DETECCIN DE MICROORGANISMOS MEDIANTE

MTODOS MOLECULARES

R. Rodrguez-Herrera*, C. N. Aguilar-Gonzlez, L. A. Ayala-Labarrios, J.C. Rocha-Revilla, V.

Padilla-Garca, y T. C. Espinosa-Hernndez

Laboratorio de Microbiologa y Biologa Molecular. Facultad de Ciencias Qumicas. Universidad

Autnoma de Coahuila .

Saltillo Coahuila. Mxico.* Correspondencia rrh961@hotmail.com

RESUMEN

Los microorganismos juegan un rol muy importante para el humano dado que son benficos
para su salud o economa (vg. Probiticos, fijadores de nitrgeno etc) o bien patgenos para el
humano, o bien de los animales y plantas econmicamente importantes. Dado lo anterior se
han desarrollado una serie de metodologas para poder diferenciar un microorganismo de
otro, y para poderlos identificar. Estas metodologas se ha basado tradicionalmente en la
observacin de los sntomas que presentan los hospederos, en la observacin macro o
microscpica del microorganismo o bien de las estructuras reproductivas de los
microorganismos, del desarrollo del patgeno en un medio de cultivo especifico, de la tincin
producida al aplicar algunos colorantes sobre el tejido infectado, o bien sobre el patgeno y la
reaccin de un anticuerpo a la presencia de un patgeno. Estas metodologas son buenas en
algunos casos pero deficientes en otros casos por lo que en las ltimas tres dcadas se han
desarrollado tcnicas moleculares de deteccin e identificacin de microorganismos las cuales
se basan en el anlisis de los cidos nucleicos extrados de los microorganismos en forma
directa o bien de una muestra conteniendo el microorganismo en cuestin. Dentro de las
ventajas de las tcnicas moleculares de deteccin se encuentran: Especificidad (pueden
detectar solo la molcula o microorganismo de inters), 2.- Sensibilidad (son capaces de
detectar la presencia de un solo microorganismo), 3.-Rapidez (se puede identificar un
microorganismo en menos de 24 horas) y 4.- Pueden ser automatizadas (permiten tener un
diagnstico en un menor tiempo y reducir los costos). El objetivo del presente trabajo es
describir las principales tcnicas moleculares en la deteccin e identificacin de
microorganismos as como sus ventajas y desventajas.

INTRODUCCIN

Los microorganismos juegan un papel muy importante en la vida del ser humano dado que no
solo son patgenos a los animales, plantas o seres humanos sino que muchos de ellos son
benficos ya que pueden ser utilizados para controlar otros microorganismos, insectos,
animales o plantas dainas para el hombre o su economa. Tambin los microorganismos
pueden tambin ayudar a mejor el nivel de vida de los seres humanos como en el caso de los
prebiticos y bacterias utilizadas en el yogurt. Por otra parte pueden ser utilizados para la
produccin de alimentos para humanos o animales, como el caso de los hongos comestibles
(championes, setas, huitlacoche, etc.) o en la fermentacin de alimentos como el queso, vino,
pan etc. Adems pueden ser utilizados para rehabilitacin del medio ambiente (bacterias
degradadoras de hidrocarburos, tratamientos de aguas residuales etc.). Los microorganismos
pueden ser utilizados para la produccin de metabolitos de importancia econmica
(antibiticos, pigmentos, aminocidos, hormonas etc.). En la Agricultura, los microorganismos
son utilizados por ayudar en el buen desarrollo de los cultivos (Bacterias fijadoras de
nitrgeno, micorrizas, etc).

En epidemiologa es muy importante la identificacin no solo del microorganismo en cuestin

sino que muchas veces la identificacin a nivel de cepas o razas ayuda a: 1.- Determinar el
causante del brote infeccioso, 2.- Detectar la transmisin cruzada de patgenos, 3.-
Determinar la fuente de infeccin, 4.-Reconocer cepas particularmente virulentas de
organismos y 5.- Monitorear los programas de vacunacin (Olive y Bean, 1999). En el rea
clnica y en la agricultura, la base para un tratamiento efectivo y cura de un paciente, animal o
planta es el diagnstico rpido de la enfermedad y su agente causal (Reischl, 1996). Esto es
especialmente importante cuando se pretende diagnosticar microorganismos difciles de tratar
o con crecimiento muy lento tales como Clamidia, micobacterias, micoplasmas, virus del
Herpes y enterovirus (Louie y col. 2000). En investigaciones ecolgicas una identificacin
rpida y correcta de los microorganismos ayuda a la cuantificacin de organismos y a la
caracterizacin de su actividad en diferentes hbitats (Jan y LeBorgne, 2001). El objetivo del
presente escrito es recalcar la importancia de las tcnicas moleculares en la identificacin de
microorganismos, describir algunas de las tcnicas moleculares ms utilizadas, as como
algunas tcnicas con mayor potencial para aplicarse en el diagnstico molecular de
microorganismos a corto plazo y relacionar lo anterior con algunos logros obtenidos en
nuestro laboratorio.

MTODOS DE IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS

Dado la gran importancia de los microorganismos para el ser humano, se han desarrollado una
serie de metodologas para poder diferenciar un microorganismo de otro. Las cuales se ha
basado tradicionalmente en la observacin de los sntomas que presentan los hospederos, en
la observacin macro o microscpica del microorganismo o bien de las estructuras
reproductivas de los microorganismos, del desarrollo del patgeno en un medio de cultivo
especifico, de la tincin producida al aplicar algunos colorantes sobre el tejido infectado, o
bien sobre el patgeno y la reaccin de un anticuerpo a la presencia de un patgeno.

La identificacin de un microorganismo (patgeno) basada en los sintomatologa presenta

varias desventajas como por ejemplo, los sntomas son muy variados y numerosos; dependen
del hospedero del patgeno, e incluso de los factores del medio ambiente en el que se
desarrolla el proceso patolgico. Debido a lo anterior la identificacin de patgenos basada
solo en los sntomas puede dar origen a errores graves en el diagnstico de una enfermedad
dado que dos diferentes patgenos pueden producir los mismos sntomas en el mismo
hospedero, el mismo patgeno puede producir diferentes sntomas en diferentes hospederos
y aun los sntomas pueden variar dependiendo del medio ambiente donde se desarrolla el
proceso patolgico.

La deteccin de un microorganismo basada en la observacin macro o microscpica es ms

eficiente que la identificacin basada solo en los sntomas. La observacin a nivel macro o
microscpico es un procedimiento simple, es una deteccin directa de patgenos y puede
diferenciar organismos distintos morfolgicamente. Presenta las siguientes desventajas: 1.- Es
un procedimiento lento, 2.- Laborioso y 3.-Tedioso dado que se tiene que aislar el
microorganismo (lo cual no en todos los casos es posible) y poner a crecerlo en un medio de
cultivo hasta que se alcance un tamao o una etapa de crecimiento adecuada para su
identificacin. La identificacin en forma microscpica solo es posible en casos muy
especficos. Es de baja sensibilidad. Se requiere contar con equipo muy especializado para la
identificacin a nivel microscpico de algunos microorganismos (virus, micoplasmas, viroides,
priones). La estructura de un microorganismo puede cambiar debido a la influencia del medio
ambiente, y se requiere de una gran experiencia para poder diferenciar una especie de otra a
nivel microscpico.

La identificacin de patgenos por medio de tinciones o del desarrollo del patgeno en un

medio de cultivo especifico, puede detectar un amplio rango de variantes, no requiere de
equipo muy sofisticado, son pruebas fciles de realizar. Sin embargo presenta las desventajas
de que el tiempo para identificar un microorganismo puede ser muy largo (en algunos casos
hasta de 25 das), adems se requieren un gran nmero de pruebas para estar seguro de la
identificacin del patgeno (una sola prueba no es suficiente en la mayora de los casos). Por
usarse diferentes pruebas, se utilizan una amplia gama de reactivos, lo cual incrementa el
costo de la prueba significativamente. Otros procedimientos como el cultivo in vitro e
inoculacin en ratones son tcnicas costosas y los patgenos pueden presentar diferencias en
infectividad dependiendo del hospedero.

El uso de anticuerpos para la identificacin de microorganismos se ha empleado por ser una

tcnica simple y rpida. Se puede automatizar, y puede ser usada para trabajar con varias
muestras al mismo tiempo. Sin embargo la deteccin no puede ser precisa cuando existen
cantidades mnimas de microorganismos, en el caso de patgenos no distingue entre
infecciones activas y latentes. Adems se carece de anticuerpos y antgenos para muchos
microorganismos y en algunos casos la deteccin no es precisa por la nula especificidad de
algunos anticuerpos. Otras desventajas son que los anticuerpos tienen un costo muy elevado o
bien en algunos casos pueden ofrecer falsos positivos, como por ejemplo en la primera
generacin de pruebas para la deteccin de VIH, las cuales estaban basadas en preparaciones
puras del antgeno viral derivadas del cultivo del virus, y se obtenan falsos positivos, debido a
la presencia de antgenos celulares residuales los cuales fueron incorporados dentro de
partcula viral durante la maduracin (Reischl, 1996).
Las tcnicas moleculares se basan en el anlisis de los cidos nucleicos extrados de los
microorganismos en forma directa o bien de una muestra conteniendo el microorganismo en
cuestin.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS MTODOS MOLECULARES

En la actualidad las tcnicas moleculares para la identificacin de microorganismos estn

teniendo un auge muy importante debido a: 1.- Especificidad (pueden detectar solo la
molcula o microorganismo de inters), 2.- Sensibilidad (son capaces de detectar la presencia
de un solo microorganismo), 3.-Rapidez (se puede identificar un microorganismo en menos de
24 horas) y 4.- Pueden ser automatizadas (permiten tener un diagnstico en un menor tiempo
y reducir los costos). El uso de tcnicas moleculares ha permitido identificar nuevos
microorganismos, los cuales no haba sido posible su cultivo e identificacin por tcnicas
tradicionales (Jan y LeBorgne, 2001). Adems permiten estudiar las poblaciones microbianas
sin hacer aislamientos, por lo tanto, se evitan los sesgos que pueden surgir con el cultivo de
microorganismos (Chan y col., 2002). As mismo estas tcnicas permiten la deteccin de
microorganismos altamente patgenos, los cuales pueden ser identificados muertos evitando
as los riesgos de infeccin del analista (Johansson y col., 2000). Las tcnicas moleculares han
demostraron ser muy tiles en situaciones clnicas donde los mtodos convencionales son muy
insensitivos (v.g. durante la etapa asintomtica de las infecciones del VIH), muy lenta (cultivo
micobacterial) o muy complicados para ser usados a gran escala (v.g. aislamiento viral). Otra
aplicacin importante es en el monitoreo del surgimiento de mutaciones en el genoma, por
ejemplo, la seleccin de variantes resistentes durante la terapia antiviral/antibitica (Reischl,
1996).

Algunas de las desventajas asociadas a las tcnicas moleculares son: 1.-No distinguen entre
organismos vivos y muertos, aunque algunas veces esto no es precisamente una desventaja en
el caso de Staphylococcus aureus la bacteria muere a temperaturas que no degradan la toxina
as la deteccin de la bacteria muerta es un indicativo de la presencia de toxinas en la muestra.
2.-Se tiene que contar con conocimientos de secuencias de nucletidos especificas del
patgeno diagnosticar, 3.-Se requiere de personal altamente capacitado para el desarrollo de
las pruebas de identificacin, 4.-Se requiere equipo mas especifico para el diagnostico, lo cual
eleva la inversin inicial, y 5.-Se desarrollan procedimientos con mltiples etapas, lo que
incrementa la posibilidad de errores, adems de la posibilidad de obtener falsos positivos y
falsos negativos. El alto costo de las tcnicas moleculares tendera a bajar a medida que se
incremente el uso de estas tcnicas. Por otra parte el problema de falsos positivos y falsos
negativos se puede solucionar si se incluye en cada anlisis un testigo positivo y un testigo
negativo (Ayala y col., 2004).

DETECCIN MOLECULAR DE MICROORGANISMOS

Se han propuesto una gran variedad de tcnicas moleculares para la deteccin de
microorganismos. Describir cada una de las tcnicas propuestas escapa de los alcances de este
escrito. Por lo que solo se abordaran las ms usadas comercialmente. Una de las tcnicas
moleculares ms sencillas para identificar bacterias consiste en determinar el porcentaje de
guaninas y citosina presente en su ADN. En este caso se realiza la extraccin del ADN de una
colonia pura y por espectrometra se determina el porcentaje de guanina y citosina. En el
gnero Pantoea se ha estimado un porcentaje de guanina y citosina que va del 50 al 58% y en
bacterias del gnero Pseudomona un porcentaje va del 58 al 70%. Esta tcnica tiene la
desventaja de no poder identificar especies, solo se pueden identificar bacterias a nivel de
gnero, adems algunos gneros de bacterias presentan porcentajes de guaninas y citosina
muy similares, por lo cual, las posibilidades de obtener falsos positivos (identificar a un
organismo presente cuando en realidad esta ausente) se incrementan. La mayora de las
tcnicas moleculares se basan en la hibridacin de los cidos nucleicos o bien en la reaccin en
cadena de la polimerasa (PCR).

a).- Tcnicas basadas en hibridacin de ADN

Estas tcnicas se desarrollaron a partir del conocimiento de que dos cadenas sencillas de cido
nucleico que tengan secuencias complementarias se pueden unir o hibridar para formar una
cadena doble. Las cadenas sencillas pueden ser de ADN o ARN, o bien una de ADN y otra de
ARN. Dentro de las tcnicas de hibridacin mas utilizadas esta los fragmentos de restriccin de
longitud polimrfica (RFLPs).

RFLPs. Esta tcnica est basada en hibridacin de ADN. Consiste en extraer ADN de un cultivo
puro de un microorganismo o bien de una muestra infectada y digerir el ADN con enzimas de
restriccin (enzimas que cortan el ADN en sitios especficos), posteriormente estos
fragmentos de ADN son separados en un gel de agarosa utilizando electroforesis. El ADN est
cargado negativamente, por lo tanto, en un campo elctrico el ADN migrara del polo negativo
hacia el polo positivo a travs de la matriz de un gel. La friccin entre el fragmento y la matriz
ocasiona que fragmentos pequeos migren ms rpido que fragmentos grandes. En esta
tcnica el ADN separado de la forma antes descrita en la gel, es transferido a un soporte
slido (membranas de nylon o nitrocelulosa), acto seguido se hibridiza el ADN de la
membrana con una sonda de ADN especifica (fragmento de ADN de cadena sencilla de 150 a
300 nucletidos) del microorganismo que se quiere identificar. La sonda va a unirse en el
fragmento del ADN que tenga su complemento. La sonda para la deteccin tiene que ser
marcada en forma radioactiva (P32) o no radioactiva (digoxigenina). La sonda puede ser
aislada del genoma nuclear, del genoma mitocondrial o bien de ADN que codifica para
protenas (ADNc) del microorganismo. Esta metodologa es muy especfica. Sin embargo, no es
muy rpida ni muy sensible (se requiere 103 a 106 copias de la molcula o secuencia de inters
para dar un resultado confiable), adems de que se requiere utilizar radioactividad (si no es
empleada adecuadamente y bajo condiciones especiales de laboratorio, se pueden tener
riesgos de salud del analista, contaminaciones de instalaciones o del medio ambiente).
Una variante de RFLP`s se ha diseado para la deteccin de Listeria. Esta consiste en fijar en un
microtubo una sonda de ADN complementaria a una regin del RNA ribosomal de la bacteria.
El RNA completo de la muestra es extrado y colocado en el microtubo con la sonda, la cual se
unir al RNA ribosomal, posteriormente se agrega otra sonda de ADN complementaria a otra
regin del RNA ribosomal la cual est marcada con florescencia posteriormente se detecta la
presencia del microorganismo por un anticuerpo con anti-florescencia (Giese, 2001).

Transferencia por aplastado (squash blot). En esta tcnica la muestra a analizar se aplasta
contra un soporte slido originando una huella, la muestra se fija utilizando alcohol o
exponindola a UV. Se hibridiza con la sonda especfica para el microorganismo en cuestin.
Tiene la ventaja de ser una tcnica rpida, que puede ser utilizada en campo o fuera de
laboratorio. Sin embargo es una tcnica sucia, lo cual a veces no permite distinguir una
hibridacin de cidos nucleicos, con lo cual las probabilidades de obtener falsos negativos
(diagnosticar el microorganismo como ausente cuando en realidad est presente) se
incrementan. Otra de las tcnicas son: Transferencia de punto (dot blot) similar a squash blot
y Northern blot similar a RFLPs sin embargo lo que se separa es ARN y se hibridiza con sondas
de ADN presenta ventajas y desventajas similares a RFLPs.

ARN de cadena doble. Esta tcnica se utiliza principalmente para detectar clulas infectadas
con un virus que tenga como material gentico ARN (retrovirus). Dado que el ARN en una
clula se encuentra como cadena sencilla, la presencia de ARN de cadena doble implica la
replicacin del virus dentro de la clula. Esta es una tcnica relativamente sencilla, dado que
incluye pocas etapas (extraccin y purificacin del ARN de cadena doble y su separacin en
geles de poliacrilamida). Sin embargo, presenta la desventaja de identificar solo clulas
infectadas con retrovirus, sin poderse especificar la taxonoma del virus, por lo tanto es una
tcnica muy limitada.

b).- Tcnicas basadas en PCR

La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) o la amplificacin enzimtica in vitro de un

segmento de ADN especfico del microorganismo blanco. Esta es la tcnica ms utilizada para
la deteccin de microorganismos, se basa principalmente en realizar millones de copias de un
segmento de ADN especfico de un microorganismo. En esta tcnica la cadena doble de ADN
es separada en dos cadenas sencillas sometindola a temperaturas mayores a 92 grados
centgrados despus se hibridiza o alineen dos pequeos segmento de ADN
complementarios uno a una cadena y el otro a la otra. Estos pequeos segmentos son
llamados iniciadores, los cuales deben de ser diseados de tal manera que solo hibridisen
con el ADN del microorganismo que se desee y su tamao generalmente va de 18 a 25 bases.
Una vez que los iniciadores estn unidos a las cadenas complementarias se adiciona a la
reaccin una ADN polimerasa la cual va a formar la nueva cadena tomando como bases la
cadena sencilla y uno de los extremos del iniciador (3). Despus de este primer ciclo, si se
parti de una sola cadena doble de ADN se tendran dos cadenas dobles. Esta amplificacin se
incrementa en forma geomtrica a medida que se repite el numero de ciclos, as despus de
dos ciclos tendramos cuatro cadenas dobles de ADN, y despus de tres, ocho y as
sucesivamente, despus de treinta ciclos tendramos una gran cantidad de ADN amplificado
para ser visualizado a simple vista. Las ventajas de PCR sobre otras tcnicas de deteccin se
han reportado en varias ocasiones. La deteccin de C. trachomatis por PCR resulto ser mas
precisa, con sensibilidad de 90-100% y especificidad mayor al 97% que la deteccin por ELISA
(Louie y col., 2000). As mismo la PCR ha ayudado a identificar microorganismos infecciosos
relacionados a enfermedades previamente identificadas como de origen no infeccioso.

La tcnica de PCR se ha utilizado para la identificacin de virus, bacterias hongos, fitoplasmas

nematodos etc. Un ejemplo es el mtodo desarrollado por Ayala y colaboradores 2004, para la
identificacin de la bacteria Clavibacter michiganensis subs. nebraskensis, la cual es causante
de la enfermedad conocida como marchites bacteriana del maz, en este caso se disearon
iniciadores especficos a un segmento entre los genes de rRNA 16 S y 23S. Dichos iniciadores
se compararon con las secuencias de ADN reportadas en los bancos de genes para comprobar
que solo se alinearan a la secuencia de Clavibacter michiganensis subsp nebraskensis. La
precisin y reproducibilidad de los ensayos de PCR depende de la experiencia tcnica y
experiencia de analista. La especificidad de la prueba puede ser afectada por la contaminacin
de la muestra durante su procesamiento. Si los iniciadores no son especficos o si las
condiciones de la PCR no son optimas, se pueden amplificar productos no especficos (Louie y
col., 2000). Lo anterior puede guiar a la deteccin de falsos negativos, de la misma manera la
contaminacin de la muestra con inhibidores (cidos hmicos, polifenoles, carbohidratos,
etanol, etc) de la enzima polimerasa puede ocasionar tambin falsos negativos. Sin embargo
esto se puede solucionar incorporando siempre controles positivos. La contaminacin de la
muestra con otro ADN o RNA, puede conducir a la deteccin de falsos positivos, esto se
soluciona agregando siempre un control negativo (Ayala y col., 2004). La identificacin de
microorganismos directamente de alimentos utilizando PCR presenta algunas retos como es la
baja sensibilidad provocada por la inhibicin debida a la matriz del alimento, esto puede ser
parcialmente restablecida con una etapa de enriquecimiento pero se alarga el tiempo para el
diagnostico (Grant y col., 1993). Aun con estas desventajas, la flexibilidad, automatizacin,
rapidez y confiabilidad de las tcnicas moleculares basadas en PCR son las tcnicas
moleculares con ms aceptacin en la actualidad para la deteccin de microorganismos en
general.

RT-PCR (amplificacin de un segmento de ADN previamente formado a partir de ARN). Esta es

una de las tcnicas ms utilizadas para identificar microorganismos cuyo material gentico es
ARN (retrovirus y viroides). En este caso se extrae primeramente ARN del microorganismo en
cuestin o bien de una muestra presuntamente infectada por uno de estos microorganismos,
acto seguido el ARN se somete a una temperatura generalmente de 80 0C para linearizar el
ARN dado que es por lo general una cadena sencilla y tiende a formar estructuras secundarias
y terciarias. Posteriormente se le aade un iniciador complementario y se coloca a una
temperatura entre 37 y 40 oC para que se alinee el iniciador con la cadena complementaria,
posteriormente se coloca la reaccin a 4oC con lo cual se detiene esta. Despus se coloca
una enzima denominada reverso transcriptasa la cual se va a encargar de formar ADN
tomando como molde el ARN de cadena simple y un extremo ( 3) del iniciador cuando el ADN
ya ha sido formado se procede a realizar la reaccin del PCR, esta tcnica puede ser realizada
en un solo paso si se aaden todos los reactivos en un mismo tubo y se programan las
temperaturas especificas y para cada etapa. Un ejemplo de un microorganismo que puede ser
fcilmente identificado utilizando esta tcnica es el virus de la tristeza de los ctricos. Otra de
las ventajas de esta tcnica en la deteccin de microorganismos es que permite identificar
infecciones activas (Louie y col., 2000).

PCR anidada (amplificacin enzimtica de un segmento de ADN interno de un segmento de

ADN previamente amplificado). La PCR anidada es una tcnica que se utiliza principalmente
cuando un microorganismo se encuentra en muy bajas cantidades o bien cuando se quiere
identificar si en una muestra existen microorganismos de un determinado grupo y despus
determinar que especies de microorganismos de ese grupo estn presentes. Esta tcnica
consiste en amplificar un segmento grande de ADN (700-2000 pb) por la tcnica de PCR con
un par de iniciadores y posteriormente amplificar con otro par de iniciadores un segmento
interno del primer fragmento amplificado es decir esta tcnicas es una PCR doble y por lo
tanto se estima que es mil veces ms eficiente que una PCR simple. La PCR anidada se ha
utilizado con xito para la identificacin de muestras presuntamente infectadas con
fitoplasmas, y si la muestra es positiva a la presencia de fitoplasmas. Se amplifica por segunda
ocasin para determinar el tipo especfico de fitoplasmas presente en dicha muestra. Un
ejemplo del uso de esta tcnica es la deteccin del fitoplasma del amarillamiento letal del
cocotero.

RAPDs o polimorfismo del ADN amplificado al azar en este caso se realiza una reaccin de PCR
con un solo iniciador el cual tiene un tamao de 8 a 12 bases con secuencia arbitraria. En la
etapa de alineamiento del iniciador se emplean temperaturas bajas 37 a 40 oC para asegurar
que el iniciador se una a diferentes regiones del genoma del microorganismo que se desee
identificar. En este caso la identificacin se realiza solo de cultivos puros del microorganismo y
con una sola reaccin del PCR se amplifican varios segmentos a la vez (Figura 1). Tiene la
ventaja de que no se requiere conocimientos previos del microorganismo para poderlo
identificar, esta tcnica como mtodo de identificacin a nivel comercial no es muy utilizada
debido a los problemas de reproducibilidad, sin embargo es muy til cuando se requiere
determinar diferencias entre 2 microorganismos altamente emparentados pudindose
detectar estas diferencias aun a nivel de cepa. Padilla en el 2003 utilizando RAPDs logro
identificar diferencias a nivel de ADN entre 3 cepas del Aspergillus niger degradadoras de
taninos. Otra ventaja de los RAPDs es en el caso donde se logra identificar un fragmento de
ADN amplificado que se encuentre en una cepa en particular, este se puede secuenciar y se
pueden disear a partir de esa secuencia iniciadores especficos para esa cepa. Lo mismo
aplica para el diseo de iniciadores especficos a nivel de especie o de gnero esta tcnica es
conocida como SCAR (secuencia caracterizada de regin amplificada) (Figura 2). Adems de la
desventaja de poca reproducibilidad, la presencia de una banda RAPD, no permite distinguir
entre los estados homocigoto y heterocigoto (Babalola, 2003). Una tcnica similar a RAPD`s es
la conocida como amplificacin de huellas genmicas del ADN (DAF), en esta tcnica se utilizan
iniciadores de 5-10 bases para amplificar ADN genmico al azar, las bandas amplificadas se
separan en geles de poliacrilamida. Esta tcnica se ha utilizado para el estudio de cepas de
Salmonella enterica (Babalola, 2003)
Figura 1.- Polimorfismo del ADN amplificado al azar.

Figura 2.- Secuencia caracterizada de una regin amplificada

Inmuno-PCR (unin de un microorganismo a un soporte slido utilizando un anticuerpo y una

posterior amplificacin de ADN por PCR). Es una tcnica que combina las ventajas de las
tcnicas inmunolgicas (ELISA) y de las tcnicas moleculares (PCR) para que las ventajas
combinadas, disminuyan o eliminen las desventajas de ambas tcnicas. Rocha en el 2003,
menciona que ELISA es ineficiente en la deteccin cuando se presentan niveles muy bajos de
la molcula o microorganismo de inters en la muestra a analizar, mientras que la PCR se ve
inhibida por algunos componentes de la muestra (compuestos fenlicos, polisacridos etc.).
Estas caractersticas se combinan cuando se desea detectar microorganismos cuarentenados
directamente de rganos vegetales (semillas, tubrculos etc). Rocha (2003) adapto la tcnica
de inmuno PCR para la deteccin de Pantoea stewartii, directamente de la semilla de maz. En
este caso fijo un anticuerpo primario a un microtubo, se lavo el exceso de anticuerpo y se
coloco la muestra molida de la semilla, la cual se conoca que estaba infectada por Pantoea
stewartii, posteriormente se dejo incubando por una hora para la unin antgeno-anticuerpo,
se lavo para eliminar la muestra y en el tubo con el antgeno y el anticuerpo se realizo la PCR.

Figura 3.- Etapas en la tcnica de inmuno-PCR

Inmunomagnetic PCR (similar a la anterior, en este caso el soporte es una esfera magntica, la
cual es removida de la muestra con un magneto y posteriormente se realiza la PCR) . En esta
tcnica un anticuerpo primario se encuentra unido a perlas metlicas las cuales se colocan
dentro de la muestra a analizar, se deja incubar para la unin antgeno-anticuerpo,
posteriormente se extraen estas perlas metlicas con un magneto, se lavan y se colocan en un
tubo en el cual se realiza la PCR. Esta tcnica se ha utilizado para la deteccin de Listeria
monocytogenes en alimentos.
PCR-mltiple. Uno de los problemas de las tcnicas de PCR discutidas anteriormente es que
solo permiten la identificacin de un solo patgeno a la vez. Con la finalidad de solucionar este
problema se ha diseado la tcnica conocida como PCR-mltiple la cual permite la deteccin
de diferentes molculas o microorganismo de inters en una sola reaccin. En esta tcnica se
incorporan a la reaccin un par de iniciadores por cada uno de las molculas o
microorganismos a detectar, lo cual permite un ahorro en tiempo y costo para la deteccin de
diferentes microorganismos simultneamente. Esta tcnica presenta retos como el de disear
todos los iniciadores que se deseen agregar a la reaccin con similar temperatura de
alineamiento, no deben de presentar homologa entre ellos, adems de amplificar
fragmentos de diferentes longitudes. La sensibilidad de una PCR mltiple es del orden de 102
clulas o de 2.9 pg de ADN de inters. Sin embargo esta sensibilidad puede ser afectada por el
diseo ineficiente de los iniciadores (Rodrigues y col., 2003). Esta tcnica se ha utilizado para la
deteccin de diferentes especies de Listeria en una misma muestra, as como para detectar
diferentes microorganismos a la vez como es el caso de Salmonella, Campylobacter, Shigella y
E. coli (Babalola, 2003). La PCR mltiple tambin ha sido usada para detectar diferentes genes
de un mismo organismo en una muestra. Clulas infectadas no retienen todos los genes del
virus del papiloma humano por lo tanto usando PCR mltiple se identific la presencia de
varios genes vrales a la vez, lo cual confirm el agente causal (Karlsen y col., 1996). Esta
tcnica tambin es usada para identificar cuales genes de resistencia a antibiticos poseen una
determinada cepa bacteriana (Prez-Roth y col., 2001).

IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS ALTAMENTE EMPARENTADOS

En algunas ocasiones uno se encuentra en una situacin en la cual tiene que identificar una
cepa especial de un microorganismo ya que esta presenta caractersticas sobresalientes de
produccin de alguna enzima o bien de adaptacin a una determinada condicin, o bien
cuando se requiere preservar la identidad de una cepas en particular, lo cual ayudara a
determinar si se contamin, as mismo cuando se quieren establecer relaciones de parentesco
gentico (filogentica) entre diferentes cepas de una especie, diferentes especies de un
gnero, diferentes gneros de una misma familia o bien entre diferentes familias de
microorganismos. Todos estos casos se presentan cuando se identifica una cepa con una
caracterstica no reportada previamente, por lo tanto las tcnicas moleculares permiten tener
un control sobre la produccin y diseminacin de esta cepa. Algunas de las tcnicas
moleculares que ayudan para la identificacin de microorganismos altamente emparentados
adems de las discutidas previamente son: RepPCR, PCR-RFLP, AFLPs entre otros.

Rep-PCR esta tcnica est basada en la amplificacin simultnea de diferentes regiones con
secuencias repetidas, se ha utilizado preferentemente en bacterias amplificando las regiones
BOX, ERIC, y Rep. En este caso se obtienen varios fragmentos de diferentes tamaos los cuales
son amplificados simultneamente lo cual permite distinguir dos microorganismos altamente
emparentados al comparar los patrones de amplificacin de estos microorganismos. Se ha
propuesto que la tcnica REP-PCR puede ser usada para elucidar las bases genticas de la
variabilidad fenotpica entre diferentes especies, dado que se producen patrones de bandeado
reproducibles, de complejidad similar, y permiten la diferenciacin de cepas al nivel de
subespecie (Johansson y col.. 2000). Esta tcnica se ha utilizado para la identificacin de
diferentes especies de Xanthomonas y de Francisella.
PCR-RFLP esta tcnica consiste en amplificar por PCR un segmento especfico de un
microorganismo y posteriormente digerir el ADN amplificado con enzimas de restriccin, esto
permite poder determinar diferencias entre los patrones de bandas amplificadas y/o entre los
patrones de los fragmentos resultantes de la digestin del ADN. Existen diferentes variantes
de esta tcnica dependiendo del fragmento especfico amplificado y digerido. Entre los
segmentos ms comnmente amplificados y posteriormente digeridos se encuentran los genes
ribosomales (16s en el caso de procariotes y 18s en el caso de eucariotes), los espacios entre
el conjunto de genes ribosomales (espacios intergnicos IGS) (Figura 4) y los espacios
internos transcritos (ITS) (Figura 5) del conjunto de genes ribosomales. El gen ribosomal 16S
est altamente conservado pero con la variabilidad suficiente para hacer distinciones entre
gneros y especies (Jan y LeBorgne 2001). Se han desarrollado iniciadores a partir de la
secuencia del gen ribosomal 16S dentro de un rango muy amplio (universales), desde el nivel
de dominio (bacterias, archaea o eucariotes), grupos (bacterias metanognicas, bacterias
sulfatoreductoras, bacterias lcticas, etc) hasta gneros individuales (Escherichia) (Jan y
LeBorgne 2001). Sin embargo cuando la resolucin del anlisis basado en el gen 16S rRNA es
muy pequea para hacer inferencias sobre el parentesco de microorganismos altamente
relacionados se ha propuesto la utilizacin del gen gyrB el cual codifica para la subunidad B
del polipptido de la ADN girasa. Se ha estimado que este gen evoluciona ms rpido que el
gen 16S rRNA mientras que aun mantiene una alta correlacin con la homologa del genoma
total analizada por hibridacin total ADN-ADN y microarreglos (Rodrguez y col.., 2003). Se han
establecido metodologas para la identificacin rpida basada en PCR-RFLP de cuatro especies
altamente emparentadas de Carnobacterium las cuales son importantes en la industria
alimentaria (Babalola, 2003). La amplificacin de los segmentos IGS y su posterior digestin
con la enzima Hind III permiti identificar diferentes cepas de Penicillum purpurogenum
(Espinoza, 2004) La amplificacin de los segmentos ITS y su posterior digestin con la enzima
Xho I permiti la identificacin de diferentes cepas altamente emparentadas de Aspergillus
niger (Padilla, 2003).

AFLP`s. Amplificacin de fragmentos de longitud polimrfica. Esta tcnica se basa en la

amplificacin de un subgrupo de fragmentos de ADN generados por la digestin con enzimas
de restriccin. El ADN de los microorganismos es aislado, purificado y sometido a digestin con
las enzimas de restriccin Eco RI y MseI. Los fragmentos de restriccin son despus ligados a
adaptadores los cuales contienen sitios de restriccin a cada uno de los extremos del
fragmento y una secuencia homologa al sitio de apareamiento del iniciador. Los iniciadores
usados para la amplificacin contienen secuencias de ADN homologas a los adaptadores y
contienen una a dos bases selectivas a las terminaciones 3 de los fragmentos. As los
nucletidos selectivos, permiten la amplificacin de solo un subgrupo de los fragmentos
cortados. Los AFLP`s han demostrado ser reproducibles, y una buena forma de diferenciar
cepas de microorganismos altamente emparentadas. La deteccin a nivel comercial se ve
restringida por el alto costo del secuenciador que se utiliza para visualizar los fragmentos
amplificados (Olive y Bean, 1999). Restrepo y col.., en 1999 evaluaron la eficiencia de la tcnica
de AFLP`s para detectar la variacin gentica entre diferentes cepas de Xanthomonas
axonopodis.

DGGE. Electroforesis en geles con gradiente desnaturalizante. Esta tcnica es capaz de separar
secuencias altamente relacionadas por su diferente movilidad en gradientes desnaturalizantes
(Kowalchuk y col.., 1997). En esta tcnica comnmente se amplifica alguno de los genes que
codifican para el RNA ribosomal (16S rDNA, 18S rDNA etc). El ambiente desnaturalizante se
crea manteniendo una temperatura uniforme (50-60 oC) y un gradiente lineal con urea y
formamida. El incremento de una concentracin desnaturalizante separa las cadenas dobles
de ADN en dominios distintos. Cuando un dominio alcanza su temperatura de
desnaturalizacin en una posicin particular del gel ocurre una transicin del hlice doble a
parcialmente desnaturalizado, y la migracin de la molcula prcticamente se detiene. Las
variaciones en la secuencia de los dominios causa que sus temperaturas de desnaturalizacin
sean diferentes; por lo tanto, migran a posiciones diferentes dentro del gradiente
desnaturalizante, logrndose la separacin de los dominios de manera efectiva (Jan y
LeBorgne, 2001). Kowalchuk y col. en 1997 amplificaron el gen 18S rRNA de 20 especies
fngicas y sometieron los productos amplificados a DGGE, adems secuenciaron las bandas
separadas con DGGE, con esto se pudo identificar algunas cepas fngicas.

TGGE. Electroforesis en geles con gradiente de temperatura. Similar al DGGE, sin embargo en
este caso el gradiente se crea incrementando gradualmente la temperatura durante la
electroforesis. El ambiente desnaturalizante se forma por una concentracin constante de
urea en el gel, combinado con el gradiente de temperatura temporal (Jan y LeBorgne, 2001).
Esta tcnica puede utilizarse para estudiar la diversidad de especies en una comunidad de
microorganismos y comparar as la diversidad de especies entre comunidades. Esta
comparacin se basa en que el nmero, la posicin precisa y la intensidad de las bandas
reflejan el nmero y abundancia de los tipos dominantes de rDNA en una muestra y as se
puede comparar dos comunidades de microorganismos (Eichner y col., 1999).

FUTURO DE LA DETECCIN DE MICROORGANISMOS

Actualmente existen tcnicas muy prometedoras que en los prximos aos jugarn sin duda
un papel importante en la deteccin y cuantificacin de un microorganismo en una muestra
dada, las consideradas con ms futuro se enuncian a continuacin.

PCR en tiempo real. En esta tcnica adems de los componentes tradicionales de una PCR
normal se agrega un sonda de ADN la cual en un extremo tiene un quincher y en el otro
extremo un beacon esta sonda es complementaria al ADN que se desea amplificar por lo tanto
se alineara con todas las cadenas de ADN en donde est su complemento cuando la ADN
polimerasa amplifica los fragmentos libera esta sonda del ADN la cual est unida, al liberarse
se emite una fluorescencia la cual puede ser detectada, as entre mas ADN se amplifique ms
luz se emitir por lo tanto se puede estimar el nmero de fragmentos de ADN amplificado. Con
esto podemos cuantificar el nmero de molculas del ADN del microorganismo presente en la
muestra en cuestin. Esta tcnica ha sido usada para medir cuantitativamente la carga viral
con el objetivo de monitorear la respuesta a la terapia por pacientes con infecciones de VIH,
citomegalovirus, o virus de la Hepatitis C (Louie y col. 2000). La cuantificacin de un
determinado microorganismo en una muestra es de importancia prognstica, ayuda a predecir
el progreso de una enfermedad, y es usada para asistir en la decisin del tratamiento mdico.
Adems, la tcnica de PCR en tiempo real se adapta para la evaluacin de un nmero grande
de muestras al mismo tiempo, permitiendo un diagnstico de laboratorio, rpido, confiable,
eficiente y barato (Klotz y col.., 2003)

Microarreglos o microchips. Esta tcnica utiliza la complementariedad de las bases

nitrogenadas del ADN y consiste de un arreglo ordenado de cientos o miles de secuencias de
ADN (oligonucleotidos, cDNA, etc) depositados sobre una superficie slida (1.2 x 1.2 cm.). Los
soportes slidos son piezas de silicio o de vidrio. Para la deteccin de microorganismos se
puede construir un arreglo (chip) con ADN de diferentes microorganismos, posteriormente una
muestra conteniendo ADN de uno o varios microorganismos puede ser depositada e hibridada
sobre el arreglo y cualquier ADN no hibridado puede ser eliminado por lavados. El arreglo es
despus analizado y escaneado para poder determinar con que ADN especfico se hibrido el
ADN de la muestra e identificar el o los microorganismos presentes en la muestra.
Actualmente esta tcnica es muy costosa tanto por los reactivos empleados como por el
digitalizador de imgenes utilizado para escanear los microarreglos (Rapley, 2000).

Secuenciacin. La determinacin del orden o secuencia de bases a travs de un segmento de

ADN es una de las tcnicas centrales de la biologa molecular. Se cuenta con dos tcnicas para
secuenciar una basada en un mtodo enzimtico y la otra en un mtodo qumico. Los
requisitos que debe tener una secuencia para poder utilizarse en la identificacin de
microorganismos son 1.- La secuencia debe de ser conservada entre un nmero de organismos
relativamente grande. 2.- Su proporcin de cambio debe ser constante sobre largos periodos y
entre diversos organismos y deber permitir inferencia de la distancia evolutiva entre un
amplio rango de formas de vida; la secuencia no debe ser sujeta a grados amplios discrepantes
de la presin de evolucin. Tercero, La secuencia deber no haber sido compartida entre
diferentes organismos por transmisin horizontal. Finalmente, la secuencia deber ser factible
de ser amplificada y detectada de variadas formas (Relman, 1998). Secuencias que cumplen
con los anteriores requisitos son las regiones que codifican para las pequeas unidades
ribosomales 16S en procariotes y 18 S en eucariotes (Vinayagamoorthy y col. 2002) reportan
un mtodo basado en la secuencia de nucletidos que puede simultneamente generar
secuencias cortas conocidas de nucletidos de un nmero de segmentos del mismo genoma o
de diferentes genomas. La secuenciacin es uno de los mtodos con ms futuro dado que se
puede solo amplificar por PCR el gen ribosomal 16S o 18S, separar las bandas amplificadas,
secuenciar o mandar secuenciar las bandas encontradas, posteriormente comparar esas
secuencias con las secuencias depositadas en los bancos de genes y poder llegar a identificar el
o los microorganismos presentes en una muestra.