Protocolos de extraccin de material gentico

1. Identificacin gentica de muestras de origen animal

1.1 Extraccin de DNA

La extraccin de material gentico desde muestras de plumas, cscaras de huevos de aves y garras,
fue realizado mediante la tcnica de extraccin mediante el uso de CTAB, modificado desde Murray
& Thompson, 1980.

Para llevar a cabo la tcnica de extraccin mencionada anteriormente, se homogenizaron 200 mg

de muestra de origen animal en 400 L de buffer de extraccin (100 mM Tris pH 8.0, 1,4 M NaCl,
50 mM EDTA, 2% CTAB) previamente calentado a 60C. Posteriormente, las muestras fueron
incubadas durante 24 horas a 60C.
Transcurrido el tiempo de incubacin, se adicionaron 200 L de cloroformo: alcohol isoamlico 24:1,
y se realiz vrtex durante 1 minuto. Luego, se llev a cabo la centrifugacin de las muestras a 8000
rpm durante 10 minutos a 20-25C.
Se extrajo cuidadosamente la parte superior del sobrenadante evitando tocar la interface y se
deposita en un nuevo eppendorf 1,5 ml. Se adicionaron en una proporcin 0,75 : 1 de isopropanol
helado, el cual debe ser mezclado suavemente con la muestra. Se dej incubar durante 24 horas a
-20C. Posteriormente, se realiz la centrifugacin de las muestras a 10000 rpm durante 10 minutos
a 4C. Se desech el sobrenadante y el pellet fue secado a 65C durante 20-30 minutos. Finalmente,
para re-suspender el DNA, se adicionaron 30 L de buffer TE (EDTA 1,0 mM, Tris-HCl 10 mM, pH=8)
y luego, fueron almacenadas a 4C.

1.2 Amplificacin gen COI-2 mediante PCR

Para la identificacin de las muestras de origen animal, se realiz la amplificacin de una regin del
gen de la citocromo C oxidasa (COI-2), utilizando como cebadores forward y reverse (cada uno de
ellos con una concentracin de 10 M) , dos cocktails de primers vertebrates (non-fish) descritos
por Ivanova et. al (2007). Estos cocktails (C_VF1 di y C_VR1 di) fueron elaborados mediante la mezcla
de tres primers: VF1/VF1d/VF1i en una proporcin 1:1:2 respectivamente. En el caso del cocktail
C_VR1, se mezclaron los primers VR1/VR1d/VR1i en una proporcin 1:1:2 respectivamente. Las
secuencias de cada uno de los cebadores utilizados se presentan a continuacin:

Tabla 1. Secuencias nucleotdicas de los cebadores utilizados para la preparacin de los cocktails
C_VF1 di y C_VR1 di, modificado desde Ivanova et.al, 2007.

Nombre cebador Secuencia nucleotdica 5-3

VF1 TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCAACCAACCACAAAGACATTGG
VF1d TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCAACCAACCACAARGAYATYGG
VF1i TGTAAAACGACGGCCAGTTCTCAACCAACCAIAAIGAIATIGG
VR1 CAGGAAACAGCTATGACTAGACTTCTGGGTGGCCAAAGAATCA
VR1d CAGGAAACAGCTATGACTAGACTTCTGGGTGGCCRAARAAYCA
VR1i CAGGAAACAGCTATGACTAGACTTCTGGGTGICCIAAIAAICA
El mix de reaccin de PCR de 25 l contena: 1 mM MgCl2, Dream Taq Green buffer 1X (con 20 mM
MgCl2) Thermo Scientific, 0,2 mM dNTPs, 2,5 U/ reaccin enzima Dream Taq polimerasa Thermo
Scientific, 0,2 M de cada uno de los cocktails C_VF1 di y C_VR di, descritos anteriormente.
El protocolo de amplificacin consisti en 2 programas de amplificacin, el primero de ellos posea
una denaturacin inicial a 94C por 1 minuto seguido de 5 ciclos a 94C por 30 segundos, 50C por
40 segundos, 72C por 1 min. El segundo programa consisti en 30 a 35 ciclos a 94C por 30
segundos, 54C por 40 segundos, 72C por 1 minuto y una elongacin final de 72C por 10 minutos.
La amplificacin se realiz en el termociclador 2720 Thermal cycler (Applied Biosystems). Los
productos PCR (5 l) fueron separados por electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer TAE a
100 V durante 50 min y visualizados mediante tincin con GelRed (Biotium). El amplicn esperado
posee 638 pb.

1.3 Anlisis de secuencias nucleotdicas de amplificados

Tras la realizacin de la amplificacin del gen COI-2, 20 L del producto PCR obtenido fueron
enviados a secuenciar a Macrogen Inc. (Corea). Posteriormente, las secuencias nucleotdicas
recibidas fueron editadas en el programa Bioedit (BioEdit 7.2) (Hall, 1999) y luego, fueron
comparadas con secuencias disponibles en la base de datos de The National Center for
Biotechnology (NCBI; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizando la herramienta BLAST
(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).

2. Identificacin gentica de muestras de origen vegetal

2.1 Extraccin de DNA

La extraccin de material gentico se llev a cabo a partir de muestras de hojas y tallos extradas de
diferentes nidos, las cuales se dejaron crecer durante un periodo de tiempo en las cmaras de
germinacin.

Para la extraccin se utiliz el kit DNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN), se homogenizaron 200 mg de
muestra en 360 L de buffer AP1 y 40 L de proteinasa K (20 mg/mL), llevndolo a incubacin
durante 3 horas a 55C. Una vez transcurrido el tiempo de incubacin se adicionaron 4 L de RNasa
A (100 mg/mL) a cada una de las muestras y se incubaron a temperatura ambiente durante 5
minutos. Posteriormente,
2.2 Amplificacin gen rbcL mediante PCR

Para la identificacin de las muestras de origen vegetal, se realiz la amplificacin de la regin del
gen que codifica la subunidad grande la enzima ribulosa-1,5-bisfosfato carboxilasa/oxigenasa (gen
rbcL), utilizando como cebadores forward y reverse descritos en Bafeel et. al (2007) y cuyas
secuencias se describen a continuacin:

Tabla 2. Secuencias nucleotdicas de los cebadores utilizados para la amplificacin del gen rbcL,
modificado desde

Nombre
cebador Secuencia nucleotdica 5-3
rbcLa F ATGTCACCACAAACAGAGACTAAAGC
rbcLa R TGTAAAATCAAGTCCACCRCG

El mix de reaccin de PCR de 25 l contena: 1 mM MgCl2, Dream Taq Green buffer 1X (con 20 mM
MgCl2) Thermo Scientific, 0,2 mM dNTPs, 2,5 U/ reaccin enzima Dream Taq polimerasa Thermo
Scientific, 0,2 M de cada uno de los cebadores descritos anteriormente.
El programa de amplificacin consisti de una denaturacin inicial a 92C por 3 minutos seguido de
35 ciclos de 20 segundos de denaturacin a 92C, 20 segundo a 55C y 90 segundo a 72C con una
elongacin final de 72C durante 5 minutos. La amplificacin se llev a cabo en el termociclador
2720 Thermal cycler (Applied Biosystems). Los productos PCR (5 l) fueron separados por
electroforesis en gel de agarosa al 1% en buffer TAE a 100 V durante 50 min y visualizados mediante
tincin con GelRed (Biotium). El amplicn esperado posee 553 pb.

1.3 Anlisis de secuencias nucleotdicas de amplificados

Tras la realizacin de la amplificacin del gen rbcL, 20 L del producto PCR obtenido fueron enviados
a secuenciar a Macrogen Inc. (Corea). Posteriormente, las secuencias nucleotdicas recibidas fueron
editadas en el programa Bioedit (BioEdit 7.2) (Hall, 1999) y luego, fueron comparadas con
secuencias disponibles en la base de datos de The National Center for Biotechnology (NCBI;
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) utilizando la herramienta BLAST (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/).