teorías o hipótesis mencionadas proponen en común que el cáncer es consecuencia de la expresión de ciertos genes presentes en las células, mismos que normalmente no son expresados o lo hacen con muy baja intensidad; por lo tanto, el cáncer es consecuencia de una pérdida en la regulación de la expresión genética (figura IX.2.). Los retrovirus han sido definidos como virus ARN que en forma obligatoria se propagan a través de un intermediario intracelular constituido por una molécula de ADN de cadena doble sintetizada por la enzima transcriptasa inversa característica de estos virus, a partir del ARN que constituye el genoma viral. Si se supone que las secuencias correspondientes a los genes oncogénicos presentes en los retrovirus tumorales no son necesarias para la replicación de estos virus, como ocurre en el caso del RSV, sino que, por el contrario, constituyen genes extras que proporcionan una cierta ventaja selectiva para la proliferación celular, entonces se deduce que las células transformadas por retrovirus oncogénicos deben contener secuencias de ácido nucleico que no están presentes en los retrovirus no oncogénicos pertenecientes al mismo tipo o clase viral que los retrovirus oncogénicos en cuestión. Esta idea predice que el genoma del virus transformante (oncogénico) debe codificar cuando menos una proteína que está específicamente asociada con el proceso de transformación y que esta proteína no es necesaria para la replicación del virus a pesar de cumplir una función en las células hospederas transformadas por el virus. A principios de los años setenta diferentes grupos de investigadores encontraron evidencia de que los virus del sarcoma aviario (de los cuales el RSV es un ejemplo) contienen más información genética que la presente en cepas de virus similares, pero que han perdido su capacidad para transformar células. Las cepas de virus del sarcoma aviario (ASV) conocidas como "defectuosas en transformación", no pueden inducir sarcomas en animales experimentales, tampoco transforman células en cultivo y carecen de 10 a 20% de la información genética (ARN) presente en virus similares, pero que cuentan con capacidad transformante. Sin embargo, estos virus defectuosos en transformación son capaces de infectar células y replicarse en forma normal dando origen a nueva progenie viral. Esto indica que la eliminación de la porción del genoma que codifica la actividad o actividades transformantes no tiene efecto alguno sobre la capacidad del virus para replicarse. De hecho, la gran mayoría de los retrovirus directamente oncogénicos, es decir, capaces de transformar directamente a la célula infectada mediante la expresión de un oncogene viral, son virus "defectuosos en

replicación". O sea que estos virus oncogénicos no pueden replicarse porque han perdido funciones virales esenciales para su replicación, ya que las secuencias génicas que codifican dichas funciones han sido sustituidas por la secuencia correspondiente al oncogene celular, mismo que fue adquirido por el genoma viral mediante un proceso mal comprendido y que se conoce como "transducción". Por esta razón, la mayoría de los retrovirus directamente oncogénicos sólo pueden ser propagados en presencia de un virus auxiliar, el cual debe ser un retrovirus capaz de replicarse y, por lo tanto, no es oncogénico. El retrovirus auxiliar aporta las funciones virales que están ausentes en el retrovirus oncogénico, y así permite la replicación y propagación de este último. Por lo tanto, la propagación de retrovirus directamente oncogénicos es un fenómeno de laboratorio, ya que en condiciones naturales es muy improbable que una misma célula sea coinfectada por el retrovirus oncogénico y el retrovirus auxiliar. De hecho, no existen reportes de epidemias de cáncer en animales silvestres.

Figura IX. 2. Esquema que ilustra una posible manera de cómo el protovirus puede causar una reorganización de los cromosomas de una célula para producir información oncogénica. El protovirus transcribe un segmento del gene en ARN (minúsculas), el cual es copiado en ADN e insertado en una nueva posición dentro del cromosoma. La repetición de este proceso puede en algunos casos producir un alineamiento paralelo de los genes (encasillados) que son necesarios para producir carcinogénesis.

En 1976, Bishop, Varmus y colaboradores lograron aislar el fragmento del genoma del virus del sarcoma de Rous (RSV) que codifica la actividad encargada de inducir la transformación celular. Este gene fue bautizado como v-src. El mismo grupo de investigadores demostró que en el genoma de células transformadas por RSV y también en el genoma de células normales no infectadas por éste virus, existen secuencias homólogas aunque no completamente idénticas al v-src; estas secuencias homólogas fueron observadas en el genoma de células de aves, ratones, peces, bovinos y humanos, pero no en células de erizo de mar, mosca de la fruta ni en bacterias. Este resultado sugiere que una porción del gene src ha sido conservada en el genoma de las células de organismos superiores a lo largo de varias etapas de la evolución. Estudios posteriores demostraron que ARN mensajero complementario a la secuencia presente en el ADN correspondiente al gene v-src se encuentra presente en el interior de células aviarias tumorales y normales. Esto indica la presencia del gene src y la transcripción de este gene en ambos tipos de células. Con el fin de evitar confusiones, el gene viral que codifica la función transformante ha sido designado vsrc, mientras que la secuencia de ADN correspondiente a src y que está presente en el genoma de las células normales ha sido designada como c-src. Otros experimentos demostraron que la localización y concentración intracelular del ARNm correspondiente al gene transformante v-src es de hecho la misma tanto en células transformadas por RSV como en células que originalmente fueron transformadas por RSV pero que han revertido en forma espontánea al estado normal. Esto sugiere que la presencia del gene src y la transcripción del mismo no son específicas de las células transformadas. Por lo tanto, si el gene src está verdaderamente involucrado en el proceso de transformación, el factor esencial debe estar localizado en el nivel de la traducción a proteína del ARNm correspondiente al gene v-src o en el nivel del electo que tiene la proteína codificada por v-src sobre ciertos componentes celulares. La proteína codificada por el gene v-src ha sido identificada y se ha encontrado que dicha proteína está presente tanto en células normales como en células transformadas. Esta proteína fue aislada por métodos inmunológicos utilizando el suero inmune obtenido de conejos que recibieron transplantes de tumores inducidos por el virus del sarcoma aviario (ASV). Con este suero fue posible precipitar una proteína con peso molecular de 60 000 daltones (p 60 ), a partir de extractos de células de pollo y de hámster que habían sido transformadas por el ASV. Posteriormente, ha sido posible sintetizar la proteína p 6 in vitro a partir de la región del ARN viral que contiene al gene v-src. La proteína p 60v es una fosfoproteína, o sea, tiene adosado un átomo de fósforo, el cual puede ser despegado en forma reversible. Se dice que la proteína está fosforilada cuando tiene el fósforo adherido a ella y esta forma de la proteína se denomina pp 60 . Curiosamente, la proteína p 60 tiene actividad de proteína cinasa, o sea, es capaz de fosforilar a otras proteínas. La fosforilación ocurre en los residuos del aminoácido tirosina presentes en la proteína a ser fosforilada. Ésta es una
v-src -src -src v-src v-src

característica muy peculiar, ya que otras proteína-cinasas conocidas tienen los aminoácidos serina y treonina como blanco de la actividad fosforilante. En células de pollo infectadas con el virus del sarcoma de Rous (RSV) ha sido identificada una proteína con peso molecular de 36 000 daltones, la cual en apariencia constituye el blanco (sustrato) de la actividad fosforilante asociada con p 60 . Paradójicamente, existe evidencia de que p 60 es capaz de autofosforilarse. Por otra parte, se ha identificado en células normales la presencia de una proteína fosforilada muy similar pero no idéntica a pp 60 . Dicha proteína es denominada pp 60 , la concentración de esta proteína en células normales se mantiene constante y no varía con el estado de crecimiento celular; a diferencia de la proteína homóloga pp 60 , la cual está presente en grandes cantidades en las células infectadas por el ASV. Existe sólida evidencia de que la secuencia básica de aminoácidos que constituyen la proteína pp 60 ha sido conservada con mínimos cambios por diferentes especies a lo largo de la evolución. El hecho de que en el gene c-src está presente la secuencia de nucleótidos que codifica a la proteína p 60 sugiere que el gene normal c-src presente en las células de varias especies es el progenitor del gene v-src característico de los virus del sarcoma aviario. Esta observación es consistente con la hipótesis del protovirus propuesta por Temin. Hasta la fecha, no ha sido posible establecer con claridad la función de p 6O en las células normales, tampoco ha sido posible definir con claridad el papel que tiene p 60 en la transformación celular. Es probable que esta proteína codificada por el gene transformante presente en los virus del sarcoma aviario tenga otras funciones aparte de su capacidad fosforilante, las cuales podrían estar más directamente involucradas en el proceso de transformación celular.
v-src v-src c-src c-src v-src c-src v-src c-src v-src

En los últimos diez años diferentes grupos de investigadores han podido aislar otros genes virales con capacidad transformante a partir de diferentes tipos de retrovirus que afectan a diversas especies animales y producen diferentes tipos de tumores. En todos los casos estudiados hasta la fecha, ha sido posible encontrar en las células normales cuando menos un gene cuya secuencia de nucleótidos es muy similar a la del gene transformante presente en el genoma de cada tipo de retrovirus oncogénico estudiado. Estas observaciones apoyan en forma muy importante los postulados básicos de la hipótesis del oncogene celular propuesta por Huebner y Todaro. Se deonomina proto-oncogenes a ciertos genes celulares que codifican diversas funciones celulares muy importantes para el control de los procesos de diferenciación, división y proliferación celular. Las diversas proteínas que son productos de estos genes cumplen diversas funciones en las células: algunas actúan como factores de crecimiento celular que son secretados al medio externo para que puedan estimular a otras células; otras son receptores membranales capaces de ligar moléculas que actúan como factores de crecimiento celular; otras proteínas transmembranales que actúan como transmisores (transductores) de las señales generadas por la interacción entre los factores membranales o citoplásmicas que pueden regular la actividad de otras proteínas al fosforilarlas (cinasas de proteínas). Por último, los productos de varios proto-oncogenes actúan directamente como reguladores de la expresión de diversos genes, ya que son proteínas con capacidad para pegarse a secuencias específicas del ADN celular, mismas que constituyen las regiones promotoras o activadores de la expresión de ciertos genes.

Todos estos proto-oncogenes pueden convertirse en oncogenes cuando sufren mutaciones que alteran su secuencia de nucleótidos. Las mutaciones pueden consistir en la sustitución o eliminación de uno o varios nucleótidos, situación que modifica la información codificada por el proto-oncogene y que resulta en la producción de una proteína modificada y con función alterada. Sin embargo, también existen las mutaciones causadas por inserciones génicas. Por ejemplo, el ciclo replicativo de los retrovirus implica que el genoma viral, en forma de provirus de ADN, debe integrarse en el genoma celular; dicha integración ocurre en sitios al azar. Algunos retrovirus son indirectamente oncogénicos porque se integran cerca de un proto-oncogene. Como consecuencia de esta integración puede ocurrir que las secuencias promotoras de la expresión de los genes retrovirales, conocidas como secuencias LTR, queden contiguas a la secuencia del proto-oncogene, de manera que la interacción de estas secuencias promotoras con factores de transcripción virales o celulares puede resultar en la hiperactivación del proto-oncogene, el cual ahora se comporta como un oncogene que produce en forma anárquica el ARN mensajero que codifica a una proteína normal, misma que al encontrarse en exceso, induce la transformación celular. También puede ocurrir que como consecuencia de un evento defectuoso de integración retroviral, un segmento de un gene viral quede contiguo a un segmento de un proto-oncogene celular, el resultado de este fenómeno es la creación de un gene quimérico, mismo que codifica a una proteína quimérica la cual funciona en forma alterada y puede desencadenar el proceso de transformación celular. Fenómenos fisocoquímicos y ambientales como las radiaciones, pueden inducir rupturas y rearreglos en los cromosomas. Como resultado de estos rearreglos puede ocurrir que la secuencia de un proto-oncogene queda contigua a la secuencia promotora de la expresión de otro gene de mayor actividad. Esto resulta en la hiperactivación del proto-oncogene que se comporta como oncogene al ocasionar la sobreproducción de su proteína codificada, situación que provoca la pérdida de la regulación de la división y proliferación celular. En 1978 se aisló por primera vez un retrovirus humano a partir de un cultivo de células conocidas como linfocitos T, procedentes de un paciente con un raro tipo de leucemia. Este retrovirus es ahora conocido como virus linfotrópico humano tipo 1 o HTLV-l, y es el prototipo de más de 100 diferentes muestras del mismo virus obtenidas alrededor del mundo. Antes, en 1977, Takatsuki y colaboradores habían descrito un raro tipo de cáncer conocido como leucemia de células T del adulto (ATL), el cual es relativamente frecuente en ciertas partes del sudoeste de Japón. El tipo y las características morfológicas de las células de este tumor son muy similares a las de las células a partir de las cuales se aisló el HTLV-1. Esta observación hizo sospechar que este virus podría ser el agente causal de la leucemia tipo ATL. En 1981, Gallo y colaboradores analizaron el suero de pacientes japoneses afectados por esta rara forma de leucemia y en el 100% de los casos encontraron la presencia de anticuerpos contra el HTLV-1. El siguiente paso consistió en el aislamiento del virus a partir de células obtenidas de pacientes con ATL. Esto fue logrado por Yoshida y colaboradores en 1982 y pronto fue demostrado que el virus de la leucemia ATL es idéntico al HTLV-1. Posteriormente fue posible identificar otras zonas y poblaciones del mundo en las cuales la presencia de este virus es endémica. En 1982 se descubrió un virus en particular prevalente en los monos verdes africanos; este virus, denominado virus linfotrópico de simios tipo 1 (STLV4), es homólogo en más de 95% al HTLV-l. Esta observación, asociada con datos

referentes a la distribución geográfica del HTLV, ha hecho especular que el retrovirus humano es descendiente del retrovirus presente en los monos, el cual está asociado con la producción de linfomas malignos en los monos infectados. Estudios epidemiológicos, experimentos de transformación celular con linfocitos T normales y la caracterización de las propiedades moleculares del HTLV-1, sugieren que este virus puede estar involucrado en los mecanismos que causan la leucemia tipo ATL. Todas las células tumorales ATL contienen un genoma de HTLV-1 en forma de provirus, mismo que no está presente en las células normales. El provirus es clonal, o sea, es exactamente igual en todas las células tumorales; esto indica que cada provirus es descendiente directo del provirus progenitor presente en la célula que dio origen al tumor. Este hecho implica que la infección por HTLV-1 ocurre antes del primer evento de transformación celular, mismo que dará origen a la primera célula tumoral. El sitio de integración del provirus dentro del genoma celular es el mismo en todas las células, pero varía de un paciente a otro ya que en diferentes enfermos el tumor se origina a partir de un linfocito T diferente. La figura IX.3 ilustra tres diferentes modelos propuestos para explicar la producción de leucemia por tres diferentes tipos de retrovirus.

Figura IX.3. Mecanismos de leukemogénesis viral. (a) Los virus productores de leucemias agudas capturan genes derivados de las células (oncogenes) que codifican proteínas específicas involucradas en la transformación celular. Algunas de estas proteínas son promotoras del crecimiento celular y pueden estar localizadas en la membrana, el citoplasma o el núcleo celular. Estos posibles sitios de acción son indicados por las flechas. Estas proteínas actúan en trans,o sea, sobre una región del ADN diferente a la que contiene el oncogene y el provirus integrado; por lo tanto, no se requiere de un sitio constante y específico para la integración del provirus. (b) Los virus productores de leucemias crónicas activan genes celulares a causa de que se integran en forma de provirus en una posición próxima a los genes afectados. Los genes celulares activados pueden ser proto-oncogenes. El mecanismo de activación en cisrequiere de la conservación de sitios de integración proviral específicos. (c) El virus HTLV-1, asociado con la leucemia tipo T del adulto (ATL), produce una proteína nuclear (TAT) que activa la transcripción de genes localizados en segmentos del genoma diferentes a los que contiene el provirus integrado (activación en trans);por lo tanto, no es necesario que exista un sitio específico para la integración del provirus. Se ha especulado que el producto del gene ta tes capaz de activar la expresión de genes promotores del crecimiento celular (GPG) específicos para células linfoides. Las letras LTR indican las secuencias repetidas invertidas que están presentes en ambos extremos del genoma correspondiente al provirus integrado o al

virus

HTLV-1

no

integrado.

VIRUS DEL PAPILOMA HUMANO Desde la época grecoromana se sospechaba que las verrugas en la región anogenital del humano podían ser de origen venéreo. El origen infeccioso de estas verrugas fue establecido a fines del siglo XIX, y en 1907 Ciuffo demostró la transmisión de los papilomas epidérmicos, por medio de la inoculación de voluntarios con filtrados libres de células obtenidas a partir de estos papilomas (las verrugas o tumores benignos conocidos como "mezquinos"). Esto demostró la etiología viral de los papilomas (mezquinos). En 1932, Shope aisló el virus del papiloma de conejo, mismo que produce papilomas y tumores en la piel del conejo. Este virus fue el primer modelo para estudiar el posible papel oncogénico de los virus en los mamíferos. Desde entonces empezó a sospecharse que puede existir una cooperación entre ciertos virus y carcinógenos químicos durante el desarrollo de ciertos tipos de tumores. El estudio de los virus del papiloma humano (VPH) o Human Papilloma Virus (HPV) ha estado limitado por la falta de sistemas para cultivarlo in vitro, ya que este tipo de virus solamente infecta células epiteliales y sólo se replica activamente en células epidérmicas (queratinocitos) totalmente diferenciadas, mismas que no pueden ser mantenidas en cultivo por largo tiempo. Sin embargo, el advenimiento de las técnicas de ingeniería genética ha permitido "donar" los genomas de varios tipos de virus del papiloma humano HPV, obtenidos a partir de biopsias de tejidos infectados. Hasta la fecha han sido identificados 68 genotipos diferentes de HPV. Por convención, se considera que dos cepas de HPV constituyen tipos diferentes si la secuencia de nucleótidos de sus genomas manifiestan una homología menor a 50%. Existen virus del papiloma en diferentes especies animales y cada uno de estos virus es específico para la especie a partir de la cual fue aislado, o sea que el HPV no infecta especies animales y los virus de animales no pueden infectar al humano. Todos los virus del papiloma (papilomavirus) pertenecen al grupo de los papovavirus y se caracterizan por ser virus sin envoltura con cápside icosaédrica y con un genoma circular de ADN de doble cadena que consta de aproximadamente 8 000 pares de bases. Las infecciones por HPV tienen una dis tribución mundial. Se ha podido establecer que la infección por HPV tipo 5 está muy asociada con el desarrollo de cáncer de piel en pacientes que padecen una rara enfermedad congénita llamada epidermodisplasia verruciforme (EV). Por otra parte, desde mediados del siglo XIX se ha sospechado que el cáncer del cérvix (cuello) uterino puede ser de origen infeccioso. Estudios epidemiológicos realizados entre 1960 y 1970 parecían implicar al virus Herpes simplex tipo 2 en la etiología de este tipo de cáncer; sin embargo, en 1974 surgió la primera evidencia de una asociación entre la infección por HPV y el subsecuente desarrollo de cáncer cérvico uterino (CaCu). En 1984 el grupo dirigido por Harald zur Hausen reportó el aislamiento frecuente de los HPV 16 y 18 a partir de tumores cervicouterinos. En la actualidad se sabe que el HPV 16 está presente aproximadamente en de 50% de los CaCus, mientras que el HPV 18 se encuentra cerca del 20% de estos tumores. Otros tipos de HPV han sido encontrados en muestras de CaCu, por lo cual casi el 90% de los tumores cervicouterinos son positivos a HPV. El

periodo de latencia entre la infección primaria y la aparición del cáncer es del orden de 20 a 40 años. Esta situación es similar a la observada en otros tumores humanos asociados con infecciones virales como son el cáncer de hígado con el HBV y la leucemia de células T del adulto con el HTLV-1. En la mayoría de las lesiones pretumorales asociadas con infección por HPV, se observa que el ADN viral persiste en forma de episoma o sea, como un minicromosoma independiente del resto del genoma de la célula hospedera. Sin embargo, en la mayoría de los tumores cervicouterinos se observa la integración del genoma viral, este evento de integración parece ser uno de los eventos tempranos en el proceso de carcinogénesis. El patrón de integración con frecuencia resulta en la interrupción de la secuencia correspondiente al gene E2 del HPV. La proteína codificada por este gene está involucrada en la regulación de la expresión de otros genes del HPV. La ausencia de la proteína E2 facilita la sobreexpresión de los genes virales E6 y E7. Se sabe que las proteínas codificadas por E6 y E7 son capaces de interactuar con las proteínas celulares p53 y RB respectivamente, dichas proteínas celulares participan en los mecanismos que controlan la división y proliferación celular, la inactivación de estas proteínas celulares está asociada con el desarrollo de varios tipos de tumores; Por lo anterior; se piensa que el mecanismo oncogénico del HPV puede estar relacionado con la inactivación de p53 y RB por medio de ciertas proteínas virales. En los últimos años se han incrementado los reportes que asocian la infección por HPV en epitelios extragenitales con el subsecuente desarrollo de tumores de la laringe, amígdalas, lengua y cavidad oral. Lo anterior sugiere que el potencial oncogénico de estos virus puede afectar diversos órganos humanos. La frecuente regresión espontánea de papilomas y verrugas benignas, sugiere que el sistema inmune puede controlar en la mayoría de los casos la infección por HPV. Sin embargo, se sabe muy poco respecto a la respuesta inmune específica contra el HPV, ya que esta respuesta inmune no parece ser intensa debido a que los HPV provocan infecciones crónicas y latentes, y en el caso de las infecciones productivas éstas no se asocian con la destrucción de la célula infectada, ya que los HPV no son citopáticos. Es probable que la inmunidad mediada por células (inmunidad celular) sea la que tenga un papel más importante en el control de las infecciones por HPV. Lo anterior se deduce de la alta incidencia de papilomas, verrugas y tumores epiteliales observada en pacientes que sufren de inmunodeficiencias congénitas o adquiridas. Así, una prioridad de la investigación sobre los HPV consiste en lograr un método para estimular la inmunidad celular específica contra los HPV. LOS VIRUS DE LA HEPATITIS La hepatitis es un padecimiento relativamente frecuente que se manifiesta como una inflamación generalizada del hígado con la consecuente alteración de importantes funciones metabólicas que tienen lugar en las células hepáticas (hepatocitos). La hepatitis humana de origen viral puede ser causada por una importante variedad de virus; sin embargo, existe un grupo de virus que manifiesta una gran predilección por infectar el tejido hepático (tropismo hepático). Hasta hace poco tiempo, las hepatitis humanas causadas por virus con tropismo hepático se clasificaban en tres tipos: A, B y no A-no B. Esto se debía a que solamente habían sido identificados los virus de la hepatitis tipo A (HAV) y de la hepatitis B (HBV). Hoy sabemos que las hepatitis virales

no A-no B pueden ser causadas por, cuando menos, tres virus diferentes: HCV, HDV y HEV. Podemos dividir a las hepatitis virales específicas en dos grupos principales: 1) hepatitis virales de incubación corta, las cuales se adquieren por lo general a través del contagio oral-fecal (principalmente por ingestión de agua contaminada por heces o de alimentos contaminados por dichas aguas residuales) y que se comportan como hepatitis agudas de resolución rápida. Los virus HAV y HEV son los principales causantes de estas hepatitis. 2) hepatitis virales de incubación larga, las cuales se adquieren por lo general a través de contagio por vía parenteral: por transfusiones con sangre contaminada, por contagio sexual, por heridas causadas por instrumentos quirúrgicos contaminados y en el caso de los toxicomanos, por compartir jeringas y agujas contaminadas. También se ha reportado la transmisión de la madre al hijo durante el periodo perinatal. Estas hepatitis evolucionan con frecuencia hacia formas de infección crónica y persistente, y los pacientes afectados pueden sufrir recaídas repetidas, además de continuar siendo contagiosos durante muchos años. Las hepatitis virales de origen parenteral e incubación larga son causadas por los virus HBV, HCV y HDV. Es interesante notar que los cinco virus de la hepatitis pertenencen a cinco grupos taxonómicos diferentes, o sea que desde el punto de vista de su organización estructural, de la organización de sus genomas y de sus respectivas estrategias de replicación, estos cinco virus son muy diferentes entre sí y solamente comparten la predilección por infectar el hígado. El virus HAV pertenece al grupo de los picornavirus cuyo miembro más conocido es el virus de la poliomelitis. El virus HCV pertenece al grupo de los flavivirus cuyos miembros más conocidos son causantes de la fiebre hemorrágica conocida como "dengue". Se sabe que varios tipos de flavivirus pueden ser transmitidos por insectos (artrópodos), sin embargo, no existe ninguna evidencia de que el HCV pueda ser transmitido por insectos. El HEV pertenece al grupo de los calcivirus, entre los cuales se encuentran virus que afectan a los felinos y otros virus com el Norwalk que causa enfermedades diarréicas en los humanos. El espacio de la presente obra no permite una discusión detallada de los cinco virus de la hepatitis; sin embargo, debido a su importancia médica y a las interesantes peculiaridades de sus modos de organización y replicación, vale la pena dedicar algunos párrafos a los virus HBV y HDV. El virus de la hepatitis B En 1963, el investigador Baruj Blumberg descubrió en el suero sanguíneo de un paciente con hemofilia (padecimiento cuyo tratamiento requiere de repetidas transfusiones de sangre o plasma sanguíneo), la presencia de un anticuerpo que era capaz de reaccionar con un antígeno presente en la sangre de un aborigen australiano. Blumberg denominó antígeno Australia a esta molécula que resultó ser el antígeno principal de superficie del virus de la hepatitis B (HBsAg). La ausencia de cultivos celulares específicos capaces de replicar al HBV in vitro, impidió la pronta caracterización de este virus. Sin embargo, con el advenimiento de las técnicas modernas de ingeniería genética, fue posible aislar y "domar" el genoma de HBV con el fin de estudiar la biología molecular de este virus. A finales de la década de los

setenta, investigadores franceses pudieron establecer que el genoma del HBV consta de un ADN circular de doble cadena (aunque es desigual la longitud de ambas cadenas), correspondiente a 3 200 pares de bases, siendo hasta la fecha el genoma más pequeño de todos los descritos en virus animales. El HBV resultó ser el primer tipo descrito de un nuevo grupo de virus denominado hepadnavirus, debido a que todos los virus que son miembros de este grupo manifiestan un marcado tropismo hepático y comparten un método de replicación muy particular, mismo que es descrito en la figura IX. 4. Entre los virus que pertenecen a este grupo se encuentran virus que causan hepatitis en marmotas, ardillas y patos. Cabe mencionar que los hepadnavirus son los únicos virus, aparte de los retrovirus, que incluyen en su ciclo de replicación la actividad de una enzima transcriptasa inversa, capaz de sintetizar una molécula de ADN a partir de un templado de ARN. De hecho, la polimerasa codificada por el gene P de los hepadnavirus, es una enzima que manifiesta cuatro actividades diferentes: ADN polimerasa dependiente de ADN; ADN polimerasa dependiente de ARN (transcriptasa inversa); Ribonucleasa H, capaz de degradar el ARN presente en moléculas híbridas ADN-ARN; actividad como molécula anda para la iniciación de la síntesis de ADN. Otra característica importante de los hepadnavirus consiste en que no son virus directamente citopáticos, o sea que no destruyen a su célula hospedera. El conocimiento actual sobre la hepatitis tipo B indica que el daño hepático, que se manifiesta como inflamación hepática y destrucción de los hepatocitos, es causado por la propia respuesta inmune dirigida contra las células infectadas por el HBV; en particular, los linfocitos T citotóxicos anti-HBV parecen ser los principales responsables de la destrucción de los hepatocitos que expresan antígenos (proteínas) de HBV en sus membranas. Se piensa que los casos de hepatitis B fulminante y fatal, son consecuencia de una excesiva respuesta inmune contra el HBV, aunque en ratones transgénicos, en cuyas células se les ha insertado en forma experimental el gene que codifica el HBsAg, se observa que la sobreproducción del HBsAg puede causar destrucción de los hepatocitos. Sin embargo, la mayoría de las personas infectadas por HBV desarrollan un cuadro de hepatitis aguda, después de un periodo de incubación de ocho a 24 semanas. Dicha hepatitis aguda se manifiesta con dolor abdominal, ictericia (coloración amarillenta de la piel), fatiga y otros síntomas asociados. En otros casos, también numerosos, la infección permanece asintomática; pero en todos los pacientes en fase aguda de la infección (sintomática o asintomática) es posible detectar la presencia de altas concentraciones del HBsAg en el suero sanguíneo. Con el paso del tiempo y en la medida en que disminuye la hepatitis, aparecen anticuerpos específicos contra HBsAg (anti-HBs) en el suero de los pacientes infectados.

Figura IX. 4. Replicación del virus de la hepatitis B (HBV)1) El HBV infecta a una célula hepática. 2) Enzimas extienden la cadena corta del ADN viral. 3) El ADN viral migra hacia el núcleo celular, donde es copiado (transcrito) en una molécula complementaria de ARN. La hebra de ARN tiene 3.5 kilobases (3 500 nucleótidos) y constituye el pregenoma que es intermediario necesario para la replicación del genoma viral. 4) El pregenoma es empacado dentro de una cápside recién sintetizada. La polimerasa viral empieza a sintetizar una copia de ADN complementario al pregenoma viral. 5) La nueva cadena de ADN es un duplicado de la cadena larga de ADN presente en el genoma viral original. El pregenoma de ARN se desintegra tan pronto es completada la síntesis del nuevo ADN viral. 6) La polimerasa viral empieza a sintetizar una cadena de ADN complementario a la secuencia de nucleótidos de la cadena larga del ADN viral. 7) El ADN viral puede permanecer en la célula por un tiempo suficiente para convertirse en ADN de cadena doble; en cuyo caso, regresa al núcleo celular para iniciar un nuevo ciclo de replicación. 8) En caso de salida prematura de la nueva partícula viral, la cápside es dotada de una nueva envoltura y la extensión de la cadena corta del ADN viral cesa tan pronto la nueva partícula sale de la célula infectada. El resultado es una partícula viral infectante que contiene una ADN viral que es parcialmente de cadena sencilla.

Por lo general, estos anticuerpos alcanzan la concentración suficiente para neutralizar las partículas infecciosas de HBV y se sostienen a buenos niveles circulantes, de manera que protejen de por vida contra una nueva infección por HBV. Sin embargo, en algunos pacientes la respuesta inmune es deficiente y esto permite que persistan altas concentraciones de HBsAg circulante en el suero de estos pacientes. El propio HBV persiste en el hígado de tales pacientes, mismos que se convierten en portadores crónicos de este virus y tienden a presentar cuadros recurrentes de hepatitis (recidivas) tanto sintomática como asintomática. La sangre de estos portadores crónicos es una fuente potencial de contagio para los individuos que no están infectados por HBV. Cabe subrayar que los hepatocitos infectados por HBV producen viriones infectantes completos (partículas de Dane), pero también producen partículas virales defectuosas, tanto esféricas como cilíndricas, que carecen del genoma viral pero que presentan en su superficie el antígeno principal del HBV (HBsAg), en sus tres versiones: grande, mediana y corta o principal. De hecho, en toda infección por HBV la producción de partículas defectuosas supera a la de viriones completos por varios órdenes de magnitud. Lo anterior indica en forma indirecta que los viriones completos tienen una gran capacidad infectiva y son suficientes para propagar la infección. Un aspecto muy importante, desde el punto de vista médico, es que alrededor del 30% de los portadores crónicos de HBsAg desarrolla cirrosis hepática, la cual es una degeneración del tejido hepático que es sustituido por tejido cicatrizal que no es funcional. De estos pacientes con cirrosis, alrededor del 30% desarrolla un cáncer primario de hígado, evento que puede ocurrir entre 30 y 50 años después de la infección original por HBV. Estudios epidemiológicos demuestran que las posibilidades de convertirse en portador crónico se incrementan entre más temprana es la edad en que se contrae la infección por HBV. Se considera que la probabilidad de que un portador crónico de HBsAg desarrolle un cáncer de hígado es 200 a 300 veces mayor que en el resto de la población. Por esta razón, la infección temprana por HBV constituye uno de los problemas mas importantes de salud pública mundial, ya que en los países del Centro y sur de África y en los países del Lejano Oriente, la infección por HBV ocurre con una gran frecuencia en niños recién nacidos (que son infectados por sus madres durante el embarazo o durante el periodo perinatal) y en menores de cinco años. Se estima que en el mundo viven actualmente 300 millones de portadores crónicos del HBsAg, los cuales son también portadores crónicos del HBV, esto significa que a partir de esta población infectada se van a desarrollar cerca de 30 millones de casos de cáncer hepático. De modo que el HBV es en términos estadísticos el agente biológico con mayor potencial oncogénico (productor de cáncer) para los seres humanos. El largo periodo de latencia entre la infección original por HBV y la aparición del cáncer hepático, no es compatible con la hipótesis de que este cáncer es causado por la activación de un oncogene presente en el genoma de HBV. De hecho, los estudios de biología molecular demuestran que el virus de la hepatitis B no posee ningún oncogene; además, está bien establecido que el HBV no necesita integrar su ADN en el genoma de la célula hospedera para llevar a cabo su ciclo de replicación. Por otra parte, diversos estudios han reportado la presencia de fragmentos de genoma del HBV integrados en el ADN de células procedentes de tumores hepáticos. El análisis de estas

células sugiere que los fragmentos del genoma viral pueden integrarse en sitios diversos del genoma celular y de esta manera pueden provocar rearreglos de secuencias de nucleótidos o modificar el patrón de expresión de ciertos genes celulares. También se ha reportado que la sobreproducción de la proteína HBx codificada por el gene X del HBV puede inducir tumores de hígado en ratones que han sido genéticamente modificados para albergar y expresar el gene X dentro de sus células (ratones transgénicos). Se sabe que la proteína HBx puede actuar como activadora de la expresión de genes virales y celulares. Sin embargo, la mayoría de los estudios epidemiológicos sugiere que el desarrollo del cáncer hepático requiere de un evento genético secundario que es consecuencia de los ciclos de destrucción y regeneración hepática característicos de la hepatitis crónica y la cirrosis. Esto pone en duda que el cáncer hepático sea consecuencia directa de la acción de un gene viral. En realidad todo parece indicar que los tumores hepáticos asociados con la infección crónica por HBV son causados por una combinación de factores: daño hepático, regeneración celular y actividades virales que actúan en forma sinergista para producir inestabilidad cromosómica con el paso del tiempo, inestabilidad que se manifiesta como una modificación gradual de las funciones y el estado de diferenciación de los hepatocitos. El hecho bien demostrado de que agentes hepatotóxicos como el alcohol y las aflatoxinas, producidas por ciertos hongos que contaminan a cereales y semillas, aceleran el desarrollo de la cirrosis hepática y la progresión hacia el cáncer hepático en individuos crónicamente infectados por HBV, apoya la idea de que el virus necesita de cofactores que actúan por periodos prolongados para producir el cáncer hepático. Se han utilizado algunos agentes antivirales como tratamiento para los cuadros de hepatitis crónica recurrente asociada con la infección por HBV. Sin embargo, solamente el interferón alfa, producido por técnicas de ingeniería genética, ha demostrado tener un efecto positivo, aunque no es curativo. Afortunadamente, desde hace algunos años existen vacunas eficaces contra el HBV. La primera de ellas, desarrollada en Francia a finales de los años setenta, se basa en la purificación de envolturas y partículas virales defectuosas a partir del suero sanguíneo de portadores crónicos del antígeno HBsAg. Dichas partículas no son infectantes; sin embargo, poseen el antígeno mayor de superficie del virus (el HBsAg), por lo cual la inyección de estas partículas purificadas provoca la producción de anticuerpos neutralizantes específicos contra HBsAg en los individuos vacunados. En la actualidad, también están disponibles vacunas recombinantes o sea, vacunas producidas por métodos de ingeniería genética. Para desarrollar estas vacunas se procedió a donar el gene del HBsAg en diferentes tipos de vectores de expresión, mismos que permiten introducir dicho gene a células de mamífero o levaduras que son utilizadas como "fábricas" para la producción de dicho antígeno, el cual es purificado en forma subsecuente y utilizado para preparar vacunas que inducen anticuerpos específicos contra HBsAg. Desafortunadamente, el alto costo de estas vacunas hace que su disponibilidad sea muy limitada, ya que se utilizan principalmente en los países desarrollados y en programas de vacunación destinados a proteger personal de alto riesgo como son los soldados, los médicos y paramédicos. Por otra parte, los niños africanos y asiáticos que corren gran riesgo de ser infectados por HBV durante los primeros años de vida constituyen, por lo tanto, el principal reservorio de este virus y el principal grupo que

será afectado por la cirrosis y el cáncer de hígado; permanecen, hasta el momento, fuera de cualquier programa mundial de vacunación dirigido a controlar la infección por RBV. Agente delta o virus de la hepatitis delta El agente etiológico de la hepatitis delta, mal llamado virus de la hepatitis delta o HDV, fue descubierto por Rizzeto en 1977, pero su caracterización fue posible hasta 1986 gracias a la biología molecular. Este agente es capaz de infectar los hepatocitos exclusivamente en presencia y con la ayuda del virus de la hepatitis B; de tal manera que los individuos inmunizados contra el virus B, ya sea por vacunación o por inmunidad adquirida después de una infección por HBV, quedan protegidos también contra el HDV. El genoma del agente delta consta de 1678 nucleótidos que forman una cadena de ARN circular. Las características moleculares del HDV se parecen mucho a las de los viroides que son moléculas de ARN desprovistas de cápside y que, sin embargo, son capaces de producir diversas enfermedades en las plantas. Hasta el momento, todo parece indicar que el genoma del agente delta sólo codifica una proteína conocida como antígeno delta (HDAg), la cual tiene una gran afinidad por el propio ARN de este viroide y también por el antígeno principal del HBV (HBsAg). Estas propiedades del HDAg permiten que el genoma del viroide sea empacado dentro de envolturas compuestas por lípidos de la célula infectada y múltiples copias del HBsAg; es decir, este viroide utiliza al antígeno principal del HBV para conformar su propia envoltura y así poder propagarse como un agente infeccioso. Por lo anterior, la infección por el agente delta sólo puede prosperar en individuos que han sido coinfectados con HBV y HDV al mismo tiempo, o que padecen de hepatitis B crónica o son portadores crónicos del HBsAg. En todos estos casos, el HBV puede actuar como virus auxiliar al proporcionar el material necesario (HBsAg) para el empacamiento de nuevas partículas infecciosas del agente delta. La infección por HDV agrava los cuadros de hepatitis crónica en pacientes portadores de HBV y se han reportado casos de hepatitis fulminante en portadores crónicos del HBV que han sido superinfectados por el HDV. Por lo general, los individuos infectados con HDV presentan anticuerpos contra el antígeno delta (HDAg) durante un periodo muy corto después de la infección. Sin embargo, los portadores crónicos del HBV que son superinfectados por el HDV evolucionan con frecuencia hacia una hepatitis crónica que se acompaña de la continua presencia del HDAg en el hígado y de anticuerpos anti-HDV en la sangre. La mayor parte de estas hepatitis crónicas degenera en cirrosis hepática. Las partículas de HDV presentan en su superficie al antígeno HBsAg; por esta razón, los pacientes infectados por HDV desarrollan anticuerpos contra HBsAg, mismos que son indistinguibles de aquellos desarrollados por pacientes infectados únicamente por HBV. Estudios realizados en chimpancés (que son los únicos animales aparte del hombre susceptibles a la coinfección por HBV y HDV), sugieren que la vacunación con preparaciones a base de HDAg no protege de la infección por el agente delta y por el contrario, parece agravar el curso de esta infección.

P R E V E N C I Ó N Y T R A T A M I E N T O D E I N F E C C I O N E S V I R A L E S

L A S

LAS INFECCIONES virales en humanos, animales y plantas son causa de muerte, daño y pérdidas económicas. Las mejoras en el nivel de salud pública e higiene personal contribuyen en forma muy importante y efectiva a controlar la diseminación de las enfermedades infecciosas, incluyendo las causadas por virus. Sin embargo, las vacunas tienen un papel primordial en la prevención activa de las enfermedades virales en el hombre y en los animales. Las vacunas pueden ser infecciosas (hechas con virus activos) o no infecciosas (hechas con virus inactivados). El proceso de vacunación se basa en la idea de que se puede lograr inmunidad específica contra una enfermedad, en particular si se provoca ésta en condiciones controladas de manera que el individuo no padece los síntomas asociados con la enfermedad y el sistema inmune reacciona produciendo un arsenal de anticuerpos y células inmunes con capacidad para destruir o neutralizar cualquiera otra invasión por parte del mismo agente infeccioso. El procedimiento de atenuación permite obtener cepas de virus que tienen una reducida capacidad para producir enfermedad; estas cepas se denominan avirulentas, en contraste con las cepas virulentas capaces de producir enfermedad. Las cepas avirulentas son obtenidas por métodos empíricos como el pasar (propagar) un virus determinado en cultivos de células que provienen de una especie animal diferente a la del hospedero natural de ese virus en particular. También la multiplicación de un virus a temperaturas subfisiológicas o la coinfección de un mismo cultivo con cepas virulentas y avirulentas de un virus en particular contribuyen a la atenuación del virus. El uso de cepas emparentadas antigénicamente con una cepa virulenta, pero que provocan una enfermedad más leve en el hospedero, es una técnica conocida desde el tiempo de Edward Jenner, quien en 1798 utilizó preparaciones de virus de la viruela vacuna para inmunizar humanos contra la viruela. Actualmente, se utiliza un virus de la vacuna, descendiente del virus de la viruela vacuna, para "vacunar" contra la viruela. De hecho, vacuna se ha convertido en sinónimo de cualquier substancia inmunogénica utilizada en la prevención de enfermedades infecciosas. Las vacunas preparadas a partir de virus muertos o inactivos deben carecer de infectividad y, sin embargo, ser suficientemente inmunogénicas para provocar inmunidad protectora. Los agentes inactivantes utilizados para matar al virus deben ser capaces de actuar sobre el ácido nucleico viral. El formaldehído y la β propiolactona son dos de los agentes más usados para inactivar preparaciones virales. El formaldehído produce entrecruzamientos entre las proteínas virales y también afecta a los grupos amino presentes en los nucleótidos. La β -propiolactona inactiva a los virus por medio de la alkilación de las proteínas y ácidos nucleicos virales. Un problema fundamental asociado con la preparación de una vacuna muerta consiste en que se debe garantizar la completa inactivación de todas las partículas virales presentes en una dosis de la vacuna. Cuando se preparan grandes lotes de vacuna se observa que una pequeña fracción de la población viral es inactivada con mayor lentitud debido a que algunas partículas virales forman agregados y cúmulos en los cuales se dificulta el acceso al agente inactivante. Esto implica que debe incrementarse el tiempo de

incubación en presencia del agente inactivante; esta situación tiene el inconveniente de que puede propiciar la pérdida de la capacidad inmunogénica de las partículas virales inactivadas. El principal problema de las vacunas preparadas con virus atenuados consiste en garantizar la estabilidad genética de la cepa avirulenta, de manera que no revierta en forma espontánea o accidental al estado virulento. Esta reversión al estado virulento puede ocurrir por causa de eventos de recombinacion genética espontánea entre el virus presente en la vacuna y algún otro tipo de virus que pueda estar presente en forma natural en el individuo vacunado. Las vacunas deben producir imnunidad suficiente y permanente, pues de lo contrario el virus invasor puede ser capaz de multiplicarse. Esto último ocurre en el caso de vacunas, como la vacuna contra la fiebre aftosa del ganado, la cual sólo confiere inminidad parcial y por lo tanto actúa como una presión selectiva que favorece la propagación de virus mutantes poseedores de nuevos variantes antigénicos no reconocidos por los anticuerpos inducidos por la vacuna. Con el paso del tiempo, la cepa de virus resistentes substituye a los otras cepas del virus y entonces se hace necesario desarrollar una nueva vacuna específica contra esta nueva cepa resistente a la vacuna anterior. Las vacunas pueden ser administradas por vía oral, vía parenteral (inyectadas) o por simple escarificación de la piel con una aguja. La vía de administración depende del tipo de preparación y de la estabilidad física de la misma. Cuando se prepara una nueva vacuna, además de los factores biológicos que determinan la elección entre una preparación muerta o una preparación atenuada, deben considerarse factores socioeconómicos relacionados con el costo, estabilidad a largo plazo de los lotes de vacuna, facilidad en el modo de administrarse de la vacuna y el número de dosis a ser administradas. También debe considerarse el efecto psicológico asociado con las incomodidades y reacciones secundarias (como fiebre, erupciones en la piel, etc.) derivadas de la administración de la vacuna. El surgimiento de la teconología del ADN recombinante o ingeniería genética abre las puertas a la posibilidad de desarrollar vacunas efectivas preparadas a partir de los componentes virales causantes de inducir la respuesta inmune, pero sin los inconvenientes asociados con la presencia de virus íntegros, ya sea que estén inactivados o atenuados. A diferencia de lo que sucede con las infecciones bacterianas, la quimioterapia de las infecciones virales.todavía se encuentra en etapas primitivas. La multiplicación de los virus está estrechamente ligada al metabolismo de la célula hospedera debido a que el virus por lo general utiliza la propia maquinaria celular para su replicación. Por lo tanto, resulta difícil encontrar fármacos y compuestos químicos capaces de afectar las funciones virales sin afectar a la célula hospedera. Sustancias químicas con actividad antiviral han sido utilizadas con éxito en el tratamiento de infecciones causadas por virus ADN que afectan la conjuntiva y la córnea del ojo. Estos agentes son pirimidinas halogenadas que son incorporadas en el ADN viral e impiden la transcripción y replicación del mismo. Debido a que estos compuestos pueden ser incorporados también en el ADN celular, su uso está limitado a las infecciones que afectan regiones

pobremente vascularizadas y con baja actividad metabólica como la superficie del ojo. Por ejemplo, soluciones a 0.1% de 5'iodo-2'-desoxiuridina, un análogo de la timidina, producen mejoría en un 72% de los casos de infecciones oculares causadas por Herpes simplex tipo 1 y adenovirus. En casos extremos como la rara encefalitis viral causada por HSV-1 o por el virus de la vacuna, se pueden utilizar análogos de la citidina (citosina arabinosido) o de la adenosina (adenina arabinosido) con probabilidades de éxito terapéutico. Estas sustancias son extremadamente tóxicas y sólo deben usarse en circunstancias cuando la otra alternativa es la rápida muerte del paciente. La amantadina es un compuesto que se ha utilizado con éxito en la profilaxis y tratamiento de la influenza viral. Durante una epidemia de influenza el número de casos en la población sujeta al tratamiento profiláctico fue equivalente a 21% de los casos presentes en la población no tratada con amantadina. El ribavirin es un compuesto capaz de inhibir la enzima ARN polimerasa del virus de la influenza y también interfiere con el mecanismo de iniciación de la transcripción del ARN viral. De hecho, el ribavirin manifiesta acción antiviral contra un amplio espectro de virus tanto de ADN como de ARN, pero esta acción sólo es efectiva en condiciones de laboratorio, por lo cual el ribavirin en aerosol ha sido aprobado solamente para el tratamiento de infecciones por virus sincitial respiratorio (RSV) en niños. El aciclovir es un compuesto que fue desarrollado en años recientes y que manifiesta una potente acción antiviral contra los virus Herpes simplex tipo 1 y 2. Esta acción selectiva se debe a que el aciclovir es un excelente sustrato para ser fosforilado por la enzima timidina cinasa de estos virus. El resultado de esta reacción de fosforilación es el monofosfato de aciclovir, el cual es a su vez fosforilado por las enzimas cinasas celulares para formar trifosfato de aciclovir; este compuesto tienen gran afinidad por la enzima ADN polimerasa de los virus Herpes simplex y, por lo tanto, actúa como inhibidor de esta enzima dando como resultado la inhibición de la síntesis de ADN viral. El aciclovir se utiliza en el tratamiento profiláctico del herpes genital y cutáneo, y también en el tratamiento de las lesiones causadas por el Herpes zoster. En pacientes que sufren de infecciones recurrentes por estos virus, el aciclovir disminuye la duración y magnitud de las recurrencias. Sin embargo, es relativamente frecuente el aislamiento de cepas de estos virus que son resistentes al aciclovir, hecho que limita la utilización masiva de este compuesto. El ganciclovir es un compuesto muy similar al aciclovir y tiene importante acción antiviral contra el citomegalovirus que también forma parte del grupo de los herpesvirus. El foscarnet es un potente inhibidor de las ADN polimerasas de los herpesvirus y se utiliza al igual que el ganciclovir, para el tratamiento de la retinitis ocular causada por citomegalovirus. En años recientes se han caracterizado o sintetizado diversos compuestos que manifiestan una acción antiviral contra el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV oVIH) en condiciones de laboratorio (in vitro). De estos compuestos solamente la azidotimidina (zidovudina o AZT) ha sido ampliamente utilizada en el tratamiento del SIDA. La azidotimidina es un potente inhibidor de la transcriptasa inversa (RT), enzima esencial para la replicación del HIV. Sin embargo, como se verá más adelante, el HIV es un retrovirus y, como tal, su genoma de ARN debe ser transcrito por la RT para convertirlo en una molécula de ADN que constituye el provirus, mismo que se integra

en el genoma de la célula hospedera en forma permanente. La expresión de la información contenida en el provirus permite la síntesis de nuevo ARN viral y de las proteínas virales codificadas por este. La azidotimidina no tiene ningún efecto sobre el provirus de HIV ya que sólo es capaz de inhibir la formación del provirus, pero no es capaz de inhibir la expresión del provirus en células que ya están infectadas en forma persistente. Por otra parte, el tratamiento prolongado con azidotimidina favorece la aparición de cepas mutantes de HIV que son resistentes a este compuesto. Desafortunadamente, la experiencia acumulada en los últimos años demuestra que la azidotimidina dista de ser un tratamiento efectivo contra el SIDA. El interferón tiene actividad antiviral universal y alta actividad específica; por lo tanto, constituye potencialmente el agente ideal para el tratamiento de las infecciones virales Sin embargo, la vida media del interferón administrado por vía parenteral es muy corta (alrededor de 3 horas) debido a que es una molécula inestable que es rápidamente degradada cuando esta fuera de las células. Esto impone la necesidad de utilizar dosis elevadas de interferón para obtener un efecto terapéutico. Quizá en un futuro cercano la metodología del ADN recombinante permitirá obtener cantidades industriales de interferón, además de modificar las características moleculares del mismo, de manera que se pueda utilizar el interferón para el tratamiento de las enfermedades virales.

V I R U S

D E

L A

I N M U N O D E F I C I E N C I A

H U M A N A

POSIBLEMENTE ningún otro virus ha recibido tanta atención por parte de los medios de comunicación y la opinión pública en general como el llamado virus de la inmunodeficiencia humana (VIH o HIV). La descripción, a principios de la década de los ochenta, de los primeros casos del llamado síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA), padecimiento que se caracteriza por una depresión progresiva de la inmunidad celular y que con frecuencia tiene un desenlace fatal, provocó un gran interés por establecer la causa o causas de esta enfermedad. El hecho de que los primeros casos de SIDA se presentaron en jóvenes homosexuales con un alto índice de promiscuidad sexual hizo sospechar que la enfermedad podía ser de carácter infeccioso y transmisible a través del contacto sexual. Poco tiempo después se estableció la presencia del SIDA en grupos de pacientes adictos a las drogas por vía intravenosa (como la heroína), y también en algunos pacientes que por diversas razones habían recibido transfusiones sanguíneas. Estos datos reforzaron la idea de que el SIDA era infeccioso y algunos autores sugirieron que podría ser causado por un virus desconocido. A principios de 1983, investigadores del Instituto Pasteur de París, encabezados por el doctor Luc Montagnier, reportaron el aislamiento de un nuevo tipo de retrovirus a partir de un ganglio linfático extirpado a un paciente con SIDA. Los investigadores franceses bautizaron como LAV (virus asociado a linfadenopatía) a este nuevo retrovirus. Los mismos investigadores proporcionaron una muestra de este retrovirus al grupo del doctor Robert Gallo en los Estados Unidos. El grupo estadounidense contaba con reactivos y tecnología para mantener células linfoides (linfocitos) en cultivo. Estas técnicas permitieron propagar al nuevo retrovirus en cultivos de

laboratorio. Sin embargo, los investigadores estadounidenses identificaron al LAV como perteneciente al mismo grupo que el HTLV-I, previamente descrito por el grupo de Gallo, y así, decidieron rebautizarlo como HTLV-III (virus linfotrópico humano tipo III). Esta situación fue el origen de muchas confusiones y de una prolongada disputa entre científicos y autoridades tanto francesas como estadounidenses para adjudicarse el descubrimiento de este retrovirus, al cual se le atribuyó la causalidad del SIDA con base en los resultados de estudios epidemiológicos realizados en diversas partes del mundo, y fue finalmente rebautizado como virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) o Human Immunodeficiency Virus (HIV). Dichos estudios epidemiológicos demuestran una correlación entre la infección por HIV y el subsecuente desarrollo del SIDA. Sin embargo, la epidemiología del SIDA también demuestra que existe un largo periodo de latencia que ha sido estimado entre 8 y 15 años, entre la infección primaria por HIV y el desarrollo del SIDA. Desde el punto de vista de su morfología y estructura genética básica, el HIV pertenece al grupo de los retrovirus que se caracterizan por tener un genoma constituido por ARN de cadena sencilla y se propagan por medio de un intermediario intracelular (el provirus) formado por una molécula de ADN de cadena doble que es sintetizada, por una enzima viral conocida como transcriptasa inversa, a partir de la molécula de ARN genómico viral. La organización de su genoma y su secuencia de nucleótidos indican que el HIV pertenece a la subfamilia de los lentivirus, que esta constituida por retrovirus que producen infecciones crónicas de evolución lenta en diversos animales, como son el virus de la anemia equina infecciosa, el virus de la artritis-endefalitis caprina, el virus visna-maedi que causa una enfermedad neurodegenerativa en los borregos y el virus de la inmunodeficiencia del simio (SIV), que puede causar en los macacos afectados un síndrome de inmunodeficiencia remotamente parecido al SIDA. La organización genómica de los lentivirus es mucho más compleja que la de los retrovirus clásicos, como lo muestra la figura XI.1. Además de los tres genes presentes en los retrovirus clásicos (genes denominados gag, pol y env, mismos que codifican a las proteínas de la cápside, a la transcriptasa inversa y funciones asociadas, y a las proteínas de la envoltura viral respectivamente), el genoma del HIV contiene varios genes pequeños que codifican proteínas que participan en forma importante en la regulación de la transcripción del genoma viral. En particular, los productos de los genes tat y rev tienen un papel muy importante como reguladores de la transcripción y el subsecuente procesamiento y transporte de las diferentes especies de ARN mensajero viral. La figura XI.2 muestra el ciclo replicativo del HIV. Es importante mencionar que la integración del provirus dentro del genoma de la célula hospedera es un paso indispensable para la replicación de la mayoría de los retrovirus. Este proceso de integración sólo es posible en células activas que pasan cuando menos un ciclo completo de división celular. Sin embargo, existe evidencia de que el HIV es capaz de replicarse y permanecer estable incluso en células inactivas que no han pasado por una división celular.

La figura XI.3 muestra la estructura del virión de HIV. Estos viriones tienen un diámetro de 100 a 120 nanómetros, son esféricos y poseen una envoltura constituida por restos de la membrana de la célula hospedera que han sido modificados por la inserción de dos tipos de proteínas virales: la gp120 que forma las púas del virión y la gp4l que queda incluida en la envoltura viral. En en el interior de la cápside viral se ubican dos copias del genoma viral, situación que es común en todos los retrovirus. Este genoma está formado por una molécula de ARN lineal de cadena sencilla que consta de 9400 nucleótidos. El genoma viral se asocia con varias copias de dos proteínas virales: p7 y p9, y la nucleocápside resultante es recubierta por varias copias de la proteína viral p24 para formar la verdadera cápside o centro viral.

FIGURA XI.1. Organización del genoma proviral en retrovirus simples y retrovirus complejos. El esquema muestra la organización del genoma proviral de un común retrovirus simple: el virus de la leucemia murina (MLV), que muestra los genes gag, pol y env, flanqueados por las terminaciones largas repetidas (LTR) que constituyen las secuencias promotoras de la expresión de los genes virales y a su vez permiten la integración del genoma proviral (provirus) en el genoma de la célula hospedera. Los genomas de dos lentivirus: el virus VisnaMaedi y el HIV-1 muestran la presencia de nuevos genes que codifican proteínas regulatorias que controlan el proceso de transcripción y replicación de estos retrovirus complejos. Las siglas PRO denotan la posición de la secuencia que codifica a la proteasa viral cuya función consiste en el procesamiento de las proteínas virales estructurales, mismo que es necesario para permitir el ensamble de nuevas partículas virales.

Figura XI.2. Replicación del HIV. a) la partícula viral se pega al receptor CD4 presente en la membrana de ciertos tipos de linfocitos y células inmunes. b) el virus penetra al interior de la célula y la envoltura viral, constituida por lípidos, es removida para permitir la fusión del virión con vacuolas citoplásmicas. c) en el corazón de la partícula viral ocurre el proceso de transcripción en reversa mediado por la enzima transcriptasa inversa (RT) viral. Este evento convierte al ARN viral original en una molécula de ADN viral que constituye el provirus. d) el provirus es introducido al núcleo celular y a continuación ocurre la integración del provirus al genoma celular. e) el provirus integrado es transcrito por la enzima celular ARN polimerasa II, los transcritos virales (ARN mensajeros) son exportados al citoplasma. f) la traducción de algunos ARN mensajeros virales conduce a la producción de proteínas virales regulatorias, mismas que estimulan la síntesis de las llamadas proteínas de maduración viral y de las proteínas estructurales del virión. g) la acumulación de proteínas estructurales en la membrana celular permite el ensamble de nuevas partículas virales. h) la maduración y brote de nuevas partículas virales ocurre entre 36 y 48 horas después del inicio de la infección.

Figura XI.3. Estructura del virión de HIV.(E) envoltura formada por una bicapa de lípidos derivada de la membrana de la célula hospedera. (gp120) glicoproteína mayor de superficie con peso molecular de 120 000 daltones. (gp120s) forma soluble de la gp120. (gp41) glicoproteína transmembranal con peso molecular de 41 000 daltones. (HLA) antígeno de histocompatibilidad derivado de la membrana de la célula hospedera. (NC) subunidades de la nucleocápside viral formada por la proteína viral con peso de 17 000 daltones. (RT) moléculas de la enzima transcriptasa inversa viral. (ARN + p24) ARN genómico viral rodeado de múltiples copias de la proteína mayor del centro viral que pesa 24 000 daltones. (ARN + p 7) ARN genómico viral cubierto por moléculas de la proteína menor del centro viral con peso de 7 000 daltones.

A pesar de ser un virus con envoltura, el HIV es bastante resistente a la acción de solventes orgánicos como el alcohol, éter y cloroformo. También es muy resistente a la inactivación por agentes antisépticos y desinfectantes como el benzal. Solamente algunos detergentes no iónicos como el TritonXl 00, el cloro activado y las temperaturas mayores a 60°C por varios minutos, son eficaces para inactivar al HIV La inusual resistencia del HIV a la inactivación por agentes fisicoquímicos es compensada por su baja infectividad, ya que el HIV infecta a sus células blanco con dificultad. Con base en diferencias en la secuencia de nucleótidos se ha establecido que existen dos tipos fundamentales de HIV: el HIV-1 que corresponde al tipo más común y que se encuentra distribuido en todo el mundo, y el HIV-2 que fue aislado de pacientes que habitan en países centroafricanos. Hasta la fecha, la infección por HIV-2 sigue limitada a los países del África Central y es muy raro encontrarlo en otras partes del mundo. Sin embargo, la enzima transcriptasa inversa encargada de copiar el genoma viral, es una enzima que comete muchos errores de modo que introduce nucleótidos equivocados durante el proceso de copiado del genoma viral. La gran frecuencia con la

que ocurren estas mutaciones (alrededor de 1 error por cada 1000 nucleótidos copiados), implica que existe una gran inestabilidad en la secuencia del genoma viral, de manera que a partir de un mismo paciente infectado con HIV se pueden aislar, en diferentes periodos de tiempo, cepas virales que han diferido entre sí debido a los cambios en la secuencia de nucleótidos del genoma viral. Esta gran viariabilidad del genoma del RIV se interpreta como una evidencia de que este virus está en proceso de lograr una adaptación evolutiva para establecer un equilibrio con su hospedero natural que en este caso, parece ser el hombre. Ha sido posible identificar la presencia del HIV en muestras congeladas de sangre o suero sanguíneo, procedentes de pacientes que fallecieron durante los años cincuenta. Pero todo parece indicar que el HIV constituye una especie viral muy reciente. La evidencia disponible indica que el HIV sólo puede infectar en forma productiva y persistente al hombre y al chimpancé, y solamente se replica en cultivos de células humanas o de chimpancé, en particular de linfocitos. Sin embargo, chimpancés que han sido infectados con grandes dosis de HIV desde 1983, no han desarrollado ninguna enfermedad que sugiera inmunodeficiencia adquirida. Es un hecho que el HIV tiene predilección por infectar células que poseen el receptor CD4 en sus membranas, como son los linfocitos T auxiliares, los monocitos y los macrófagos. Sin embargo, se sabe que otros tipos de células que no son CD4+ también son infectables por HIV, pero todo indica que estas células no sufren efectos adversos como consecuencia de dicha infección. Las principales vías de contagio por este virus son la sangre (y productos derivados de la sangre) y el contacto sexual. La eficacia del contagio por vía sanguínea depende de varios factores como son el número de partículas virales presentes en la sangre contaminada, el volumen de sangre aplicado y el estado inmunológico del individuo receptor. Hoy en día, la transmisión por vía sexual es la principal forma de contagio por HIV. Desafortunadamente, es frecuente la transmisión del HIV de la madre al producto, durante el embarazo o durante el periodo inmediato al nacimiento. La evidencia de contagio por HIV se establece por medio de una prueba de ELISA específica (ELISA significa en inglés: enzyme linked inmuno sorbent assay), esta prueba permite detectar en el suero sanguíneo la presencia de anticuerpos específicos contra la proteína gp l2O del HIV. Un resultado positivo (seropositivo) se interpreta como evidencia de que la persona ha estado en contacto con el HIV. Es una gran paradoja que la seropositividad anti-HIV sea interpretada como factor de riesgo para la transmisión del propio HIV, ya que la presencia de anticuerpos anti-HIV en el suero de los pacientes seropositivos no parece protegerlos de desarrollar, tarde o temprano, el SIDA. Esto contrasta con lo que ocurre en el caso de otros virus, ya que la seropositividad antipolio, anti-viruela o anti-HBV es interpretada como evidencia de vacunación o inmunidad específica contra estos virus. De hecho, las personas seropositivas a la polio, viruela o HBV están protegidas contra la infección o reinfección por estos virus y, a su vez, son incapaces de transmitirlos a otras personas. Sin embargo, en el caso de las personas anti-HIV seropositivas se infiere que el virus está presente y potencialmente activo, cuando menos como provirus, en el interior de las células linfoides infectadas. Por esta razón, la opinión médica dominante considera a las personas anti-HIV seropositivas como transmisores potenciales de la infección por

HIV, y esto a pesar de que en muchas personas anti-HIV seropositivas se puede demostrar la presencia de anticuerpos capaces de neutralizar al HIV en pruebas de laboratorio. Así, tomando en cuenta las graves repercusiones que puede tener el diagnóstico de seropositividad anti-HIV, toda prueba de ELISA positiva para HIV, debe ser confirmada por medio de una prueba mucho más sensible y exacta que se conoce como Western Blot, ya que el ELISA puede dar falsas reacciones positivas. La prueba del Western Blot permite demostrar la existencia de anticuerpos específicos contra todas y cada una de las proteínas estructurales del HIV. El Western Blot positivo confirma la infección por HIV. EL HIV Y EL SIDA Las características clínicas del SIDA indican una profunda alteración de los mecanismos de la inmunidad celular, por lo cual desde un principio se llegó a sospechar que el HIV tenía como blanco a un órgano o tipo de célula fundamental para la respuesta inmune celular. A fines de 1983, investigadores de Francia e Inglaterra demostraron que el HIV tiene una gran predilección por infectar linfocitos T auxiliares (o linfocitos CD4+), los cuales se caracterizan por tener un receptor membranal denominado molécula CD4. Este receptor reconoce una clase de proteínas conocidas como moléculas clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC-clase II), las cuales están presentes en las membranas de los linfocitos B, los macrófagos y de los linfocitos T activados. La interacción entre el receptor CD4 y la molécula MHC-clase II es un cofactor en el proceso de reconocimiento de antígenos específicos por parte de los linfocitos T auxiliares. Dichos linfocitos CD4+ juegan un papel central como coordinadores y estimuladores de otras células y actividades que participan en la respuesta inmune de tipo específico. Los mismos grupos de investigadores europeos demostraron que la molécula CD4 es el receptor de alta afinidad para el HIV, mismo que se fija a los linfocitos T auxiliares por medio de la interacción entre la glicoproteína viral 120 (gp 120), presente en la superficie de la envoltura del virus, y el receptor CD4. Por otra parte, estudios inmunológicos establecieron que en pacientes con SIDA avanzado existe una importante disminución en el número de linfocitos CD4+. Las primeras observaciones sobre la replicación y el comportamiento del HIV en cultivos celulares enriquecidos en linfocitos CD4+, sugirieron que el virus es citopático para este tipo de células. Las observaciones anteriores fueron conjuntadas para establecer un modelo explicativo de la patogénesis del SIDA. Dicho modelo propone que el SIDA es consecuencia de la destrucción progresiva de linfocitos auxiliares CD4+ debida a la acción citopática del HIV y por esta razón, los pacientes con SIDA terminan sucumbiendo a infecciones oportunistas o a cierto tipo de tumores malignos que son consecuencia o manifestación de la disminución de la inmunidad celular, provocada por la pérdida de células CD4+. Un corolario que deriva de este modelo es que el SIDA es potencialmente curable mediante la acción de antivirales capaces de inhibir la replicación del HIV. Sin embargo, múltiples observaciones acumuladas durante la última década sugieren que el modelo arriba mencionado dista de ser correcto, como lo demuestran las siguientes observaciones: 1) el número de linfocitos CD4+ que manifiestan infección productiva por HIV es muy reducido, siendo alrededor de 1/10 000 en la sangre

periférica y 1/1000 en los ganglios linfáticos, este nivel de infección activa es mucho menor que la capacidad del sistema inmune pra reponer a las células perdidas como consecuencia de la infección. 2) en pacientes infectados por HIV que se encuentran en la llamada fase asintomática, la cual puede durar varios años, es posible detectar importantes alteraciones en los mecanismos de inmunidad celular aun cuando sus valores de linfocitos CD4+ circulantes se encuentran dentro de lo normal. 3) varias parasitosis profundas y otras infecciones virales provocan una importante disminución en la población de linfocitos CD4+, sin embargo, no producen una sintomatología similar al SIDA. 4) Nadie ha podido demostrar el efecto citopático del HIV in vivo. Por otra parte, diversas cepas de HIV aisladas a partir de pacientes con SIDA terminal no son citopáticas in vitro. 5) Es relativamente fácil aislar el HIV a partir de los linfocitos periféricos de pacientes recién infectados con HIV, los cuales sufren una enfermedad benigna parecida a la gripe o a la mononucleosis infecciosa, misma que desaparece en pocas semanas. Sin embargo, es muy difícil aislar el virus a partir de linfocitos periféricos de pacientes en fase asintomática y sólo en algunos pacientes con SIDA terminal se puede volver a aislar el virus con facilidad. Estas observaciones sugieren que la replicación del HIV en los linfocitos periféricos está muy reducida durante la larga fase asintomática. 6) agentes antivirales como la azidotimidina también conocida como zidovudina o AZT, inhiben en forma importante la replicación del HIV; sin embargo, no han servido para detener la caída de los linfocitos CD4+ ni el desarrollo del SIDA en pacientes asintomáticos tratados con estos compuestos por largo tiempo. 7) Son cada vez más frecuentes los reportes de personas que han estado infectadas con HIV por más de diez años y que sin embargo, se encuentran en buena salud a pesar de no haber seguido ningún tipo de tratamiento específico. La falta de correlación entre los marcadores clásicos de actividad viral (como son la concentración de partículas virales infecciosas y los niveles de antígenos [proteínas] virales en el suero sanguíneo) y las manifestaciones clínicas del SIDA, ha motivado a los investigadores a establecer otros parámetros que les permitan evaluar la actividad de la infección por HIV durante el desarrollo del SIDA. El HIV es un retrovirus y como tal, en forma de provirus debe integrarse al genoma de la célula hospedera para poder replicarse y, eventualmente, producir nuevas moléculas de ARN y proteínas virales que sirvan para ensamblar nuevos vinones infectantes. Sin embargo, la mayor parte de los retrovirus clásicos tienden a permanecer como provirus silenciosos dentro del genoma de sus células hospederas y sólo muy de vez en cuando expresan su información genética con el fin de producir nuevos componentes virales. De hecho, los retrovirus prefieren propagarse en forma vertical o sea, cada vez que se replica el genoma de la célula hospedera también es replicado el provirus integrado a dicho genoma, de manera que las dos células hijas que resultan del proceso de división celular contienen una copia del provirus retroviral integrado en sus respectivos genomas. Esta estrategia equivale a una propagación pasiva del genoma viral. Por lo tanto, una importan te cuestión consiste en establecer si el HIV se propaga principalmente como un retrovirus clásico o si por el contrario, se propaga en forma horizontal y activa: por medio de la producción de viriones infectantes capaces de salir al medio externo para infectar nuevas células blanco. Así, técnicas moleculares como la llamada hibridación de ácidos nucléicos in situ y la amplificación de secuencias genómicas específicas por medio de la reacción de

polimerasa en cadena (PCR), permiten detectar la presencia de ARN viral y del provirus integrado en el genoma de la célula hospedera. Estas técnicas son muy sensibles y han permitido crear un nuevo parámetro virológico que se conoce como "carga viral", que corresponde al porcentaje de células blanco (células hospederas) que contienen información viral (como provirus o como ARN viral), pero sin importar si dicha información viral está siendo utilizada para producir nuevas partículas virales infectantes o solamente corresponde a una infección latente en la cual no se expresa la información viral presente en la célula hospedera. Al parecer, en el caso de la infección por HIV, la carga viral se va incrementando gradualmente durante el curso de los años desde la infección inicial hasta la aparición del SIDA. Por otra parte, se ha podido establecer que dicha carga viral aumenta preferentemente en las células T auxiliares (CD4+) ubicadas en los tejidos linfoides como son: los ganglios linfáticos, el bazo y el tejido linfoide presente en la pared intestinal. También los macrófagos ubicados en estos tejidos muestran un aumento en la carga viral por HIV. Sin embargo, en los linfocitos CD4+ de la sangre periférica la carga viral por HIV es muy reducida ya que sólo en 1 de cada 10 000 linfocitos CD4+ es demostrable la presencia del provirus y de esta pequeña fracción de células infectadas sólo el 1% manifiesta una infección activa y la consecuente producción de nuevas partículas virales. Estos datos constituyen una gran paradoja, ya que resulta difícil explicar la gradual disminución de la población de linfocitos CD4+ como consecuencia de la infección activa por RW, puesto que el número de células que muestran infección activa es muy reducido y sobre todo, mucho menor que la capacidad del sistema inmune para reponer las células que pudieran haber sido destruidas como consecuencia de la infección por HIV. Al momento de escribir estas notas (febrero de 1995), acaban de ser publicados los resultados de dos estudios que pretenden haber resuelto la paradoja arriba mencionada. Según estos estudios, consignados en la bibliografía al final de este libro, el número de linfocitos CD4+ que son destruidos y repuestos diariamente como consecuencia de la infección por HIV, es de alrededor de 10 (mil millones de células), este número es muy similiar a la carga viral promedio (número total de linfocitos y otras células linfoides en los cuales se puede detectar provirus o ARN viral, independientemente de que el provirus este activo o no). Los resultados de estos estudios sugieren que durante el largo curso de la infección por HIV que finalmente desemboca en el SIDA, se encuentra sobreestimulada la capacidad del sistema inmune para reponer a sus células perdidas o dañadas y que esta sobreestimulación, equivalente a 50 veces el promedio de recambio de células inmunes observado en individuos normales, es consecuencia de una continua destrucción de linfocitos CD4+ que tiene lugar, posiblemente, en los tejidos linfoides. Estas investigaciones sugieren que el SIDA es consecuencia del eventual agotamiento del sistema inmune que en un momento determinado ya no puede reponer el número de células que son diariamente destruidas por la infección viral. Para llegar a estas conclusiones fue necesario correlacionar datos de laboratorio y resultados de varios protocolos de tratamiento con antivirales experimentales en grupos de pacientes con SIDA; dichas correlaciones se establecieron por medio de métodos matemáticos que para ser utilizados requieren de una serie de suposiciones y simplificaciones respecto al comportamiento dinámico de las poblaciones virales y celulares que interactúan.
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Puede ser que los resultados arriba mencionados sean una importante contribución para comprender la dinámica de la infección por HIV. Sin embargo, existen numerosas observaciones que hacen dudar que el HIV sea un virus citopático in vivo. Además, persiste la cuestión de por qué los chimpancés, que son la especie más cercana al hombre, pueden ser infectados en forma crónica y productiva por el HIV y, sin embargo, no desarrollan el SIDA. Si el HIV es verdaderamente citopático, resulta difícil explicar la resistencia de los chimpancés a la enfermedad, a menos que el sistema inmune del chimpancé tenga una capacidad de regeneración muy superior a la del hombre, lo cual es poco probable. La evidencia disponible sugiere que el HIV dista de ser un virus que causa enfermedad por un mecanismo directamente citopático, como es el caso de los virus de la influenza o del Herpes simplex. Por lo tanto, las alteraciones en las funciones de los linfocitos CD4+, y la subsecuente disminución de los mismos deben ser provocadas por mecanismos que involucran al HIV de manera indirecta. INMUNOPATOLOGÍA DEL SIDA La inmunopatología es una disciplina que estudia la participación del sistema inmune en el desarrollo de diversas enfermedades; en algunos casos el sistema inmune pueder ser una de las causas de la enfermedad, en otros casos el sistema inmune pueder ser una víctima de la enfermedad y en otros más, el sistema inmune puede ser tanto causante como víctima de la enfermedad. Avances recientes en el conocimiento de la inmunopatología del SIDA, sugieren que el HIV puede ser una causa necesaria pero tal vez no suficiente para provocar el SIDA y, por lo tanto, se necesita de la acción de cofactores que también participan en el mecanismo o mecanismos que conducen a desarrollar el SIDA. Como ya fue mencionado, la infección primaria por HIV puede ser asintomática o manifestarse como un síndrome gripal de resolución rápida. Posteriormente hay un largo periodo de latencia que dura varios años y que es asintomático, hasta que aparecen las primeras manifestaciones clínicas del SIDA que se presenta como una inflamación de varios grupos de ganglios linfáticos (linfadenopatía), acompañada de la pérdida de peso, diarrea persistente y posteriormente, se presentan una o varias infecciones oportunistas (causadas por microorganismos que tienen un bajo potencial patogénico) o la reactivación de antiguas infecciones latentes como la tuberculosis o el herpes. En algunos casos se desarrollan tumores malignos como el sarcoma de Kaposi o ciertos linfomas, y manifestaciones neurodegenerativas que terminan en la demencia. Cualquiera de los procesos anteriores puede ser la causa del fallecimiento. Sin embargo, desde que se describieron los primeros casos de SIDA, varios autores notaron una importante similitud entre las manifestaciones clínicas del SIDA y aquellas propias de ciertas enfermedades conocidas como enfermedades autoinmunes, las cuales se caracterizan porque el sistema inmune reconoce como extrañas a células y moléculas del propio organismo, por lo cual las ataca y produce enfermedad. En particular, existe un padecimiento de tipo autoinmune conocido como enfermedad del injerto contra el hospedero, cuyas manifestaciones clínicas son muy similares al SIDA;

esta enfermedad es producida por células inmunocompetentes (linfocitos, macrófagos, etc.) que normalmente están presentes en el material o tejido transplantado. La enfermedad del injerto contra el hospedero puede ocurrir como consecuencia de la infusión de cualquier derivado de la sangre que pueda contener linfocitos viables, como es el caso en las transfusiones de sangre entre la madre y el feto, las transfusiones de sangre total con fines terapéuticos, las transfusiones de plasma sanguíneo o de paquetes de células sanguíneas. También se puede presentar esta enfermedad como consecuencia del transplante de timo o de hígado fetal y en los transplantes de médula ósea. Cierto tipo de enfermedades como la anemia aplástica, las leucemias agudas, la inmunodeficiencia combinada congénita y las anemias resultantes de la exposición a radiaciones ionizantes o debidas al uso de agentes quimioterápicos en el tratamiento del cáncer; pueden ser tratadas por medio de transplantes de médula ósea, que es el tejido a partir del cual se originan las células sanguíneas que incluyen a los glóbulos rojos y los glóbulos blancos, entre los cuales se encuentran los linfocitos B. Para hacer un transplante de médula ósea primero se establece que el donador y el receptor del transplante son compatibles a nivel de sus antígenos de histocompatibilidad, esto evita que el tejido transplantado sea eventualmente reconocido como extraño y por lo tanto, rechazado por el sistema inmune del receptor. Sin embargo, en la médula ósea del donador existen células inmunocompetentes capaces de reconocer como extraños a los tejidos del receptor. A veces no es posible eliminar las células inmunocompetentes presentes en el tejido a ser transplantado y esto da como resultado que las células inmunes del tejido transplantado empiezan a reconocer como extrañas a las células y moléculas del organismo receptor del transplante. Dichas células inmunocompetentes se activan y atacan a los tejidos del receptor, provocando la enfermedad del injerto contra el hospedero, misma que puede ir desde una simple urticaria hasta una severa inmunodeficiencia, debida al ataque de las células inmunocompetentes del injerto sobre los tejidos linfoides del individuo receptor del transplante, y que se asocia con el desarrollo de infecciones oportunistas y lesiones en la piel, el hígado y el aparato digestivo. En la actualidad se sabe que la proteína gpl20 del HIV tiene similitudes estructurales con un tipo de proteínas humanas conocidas como moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad clase II (MHC-clase II). Dichas moléculas están presentes en la superficie de los linfocitos B, de los macrófagos y de los linfocitos T activados, y participan en la presentación de antígenos foráneos para que estos puedan ser reconocidos por el sistema inmune como extraños. La similitud entre gp 120 y MHCclase II puede ser el origen de una grave confusión en la respuesta inmune, ya que anticuerpos y células T citotóxicas capaces de reconocer la presencia de gp l20 en la superficie de células infectadas por HIV, son también capaces de reconocer a las MHCclase II presentes en la superficie de células inmunocompetentes normales, esto puede provocar que los componentes de la respuesta inmune dirigida contra HIV se comporten también como atacantes de las células normales que presentan MHC-clase II. Esto puede resultar en la destrucción de varios tipos de células inmunocompetentes entre las cuales se encuentran los linfocitos CD4+ activados que expresan la MHCclase II en sus membranas.

La activación de los linfocitos T es condición necesaria para que expresen la molécula MHC-clase II en sus membranas. Por lo tanto, existe la posibilidad de que dicha activación dé como resultado que algunas poblaciones de linfocitos T activados se vuelvan blanco potencial de la respuesta inmune dirigida contra el HIV. Si tal es el caso, entonces deben existir mecanismos dirigidos a evitar la activación de estas células de manera que no puedan expresar la molécula MHC-clase II en sus membranas. Durante los últimos años se han acumulado observaciones que demuestran la presencia de abundantes linfocitos T supresores en pacientes infectados por HIV. Se ha sugerido que la función de estos linfocitos supresores consiste en evitar la activación de los linfocitos CD4+ para evitar que puedan ser blanco de un ataque por parte de la respuesta inmune contra HIV. Sin embargo, la supresión de la activación vuelve anérgicos a los linfocitos T auxiliares (CD4+), o sea, que no reaccionan ante agentes activadores como son los antígenos derivados de otros microorganismos patógenos. El resutado del estado anérgico es que los linfocitos auxiliares no pueden actuar como coordinadores y estimuladores de la respuesta inmune celular y por lo tanto, la persona afectada manifiesta importantes alteraciones en sus funciones inmunitarias a pesar de que todavía no se presenta una franca disminución en la población de linfocitos CD4+ auxiliares. Los linfocitos T citotóxicos y los linfocitos T supresores se caracterizan por presentar en sus membranas un receptor conocido como CD8. Por otra parte, en personas normales la concentración de linfocitos CD4+ es de alrededor de 1 000 por milímetro cúbico de sangre. En la sangre de individuos normales la relación entre células CD4+ y CD8+ es de 2:1. Sin embargo, en los pacientes infectados por HIV esta relación está invertida con mucha frecuencia (CD4+/CD8+ 1:2) y este fenómeno ocurre mucho antes de la disminución de la población de linfocitos CD4+, misma que se observa en las etapas terminales del SIDA (en las cuales la población de linfocitos CD4+ es menor a 200 por milímetro cúbico). De hecho, la inversión del índice CD4+/CD8+ parece deberse a una proliferación excesiva de los linfocitos CD8+. En las etapas terminales del SIDA todas las poblaciones linfocitarias disminuyen en número; sin embargo, la proporción relativa CD4+/CD8+ permanece alterada, siendo estas últimas células las más numerosas en términos relativos. Como ya fue mencionado, pacientes infectados con HIV que están en fase asintomática muestran ya importantes alteraciones en las funciones de los linfocitos CD4+, y se sabe que grupos de estos linfocitos se encuentran en estado anérgico o sea, no reaccionan ante estímulos que normalmente activan a estos linfocitos. Dicho estado de anergía puede ser cancelado o reducido si se procede a separar a los linfocitos CD4+ de los linfocitos CD8+. Los linfocitos CD4+ purificados muestran una mejoría en sus reacciones cuando son ensayados in vitro, en ausencia de linfocitos CD8+. Esto sugiere que en pacientes infectados por HIV existe un estado inmunosupresor que bloquea la activación de los linfocitos CD4+. Diversas observaciones sugieren que los pacientes infectados por HIV que presentan un aumento temprano y excesivo en sus poblaciones de linfocitos CD8+, son candidatos a desarrollar el SIDA con mayor rapidez. Los límites del presente libro no permiten continuar detallando otras importantes observaciones e hipótesis referentes a la inmunopatología del SIDA, tópico que está recibiendo cada vez mayor atención por parte de los investigadores. Todavía no se pueden hacer conclusiones definitivas acerca de los mecanismos causales del SIDA, y debemos estar preparados para futuras sorpresas al respecto. Existe una gran

urgencia por conocer dichos mecanismos con el fin de lograr tratamientos eficaces para este padecimiento. Sin embargo, a pesar de la intensa investigación sobre este tema, todavía carecemos de respuestas verdaderas; pero un sano principio de la ciencia consiste en reconocer nuestras dudas, pues a partir de estas se puede llegar a comprender y aprender; mientras que la falsa sabiduría y las respuestas mal fundamentadas conducen a la confusión y al retraso del conocimiento. PREVENCIÓN Y TRATAMIENTO DEL SIDA Hasta el momento, los tratamientos con antivirales específicos como la azidotimidina (zidovudina) han dado pobres resultados en el tratamiento del SIDA y sólo se han logrado progresos en el manejo de las complicaciones clínicas del SIDA, utilizando medicamentos que disminuyen los síntomas y molestias asociadas con esas complicaciones. Existe una amplia variedad de agentes antivirales que están siendo evaluados respecto a su acción contra el HIV. Desafortunadamente, la mayoría de los antivirales probados hasta la fecha, inducen con rapidez la aparición de mutantes de HIV resistentes a dichos antivirales. En cuanto al desarrollo de posibles vacunas específicas contra el HIV, cabe mencionar que la mayoría de los proyectos para el desarrollo de estas vacunas fueron iniciados con base en una apreciación incorrecta y apresurada de los mecanismos causales del SIDA. Hasta la fecha, la mayoría de dichas vacunas experimentales se dirige a estimular la producción de anticuerpos específicos contra componentes del HIV, por medio de la inoculación en animales (o de personas voluntarias) de proteínas o fragmentos de proteínas virales que actúen como antígenos que estimulen al sistema inmune para producir anticuerpos específicos contra estos componentes virales. Dichos anticuerpos podrían actuar neutralizando al virus, evitando así que este pueda infectar a las células del organismo vacunado. Un importante obstáculo para el desarrollo de vacunas contra el HIV es que no se conoce ninguna especie animal que desarrolle SIDA como consecuencia de la infección por HIV; por lo tanto, no existe ningún modelo animal para probar directamente la capacidad protectora de dichas vacunas. Por esta razón se ha recurrido a métodos indirectos que permiten establecer la presencia de una respuesta inmune contra el HIV en chimpancés vacunados y también se ha recurrido a un sistema paralelo que consiste en desarrollar vacunas experimentales contra el llamado síndrome de inmunodeficiencia adquirida del simio, supuestamente causado por un virus parecido al HIV (SIV), con la esperanza de que los datos obtenidos en el modelo animal puedan orientar hacia el desarrollo de una vacuna efectiva en el humano. Desafortunadamente, estos modelos de vacunación parecen no tomar en cuenta dos hechos fundamentales: la mayoría de los pacientes que desarrollan el SIDA tienen anticuerpos neutralizantes específicos contra el HIV y sin embargo no son protegidos contra la enfermedad. Por otra parte, existen importantes evidencias de que el principal modo de transmisión del HIV de un individuo infectado a un individuo receptor no es por medio de los viriones libres en el suero sanguíneo del transmisor, sino por la introducción de células infectadas en el interior del organismo receptor y el subsecuente contacto directo entre células infectadas y células no infectadas. En estas circunstancias, los anticuerpos neutralizantes no pueden actuar; ya que las partículas

virales potencialmente infectantes no están libres sino protegidas en el interior de la célula infectada. El posible desarrollo de una vacuna efectiva contra el HIV depende de un cambio radical en la manera como se entiende el concepto de vacuna, ya que las vacunas antivirales clásicas (como la de la viruela o la de la poliomielitis) están dirigidas a estimular la inmuniad humoral específica (inmunidad por anticuerpos) y hasta la fecha no ha sido desarrollada una vacuna efectiva contra ninguno de los virus cuyo control depende directamente de la inmunidad celular específica (aquélla mediada primordialmente por linfocitos T citotóxicos que atacan a las células infectadas por estos agentes). En vista de lo anterior, las mejores medidas para reducir el riesgo de infección por HIV son: verificar que la sangre y derivados de sangre utilizados con fines médicos (para transfusiones, etc.) se encuentren libres de contaminación por HIV; evitar el uso de drogas intravenosas y otros procedimientos que impliquen el intercambio de materiales e instrumentos potencialmente contaminados con sangre o células infectadas; evitar la promiscuidad sexual y utilizar condones durante el acto sexual.

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LOS VIRUS sufren cambios evolutivos al igual que los seres vivos. Los genomas virales están sujetos a la mutación con la misma frecuencia común a todos los ácidos nucleicos, y cuando las condiciones favorecen a un mutante en particular, éste es seleccionado, dando origen a una nueva cepa que paulatinamente substituye a la anterior. Hoy día existen dos opiniones predominantes en relación con el origen de los virus. La primera opinión considera que los virus se originaron a partir de células degeneradas que perdieron la capacidad para hacer vida libre. De acuerdo con la segunda opinión, los virus se originaron a partir de fragmentos de ácido nucleico celular que escaparon de la célula original. La biología molecular de los fagos y bacterias difiere en forma considerable de la de los virus de eucariotes y sus respectivas células hospederas, al grado de que no es posible propagar bacteriófagos en células eucarióticas o virus animales en bacterias. Esto sugiere que los fagos y los virus de eucariotes se originaron en forma independiente. Los virus están exitosamente diseminados en los reinos animal y vegetal, al grado de que ningún grupo de organismos conocidos hasta la fecha se encuentra libre de ser infectado por virus. La evolución exitosa de cualquier parásito requiere de la supervivencia de la especie hospedera. Un ejemplo interesante de esto lo constituye la evolución del virus del sarampión, el cual sólo infecta al ser humano y la infección generalmente resulta en la adquisición de inmunidad permanente por parte del individuo infectado. Se ha estudiado la frecuencia de la incidencia de sarampión entre los habitantes de diversas islas y se ha encontrado una buena correlación entre el tamaño de la población y el número de casos de sarampión registrados en cada isla a lo largo del

año. Se requiere una población de cuando menos 500 000 individuos para proporcionar suficientes individuos susceptibles (recién nacidos) capaces de mantener la prevalencia del virus en la población. En poblaciones menos numerosas el virus tiende a desaparecer, a menos de que sea reintroducido desde el exterior. Desde el punto de vista geológico, el hombre es una especie muy reciente y solamente ha existido en poblaciones numerosas durante los últimos 8 000 o 10 000 años. Por lo tanto, se sospecha que el virus del sarampión no existía en su forma actual en épocas cuando los núcleos de población humana eran todavía muy pequeños. Basándose en la similitud antigénica entre el virus del sarampión y aquellos del moquillo canino y la ictericia febril del ganado, F. L. Black ha postulado que estos tres virus provienen de un antepasado común, el cual infectaba por igual a humanos, perros y ganado en épocas prehistóricas. El virus ancestral evolucionó hacia el actual virus del sarampión cuando los cambios en el comportamiento social del hombre dieron origen a poblaciones lo suficientemente grandes para mantener la prevalencia de la infección. Este evento evolutivo debió de haber ocurrido en los últimos 6 000 años, a partir del establecimiento de las primeras civilizaciones en Mesopotamia. En el caso del virus de la influenza es posible distinguir tres diferentes tipos de acuerdo con la antigenicidad de sus nucleoproteínas; estos tipos son: A, B y C. El virus tipo A es causante de epidemias mundiales (pandemias) de influenza. Los virus de la influenza tipos A y B causan epidemias durante el invierno. El virus tipo C sólo causa padecimientos respiratorios menores. La resistencia a la infección depende de que el organismo susceptible haya sido expuesto previamente al virus infectante. Los antígenos virales más importantes en relación con la producción de inmunidad protectora son la hemaglutinina externa (HA) y la glicoproteína neuraminidasa (NA). Los virus A y B de la influenza se encuentran en evolución continua produciendo nuevos tipos de los antígenos HA y NA; por lo tanto, resulta inefectiva la inmunidad previamente adquirida por el organismo. A partir de 1932 se empezaron a aislar cepas del virus de la influenza tipo A. Cada nuevo aislado del virus ha sido probado serológicamente con antisueros capaces de neutralizar las otras cepas conocidas del virus A. Con el paso del tiempo se ha hecho evidente que las nuevas cepas aisladas difieren cada vez más en el nivel antigénico de las primeras cepas aisladas. Actualmente ya no es posible aislar en la población humana virus tipo A correspondientes a las cepas originales aisladas en 1932. Este fenómeno se conoce como deriva antigénica y presupone que en forma natural se producen cepas de virus que presentan nuevos antígenos; estos mutantes son seleccionados en forma natural de entre la población de virus de la influenza. Experimentos in vitro, en los cuales el virus es propagado en cultivos de células en presencia de concentraciones de anticuerpos insuficientes para neutralizar la totalidad del virus inoculado, permiten obtener progenie viral que al ser transferida a otro cultivo celular en presencia de anticuerpos contra el virus de la cepa original demuestran que después de siete transferencias en serie la progenie viral resultante difiere radicalmente en sus determinantes antigénicos cuando se le compara con el virus del inóculo original. Se supone que esta evolución in vitro es equivalente al proceso de selección natural que ocurre por el repetido pasaje del virus de la influenza por el tracto respiratorio de diferentes individuos.

El análisis de cepas aisladas a lo largo de 40 años demuestra que la evolución del virus de la influenza tipo A no depende exclusivamente de la deriva antigénica sino también ocurre en saltos evolutivos que representan la casi misteriosa aparición de nuevas cepas denominadas subtipos, diferentes por completo en sus antígenos HA y NA a las cepas prevalentes en los años previos inmediatos. Este fenómeno se conoce como cambio antigénico y es característico del virus tipo A, mientras que el virus tipo B, como se ha visto, solamente evoluciona por deriva antigénica. Existe evidencia serológica de que en el pasado reciente el hombre ha sido infectado por subtipos del virus de la influenza que están emparentados con las cepas contemporáneas H2N2 y HbN2 que infectan al humano, y la cepa HswlNl que infecta al cerdo. La importancia de los subtipos virales es evidente cuando se considera la correlación entre su aparición y la ocurrencia de pandemias de influenza. Algunas hipótesis para explicar el origen del cambio antigénico se basan en el hecho de que cepas del virus de la influenza de humanos pueden infectar a los animales, y diferentes subtipos del virus A tienen al cerdo, al caballo y a algunos tipos de pájaros como hospederos naturales. El virus tipo B solamente infecta al ser humano; por lo tanto, existe una correlación entre la ausencia de cepas de virus tipo B capaces de infectar especies animales y la falta de cambio antigénico, lo que contribuye a explicar la ausencia de pandemias de influenza debidas al virus tipo B. La explicación más sencilla para el fenómeno de cambio antigénico consiste en que una cepa del virus capaz de infectar animales adquiere la capacidad para infectar al hombre. Esto explicaría el hecho de que en la pandemia de influenza de 1957 se aisló una cepa del virus que tiene antígenos HA y NA totalmente diferentes a los de la cepa del virus más común en el año 1956. A mediados de los años setenta se aisló en varias regiones de Estados Unidos el mismo subtipo de virus de la influenza a partir de cerdos y granjeros dedicados a la cría de cerdos; este hecho demostró que realmente ocurre el intercambio de cepas de virus de la influenza entre diferentes especies animales. Sin embargo, no se produjo ninguna pandemia a pesar de que la población humana carecía de inmunidad contra el subtipo viral HswlNl característico del cerdo. Por lo tanto, se ha especulado que este subtipo del virus carece de la capacidad para ser transmitido directamente entre seres humanos. Los indios americanos sufrieron un gran desastre demográfico en los años inmediatos posteriores al descubrimiento de América; este desastre ha sido generalmente atribuido a la introducción de la viruela en el Nuevo Mundo. Sin embargo, la viruela no fue introducida en Santo Domingo sino hasta 1518, o sea, veintiséis años después del descubrimiento; ya para entonces la población de la isla había disminuido de más de un millón (en 1492) a poco más de diez mil habitantes, por lo tanto, la viruela no es la causa de esta mortandad. El historiador Francisco Guerra ha sugerido, basándose en los relatos de diversos cronistas de Indias, como Bartolomé de las Casas, Fernández de Oviedo, Hernando Colón y Herrera y Tordesillas, que la mayor parte de la mortandad entre los indios de Santo Domingo fue causada por una epidemia de influenza porcina. De acuerdo con las crónicas, la epidemia se inició en La Isabela, la primera ciudad del Nuevo Mundo, el 9 de diciembre de 1493, un día después de la llegada de 1 500 hombres y animales domésticos transportados en los diecisiete barcos que constituían la segunda expedición de Colón. Los animales domésticos, que incluían ocho cerdas, habían sido embarcados en el la nave insignia en La Gomera, Islas Canarias, entre el 5 y el 7 de octubre de 1493, pero el contacto entre los animales y los miembros de la

expedición ocurrió solamente después del desembarco en Santo Domingo cuando, de acuerdo con las crónicas, los caballos fueron considerados perdidos a causa de una enfermedad. Todas las fuentes históricas están de acuerdo en la fecha, lugar y descripción de las manifestaciones clínicas y mortandad de la epidemia. El cuadro clínico corresponde a una infección aguda extremadamente contagiosa capaz de afectar en forma inmediata a todos los miembros de la expedición incluyendo al propio Colón. Los sintomas consistían en fiebre elevada, escalofrío, postración y elevada mortalidad, aunque aquellos que sobrevivieron manifestaron resistencia a las recaídas. Crónicas que hablan de otros brotes de la enfermedad posteriores a la invasión de tierra firme, entre 1514 y 1519, mencionan problemas respiratorios y epistaxis (hemorragias nasales) como síntomas asociados. Los cronistas indican que después de haber afectado a los españoles, la enfermedad empezó a provocar la muerte de "innumerables indios". El corto periodo de incubación observado en la epidemia de 1493 y la evolución del padecimiento descartan al paludismo como causante de la epidemia y, por el contrario, apoyan clínica y epidemiológicamente que la enfermedad causante fue la influenza. Guerra ha estudiado el papel de los virus de la influenza porcina en la producción de pandemias de influenza en humanos, y ha comparado la evolución demográfica de las Antillas desde la llegada de Colón en 1492, con la evolución demográfica de las Filipinas desde la llegada de Magallanes en 1521. Ambos archipiélagos tienen una extensión y clima similares. Sin embargo, los indígenas precolombinos prácticamente carecían de animales domésticos y por lo tanto fueron por primera vez expuestos a los virus de estos animales después de la llegada de Colón. Los filipinos poseían animales domésticos incluyendo tres especies de cerdos, antes de la llegada de Magallanes. Por lo tanto, los filipinos habían adquirido inmunidad que les permitió tolerar la colisión inmunológica con los exploradores españoles, mientras que los antillanos perecieron en grandes cantidades debido a la carencia de inmunidad previa. Los cronistas han dejado constancia de la inmunidad selectiva mostrada por los indígenas. Fernández de Oviedo comentó la resistencia de los indios a las enfermedades venéreas y la frambesia, mientras que el obispo Las Casas hizo notar lo susceptibles que eran a los padecimientos respiratorios. El cronista Solórzano Pereira escribió que "el aliento ajeno mata al indio" Existe una teoría cíclica para explicar el cambio antigénico; esta teoría se basa en la observación de anticuerpos contra la influenza en el suero de personas que estaban vivas antes de 1932, año en que fueron aisladas las primeras cepas del virus. Suero humano obtenido en 1957, el año en que apareció el virus subtipo H2N2, fue mantenido en congelación y posteriormente probado para establecer si contenía anticuerpos contra las cepas contemporáneas H2N2 y H3N2. El suero de individuos que ya estaban vivos en 1889, pero no, en 1888, mostró la presencia de anticuerpos contra el subtipo H2N2; esto sugiere que estos individuos habían sido infectados por una cepa H2N2 en 1889. Experimentos similares demostraron que la cepa H3N2 ya estaba presente alrededor de 1900. Por lo tanto, la teoría cíclica supone que las cepas virales se "ocultan" con cierta periodicidad, permaneciendo quizá en otra especie que actúa como hospedera hasta que la población de la especie hospedera natural, que manifiesta inmunidad contra el virus, es substituida paulatinamente por un número suficiente de nuevos individuos susceptibles que no han estado expuestos al contagio

por el virus. Bajo estas condiciones, el virus puede resurgir e infectar una vez más una proporción considerable de la especie hospedera natural. El ciclo observado en el caso de los subtipos H2N2 y H3N2 es de alrededor de 60-70 años, o sea, equivalente a la expectativa de vida promedio. Sin embargo, la aparición en 1977 de una cepa HINI idéntica desde el punto de vista serológico y de hibridación de ácidos nucleicos a la cepa presente en 1950 sugiere que una nueva población de individuos susceptibles puede acumularse en sólo 25 años. El genoma del virus de la influenza (tipos A y B) consta de ocho segmentos de ARN de cadena sencilla, cada uno de los cuales da origen a un ARN mensajero monocistrónico. Cuando una célula es infectada en forma simultánea por más de una cepa del virus de la influenza los nuevos fragmentos de ARN viral sintetizados pueden mezclarse al azar, dando origen a viriones híbridos que son genéticamente estables. Se ha demostrado que estas cepas híbridas pueden diseminarse en forma natural e infectar animales susceptibles. Cepas que pueden haberse originado por la combinación genética espontánea entre cepas de virus humano y de virus de animal han sido aisladas en forma natural. Algunos autores sugieren que la recombinación genética espontánea constituye el principal mecanismo por el cual surgen las nuevas cepas o subtipos del virus de la influenza tipo A.

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UN FENÓMENO comúnmente observado en el laboratorio consiste en que un fago capaz de propagarse en una cepa bacteriana determinada se replica en forma ineficiente cuando es crecido en otra cepa diferente. Se dice que estos fagos están restringidos cuando se encuentran en una cepa bacteriana diferente de aquella en la cual han sido propagados originalmente. Sin embargo, casi siempre una pequeña proporción del fago es capaz de evadir el estado de restricción y crecer de manera adecuada en la nueva cepa bacteriana, pero la progenie de este fago será incapaz de crecer en la cepa bacteriana que originalmente permitió la propagación del fago precursor. Estas observaciones sugieren que una modificación específica inducida por la nueva bacteria hospedera protege al fago de manera que no puede ser restringido dentro de la nueva cepa bacteriana, pero a la vez pierde la capacidad para crecer en la antigua cepa hospedera. A principios de los años sesenta, Bertani, Weigle y Arber demostraron en forma independiente que la modificación inducida por el hospedero ocurre en el nivel del ADN del fago, y el fenómeno de restricción es consecuencia de la degradación por hidrólisis enzimática del ADN viral que no ha sido modificado. El ADN de la bacteria hospedera y otros ADNs presentes en dicha céla son modificados por la adición de grupos metilo (CH ) en sitios específicos los cuales son normalmente reconocidos por un tipo de enzimas conocidas como enzimas de restricción, las cuales solamente pueden degradar ADN no metilado. Así, la metilación de una base en particular presente en la secuencia de nucleótidos reconocida por la enzima, impide la hidrólisis y ruptura del ADN en la región de esta secuencia. Las enzimas de restricción son endonucleasas capaces de
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reconocer secuencias específicas de nucleótidos en el ADN de cadena doble y cortar ambas cadenas a la altura de dichas secuencias. Cada tipo de enzima de restricción reconoce una secuencia de nucleótidos en particular, la cual generalmente consta de cuatro a seis pares de bases. Una caracterísuca notable de los sitios donde actúan las enzimas de restricción consiste en que la secuencia de bases es palindrómica y el sitio de corte está localizado en forma simétrica con respecto al doble eje de simetría, por ejemplo: la secuencia reconocida por la enzima de restricción Eco Rl, obtenida de la bacteria E. coli, es:

FIGURA XIII.1. Recombinación in vitro de dos fragmentos de ADN.

En este caso, la unión AG presente en cada cadena de nucleótidos es hidrolizada por la endonucleasa. Hasta la fecha han sido purificadas y caracterizadas más de cien diferentes enzimas de restricción. Su nomenclatura consiste en una abreviatura de tres letras correspondientes a la bacteria productora de la enzima (por ej.: Hae = Haemophilus aegyptum) más una letra en ciertos casos, que designa a la cepa bacteriana, y un número romano, por ej.: Hae III. La caracterización de las enzimas de restricción ha permitido desarrollar técnicas refinadas para manipular los genes. El factor principal en estas técnicas está dado por la capacidad de ciertas enzimas de restricción para producir cortes escalonados (indentados) en sitios bien definidos presentes en las moléculas de ADN. La figura

XIII.1 ilustra la manera en que estas enzimas pueden ser utilizadas: ADN procedente de dos fuentes diferentes es cortado con la misma endonucleasa (por ej.: Eco Rl) para producir fragmentos que poseen colas o términos de cadena sencilla cuyas secuencias de nucleótidos son complementarias. Incubando mezclas de ambos fragmentos en condiciones que favorecen la reunión de los mismos en presencia de la enzima ADN ligasa, es posible producir fragmentos de ADN híbrido también conocido como ADN recombinante. Es relativamente sencillo introducir en una bacteria fragmentos de ADN por medio del proceso conocido como transformación. Sin embargo, dichos fragmentos de ADN no pueden replicarse y acaban siendo eliminados. Para evitar este problema, el fragmento de ADN es insertado en un vector o vehículo de clonación, el cual consiste en una molécula de ADN capaz de replicarse en forma autónoma. Entre los vectores más a menudo utilizados se encuentran los plásmidos bacterianos, que son pequeñas moléculas de ADN circular de cadena doble, los cuales generalmente contienen genes que codifican toxinas o enzimas capaces de inactivar ciertos antibióticos. Los plásmidos son cromosomas bacterianos accesorios y se diferencian del cromosoma principal en que los plásmidos no son estrictamente necesarios para la subsistencia y reproducción de la bacteria en cuestión. Los plásmidos pueden replicarse independientemente del cromosoma principal. Las bacterias pueden contener plásmidos tipo unicopia o multicopia (más de 20). En general, los plásmidos multicopia son pequeños y a menudo se utilizan como vehículos moleculares de donación. Por ejemplo, una célula de E. coli generalmente contiene 20 moléculas (copias) de plásmidos y sólo una molécula del cromosoma principal. Otros vectores de donación están representados por ciertos bacteriófagos, particularmente el fago ha sido utilizado con éxito en diversos protocolos de manipulación genética. El fago λ tiene dos grandes ventajas como vector de clonación. En primer lugar, el ADN recombinante puede ser preparado en grandes cantidades, ya que cada bacteria produce cientos de copias del ADN viral recombinante. Dicho ADN recombinante puede ser purificado fácilmente, ya que aparece como componente de las nuevas partículas del fago λ . Utilizando cepas mutantes del fago λ defectuosas en su capacidad para lisar la célula hospedera, es posible incrementar el rendimiento de nuevas partículas virales, las cuales pueden ser recuperadas induciendo artificialmente la lisis de la bacteria hospedera. El actual conocimiento detallado de la estructura del genoma del fago λ permite construir mutaciones que incrementan la transcripción del ADN recombinante insertado en el genoma del fago λ . Es posible eliminar grandes regiones del genoma del fago λ que no son esenciales para la replicación del ADN viral y la lisis de la bacteria hospedera; las regiones eliminadas pueden ser substituidas por fragmentos de ADN recombinante procedente de las más variadas fuentes. Solamente se requiere un 25% del genoma del fago λ para permitir el crecimiento lítico de este fago en la bacteria hospedera. Sin embargo, la eliminación del exceso de ADN viral, incluso de ADN que no contiene secuencias esenciales para la replicación del fago provoca que las nuevas copias de ADN no pueden ser empacadas en partículas virales. Esta última propiedad es muy útil en ingeniería genética, pues el ADN del fago λ puede ser reducido en tamaño cortándolo con una enzima de restricción posteriormente, este ADN λ puede ser mezclado con un ADN foráneo que ha sido cortado con la misma enzima de restricción,

de manera que ambos tipos de ADN pueden recombinarse formando un ADN híbrido de suficiente tamaño como para ser introducido por transfección en bacterias susceptibles. El ADN recombinante puede replicarse en la bacteria, dando origen a nuevas moléculas de ADN recombinante con un tamaño suficiente para ser empacadas en partículas virales. Sólo las partículas que contienen ADN recombinante en cantidad equivalente a 7S-105% del ADN originalmente presente en el genoma del fago λ pueden ser empacadas en nuevas partículas virales que producirán la formación de placas en un cultivo infectado; de esta manera, pueden ser distinguidas y separadas de aquellas partículas que contienen un ADN λ de tamaño insuficiente debido a la ausencia de recombinación con el ADN foráneo (figura XIII.2).

FIGURA XIII.2. Esquema que muestra cómo puede ser utilizado un mutante del fago 1 como vector de clonación. La reacción de empacamiento selecciona las moléculas de ADN recombinante.

Actualmente existen métodos análogos a los empleados para donar ADN recombinante en bacterias, para propagar fragmentos de ADN recombinante en células eucarióticas. En este caso, los vectores de donación están representados por virus de animales como el SV4O, los adenovirus y algunos rotavirus, además de algunos virus de plantas útiles para clonar genes en células vegetales.

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V I R U S :

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C O N C E P T O

PARA CIERTOS filósofos, y no sin razón, el universo del hombre es equivalente al lenguaje, o sea, es a través del lenguaje, de sus palabras, conceptos y definiciones, como podemos comprender y enfocar el universo que nos rodea. De acuerdo con este

punto de vista, la definición precisa de cualquier objeto o fenómeno es la condición primaria necesaria para poder lograr la cabal comprensión del mismo. Usualmente ha sido conveniente dividir las ciencias biológicas en tres grupos de acuerdo con la naturaleza de sus temas de estudio: ciencias taxonómicas, ciencias integrativas y ciencias reduccionistas. Las disciplinas taxonómicas, como la botanica y la zoología, se refieren a grupos de organismos que tienen un origen y desarrollo histórico en común. Por su parte, disciplinas como la fisiología y la genética se dedican al estudio de las propiedades comunes o especializadas de los organismos vivos y por lo tanto son disciplinas de tipo integrativo. Las disciplinas reduccionistas examinan los procesos elementales y las funciones de los organismos en el nivel molecular; ejemplos de estas disciplinas son la biofísica y la bioquímica. La virología no encaja con facilidad en ninguno de los grupos mencionados debido a que su tema de estudio: los virus, no pueden ser definidos adecuadamente a partir de los criterios que por lo general se emplean para clasificar plantas y animales. La muy citada frase: "un virus es un virus", atribuida a André Lwoff, a la vez que carece de significado también testifica la dificultad de explicar o definir al virus. Esta dificultad deriva del problema de reconciliar las propiedades vitales y no vitales mostradas por los virus. Los virus, incluyendo los viroides, representan las entidades biológicas más pequeñas con capacidad de autorreplicación. Con frecuencia se les confunde con las bacterias debido a que ambos tipos de organismos son capaces de causar enfermedades infecciosas; sin embargo, es fácil distinguirlos de las bacterias debido a que los virus solamente contienen un tipo de ácido nucleico y son incapaces de multiplicarse cuando están afuera de una célula viva, además de que no son afectados por los antibióticos que matan a las bacterias. La clasificación de los virus presenta serios problemas. Por una parte, el registro fósil de los virus es prácticamente inexistente, lo que impide que puedan ser agrupados de acuerdo con su desarrollo evolutivo. Una situación similar ocurre con las bacterias, las cuales son clasificadas a partir de una arbitraria selección de características morfológicas y fisiológicas. Sin embargo, este método jerárquico y no filogenético para clasificar bacterias ha sido aceptado por los microbiólogos acostumbrados a consultar el Bergey's Manual of determinative bacteriology, considerado la autoridad definitiva sobre el tema. Los intentos por aplicar el sistema de clasificación de Bergey, basado en binomiales latinizados, a la clasificación de los virus, han dado resultados poco satisfactorios debido a que el criterio de clasificación se basa demasiado en los efectos causados por el virus en el hospedero en lugar de basarse en las propiedades intrínsecas del virus. La mayoría de los nombres de los virus derivan de las características clínicas, patológicas y epidemiológicas asociadas con las infecciones virales. Como ejemplos podemos citar el virus de la dermatitis postular contagiosa que pertenece al grupo de los poxvirus, y el virus de la degeneración vascular del frijol grueso. Algunos virus han sido nombrados de acuerdo con la localidad geográfica donde fueron aislados por primera vez: el virus de Sendai. Otros virus llevan el nombre de sus descubridores: virus de Epstein-Barr. Algunos virus son conocidos solamente en la versión abreviada de su nombre original; así, reovirus corresponde a respiratory enteric orphan virus, y arbovirus corresponde a arthropod-borne virus.

El método más extendido y aceptado para clasificar los virus agrupa a estos agentes de acuerdo con el tipo de hospedero que infectan: bacterias, hongos, plantas, invertebrados (particularmente insectos), animales, humanos. Los virus pueden ser subdivididos de acuerdo con un particular nivel de interés sobre los mismos. En años recientes el uso de un sistema taxonómico racional basado en principios de estructura y formación molecular ha sido promovido por el Comité Internacional de Taxonomía de los Virus; la figura XV1 es un esquema simplificado de este tipo de clasificación. Considerando lo anterior, podemos citar algunas de las múltiples definiciones de virus producidas a lo largo del tiempo. Por ejemplo, André Lwoff propuso en 1957 que un virus es: "una entidad estrictamente intracelular y potencialmente patógena que se caracteriza por tener una fase infecciosa, poseer solamente un tipo de ácido nucleico, multiplicarse en la misma forma que su material genético, incapaz de crecer o dividirse en forma binaria, carente de un sistema productor de energía metabólica". De acuerdo con esta definición, el virus es fundamentalmente de naturaleza no celular y es dependiente por completo del metabolismo de la célula hospedera, además de que en cierto estadio del ciclo replicativo el material viral se reduce exclusivamente al ácido nucleico. Otra definición muy conocida es la propuesta por Salvatore Luna en 1959: "los virus son elementos de material genético que pueden determinar en las células donde se reproducen la biosíntesis de un sistema que constituye un aparato específico para permitir la propia transferencia del virus hacia otras células".

Figura XV.1

Esta definición recalca la independencia del genoma viral con respecto al genoma del hospedero, así como la capacidad reproductiva de dicho genoma viral y su especialización que le permite ser transferido de una célula a otra. Luna y Darnell propusieron otra definición en 1967: "los virus son entidades cuyos genomas son elementos de ácido nucleico que se replican dentro de las células vivas

utilizando para este fin la maquinaria sintética de la propia célula hospedera y provocando la síntesis de elementos especializados que pueden transferir el genoma viral hacia otras células." Renato Dulbecco, 1975: "un virus es un parásito intracelular obligatorio que puede ser considerado como un bloque de material genético (ya sea ADN o ARN) capaz de replicarse en forma autónoma, y que está rodeado por una cubierta de proteína y en ocasiones también por una envoltura membranosa que lo protege del medio y sirve como vehículo para la transmisión del virus de una célula a otra." Es obvio que todas las definiciones citadas comparten ciertos elementos, pero también subrayan o pasan por alto factores considerados importantes por una u otra definición. Así, surge la posibilidad de que en realidad cada investigador en el campo de la virología puede tener un concepto de virus en particular, concepto que no será compartido del todo por el resto de sus colegas y esto lleva al corolario de que diferentes virólogos estarán en realidad estudiando diferentes objetos o fenómenos que en forma superficial resultan ser similares pero profundamente distintos en el nivel conceptual. Esta posibilidad es apoyada cuando consideramos definiciones más antiguas de virus. El criterio decimonónico que definía a un virus es la propiedad de filtrabilidad, o sea, la propiedad del agente infeccioso de pasar a través de filtros normalmente capaces de retener las más pequeñas bacterias conocidas hasta entonces. Recordemos que Beijerinck denominó al agente del mosaico del tabaco como Contagium vivum fluidum, queriendo recalcar la naturaleza dispersa, y por lo tanto molecular, del novedoso agente infeccioso capaz de pasar a través de los filtros antibacterianos. Beijerinck concibió al virus como un tipo de molécula soluble en agua, capaz de replicarse sólo cuando se encuentra incorporada en el protoplasma vivo de una célula en la cual la reproducción del virus ocurre en forma pasiva. Previamente, Pasteur había declarado (en 1890) que todos los virus eran microbios. Pasteur utilizó el término virus para referirse en particular a cualquier agente infeccioso capaz de producir inmunidad después de la recuperación del organismo infectado. Finalmente, recordemos que en el siglo I d.C., el médico romano Celso denominó virus al agente causal de la rabia, queriendo significar o referirse a un veneno desconocido presente en la viscosa saliva de los animales afectados por esta enfermedad. Una consecuencia inevitable del análisis de todas las definiciones de virus mencionadas consiste en que el término virus ha tenido significados muy diferentes a lo largo del tiempo. Muchos de estos significados son incompatibles o inconmensurables entre sí. Por ejemplo, es obvio que el concepto del virus de la rabia definido por Celso no tiene nada que ver con el virus de la rabia observado por cualquier virólogo molecular contemporáneo. Si consideramos que las conductas adoptadas en relación con cualquier fenómeno observado dependen de la interpretación conceptual de dicho fenómeno, entonces es obvio que el moderno agente causal de la rabia está totalmente fuera de la visión del mundo de los médicos de la antigua Roma, o sea, diferentes científicos ubicados en diferentes épocas han estado observando un fenómeno llamado rabia, el cual es similar en todas las épocas en el nivel superficial, pero es radicalmente diferente cuando se le considera dentro del marco psicológico y cultural de cada época a lo largo del tiempo.

La virología es una de tantas disciplinas que constituyen el panorama de la ciencia. Por lo tanto, es pertinente finalizar esta introducción al estudio de los virus co una breve reflexión sobre la naturaleza de la ciencia. No puede dejar de llamar nuestra atención el hecho de que la mayoría de los avances teóricos en el campo de la virología han sido, en sus respectivos tiempos, recibidos con escepticismo por la mayor parte de la comunidad científica. También es notable que se requiere el paso de varios años y la acumulación de fracasos experimentales con resultados negativos que contradicen los postulados de la ortodoxia científica, antes de que la mayoría de los investigadores estén dispuestos a considerar seriamente la otra evidencia disponible que apoya teorías alternativas que han permanecido ignoradas hasta entonces. Como ejemplo de lo anterior tenemos el caso de Peyton Rous, que a principios de este siglo produjo sólida evidencia experimental de que algunos tumores en animales son causados por virus filtrables. Se necesitaron casi cincuenta años para que el trabajo de Rous recibiera el debido reconocimiento y aceptación por la mayor parte de la comunidad científica. En forma similar, las observaciones y experimentos de Avery, MacLeod y McCarty, que demostraron que el ADN es el factor capaz de transformar bacterias inocuas en bacterias patogénicas, no fueron cabalmente apreciados por la mayoría de sus contemporáneos que suponían que las proteínas eran capaces de contener y transmitir la información genética. En otras ocasiones los científicos se encuentran inmersos en un marco teórico y conceptual que les impide interpretar adecuadamente la evidencia proporcionada por el método experimental y la simple observación. Ejemplo de lo anterior es el caso de Ivanovsky, que fue el primero en establecer la filtrabilidad del agente causal del mosaico del tabaco, pero atribuyó este fenómeno a un microorganismo productor de toxinas difusibles, negándose a considerar la posibilidad de que existieran partículas con actividad biológica capaces de pasar a través de los poros de filtros antibacterianos. Un caso similar es el de Pasteur, que nunca sospechó que el agente de la rabia era de naturaleza diferente a las bacterias. En otras ocasiones, los científicos manifiestan cierta timidez o excesiva reserva para formular hipótesis innovadoras, pues se sienten indirectamente restringidos por el marco cultural y las ideas dominantes en un periodo determinado. Tal es el caso de F. W. Twort, que fue el primero en observar el fenómeno de lisis bacteriana causada por fagos, y en forma muy cautelosa y sin comprometerse sugirió que este fenómeno podía ser causado por un virus filtrable bacteriano, dejando así el campo libre para que D'Herelle elaborara y reclamara para sí el descubrimiento del bacteriófago. Otro problema que enfrentan los científicos es la incomprensión de sus ideas debido a la falta de un marco de referencia adecuado que permita integrarlas dentro de la corriente del pensamiento científico contemporáneo. Tal es el caso de la hipótesis del provirus, propuesta por Temin con base en sus observaciones sobre la replicación de ciertos virus ARN. Dicha hipótesis permaneció casi ignorada hasta que el propio Temin y David Baltimore proporcionaron evidencia de que existe la enzima transcriptasa inversa que puede hacer fluir la información genética de ARN hacia ADN, evento que hasta entonces era considerado anatema por el llamado dogma central de la biología molecular ejemplificado por el esquema: ADN ARN Proteína.

En otras ocasiones, la ausencia de ciertos conceptos teóricos e incluso taxonómicos, impide establecer el eslabón entre observaciones aparentemente independientes, pero que en realidad corresponden a dos versiones de un mismo tipo de fenómeno. Un ejemplo de lo anterior fue la incapacidad de establecer una correlación entre las observaciones de Ellerman y Bang sobre la leucemia aviaria y los experimentos de Rous con el sarcoma de los pollos, debido a que a principios de este siglo las leucemias no eran consideradas como una forma de cáncer. Por otra parte, tenemos el caso de los investigadores solitarios, capaces de proponer teorías o hacer observaciones avanzadas, las cuales tienden a ser incomprendidas o pasadas por alto por los pocos contemporáneos que tienen noticia de las mismas. Tal es el caso de Beijerinck y su hipótesis del Contagium vivum fluidum, referente al agente del mosaico del tabaco. Similar es el caso de Fred Griffith, que en 928 realizó los primeros experimentos de transformación bacteriana in vitro, los cuales permanecieron ignorados por casi veinte años hasta que fueron actualizados por Avery, MacLeod y McCarty. También debemos considerar el caso de observadores empíricos (sean científicos o no lo sean) que son capaces de aplicar el sentido común para obtener resultados prácticos a partir de observaciones empíricas. Ejemplos extremos de lo anterior son el caso de Edward Jenner y su descubrimiento de la vacuna contra la viruela, o el caso de los capitanes de Francisco Pizarro, que habiendo notado la correlación entre la viruela y la enorme mortandad entre la población indígena, solían enviar por delante de las tropas conquistadoras a soldados o esclavos portando lanzas con lienzos impregnados con secreciones obtenidas de enfermos de viruela con la idea de que así podrían obtener una fácil victoria al diseminar la enfermedad entre la población del Imperio inca. El registro histórico nos muestra que una disciplina científica avanza no tanto por causa de la acumulación de observaciones fenomenológicas, sino por causa de la transformación de conceptos y teorías que permiten la reinterpretación de dichas observaciones. En ocasiones, los nuevos conceptos y teorías incorporan parte de las ideas contenidas en teorías e hipótesis previas, pero también en muchos casos representan una ruptura total con el saber del pasado a la vez que significan la adopción de un nuevo marco de referencia teórico e incluso psicológico, a veces totalmente incompatible con las pautas científicas y culturales de épocas previas. Por ejemplo, las ideas y conceptos del médico romano Celso, que indiscutiblemente corresponden a las de un notable sabio del siglo I, guardan muy poca correlación y difícilmente pueden ser incorporadas en el marco de la virología molecular. Sin embargo, es un error aplicar sin restricción los criterios y normas de una época como la nuestra a los eventos y actividades desarrolladas por los científicos de épocas pasadas. Ni Celso ni Pasteur eran ignorantes u obscurantistas; por el contrario, ambos representan brillantes intelectos trabajando en un particular contexto cultural y psicológico. Conceptos que eran válidos para Celso resultan carentes de sentido para Pasteur, al igual que bajo criterios contemporáneos Pasteur resulta estar equivocado al clasificar virus y bacterias en un mismo grupo. Igualmente, varios de los conceptos y teorías actualmente considerados como ejemplos de ortodoxia científica resultarán erróneos e incluso carentes de sentido y poder explicativo para los científicos del siglo XXI.

El filósofo Thomas Kuhn ha propuesto la existencia de una "tensión esencial" entre la comunidad de científicos ortodoxos y aquellos innovadores capaces de vislumbrar y sugerir nuevas teorías e interpretaciones que amplían el panorama de la ciencia por fuera de los límites del conocimiento establecido en una época en particular. Quizá es el silencioso conflicto entre una ortodoxia y una heterodoxia científica uno de los principales factores de la dinámica de la ciencia. La ortodoxia científica es necesaria, pues contribuye a crear un marco de referencia a partir del cual es posible obtener resultados que algunas veces se ven reflejados en aplicaciones prácticas del conocimiento científico, mismas que contribuyen a elevar la calidad de la vida de los seres humanos. Esta ortodoxia con sus dogmas y teorías, también sirve como un filtro que permite descartar proposiciones erróneas o falsos caminos para el avance científico. Sin embargo, esta ortodoxia también conduce al estancamiento científico y al desvío o a pasar por alto nuevas teorías con mayor poder explicativo. Un factor común a la mayoría de los eventos considerados como revoluciones en la historia de la ciencia es la imaginación demostrada por los científicos responsables de tales hitos científicos. Esta imaginación científica a veces se nutre de ciertos factores racionales como la observación y experimentación paciente, objetiva y rigurosa. Pero con mayor frecuencia la imaginación científica se basa en la intuición y la capacidad creativa de ver en el mismo fenómeno posibilidades que permanecen ocultas para la mayoría de los contemporáneos. En todo gran hombre de ciencia convergen la intuición e imaginación que son características también del filósofo. Ciertamente, el rigor y la disciplina son factores que pueden hacer un buen científico. Pero es quizá el culto a la imaginación en un clima de tolerancia lo que da lugar a la aparición del científico trascendente que, al igual que el artista, es un creador de nuevos horizontes y por lo tanto profundamente humano.

B I B L I O G R A F Í A

M Í N I M A

TEXTOS GENERALES Alberts, B., D. Bray, J. Lewis, M. Raff, K. Roberts y J. D. Watson Molecular Biology of the Cell, 3a. ed., Garland, Nueva York, 1994. C.A. Janeway y P. Travers. Inmunobiology: the inmune system in healt and disease, Current Biology/Garland, 1994. Lewin, B., Genes V, Oxford University Press, 1994. Stent, G.S., y R. Calendar, Molecular Genetics, 2a. ed., W. H. Freeman & Co., 1978.

Stryer, L., Biochemistry, 3a. ed., W. H. Freeman & Co. 1988. TEXTOS DE VIROLOGÍA Calendar, R., The Bacteriophages, 2 vols, (comp), Plenum Press, 1988. Fields, B. N., et al.(comps.), Virology 2 vols., 2a. ed., Raven Press, Nueva York, 1990. Luria S. E., J. E. Darnell, D. Baltimore y A. Campbell, General Virology,3a. ed., John Wiley & Sons, 1978. Varmus, H., y A. Levine (comps.), Readings in Tumor Virology. Cold Spring Harbor Laboratory, 1983. Webster, R.G., y A. Granoff, Encyclopedia of Virology, 3 vols, Academic Press, 1994. ARTÍCULOS Adleman, L. M., y D. Wofsky, "T-cell homeostasis: implications in HIV infection", Journal of Acquired Immune Deficieny Syndromes 6, pp. 144-152. Aranda-Anzaldo, A., "A role for CD8+T lymphocytes in the pathogenesis of AIDS" Research in Inmunology142, pp. 541-550. Aranda-Anzaldo, A., D. Viza y R. G. Busnel, "Chemical inactivation of human immunodeficiency virus (HIV) in vitro", Journal of Virological Methods 37, pp. 71-82. Aranda-Anzaldo, A., "Possible cell-free prion replication", Med. Hypoth. 38, 1992, pp. 249-251. Ascher, M. S. et al.,"HIV Paradox Remains", Nature,375, 1995, p. 196. Cao, Y. et al., "Virologic and immunologic characterization of long-term survivors of human immunodeficiency virus type 1 infection". N. Eng J. Med.,332 (4), 1995, pp. 201-208. Cann, A. J., y J. Karn, "Molecular Biology of HIV: new insights into the virus life-cycle." AIDS3 (suppl. 1), 1989, pp. s19-s34. Cullen, B. R., " Human immunodeficiency virus as a prototypic complex retrovirus", Journal of Virology 65, 1991, pp. 1053-1056. Dalgleish, A. G., "Pathogenesis of AIDS: classical and alternative views", Journal of the Royal College of Physicians of London 26, 1992, pp. 152-158. Ho, D. y D. et al. "Rapid turnover of plasma virions and CD4 lymphocytes in HIV.1 infecction", Nature 373,1994, pp. 123-126. Hoover, D. R. et al.,"Lon-term survival without clinical AIDS after CD4 cell counts fall bellow 200/ml." AIDS 9, 1995, pp. 145-152.

Kocisko, D. A., et al., "Cell-free formation of protease-resistant prion protein", Nature 370, 1994, pp. 471-474. Levy, J. A., "Pathogenesis of human immunodeficiency virus infection", Microbiological Reviews 57 (1), 1993, pp. 183-289. Marrack, P., y J. Kappler, "Subversion of the immune system by pathogenes", Cell 76, 1994, pp. 323-332 McCune, J. M., "HIV: the infective process in vivo", Cell 64, 1991, pp. 351-363. Wei, X. et al.,"Viral dynamics in human immunodeficiency virus type 1 infection", Nature 373, 1995, pp. 117-122.

C O N T R A P O R T A D A

La rabia, enfermedad capaz de transformar a un perro doméstico en una bestia feroz, presenta un cuadro pavoroso y a la vez irresistible que ha merecido desde la antigüedad la atención de los hombres. Si se comparan las descripciones de los cronistas griegos de esta enfermedad con las que se tienen en la actualidad encontramos, nos dice el doctor Armando Aranda, que desde el punto de vista clínico el virus de la rabia no ha cambiado a lo largo de los siglos, característica que lo distingue de aquellos virus que sí se han modificado sus cepas con el tiempo. Volviendo a la rabia, una de sus descripciones más precisas y detalladas se debe a Celso, médico que vivió en el siglo I de nuestra era y que en su libro De medicina escribió una frase que ha llamado la atención de los historiadores: "Especialmente en el caso en que el perro es rabioso, el virus debe ser drenado con una ventosa de vidrio." Nadie se atrevería a pensar que Celso identificó al agente causante de la rabia como un virus en el sentido que se le da actualmente, mas es importante subrayar que Celso utilizó el término virus para denotar al agente causal de la rabia mientras que en su libro emplea la palabra venenum para calificar la ponzoña de las serpientes. En especial, si consideramos que virus significa también veneno o líquido viscoso. Quizá Celso había observado que la rabia se transmitía por medio de la saliva del animal infectado. Muy posteriormente, la palabra virus ha sido empleada por gente tan notable en el campo de la medicina comoThomas Fuller, Angelo Gatti, Edward Jenner, el descubridor de la vacunación y Claude Bernard, por citar sólo unos cuantos. Sin embargo, la primera revista científica dedicada exclusivamente al campo de la virología inició su publicación en 1939 y el primer texto que trata exclusivamente el tema fue publicado en 1953: General Virology de Salvatore Luria.

Los virus son extremadamente pequeños, sólo pueden ser observados por medio de los microscopios más potentes, los electrónicos. Su naturaleza es tan esquiva que su mejor definición es la del contemporáneo André Lwoff: "Un virus es un virus." Mas como producen una buena cantidad de infecciones su estudio resulta de necesidad extrema. El presente libro ofrece al lector una visión global de lo que se sabe sobre los virus: su origen, su estructura, sus interacciones, su evolución. Armando Aranda Anzaldo es médico cirujano graduado en la Facultad de Medicina de la UNAM, maestro en ciencias químicas de la Facultad de Quimíca de la misma institución y doctor en filosofía (bioquímica) por la Universidad de Cambridge, Gran Bretaña. Actualmente es investigador del Laboratorio de Inmunología de la Facultad de Medicina de la Universidad de París. Diseño: Carlos Haces.

P R Ó L O G O

A LA SEGUNDA EDICIÓN El manuscrito de la primera edición de este libro fue terminado en la primavera de 1987; ocho años han transcurrido desde entonces, lapso en el cual nuevos descubrimientos, en el ámbito de la biología y las ciencias biomédicas, han permitido resolver viejas cuestiones, plantear nuevas incógnitas y también reconsiderar antiguas respuestas que resultaron equivocadas a la luz de los nuevos conocimientos. En el campo de la virología se han producido importantes avances y han sido descritos nuevos agentes virales tanto en bacterias, como en plantas y animales; baste mencionar tres nuevos tipos de virus de Herpes humanos (HHV-6, HHV-7 y HHV-8). Los avances de la biología molecular han permitido desarrollar nuevas técnicas para el rastreo e identificación de nuevas moléculas, nuevos microorganismos y nuevos virus. Por supuesto que el calificativo de nuevo debe ser tomado con reserva; recordemos que Colón descubrió América para los europeos, sin embargo, los indígenas tenían siglos de habitarla. De la misma manera, muchos de los "nuevos" virus pueden haber estado todo el tiempo con nosotros y lo único que ha cambiado es la precisión de los métodos que ahora nos permiten conocer su existencia. La virología es una disciplina en pleno desarrollo y, por lo tanto, resulta arriesgado, por no decir insensato, pretender fijarla y agotarla en el magro espacio del presente libro. En la primera edición, el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) o Human Inmunodeficiency Virus (HIV) fue mencionado en forma por demás somera y sin discutir su relación con el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA). La presente edición pretende subsanar, en la medida de lo posible, las deficiencias de la primera en cuanto al HIV y otros virus de interés médico y general. Sin embargo, algunos lectores

notarán también que en el presente texto se han suprimido conceptos que hace unos cuantos años parecían ciertos. Es indudable que el aislamiento y caracterización del llamado virus de la inmunodeficiencia humana ha causado un aumento del interés de la comunidad científica por los virus en general; pero, sobre todo, ha provocado que el término virus ya forme parte del vocabulario cotidiano y que ciertos aspectos de la virología sean de interés para el público en general. Desde 1987 hasta 1993 trabajé en la Universidad de París en proyectos de investigación directamente relacionados con el HIV. Esta experiencia me permitió conocer de primera mano muchos de los factores y actores que han tomado parte en la historia científica del SIDA; historia que con mucha frecuencia se ha visto desviada por intereses personales, competencia desleal y afirmaciones apresuradas que presentan a ciertos fenómenos de laboratorio —artificiales y pasajeros—, como si fueran hechos plenamente demostrados. Pienso que en el caso de un tema que produce reacciones tan diversas e intensas, como el del SIDA, puede ser contraproducente la proliferación de obras de divulgación basadas en información científica de carácter preliminar, por no decir transitorio. Sin embargo, prefiero correr el riesgo de equivocarme en mi presentación del estado actual del conocimiento sobre el HIV y el SIDA, que optar por reproducir cierta información "clásica", misma que continúa siendo divulgada a pesar de ser incorrecta, como lo ha demostrado el propio curso de la investigación sobre este tema. Es común decir que la naturaleza es sabia; sin embargo, la labor del científico consiste en desentrañar dicha sabiduría, lo cual toma su tiempo y dista de ser sencillo. Es indudable que la ciencia y en particular las ciencias biomédicas pueden contribuir en forma muy importante al bienestar del género humano; pero muchas veces nuestras necesidades y urgencias humanas interfieren en el proceso del conocimiento, al constituir presiones para encontrar, a toda costa, respuestas inmediatas. Un claro ejemplo de lo anterior es la compleja interacción que se da en torno al problema del SIDA, entre la ciencia, la opinión pública y los intereses comerciales. Por lo tanto, vale la pena tener presente que en la ciencia, como en cualquier otra actividad humana, más vale tarde que nunca. Toluca, marzo de 1995.

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