PRCTICA DE LABORATORIO N 3

COLORACIN FEULGEN

I. INTRODUCCIN:

Segn Kiernan (1999), el fundamento de este mtodo se basa en la identificacin altamente

especfica de cidos nucleicos del ADN a partir del reconocimiento de los grupos aldehdos
de la pentosa (azcar). Para esto se realizan 2 pasos fundamentales:

La hidrlisis cida, se utiliza para romper los puentes de hidrgeno que unen a la doble
hlice, mediante la desnaturalizacin de la cadena. Para esto se utiliza cido clorhdrico
(HCl), que es el componente reactivo ms crtico del mtodo, controlando la concentracin
del cido, temperatura y tiempo, que depende del tipo de tejido (compactacin de cromatina)
y fijador empleado.

Durante la hidrlisis cida suave la

mayor parte del RNA se divide en
sustancias solubles y se pierde del
tejido, sin ser removidos los grupos
ribosil debido a la presencia de un
grupo hidroxilo en la posicin 2' de
la ribosa, por lo que, este material
no reaccin posteriormente con el
reactivo de Schiff. Mientras tanto el
DNA es parcialmente hidrolizado
siendo removidas y liberadas las
bases pricas (A y G) de los
residuos de desoxirribosa
(DEPURINIZACIN) formando
cido apurnico y generando
GraficoReaccin
N1:
grupos
de Feulgen.(1924)
aldehdo (CHO) en el C1 de la pentosa, donde se encontraba unida la base nitrogenada.

Davidson (1980) seala que, La interpretacin de la reaccin de Feulgen es que el ADN en

el material nuclear del tejido es hidrolizado parcialmente por el HCl caliente, dando
sustancias que permanecen en el lugar de la produccin y originas el color rojo. Las reas
ricas en ADN quedan, por lo tanto, fuertemente teidas. Se cree que el tratamiento con
cido rompe los enlaces glucosidicos entre la desoxirribosa y las bases puricas. Este hecho
deja expuestas las desoxirribosas. La duracin de la hidrolisis es un factor crtico, si se ha
utilizado el liquido de Carnoy como fijador(como en este caso), la duracin optima es de 10
minutos, que corresponde a la mitad de las bases totales, presumiblemente las purinas. De
prolongarse el tiempo de hidrolisis, se da una progresiva separacin del ADN de la
preparacin, con la consecuente reduccin de la tincin de Feulgen. Tambien hay que
tener en cuenta las variables de tiempo de exposicin a la hidrlisis acida, pH ([ H+]) al que
se lleve a cabo la reaccin, temperatura y el grado de compactacin de la cromatina que
depende de la naturaleza del tejido.

Como segundo paso, segn Kiernan (1999), es la Tincin con Reactivo de Schiff. Los
grupos aldehdos liberados por la hidrlisis de Feulgen son teidos con reactivo de Schiff.
Los resultados son DNA (cromatina nuclear, cromosomas) teido color fucsia y fondo
incoloro. La hidrlisis cida rompe los puentes de hidrgeno separando las hebras de DNA
produciendo una DEPURINIZACIN, por lo tanto, para obtener un mayor nmero de grupos
aldehdo reactivos, identificables con reactivo de Schiff, es necesario realizar una hidrlisis
que libere mayor cantidad de bases pricas.

Ejemplo de Curva de hidrlisis para Feulgen obtenida experimentalmente.

Grafico N2:

Anlisis de la curva de hidrlisis:

*Tiempo 0 min.: la muestra de tejido se encuentra con una intensidad de coloracin

prcticamente nula ya que el DNA no posee una cantidad grupos aldehdos expuestos
suficiente como para reaccionar con reactivo de Schiff, y producir color, porque no fue
sometido a un tratamiento de hidrlisis cida que produzca depurinizacin con una
regeneracin de grupos aldehdos.

*Tiempo 0 a 60 (ascenso): durante los primeros 60 en que el tejido a sido expuesto a la

hidrlisis cida se han ido rompiendo los puentes de hidrogeno, que unen la doble hlice,
progresivamente liberando bases pricas generando grupos aldehdos (CHO) en el C1 de la
pentosa, donde se encontraba la base nitrogenada. A medida que aumenta el tiempo de
hidrlisis se produce, por la depurinizacin, una mayor cantidad de grupos aldehdos
expuestos que por reaccin con el reactivo de Schiff, generan una coloracin que se va
haciendo mas intensa a medida que el tiempo de exposicin al cido es mayor.

*Tiempo 60 a 90 (meseta): durante estos 30 de hidrlisis cida se han liberado todas las
bases pricas y pirimidicas del tejido sin producir una despolimerizacin del DNA, por lo que,
se observa la mxima intensidad de coloracin, con tonalidad fucsia, de los cidos
nucleicos.

*Tiempo 90 a 120 (descenso): durante estos 30, en los que se trabaj, se pudo observar
que el tiempo al que a sido expuesto el tejido al cido clorhdrico a sido excesivo, por lo que,
la hidrlisis cida rompe las uniones tipo ester de la pentosa con los fosfatos en los C3 y C5
de forma progresiva hasta producir una despolimerizacin del DNA. El objetivo de esta
prctica es conocer los fundamentos de una coloracin Feulgen y el protocolo de ejecucin
que se debe seguir para realizar una correcta Coloracion.

II. MATERIALES:

1. 03 microscopios.
2. 01 vaso de precipitacin.
3. 03 Lminas.
4. 03 Laminillas.
5. Raicillas de Allium cepa (meristemos)
6. 01 Termmetro.
7. HCl 1M.
8. Reactivo de Schiff.
9. 01 cocina elctrica.

III. RESULTADOS:

Observacin realizada en la presente prctica.

IV. COMENTARIO:

V. CONCLUSIONES:

1. Se describi los fundamentos de una Coloracin Feulgen, incluyendo a todos los

reactivos que intervienen en dicha coloracin.

2. Se detall el protocolo de ejecucin que se debe seguir para realizar una correcta
Coloracion Feulgen.

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

- Davidson, R. (1980). Bioqumica de los cidos Nucleicos. Editorial Revert

S.A. Mexico, D.F.

- Kiernan, J. (1999) Histological and Histochemical Methods, Theory and

Practice. (3Ed.). Washington D.C, Estados Unidos.

- Martinez, R. & Gragera, R. (2008) Fundamentos Tericos y Prcticos de la

Histoqumica. Consejo Superior de Investigaciones Cientficas. Madrid,
Espaa.

AO DE LA CONSOLIDACIN DEL MAR

DE GRAU

UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLGICAS
ESCUELA ACADMICA DE CIENCIAS
BIOLGICAS
 ALUMNO:

PROFESORES:

MESA:

CICLO:

2016