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TCNICA DEL SUDN III

La tcnica del sudn III es un mtodo utilizado generalmente para demostrar la presencia de
grasas mediante tincin de triglicridos, aunque tambin tie otros lpidos.

Pertenece al grupo de colorantes indiferentes, que son aquellos que no tienen afinidad por
estructuras cidas o bsicas. Son insolubles en el agua y tien aquellas sustancias que tienen
un poder de disolucin superior al del lquido empleado para preparar la solucin colorante.

FUNDAMENTO
Los colorantes para grasas son ms solubles en las propias grasas que en el medio en el que
van disueltos. As, al baar la grasa con la solucin del colorante, ste tiende a disolverse en la
grasa que se va cargando del colorante. Por regla general estos colorantes siempre van en
solucin alcohlica o bien en una mezcla de alcohol/acetona o alcohol/agua.

TEJIDO CONTROL Y DIANA


El tejido diana para esta tcnica es el tejido adiposo y lpidos en general. El fijador ideal es el
formol 10%, y el grosor ptimo de corte es de 4 a 6 micras.

REOS
1. Sudn III.
2. Escarlata.
3. Hematoxilina o carmn.

PROCEDIMIENTO
1. Desparafinar e hidratar.
2. Lavar en agua destilada.
3. Aadir sudn III + 40 gotas de rojo escarlata, de 1 a 24 horas.
4. Lavar con agua corriente.
5. Aadir hematoxilina o carmn (para el contraste), 5-10 minutos.
6. Lavar en agua corriente, 5 minutos.
7. Montar.

RESULTADOS
Color inicial:

Grasa: rojo.
MTODO DE BIURET
Se basa en la formacin de un complejo coloreado entre el Cu2+ y los grupos NH de los enlaces
peptdicos en medio bsico. 1Cu2+ se acompleja con 4 NH. La intensidad de coloracin es
directamente proporcional a la cantidad de protenas (enlaces peptdicos) y la reaccin es
bastante especfica, de manera que pocas sustancias interfieren. La sensibilidad del mtodo es
muy baja y slo se recomienda para la cuantificacin de protenas en preparados muy
concentrados (por ejemplo en suero).

PROTOCOLO A REALIZAR
Aadir 1 ml del reactivo de biuret a los tubos estndar y muestras problemas preparadas como
se indica en la Tabla III. Dejar a temperatura ambiente y leer la Absorbancia a 545 nm frente al
blanco. El color es estable 1 hora.

- Representa la curva estndar.

- Calcula el coeficiente de extincin.

- Calcula las concentraciones de protenas de las muestras M1 y M2.

RESULTADOS ESPERADOS
El mtodo de Biuret (poco sensible) permitir cuantificar la cantidad de protenas en la
muestra M1 pero no en la M2.

REACTIVO DE BIURET

Reactivo preparado del siguiente modo. Disolver 3,8 g de CuSO4.5H2O y 6,7 g NaEDTA en 700
ml de H2O. Mientras se agita aadir 200 ml de NaOH 5N y luego 1g de KI como estabilizante.
Guardar en frasco de plstico.
PRUEBA DEL YODO
La prueba del yodo es una reaccin qumica usada para determinar la presencia o alteracin de
almidn u otros polisacridos. Una solucin de yodo - diyodo disuelto en una solucin acuosa
de yoduro de potasio - reacciona con almidn produciendo un color prpura profundo.

Este tipo de prueba puede realizarse con cualquier producto que contenga almidn como ser
patatas, pan o determinados frutos.

Esta reaccin es el resultado de la formacin de cadenas de poliyoduro a partir de la reaccin


del almidn con el yodo presente en la solucin de un reactivo llamado Lugol. La amilosa, el
componente del almidn de cadena lineal, forma hlices donde se juntan las molculas de yodo,
formando un color azul oscuro a negro. La amilopectina, el componente del almidn de cadena
ramificada, forma hlices mucho ms cortas, y las molculas de yodo son incapaces de juntarse,
obtenindose un color entre naranja y amarillo. Al romperse o hidrolizarse el almidn en
unidades ms pequeas de carbohidrato, el color azul-negro desaparece. En consecuencia, esta
prueba puede determinar el final de una hidrlisis, cuando ya no hay cambio de color
constituyendo una evidencia experimental ampliamente utilizada.

La solucin de yodo tambin reacciona con el glucgeno, aunque el color producido es ms


castao y mucho menos intenso.

Esta prueba se utiliza como indicador del grado de madurez de los frutos. El fruto cuando est
inmaduro contiene altas cantidades de almidn, que son detectadas a travs de la tincin con
la prueba de almidn, apareciendo como grandes zonas en el fruto teidas de azul. Mientras
que cuando un fruto esta maduro, ese almidn se ha transformado en azcares y por lo tanto
no se tie en la prueba.

En la industria, la hidrlisis del almidn es ampliamente utilizada para producir glucosa a partir
del almidn presente en la pulpa del fruto de banano verde. El proceso consta de tres etapas:

1. Gelatinizacin:

Consiste en calentar los grnulos de almidn en agua y separar la amilosa de la amilopectina.


(Lixiviacin).

2. Dextrinizacin:

Luego de la gelatinizacin del almidn, se procede a obtener polisacridos de bajo y alto peso
molecular (maltodextrinas) aplicando una hidrolizacin parcial.

Las dextrinas tambin pueden experimentar cambio de coloracin cuando reaccionan con una
solucin de yoduro de potasio. La coloracin obtenida va a depender del grado de hidrlisis de
la molcula, (en este caso se trata de macromolculas las cuales estn conformadas por una
cantidad importante de tomos en su estructura).

3. Sacarificacin:
En esta etapa, se hidrolizan totalmente las maltodextrinas a glucosa, completndose el proceso.

En el procedimiento industrial anteriormente detallado, puede utilizase la prueba de yodo para


realizar seguimiento de las reacciones de hidrlisis. Cuando el almidn se degrada totalmente a
glucosa, ya no se obtiene la coloracin azul oscura que caracteriza a la reaccin entre el almidn
y la solucin de yodo-yodurada.