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HPLC

1-¿Qué es la cromatografía de líquidos?

La historia de la cromatografía líquida (CL) se inició a principios del siglo XX. En 1906, un botánico
ruso Mikhail Tswett invento CL para separar varios pigmentos de plantas. El inyecto el extracto de
una planta y éter de petróleo a través de una columna de vidrio lleno de carbonato de calcio. Dado
que esto fue hecho en una columna de vidrio, fue capaz de observar los cambios dentro de la
columna. Al principio, sólo vio una capa de pigmento en la parte superior de la columna (figura
1.a). Pero a medida que pasa el tiempo, el pigmento se divide en cuatro capas de colores
diferentes (Figura 1.b). La investigación descubrió más tarde que las cuatro capas eran (i) de color
verde azulado, clorofila a, (ii) de color verde amarillento, clorofila b, (iii) de color amarillo, xantina,
y (iv) de color naranja; caroteno. Todo el proceso de separación duró varias horas y por lo tanto no
era un método muy práctico. Este tiempo largo de análisis fue una de las razones que la CL no se
convirtió en una herramienta analítica popular hasta 1970, medio siglo después de la invención de
Mikhail Tswett.

A continuación se presenta algunos de los términos utilizados en el análisis de cromatografía. La
cromatografía es una técnica de separación y la palabra cromatografía se originó de la
palabra chroma que significa “color” y graphein que significa “escribir”. Cromatógrafo es el equipo
de separación y cromatograma es el gráfico obtenido en el análisis.

Técnica Analítica

Cromatografía Cromatografo Cromatograma

Figure 2. Imágenes de cromatografía, chromatografo, and cromatograma.

2. ¿Qué es el HPLC?

HPLC significa cromatografía líquida de alto rendimiento. Antes que el HPLC esté disponible, el
análisis de LC era llevado a cabo por el flujo gravitacional del eluyente (el disolvente utilizado para
el análisis de CL), lo que requiere varias horas para que el análisis sea completado. Incluso las
mejoras añadidas más tarde fueron capaces solo de acortar el tiempo de análisis un poco. Los
sistemas CL iniciales se llaman “cromatografía de baja presión” o “cromatografía en columna”.

En 1970 en los EE.UU., Jim Waters fundó Waters Corporación y comenzó a vender instrumentos
de HPLC. Esto promovió el uso de HPLC en las áreas de análisis prácticos. Los sistemas de CL que
Waters Corporation desarrolló utilizan bomba de alta presión que genera un rápido flujo de

sin embargo hoy en día es entendido que las siglas HPLC se refieren a Cromatografía Líquida de Alto Rendimiento. Verde Azulado Figure 3. la mayoría de los sistemas de CL utilizada en estos días son HPLC lo que a menudo la palabra LC es utilizada para referirse al HPLC. se solía pensar que HPLC significa cromatografía líquida de alta presión. Otro gran cambio a partir de la fecha de Tswett fue los métodos de adquisición de datos. Los Componentes de HPLC Típicamente el sistema HPLC consta de lo siguiente (Figura 4). la Palabra CL representa toda la cromatografía de Líquidos. En lugar de observar los cambios de las capas con los ojos. incluyendo CL de baja presión. . Si tuviéramos que demostrar el resultado del análisis de Tswett sería un gráfico (cromatograma). Representación del análisis LC de Tswett Inicialmente. se acopló el sistema detector y la información de datos fueron grabados en hojas de papel. 1. Técnicamente Hablando. Los detalles de cada uno se explican abajo. como la figura 3.eluyente. sin embargo. 3. Comparados con la “cromatografía de baja presión” los nuevos tipos se llamaron “cromatografía líquida de alta presión”. Amarillo 3. Por lo tanto. Amarillento 4. Aun Ahora. el Sistema HPLC se le refería como Waters Corporation’s System. Waters Corporation es el pionero de HPLC. Naranja 2. pero hay varias otras empresas que fabrican y venden sistemas de HPLC. y por lo tanto resultó en una mejoría dramática en el tiempo de análisis.

1 Bomba En la primera etapa del desarrollo del HPLC. El método de inyección más utilizado se basa en lazos de muestreo. para proporcionar un caudal controlable y reproducible dado que el cambio en la proporción del flujo puede influir el análisis en gran medida. El uso de muestreador automático (auto-inyector) del sistema también es ampliamente utilizado ya que permite una serie de inyecciones repetitivas en un tiempo programado.Figure 4. hoy en día. y la muestra se introduce en el flujo de eluyente. En esta etapa el requisito más importante del sistema era poder generar una alta presión. 3. El desarrollo del HPLC se puede decir que fue dado por el desarrollo del sistema de bombeo. el diseño de los inyectores es un factor importante. 3. e incluso un pequeño cambio en la velocidad del flujo puede influir en el análisis. se produce “pulsos”. Por lo tanto. la bomba fue la parte más importante del sistema. la generación de alta presión es normal y lo que más preocupa más hoy en día es proporcionar una presión constante en cualquier condición. los análisis actuales requieren una sensibilidad muy alta para cuantificar una pequeña cantidad de analitos. Ya que la precisión de la medición por CL tiene mucho que ver con la reproducibilidad de la inyección de la muestra. las bombas necesarias para el análisis de alta sensibilidad tienen que ser muy precisas. El método más simple es utilizar una jeringa. La mayoría de las bombas utilizadas en los sistemas LC actuales generan el flujo con un movimiento de vaivén de un pistón de motor (bombas de pistón). La bomba se colocaba en lo más alto del sistema CL y generaba un flujo del reservorio del disolvente al sistema. Sin embargo. Ha habido grandes mejoras del sistema para reducir esta pulsación y las bombas recientes crean un pulso muy inferior a las antiguas bombas. Sin embargo.2 Inyector Un inyector se coloca al lado de la bomba. . Debido a este movimiento del pistón.

Mediante la colocación de esta tubería bajo el contenedor de . Hay diferentes tipos de detectores disponibles. por lo tanto columnas con cubierta de poliéter éter cetona (PEEK) se utiliza en su lugar. y un tipo de computadora personal que consta de monitor. Registración de Datos 3. La mayoría de la cubierta de la columna es de acero inoxidable y es tolerante a una gran variedad de disolventes. la pluma.3 Columna La separación se lleva a cabo dentro de la columna. 4. A continuación se presentan algunos equipos opcionales se utiliza con el sistema básico de LC. Diferentes tipos detector y se explican en la lección 6. Ofrece no sólo la adquisición de datos. Los numerosos pequeños poros en la superficie del tubo de polímero permite que el aire pase a través mientras que previene cualquier otro líquido pasar a través del poro. una computadora con un posesor de base de datos (integrador) es más común. el cálculo automático de la concentración.5 El cambio en eluyente detectado por un detector es una forma de señal electrónica. el material de relleno que se utiliza es de gel de sílice o de polímeros en comparación con el carbonato de calcio utilizado por Tswett. la determinación del peso molecular.3. El eluyente utilizado para la CL varía de ácido a solventes básicos. y / o calentamiento y agitación. por lo tanto. La teoría de la cromatografía en columna no ha cambiado desde la época de Tswett. Las columnas recientes suelen estar preparados en una carcasa de acero inoxidable. En otros tiempos. Lo que el detector hace es medir estas diferencias. En general. pero también cateréticas como máximo de ajuste. en lugar de columnas de vidrio utilizadas en el experimento de Tswett.papel-registrador gráfico se utilizaba muy popularmente. para el análisis de algunos analitos como las biomoléculas y los compuestos iónicos. Hoy en día. y así no es visibles a nuestros ojos. este se detecta como un ruido y causas una línea base inestable. durante un análisis largo). mientras que un detector se utiliza para observar la separación obtenida. teclado e impresora. La composición del eluyente es consistente cuando no hay analito está presente. También hay programas que están diseñados específicamente para el sistema LC. Cuando el gas está presente en eluyente. la corrección de línea base.6 Desgasificador El eluyente utilizado para análisis con LC puede contener gases como oxígeno que son no visibles a nuestros ojos. estos métodos no son convenientes cuando el disolvente se deja por un período de tiempo determinado (por ejemplo. Sin embargo. en cambio la presencia del analito cambia la composición del eluyente. e incluye un sistema simple que consiste en construir la impresora y el procesador de textos. 3. se puede decir que la columna es el corazón de un sistema de CL. sistema destilación.4 Detector La separación de los analitos se realiza dentro de la columna. Hay varios tipos de procesadores de datos. el contacto con el metal no es deseable. etc Los componentes introducidos hasta el momento son los fundamentos del sistema LC. Sin embargo. Esta diferencia se observa como una forma de señal electrónica. sin embargo ha habido una continua mejora en el desarrollo de la columna. uso de bomba de vacio. El desgasificador usa unos tubos de membrana de polímero especial para eliminar los gases. Generalmente los métodos que se utilizan incluye el burbujeo (burbujeo de gas inerte).

etc. la mayoría de las muestras son en forma líquida o sólida y requiere calentamiento a alta temperatura para convertirlo en gas. esta puede ser analizada por LC. LC se puede utilizar a temperatura de ambiente (es decir. En comparación. La sencillez del sistema GC es una ventaja pero también una desventaja. pero la mayoría de ellos son solubles en disolventes orgánicos. palabra cromatografía se refiere al GC. pero sus usos son aún menos populares que el GC . Las muestras que se analizaron tienen que estar en forma gaseosa antes de ser introducido en el flujo del gas portador. por lo que el método de GC no es ideal para ese caso. como el azúcar y los ácidos orgánicos. Algunas muestras son insolubles en agua. siempre desde un tanque de gas. Muchos de los nuevos sistemas HPLC contienen un desgasificador. Problema relacionado es que GC tiene un límite superior para el análisis de compuestos de gran peso molecular. super-crítica cromatografía de fluidos. Algunos analitos se alternan por el calor. Por lo tanto. En comparación con el tipo clásico de desgasificación por lotes. Hay posibilidades de que los diferentes cambios de temperatura haga que los resultados de la separación sean diferentes. Por lo tanto. es más conveniente y eficiente. el GC es una herramienta conveniente. Esta diferencia hace que el gas disuelto se mueva a través de los poros y eliminar el gas. era ampliamente disponible antes de que el sistema LC llegara a ser popular. si la muestra sólida puede ser disuelta en un solvente. incluso cuando se analiza a una temperatura de ambiente. que se utiliza a menudo como el LC. por lo que no requiere sistema de bombeo. crea las diferencias de presión dentro y fuera de la tubería (mayor en el interior del tubo). Por lo tanto. sin causar alteración de la sustancia analizada) para una amplia gama de análisis. En ese momento. se puede obtener mejor resolución a temperatura elevada (50 ~ 80 º C). Mientras LC utiliza eluyente (flujo generado por un sistema de bombeo). Generalmente las columnas se mantienen dentro del horno de columna (calentador columna). las muestras líquidas pueden ser analizadas directamente por LC. Sin embargo. papel. 3. Con el fin de obtener resultados repetibles. es la cromatografía a gas (GC). Además. el desgasificador se puede utilizar on- line. hay una alta probabilidad de que podemos encontrar un solvente que disuelve la muestra.7 Horno de columna La separación con LC es a menudo muy influenciada por la temperatura de la columna. GC utiliza el gas (gas portador).8 Otro tipos de Cromatografía Otro miembro de la cromatografía. Esto hizo que el método de LC pueda ser más popular que el método de GC. es importante mantener una temperatura constante. También para algunos análisis. si la muestra original esta en forma gaseosa. Hay otros tipos de cromatografía como la cromatografía en capa fina. 3. el sistema de GC es más simple que el sistema LC y por esa razón.baja presión. También es importante mantener una temperatura estable para obtener resultados repetibles.