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INFORME 8

CURVA DE CRECIMIENTO Y RECUENTO MICROBIANO DE E. COLI

LABORATORIO MICROBIOLOGÍA GENERAL

VIVIAN JULIETH MARTÍNEZ CIFUENTES

CRISTIAN CAMILO SALGUERO GOMEZ

OBJETIVOS

GENERAL

Realizar

análisis

del

microorganismos

ESPECIFICO

crecimiento

microbiano

y

cuantificación

de

Desarrollar técnicas comunes para medir el crecimiento de Escherichia coli.

Conocer las fases de crecimiento en un cultivo de Escherichia coli.

Conocer técnicas de cuantificación directa e indirecta de microorganismos.

Evaluar el pH del cultivo con el paso del tiempo.

RESULTADOS

Tiempo

UFC/ml

Log 10

pH

Absorbancia

UFC/ml

(540nm)

0

1,15E+07

7,061

7,03

0,135

0,5

1,73E+08

8,238

6,9

0,135

1

2,39E+09

9,378

6,96

0,355

1,5

6,32E+09

10,801

6,74

0,455

2

4,84E+11

11,685

6,73

0,594

4

4,50E+12

12,653

6,32

0,908

Tabla 1. Datos de UFC/ml, pH, Absorbancia a 540 nm y Log 10 (UFC/ml) para los diferentes tiempos del crecimiento de la cepa de E.coli.

5,40E+12 4,50E+12 3,60E+12 2,70E+12 1,80E+12 9,00E+11 0,00E+00 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
5,40E+12
4,50E+12
3,60E+12
2,70E+12
1,80E+12
9,00E+11
0,00E+00
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
UFC/ml

Tiempo (h)

Gráfica 1. Velocidad de crecimiento. UFC/ml en función del tiempo para una cepa de E.coli. Tendencia exponencial, las células se duplican en cada periodo de tiempo.

14 12 10 8 6 4 2 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
14
12
10
8
6
4
2
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Tiempo (h)
Log10(UFC/ml)

Gráfica 2. Curva de crecimiento de una cepa de E.coli, Log 10 (UFC/ml) en función del tiempo. Periodo de latencia y periodo exponencial.

8 7 6 5 4 3 2 1 0 0 0,5 1 1,5 2 2,5
8
7
6
5
4
3
2
1
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Tiempo (h)
pH
Gráfica 3. Curva de pH de una cepa de E.coli en función del tiempo. 1
Gráfica 3. Curva de pH de una cepa de E.coli en función del tiempo.
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
4,5
Tiempo (h)
OD

Gráfica 4. Curva de Absorbancia a 540 nm de una cepa de E.coli en función del tiempo.

Calculo

generación (g)

de

constante

de

velocidad

de

crecimiento

(k)

y

de

tiempo

de

Donde: n es el número de generaciones en un tiempo t.

N

0 es el número inicial de células.

N

t es el número de células en un tiempo t.

t es tiempo transcurrido.

k constante de velocidad de crecimiento

g tiempo de generación

Reemplazando en la ecuación 1 los valores de N 0 , N t , y t para nuestros valores se tiene

Con un

Y reemplazando en la ecuación 2 se tiene

Con un

DISCUSIÓN DE RESULTADOS

El aumento en el número de células bacterianas se denomina crecimiento, el cual al ser continuo ayuda a la preservación de las especies ya que cada célula microbiana tiene un tiempo de vida finito. El crecimiento celular bacteriano depende de un gran número de reacciones químicas las cuales ayudan a doblar la cantidad de todos los componentes celulares, la mayoría de los microorganismos crecen por fisión binaria con lo cual cada célula da origen a dos células idénticas, el tiempo que se demora cada célula en ese proceso se denomina tiempo de generación el cual difiere de acuerdo con cada microorganismo y depende del medio de crecimiento y las condiciones de cultivo [2]. Al modelo de crecimiento en el cual en cada periodo de tiempo se dobla la población se denomina crecimiento exponencial y una de sus características es que inicialmente el aumento en el número de células es lento y la velocidad de este va aumentando con el tiempo. Gracias a este modelo, en los casos que se conoce el número inicial y final de células, y el tiempo de crecimiento se puede calcular la velocidad específica de crecimiento (k) y el tiempo de generación (g) de una determinada población celular (ecuaciones 1 y 2 respectivamente)

[1].

Un ciclo completo de crecimiento de un microorganismo puede describirse mediante una curva de crecimiento la cual puede dividirse en cuatro diferentes fases: 1. Fase lag o de latencia en la cual hay un incremento en la actividad metabólica para el crecimiento, más no un incremento en la población. 2. Fase exponencial donde ocurre un incremento constante de la población. 3. La fase estacionaria la cual es una fase de equilibrio entre muertes celulares y producción de nuevas células. Las causas para que pare la fase exponencial pueden ser el agotamiento de nutrientes, la acumulación de productos de desecho y los cambios de pH. Y 4. Fase de muerte en la cual la población decrece [3].

El crecimiento de una población puede medirse teniendo en cuenta los cambios en el número de células, en la cantidad de algún componente de las mismas, o el peso seco de estas [2]. Los métodos pueden ser directos como conteo en microscopio utilizando una cámara de tipo Petroff-Hausser [3] o métodos indirectos tales como el recuento de células viables también denominado recuento en placa o recuento de unidades formadoras de colonias (UFC) en el cual se realizan diluciones de un volumen determinado del cultivo y cada dilución se siembra por extensión en placa en medio sólido el cual se incuba para después hacer el conteo [2], y el método turbidimétrico en el cual se mide la densidad óptica (OD) de una suspensión del cultivo a una determinada longitud de onda [1], siendo la OD directamente proporcional al número de células [2]. Las condiciones químicas y físicas del medio tales como temperatura, pH, disponibilidad de agua, disponibilidad de nutrientes y disponibilidad de oxigeno afectan las actividades de los microorganismos [1]. En el laboratorio se realizó seguimiento del crecimiento de un cultivo de Escherichia coli la cual es una bacteria Gram negativa, miembro de la familia Enterobacteriaceae, anaerobio facultativo, lactosa negativo, que crece usando fuentes simples de carbono como glucosa y acetato, de igual forma fermenta hexosa a una mezcla de ácidos y dióxido de carbono [4]. Las diferentes cepas de E.coli se clasifican basadas en sus factores de virulencia, cuadros clínicos y antígenos de superficie [5]. E.coli crece a temperaturas entre 7 y 46 ºC teniendo una temperatura optima entre 35 y ºC, de igual forma crece a pH neutro cercano a 7 y concentraciones de hasta el 6% de NaCl [6]. Se tomó una muestra de una cepa de E.coli la cual se transfirió a caldo BHI el cual tenía un pH de 7.4 ± 0.2 [7] y se mantuvo en agitación a una temperatura constante durante el tiempo de medición el cual fue de 4 horas, se tomaron 6 datos a tiempos diferentes a los cuales se les midió pH, OD y de cada uno se realizaron diluciones tomando 0.1 ml de muestra y sembrando en placas de agar BHI las cuales se incubaron a 37ºC durante 2 días y luego se realizó recuento de UFC. El cultivo presentó una fase de latencia de 0 a 1.5 horas como se evidencia en las gráficas 1 y 2, fase que se da debido al cambio de medio ya que las células deben adaptarse [8]. La fase exponencial se ve de 1.5 a 4 (gráficas 1 y 2) donde hay un gran aumento de las céulas debido a que estas ya se han adaptado al medio y usan los nutrientes de este [8]. En las mediciones realizadas no se evidenciaron fases estacionaria ni de muerte, se esperaba que la fase estacionaria iniciara después de la hora 5 [8]. Durante la fase estacionaria E.coli debido a que es no esporulado presenta cambios morfológicos y fisiológicos y se mantiene en un estado basal, disminuye el volumen y la célula se redondea, aumentan los compuestos de reserva y de osmoprotección y se regula la expresión de genes [9]. La cepa de E.coli presentó una constante de velocidad de crecimiento

12.9

minutos el cual está por debajo de lo indicado por algunos autores 20 minutos [1],[2],[3],[5] pero de igual forma esta cercano a valores entre 7 y 14 minutos reportados por otros autores [6] que usaron el mismo medio de cultivo BHI, condiciones de temperaturas de agitación y de incubación parecidas (±20 y

y un tiempo de generación de

37ºC respectivamente) y basándonos en los experimentos a pH cercano a 7.4. Esta diferencia en tiempos de generación pudo darse por diversos factores como la cepa utilizada, el medio de cultivo, el pH, la temperatura, entre otros, así como factores de manipulación ya que fueron muchos los experimentadores y mal conteo de UFC/ml. El pH del cultivo presentó una disminución (gráfica 3) lo cual pudo deberse a la producción de ácidos producto de la fermentación de azucares [4]. El recuento de microorganismos es de gran uso en la industria farmacéutica debido a que hay ciertos límites de aparición de estos en fármacos. Para E.coli los limites en formas farmacéuticas es de 10 3 UFC/ml [10].

CONCLUSIONES

A medida que aumenta el tiempo la población bacteriana va aumentando exponencialmente es por esto que las diluciones se aumentan lo cual ayuda a que las UFC/ml puedan ser cuantificadas.

La cepa de E.coli con la que se trabajó presentó una periodo de latencia en las 0 y las 1.5 horas.

Presento una fase exponencial entre las 1.5 y las 4 horas.

Tuvo una constante de velocidad de crecimiento de 4.64 y un tiempo de generación de aproximadamente 13 minutos.

El pH del cultivo disminuye con el tiempo debido a la producción de ácidos.

BIBLIOGRAFÍA

1. Willey, J. (2014). Prescott, harley, and klein's microbiology-9th international ed./Joanne M. willey, linda M. sherwood, christopher J. woolverton. New York: McGraw-Hill Higher Education.

2. Madigan, M. T., Martinko, J. M., & Parker, J. (2004). Brock. Biología de los Microorganismos. 10a edición.

3. Tortora, G. J., Funke, B. R., Case, C. L., & Johnson, T. R. (2013). Microbiology: an introduction (Vol. 11). San Francisco: Benjamin Cummings.

4. Encyclopedia of Food Microbiology. Encyclopedia of Food Microbiology.

5. BAUTISTA DE LEON, H. A. Y. D. E. E. (2012). MONITOREO DEL COMPORTAMIENTO DE ESCHERICHIA COLI GENERICA Y ESCHERICHIA COLI O157: H7 EN CALDO DE CULTIVO MEDIANTE PARAMETROS FISICOQUIMICOS Y DE CULTIVO (Doctoral dissertation).

6. Santos, A. D. (2007). Estudio del comportamiento cinético de microorganismos de interés en seguridad alimentaria con modelos matemáticos.

8. Garzón Ruiz, A. X., & Gómez Guerrero, J. A. (2008). Evaluación de la cinética de crecimiento para escherichia coli ATCC 25922, y estandarización de un método alternativo de preservación a corto plazo empleado buffer fosfato (Bachelor's thesis).

9. Santos, A. R., Ferrat, G. C., & Eichelmann, M. G. (2005). La fase estacionaria en la bacteria Escherichia coli. Rev, Latinoamericana Microbiología, 47, 92-101.

10. Farmacopea (2007) cap 1111 pagina 646 volumen 1 no se como poner
10. Farmacopea (2007) cap 1111 pagina 646 volumen 1 no se como poner

10. Farmacopea (2007) cap 1111 pagina 646 volumen 1 no se como poner

10. Farmacopea (2007) cap 1111 pagina 646 volumen 1 no se como poner esta cita por

esta cita por fa organizala

10. Farmacopea (2007) cap 1111 pagina 646 volumen 1 no se como poner esta cita por

11. Breed, R. (1957). BERGEY`S MANUAL Of Determinative Bacteriology. En N. Smith. pag. 336-338 Baltimore: The Williams and Wilkins Company.