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FUNDACIN UNIVERSITARIA DE SAN GIL

UNISANGIL

GUIA DE LABORATORIO
UNIDAD DE CIENCIAS BSICAS

PROGRAMA
ASIGNATURA BIOLOGIA GENERAL
HORAS 2
PREPARACION Y ESTERILIZACION DE
PRCTICA NOMBRE DE LA
5 MEDIOS DE CULTIVO.
No. PRCTICA
FECHA DE
REALIZACIN DE LA
NOMBRE DE LA PRCTICA
PERSONA QUE CLARET CARREO SOLANO DD MM AAAA
ELABORA LA GUIA
27 06 2017

INTRODUCCIN

Es importante tener claro que para el estudio de los microortganismos, se debe


contar con material y medios de cultivo estriles.
La esterilizacin la podemos definir como el Proceso mediante el cual se
destruyen todos los microorganismos y sus respectivas formas resistentes como
las capsulas o esporas de un objeto, medio o superficie y su aplicacin debe
garantizar la ausencia de microorganismos en el material y medios de cultivo a ser
utilizados.

Existen diversos mtodos de esterilizacin, entre ellos: la aplicacin de calor (seco


o hmedo), filtracin (para sustancias termolbiles y aire), radiaciones y aplicacin
de gas de xido de etileno (para jeringas y cajas de plstico).

Un medio de cultivo est constituido por una mezcla de agua y sustancias


orgnicas e inorgnicas, los cuales proporcionan los requerimientos nutricionales
para el crecimiento o desarrollo de los microorganismos. La composicin de los
medios de cultivo vara en funcin de: a) grupo microbiano que se pretende
estudiar, b) complejidad qumica, c) estado fsico, y d) aplicacin.

Podemos definir los medios de cultivo, como un sistema artificial que permite las
condiciones ptimas y necesarias (de cantidad de nutrientes, temperatura) para el
desarrollo de determinados microorganismos.
De acuerdo con esto encontramos diferentes requerimientos nutricionales,
distintos tipos de medios en cuanto a consistencia: lquidos, slidos alrededor de
1.6% de agar, semislidos (0.8% de agar), la consistencia depende de cantidad de
agar o de su ausencia, el agar es componente esencial que proviene de las algas
rojas, adems que es resistente a la accin de degradacin que realizan las
bacterias.
El conocimiento de la nutricin microbiana permite el cultivo de los
microorganismos en el laboratorio. Todos los microorganismos tienen parecidos
requerimientos de macro y micronutrientes, aunque ha quedado caro que la forma
en que cada nutriente es captado puede variar mucho entre unas bacterias y
otras, as como la cantidad relativa de cada nutriente.

METODOS DE ESTERILIZACIN

Tabla 1. Mtodo tipo y fuente de esterilizacin empleados en los laboratorios de microbiologa.

Mtodo Tipo Fuente


Calor seco Esterilizacin al rojo Accin directa de la
Flameado llama.
Estufa de calor seco Accin directa por
generacin de calor.
Calor Hmedo Accin de agua caliente Bao de mara hirviendo
Calentamiento repetido
Ebullicin directa.
Accin de vapor de agua. Autoclave
Radiacin Ionizantes Rayos X
Rayos Gama
Ultravioleta UV 260nm
UV 280nm-230nm.
EL AUTOCLAVE

Es un instrumento habitual en los laboratorios de Microbiologa.


Es un sistema cerrado donde se forma vapor de agua que se somete a una
presin elevada, una atmsfera, lo que hace que el agua alcance una temperatura
de 121C causando la desnaturalizacin de enzimas lo que conlleva a la muerte
de los microorganismos y la destruccin de las esporas. Habitualmente, se
esteriliza a 121C durante 20 minutos.

El Funcionamiento de la autoclave

A continuacin, mostrar el proceso completo de esterilizacin en una autoclave el


cual comprende diferentes fases.

1. Fase de purgado: A medida que la resistencia calienta el agua del fondo


del caldern, se va produciendo vapor que desplaza el aire, hacindolo salir
por la vlvula de purgado que est abierta. Esta fase termina cuando se
alcanza la temperatura de esterilizacin.
2. Fase de esterilizacin: Una vez cerrada la vlvula de purgado y alcanzada
la temperatura de esterilizacin previamente seleccionada se inicia el
proceso de esterilizacin.
3. Fase de descarga: Terminado el proceso de esterilizacin, deja de
funcionar la resistencia calefactora, con lo que deja de producirse vapor y la
presin y temperatura del caldern empieza a bajar poco a poco.
Imagen 1. Autoclave y sus partes

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Uso correcto para la esterilizacin del material.

1. Para una esterilizacin de medios de cultivo eficaz, la temperatura y el


tiempo seleccionados deben alcanzarse en todo el lquido.
2. Los recipientes con cierre hermtico deben ser introducidos en el autoclave
sin cerrar totalmente el tapn, para facilitar la entrada del vapor durante el
proceso. Al vaciar el autoclave despus de la esterilizacin procederemos a
cerrar totalmente estos recipientes.
3. Los recipientes vacos poseen un tiempo de esterilizacin mayor que los
recipientes con lquido en su interior.
TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Un medio de cultivo es una solucin acuosa (bien como tal, o bien incorporada a
un coloide en estado de gel) en la que estn presentes todas las sustancias
necesarias para el crecimiento de un(os) determinados microorganismos.
Los medios de cultivo se pueden clasificar en primera instancia en tres grandes
tipos:
1. Medios complejos o indefinidos: su composicin qumica exacta se
desconoce, ya que son el producto de realizar infusiones y extractos de
materiales naturales complejos:
Ejemplos: Digeridos crudos de extracto de carne, extracto de levadura, peptona de
carne, extracto de levadura y casena (de la leche).
Con ellos se logra un tipo de medio rico nutricionalmente, aunque indefinido
qumicamente. Si lo que pretendemos simplemente es obtener un buen
crecimiento bacteriano, este tipo de medios es ideal, ya que su confeccin es fcil
y rpida (basta pesar cierta cantidad del extracto desecado, suministrado por
casas comerciales, disolverlo en agua y esterilizar en autoclave, antes de inocular
e incubar la bacteria con la que queramos trabajar). Estos medios contienen
fuentes variadas de C y N orgnicas, sales minerales y micronutrientes. Sin
embargo con ellos no podemos tener un control nutricional preciso, ya que
desconocemos la composicin qumica y proporcin exacta de los distintos
nutrientes.
2. Medios sintticos o definidos: se obtienen disolviendo en agua destilada
cantidades concretas de distintas sustancias qumicas puras, orgnicas y/o
orgnicas. La composicin concreta de un medio sinttico depender de la
bacteria que queramos cultivar: lgicamente un medio definido para una
bacteria con grandes capacidades biosinttica ser ms sencillo que el
medio definido de otra bacteria con menores posibilidades biosintticas.

3. En tercer lugar, podemos fabricar un tipo de medio mezcla de los


anteriores, denominado medio semisinttico: llevan algunas sustancias
qumicas cuya naturaleza y cantidad conocemos, junto con sustancias de
naturaleza y composicin indefinidas.
Cualquiera que sea el tipo de medio, de los 3 que acabamos de citar, podemos
elaborar dos tipos de versiones, segn su estado aparente:
-Medios lquidos.
-Medios slidos: derivan de los lquidos simplemente aadiendo a la solucin
nutritiva un coloide en estado gel, que solidifica (da consistencia) a esta solucin.
En los primeros tiempos de la microbiologa solo se conoca como sustancia
gelificante, la gelatina. Sin embargo, presenta muchos inconvenientes, ya que
funde a 25C (por encima de esta temperatura el medio se lica), y adems,
muchas bacterias presentan gelatinasas que hidrolizan la gelatina.
El gelificante ms usado es el agar-agar, extrado de algas rojas (p.ej. Gelidium),
del cual existen versiones ms o menos purificadas (las ms puras estn ms
enriquecidas en el polisacrido agarosa, son las que se emplean para los medios
definidos, con el objeto de evitar la introduccin de sustancias contaminantes,
inadvertidas que falseen las interpretaciones sobre el comportamiento nutricional
de la bacteria).
El agar presenta la ventaja de que una vez gelificado, no funde hasta cerca de los
100C, lo que permite su uso para la inmensa mayora de las bacterias, que son
mesfilas.
Para cultivar ciertas bacterias (sobre todo los quimioauttrofos) se suele recurrir a
un gelificante inorgnico, el silicagel o gel de slice.
Medios selectivos son aquellos que permiten seleccionar un tipo (unos pocos
tipos) de microorganismos. En el laboratorio se emplean mucho medios selectivos
slidos que incorporan ciertas sustancias que inhiben el crecimiento de ciertas
bacterias, pero permite el crecimiento de otras (p. ej. Medios que llevan violeta
cristal inhiben el crecimiento de bacterias gran positivas).
Medios diferenciales son aquellos que permite distinguir a simple vista dos o ms
tipos de bacterias en funcin de su distinto comportamiento respecto de algn
nutriente del medio. Este comportamiento diferencial se traduce normalmente en
viraje de color de una sustancia indicadora presente en el medio.
Ejemplos:
En el medio EMB (eosina azul de metileno) ciertos tipos de metablicos de
bacterias producen cidos por fermentacin de ciertas fuentes de carbono.
El medio agar-sangre lleva un 5% de sangre de caballo o carnero, lo cual revela la
capacidad (y el tipo) de hemlisis de ciertas bacterias.

CONTROL DE CALIDAD DE LOS MEDIOS DE CULTIVOS


Antes de utilizar un medio de cultivo se debe realizar el control de calidad para
comprobar si las caractersticas del medio estn dentro de las especificaciones
dadas por la casa comercial y si la metodologa de preparacin es satisfactoria.
Cada lote de medio preparado debe someterse a un programa mnimo de ensayo
que asegure su aceptacin y demuestre su actividad bacteriana tpica.
Valor de pH: compruebe el pH del medio, cuando este, tenga la temperatura
ambiente, el cual debe coincidir con el sealado en la etiqueta.
Esterilidad: Tome al azar una muestra del 3 al 5% del lote preparado e incbelo a
37C durante 2 a 5 das, para observar si hay crecimiento microbiano. Si hay
presencia es indicativa de mala esterilizacin y debe repetirse toda la preparacin.
La esterilizacin es el proceso mediante el cual se destruyen los microorganismos
sea cual sean sus caractersticas (clulas viables, esporas etc.) patgenos o no,
sobre el material o dentro de l.
Efectividad: Que en el medio preparado efectivamente hay un desarrollo de
microorganismos, se pone el medio de cultivo al ambiente o sirviendo una
muestra.
Estabilidad: con cierta periodicidad compruebe los datos mencionados en el medio
preparado y conservado, para determinar si las condiciones de conservacin son
satisfactorias

OBJETIVOS

1. Explicar el concepto de esterilizacin y su aplicacin en los laboratorios.


2. Aplicar algunas metodologas para esterilizar material y medios de cultivo.
3. Explicar el concepto de medio de cultivo en microbiologa.
4. Preparar medios de cultivo con diferente estado fsico y explicar la
diferencia en el procedimiento de preparacin.
PRE INFORME

El pre informe debe elaborarse de manera individual, a mano, consignado en un


cuaderno, cuadriculado de preferencia, deber ser entregado dos das antes de
cada prctica.

El pre informe constar de las siguientes partes:

1. Ttulo de la prctica y datos de los estudiantes. Lo escribirn en la parte


superior de su cuaderno y en mayscula, y centrado.
2. Objetivos: Debe haber un objetivo general, qu debe responder a las
preguntas: qu y para qu; Deben ir tres objetivos especficos, los
cuales les deben permitir logra cumplir el objetivo General. (cada objetivo
debe iniciar con un verbo infinitivo (determinar, definir, conocer etc.).
3. Introduccin: Aqu se incluirn los conceptos necesarios para realizar la
prctica y las preguntar a consultar.
4. Materiales, equipos y reactivos necesarios usados.
5. Procedimiento: El procedimiento debe ser escrito en forma de diagrama
de flujo, el cual deben indicar el paso a paso de cada proceso.
Debern: Indicar en el diagrama, cmo ser la disposicin final de los
residuos emitidos durante la prctica.
6. Tabla de datos: Debe hacer el encabezado de la tabla de datos (si la
prctica lo exige), en el cuaderno, para luego registrar los datos
correspondientes durante la prctica.
7. Bibliografa: La bibliografa consultada, debe ir segn normas APA.
Deben tener en cuenta el tipo de fuente bibliogrfica. NO SE ACEPTARN
MAS DE TRES BIBLIOGRAFIAS DE INTERNET, WIKIPEDIA NI
RINCOSN DEL VAGO.
EQUIPOS A UTILIZAR EN LA PRCTICA
CANTIDAD DESCRIPCIN
1 Autoclave
1 Balanza digital

MATERIALES A UTILIZAR EN LA PRCTICA


CANTIDAD DESCRIPCIN
1 Esptula
1 Erlenmeyer
1 Cajas de petri
1 Agua destilada
1 Papel kraft
1 Probetas
1 Erlenmeyer
1 pipeta

REACTIVOS REQUERIDOS
CANTIDAD DESCRIPCIN
Medios de cultivo (agar y caldo)
PROCEDIMIENTO

En la prctica, se realizar la preparacin de medios de cultivo tales como: agar


nutritivo y caldo nutritivo.

- Realizar los clculos correspondientes para la preparacin de los medios,


teniendo en cuenta el recipiente en el que se va a ensayar el medio, ya que
los tubos de ensayo 13X100 tapn algodn se ponen 3 ml y en las cajas de
petri se envasan 20 ml.

- Agregar en un Erlenmeyer el medio (gramos) y agregue la cantidad de agua


calculada (ml). Agite el medio y pngalo a calentar con un tapn algodn
ligeramente puesto, deje hervir. En el caso de los caldos no se calientan.

- Posteriormente esterilice en autoclave (calor hmedo). Es importante saber


que hay condiciones que garantizan una verdadera esterilizacin: tiempo:
15-30 minutos, presin de vapor 15 libras/pulgadas cuadradas o 1.2
atmsfera y temperatura de 121C.

- Deje enfriar a temperatura cachete y sirva en cajas de petri, en el caso de


los tubos sirva 5 o 6 mililitros con la pipeta.

- Para conservar los medios de cultivo, se colocarn en el refrigerador para


evitar que se daen y se contaminen. Se recomienda guardar los medios
dentro de bolsas de plstico selladas.

- Realizar la prueba de esterilidad para 2 cajas, una como control sin


esterilizar y una prueba de efectividad exponiendo la caja al ambiente.
PREGUNTAS

PREGUNTAS PRELABORATORIO

Qu efecto tiene el calor sobre los microorganismos?


Qu efecto tiene la luz ultravioleta sobre la clula (microorganismos)?
Defina desinfectante, antisptico, bactericida, liofilizacin,

PREGUNTAS COMPLEMENTARIAS

Haga un esquema del autoclave con sus partes y su funcin


Qu medidas propondra usted para verificar la efectividad de la
esterilizacin en el autoclave.
Esquematice etapas de esterilizacin en autoclave.
Mencione los dos tipos principales de esterilizacin y explique cada uno de
ellos.
Explique en un cuadro, cules son las diferencias entre los procesos de
esterilizacin, desinfeccin y asepsia. Cmo se relacionan stos
procedimientos con la Pasteurizacin?.
Qu caractersticas de un material o sustancia se requieren conocer para
elegir el mtodo adecuado de esterilizacin?
BIBLIOGRAFIA

Prcticas de esterilizacin y medios de cultivo.


http://www.enfermeraspabellonyesterilizacion.cl/trabajos/biologicos.pdf

Medios de cultivos en microbiologa general, autor Edith Armanetti de Stostz,


Editor. Universidad de la Repblica, Divisin Publicaciones y Ediciones, 1977.

Mtodos de investigacin fitopatolgica. Escrito por Teddy Theodore Hebert.

Manual bsico de microbiologa. CULTIMED

Manual de medios de cultivo Merck. Editorial Merck alemana 1994.

Manual prctico de Microbiologa general. Universidad de Pamplona 67p


http://ebooks-kings.com/pdf/manual-de-practicas-de-laboratorio-de-microbiologia-
general-80351.html.

http://www.bdigital.unal.edu.co/4999/1/albertorojastrivino.2011.pdf

http://www.izt.uam.mx/ceu/publicaciones/MMBG/files/manual_microbiologia_gener
al.pdf