Produccin biotecnolgica de Dextrano a partir de Leuconostoc

mesenteroides
Ana Diaz, Esteban Jaramillo, Sara Giraldo, Karla Restrepo (1)
Wilman Alcaraz (2)
(1) Estudiantes de Microbiologa Industrial y Ambiental
(2) Docente de Biotecnologa Industrial
Escuela de Microbiologa, Universidad de Antioquia

INTRODUCCIN

En los ltimos aos la industrializacin de la biomasa genera gran cantidad de

desechos, lo cuales son dispuestos en rellenos sanitarios, zanjas o riberas de los
ros convirtindose en una fuente de contaminacin ambiental. Con el objetivo de
aminorar los impactos ambientales, costos en tratamientos, disposicin de
residuos se han desarrollado una serie de tecnologas para obtener productos
biotecnolgicos a partir de residuos agroindustriales. Un ejemplo de estos
productos son los biopolmeros o polisacridos entre los que encuentra el
dextrano. (1)

El dextrano es un polisacrido de alto peso molecular, compuesto de unidades de

D-glucosa unidos mediante enlaces glucosdicos -(1-6) Figura 1.; son
estructuralmente diversos y se caracterizan de acuerdo con el porcentaje,
naturaleza y distribucin de sus enlaces. El dextrano se produce generalmente en
cultivos de bacterias lcticas como Streptococcus, Acetobacter o Leuconostoc y
algunos hongos del gnero Penicillium (2); en medios que contienen sacarosa
como fuente de carbono; las clulas en crecimiento secretan una enzima inducible
llamada dextransucrasa que convierte el exceso de sacarosa en dextrano y
fructosa(3).

El dextrano sintetizado por Leuconostoc mesenteroides fue uno de los primeros

biopolmeros producidos a escala industrial con varias aplicaciones en la
biotecnologa y medicina como sustitutos del plasma sanguneo, tratamiento de la
anemia por deficiencia de hierro, portadores de frmacos. (6)(4). En la industria
alimentaria se utiliza el dextrano para preparar dulces que poseen una textura
interior adecuada, mientras que la industria de la pintura, los teres y steres
mixtos de dextranos son usados como agentes lacantes. Adems, determinadas
columnas cromatogrficas cuentan con dextranos como fase fija. Los dextranos
son tiles en diversas industrias debido a su inercia, estructura porosa y las
propiedades gelificantes, tambin es neutro y soluble en agua, fcilmente filtrable,
biocompatible, biodegradable y estable durante ms de cinco aos. (4)(5).

Los altos precios en los mercados internacionales convierten a estos productos en

una lnea importante de desarrollo, sobre todo si la materia prima a utilizar es un
desecho; mundialmente la produccin de extrao se acerca a 2000 toneladas al
ao y se vende en 100 dlares el kg. (6)

Inicialmente se comenz a utilizar por la empresa Pharmacia Fine Chemicals,

revolucionando la purificacin y separacin de macromolculas (protenas, cidos
nucleicos y polisacridos). Comercialmente se conoce como Sephadex
(Separacin Pharmacia Dextran).

Imagen 1. Presentacin comercial del Dextrano

Figura 1. Estructura qumica del dextrano.

2. BIOPROSPECCIN DE CEPAS, RUTA METABLICA Y MEDIO DE CULTIVO

2.2 Leuconostoc mesenteroides MICROORGANISMO PRODUCTOR DE

DEXTRANO

Leuconostoc mesenteroides es una bacteria Gram positiva, quimioorganotrofa y

microaerofilia que se caracteriza por su capacidad para fermentar la lactosa y
producir cido lctico. Su morfologa es principalmente esfrica y se encuentran
en pares o cadenas cocos. La especie mesenteroides produce
glucosiltransferasas extracelulares, las cuales sintetizan dextrano y polmeros
afines por divisin de la sacarosa y transferencia del grupo glucosdico a la cadena
inicial de polmero, liberando fructosa como subproducto de la sntesis. (6)

2.2 AISLAMIENTO

La bacteria lctica L. Mesenteroides, es aislada comnmente de ensilados y leche,

tambin de jugo de caa, pero esta matriz presenta mucha variedad microbiana,
por lo que es necesario aislar las colonias y seleccionarlas por sus diferencias
morfolgicas y diferencias microscpicas tales como coloracin Gram seguido de
pruebas bioqumicas para su correcta identificacin, las cuales tienen como
resultado que: no utilizan citrato como nica fuente de carbono y energa, no
presentan movilidad, no producen indol y no convierten el nitrito en nitrato,
catalasa y oxidasa negativa, crecimiento positivo en NaCl 3% y negativo en NaCl
al 6.5% y 10%, fermentacin de arabinosa, fructosa, glucosa, lactosa, maltosa,
manitol, sacarosa al 5%, positivo para la hidrlisis de almidn. (7)

El mantenimiento de la cepa pura aislada se debe realizar en medio MRS y

glicerol a -20C.

2.3 SUSTRATO AGROINDUSTRIAL

Para la produccin de dextrano se han utilizado sustratos agroindustriales como

cscaras de naranja, pia y bagazo de caa.

El sustrato agroindustrial que se propone para la elaboracin del medio de cultivo

es la cscara de la naranja, debido a que esta contiene 38g/L de sacarosa (Tabla
1). Adems, contiene minerales como calcio, fsforo, magnesio y potasio los
cuales son necesarios en los medios de cultivos como elementos traza. La
agroindustrializacin de la naranja se concentra principalmente en la produccin
de jugos, cuyo proceso conlleva una generacin considerable de desechos entre
el 23 y 40% como cscaras, pulpa y semillas, causando un problema ambiental en
la disposicin de los mismos (13).
MATERIA PRIMA

Tabla 1.Composicin fisicoqumica de la materia prima utilizada (8).

Componentes de la Cscara Contenido (%)

de Naranja

Sacarosa 38

Humedad 55,20

Protena 5,51

Nitrgeno 0,07

Minerales 1,22

3. BIORREACTOR PARA EL PROCESO FERMENTATIVO

La produccin del polisacrido se realiza en un proceso aerobio donde el reactor

ms adecuado es tanque agitado, garantizando as que Leuconostoc
mesenteroides excrete el dextrano al medio, el cual adquiere cierto grado de
viscosidad lo que interfiere negativamente con la transferencia de oxgeno y de
nutrientes en el biorreactor.

Segn trabajos realizados en la produccin de Alginatos, Dextranos y Xantanos a

valores de la temperatura que estn entre 29 y 34C y se ven favorecidos a altas
concentraciones de oxgeno (6).

Se trabajar con un biorreactor de tanque agitado de 100 L fabricado en acero

inoxidable, con un volumen efectivo de 60,4 L, ya que el crecimiento de este
microorganismo se ve notablemente influenciado por la agitacin, se mantendr a
150 rpm, 30 C, en un rango de pH de 6.0 a 6.9 y a 0,5 vvm de aire, las cuales son
condiciones favorables para la produccin de dextrano y reducir el tiempo de
fermentacin. (6)

Adems de contar con un sistema de suministro de aire para el proceso con

caudalmetro y control automtico de caudal, con filtro estril de 0.2 um en lnea
de entrada de aire y control de presin automtico del proceso. La aireacin y
mezclado son dos factores determinantes en la produccin de polisacridos sobre
todo a gran escala en donde surgen dificultades que no son apreciables a nivel
laboratorio, debido a que al incrementar el tamao del equipo, cambia la relacin
superficie volumen y la presin hidrosttica. Para el caso de algunos cultivos
donde se producen polisacridos, el uso combinado de impulsores de tipo axial y
de agitadores de tipo turbina Rushton, proveen una adecuada transferencia de
oxgeno, adems de un excelente mezclado. (9)

3.1 MODO DE OPERACIN

Para la produccin de dextrano por Leuconostoc mesenteroides el modo de

operacin ser continuo, en el cual se provee un medio de cultivo constante para
el crecimiento de las clulas y para la formacin del producto; en este modo el
volumen se mantiene constante retirando una cantidad de fluido equivalente al que
se agrega. Se operar de esta forma para asegurar que el medio en el biorreactor
est siempre a la concentracin ptima dado que el fluido tiende a obtener
consistencia viscosa y adems se reporta que con este modo de operacin se
obtiene altas tasas de productividad. (10)

Sistemas de control de las variables del proceso

Temperatura: Para mantener la temperatura se usar la chaqueta del
biorreactor para la transferencia de calor, el proceso debe mantenerse en
una rango de 29 a 34C, la cual es un factor clave en la velocidad de
crecimiento y productividad del microorganismo.
Control del pH : Se utilizar un sensor con el fin de monitorear el pH que
debe mantenerse cercano entre 6.0 y 6.9 y el cual ser regulado con
solucin de NaOH a 1 M o HCL por bombas peristlticas.
Antiespumante: La formacin de espuma en los procesos de fermentacin
aerobia es muy comn y puede generar problemas en el proceso, adems
de proporcionar una va de acceso a microorganismos contaminantes y un
bloqueo de la salida de gases, para esto Se utilizar uno de los
antiespumantes EROL, BIOSPUMEXo CLEROL de PMC Ouvrie, por
su baja toxicidad, por ser estables al calor al momento de ser esterilizados y
por qu no interfieren con los procesos metablicos, adems controlan la
formacin de espuma que ocurre frecuentemente.
Agitacin: Dado el crecimiento de Leuconostoc mesenteroides se requiere
de una agitacin constante de 150 rpm, con un agitador de potencia de
agitacin de 0.5 kW. Dicha agitacin podr aumentar o disminuir durante el
tiempo de fermentacin teniendo en cuenta las variaciones que se
comiencen a desarrollar durante el proceso, por lo que dependiendo de la
necesidad de una mayor agitacin o menor se realiza el control de dicha
variable, para lograr favorecer otras.
Anlisis KLa
La velocidad de transferencia de oxgeno es afectado por varios factores qumicos
y fsicos, que varan el valor del Kla, en nuestro caso una fermentacin aerobia , el
Kla depende en gran medida de las propiedades hidrodinmicas existentes
alrededor de las burbujas y teniendo en cuenta que al aumentar el tiempo de
fermentacin aumenta tambin la viscosidad del medio por la formacin del
polisacrido, el kla va a disminuir, por lo que se hace necesario aumentar la
velocidad de agitacin y/o operar el sistema en continuo.

3.2 CLCULOS DE LOS REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES

Tabla 2. Pesos y frmulas moleculares de componentes implicados en el
proceso. (11) (12)

Compuesto Frmula Peso molecular (g

molecular /mol)

Sacarosa C12H22O11 324,30

Dextrano C18H32O16 504,44

Biomasa CH2,05O0,45N0,20 24,05

Fructosa C6H12O6 180,16

Amoniaco NH3 17,03

Oxgeno molecular O2 32

Agua H2O 18,01

Dixido de carbono C02 44,01

Balance estequiomtrico para biomasa, sustrato y producto.

Ecuacin Estequiomtrica

aC12H22O11 + b O2 + c NH3---> d CH2,05O0,45N0,20 + e C6H12O6 + f C18H32O16+ g CO2+ h

H2O
Partiendo de 1 mol de Sacarosa y 3 rendimientos obtenidos en investigaciones
previas, se realiz el balance estequiomtrico el cual se presenta a continuacin.
Tabla 3. Datos requeridos para realizar el balance estequiomtrico.
Parmetro Valor Fuente

Biomasa Yx/s 0,26 mol/mol

Dextrano Yp/s 0,32 mol/mol Rodrguez, 2007

Fructosa Yp/s 0,48 mol/mol

Balances por elementos Balance de Hidrgeno

Coeficientes conocidos a(22) + c(3)=d(2,05) +
a=1; d=0,26; f=0,32 e(12)+f(32)+h(2)
* Se asume que el coeficiente de la 22 + 3c=0,58 + 5,76 + 10,24 + 2h
celulosa es 1 3c+5,47= 2h
h=1,5c+2,74
Balance de Carbono h=2,82

a(12)=d(1)+e(6)+f(18)+g(1) Balance de Oxgeno

12=0,26 + 2,88 + 5,76+ g a(11) +
g=3,1 b(2)=d(0,45)+e(6)+f(16)+g(2)+ h
11 + 2b= 0,12+ 2,88+5,12+6,2+h
Balance de Nitrgeno -3,32+2b=2,82
c(1)=d(0,20) b=3,07
b=0,05

Tabla 4. Coeficientes estequiomtricos de la ecuacin balanceada

COEFICIENTES ESTEQUIOMTRICOS

Sacarosa a 1
Oxgeno b 3,07
Amoniaco c 0,05
Biomasa d 0,26
Fructosa e 0,48
Dextrano f 0,32
CO2 g 3,1
H2O h 2,82
 Frmula general balanceada:

1C12H22O11 + 3,07 O2 + 0,05 NH3---> 0,26CH2,05O0,45N0,20 + 0,48 C6H12O6 +0,32

C18H32O16+ 3,1 CO2+ 2,82 H2O

4. BALANCE DE MATERIA EN SISTEMAS NO REACCIONANTE

Ecuacin General del Balance de materia en sistemas no reaccionantes

Masa entra-Masa sale +Masa generada-Masa consumida= Masa acumulada

Masa entrada = Masa salida

4.1 SECADO: Las cscaras de naranja se sometern a un a un proceso de

deshidratado en un secador con flujo de aire a 60C, luego sern almacenarlos en un
lugar fresco y ventilado, para utilizarlos durante la experimentacin.
Se ingresarn 31,78 Kg de cscara de naranja las cuales tienen un alto contenido de
humedad y el proceso se de secado se realizar con el fin de facilitar el proceso de
triturado.
Suposiciones
El proceso se encuentra en estado estable
Se asume eficiencia del 80% de secado, por ende la materia prima a la salida
del secador tiene un porcentaje de agua del 20%
Secado a 60C para lograr un secado uniforme.
La masa que entra es igual a la masa que sale
Todo lo que se evapora es agua.
No hay acumulaciones en el desecador.
Se desprecia el aire de entrada.
Balance global: A= B+C A-B=C
31,78Kg-13,98Kg = 17,8 C= 17,8Kg
Balance por componentes A (x) = B(x) + C(x)
Agua A.XA Sacarosa =B.XB Sacarosa + C.XC
A.XA Agua =B.XB Agua + C.XC Agua Sacarosa

(31,78Kg) (0,55)= (13,98Kg)(1)+ (31,78Kg) (0,38)= (13,98Kg)(0)+

(17,80 Kg)(Xc Agua) (17,80 Kg)(Xc Sacarosa)
Xc Agua=0,20 Xc Sacarosa =0,68
Sacarosa
Amoniaco
A.XA NH3 =B.XB NH3 + C.XC NH3 Sales
(31,78Kg) (0,001) = (13,98Kg) (0) + A.XA Sales =B.XB Sales + C.XC Sales
(17,80 Kg) (Xc NH3)
(31,78Kg) (0,07)= (13,98Kg)(0)+
Xc NH3 =0,001 (17,80 Kg)(Xc Sales)
Xc Sales=0,12

Diagrama de proceso de secado

4.2 TRITURADO: Las cscaras de naranja se someten a un pretratamiento

mecnico, en donde estas son sometidas a un proceso de molienda y se obtiene
la materia prima pulverizada.
Suposiciones
No se presentan fugas
El sistema se encuentra en estado estacionario
Sistema no reaccionante
No hay prdidas de materia prima.

Balance global: C= D
Balance por componentes: C(x)=D(x)
Agua Sacarosa
CXC Agua =D.XD Agua CXC sacarosa =D.XD sacarosa
(17,80Kg) (0,20)= (17,80 Kg)(XD Agua) (17,80Kg) (0,68)= (17,80 Kg)(XD
sacarosa)
XD Agua=0,20
XD sacarosa =0,68 XD NH3 =0,001
Amoniaco Sales
CXC NH3 =D.XD NH3 CXC Sales =D.XD Sales
(17,80Kg) (0,001) = (17,80 Kg)(XD (17,80Kg) (0,12)= (17,80 Kg)(XD Sales)
NH3)
XD s Sales =0,12

Diagrama de proceso de triturado

4.3 MEZCLADO: Durante este proceso se lleva a cabo la homogeneizacin del

medio.
Suposiciones
La masa que entra es igual a la masa que sale.
No hay prdidas.
El mezclado es homogneo
No se presentan fugas
El medio de cultivo debe suplementarse con amoniaco para satisfacer los
requerimientos del microorganismo
Para la produccin de dextrano la concentracin de sacarosa debe ser
20g/L, por esta razn se incorpora una corriente de agua.

Balance global: D+E+F= G

G =17,80 Kg +42,63 Kg +0,008 Kg
G=60,4 Kg
Balance por componentes: D(x)+E(x)+F(x)= G(x)
Agua 0,008Kg)(1)=(60,4Kg)(XG Agua)
D.XD Agua + E.XE Agua + F.XF Agua = G.XG XG Agua =0,76
Agua
Sacarosa
(17,8Kg)(0,20)+ (42,63Kg)(1)+(
D.XD sacarosa + E.XE sacarosa + F.XF
sacarosa = G.XG sacarosa 0,008Kg)(1)=(60,4Kg)(XG NH3)
(17,8Kg)(0,68)+ (42,63Kg)(0)+( XG NH3=0,0005
0,008Kg)(0)=(60,4Kg)(XG sacarosa)
Sales
XG sacarosa =0,20
D.XD Sales + E.XE Sales + F.XF Sales =
Amoniaco G.XG Sales
D.XD NH3 + E.XE NH3+ F.XF NH3 = G.XG (17,8Kg)(0,12)+ (42,63Kg)(0)+(
NH3 0,008Kg)(0)=(60,4Kg)(XG Sales)
(17,8Kg)(0,001)+ (42,63Kg)(0)+( XG Sales =0,04

Diagrama proceso de mezclado

4.4 ESTERILIZACIN: Se realiza con el fin de eliminar microorganismos no

deseados que pueden interferir en la trasformacin de la materia prima al
metabolito deseado.
Suposiciones.
No hay prdidas ni transformacin de los componentes del medio
Sistema opera en estado estable
Sistema no reaccionante
Balance global: G= H
Agua XH Agua=0,76
GXG Agua =H.XH Agua Sacarosa
(60,4Kg) (0,76) = (60,4 Kg)(XH Agua) GXG sacarosa =H.XH sacarosa
(60,4Kg) (0,20) = (60,4 Kg)(XH sacarosa) XH NH3 0,0005
XH sacarosa =0,20 Sales
Amoniaco GXG Sales =H.XH Sales
GXG NH3 =H.XH NH3 (60,4Kg) (0,04) = (60,4 Kg)(XH Sales)
(60,4Kg) (0,0005) = (60,4 Kg)(XH NH3) XH Sales =0,04

Diagrama proceso de esterilizacin

Diagrama proceso Biorreactor

Tabla 5. Corrientes entrada al biorreactor

Tabla para corrientes de entrada(Kg)
Corrient Sacar Ag N Sal O2 N2 C Fruct Dextr Biom Tot
es osa ua H3 es O2 osa ano asa al
Aliment 12,08 46, 0, 2,1 0 0 0 0 0 0 60,
acin 13 03 6 4
 Aire 0 0 0 0 6, 22, 0 0 0 0 28,
72 12 84
Gas de - - - - - - - - - - -
Salida
Product - - - - - - - - - - -
o
Total 12,08 46, 0, 2,1 6, 22, 0 0 0 0 89,
13 03 6 72 12 24

Tabla 6. Corrientes salida del biorreactor

Tabla para corrientes de salida(Kg)
Corrient Sacar Ag N Sal O2 N2 C Fruct Dextr Biom Tot
es osa ua H3 es O2 osa ano asa al
Aliment - - - - - - - - - - -
acin
Aire - - - - - - - - - - -
Gas de 0 0 0 0 3, 22, 4, 0 0 0 30,
Salida 25 12 82 19
Product 0 47, 0 0 0 0 0 3,05 5,7 2,38 59,
o 95 08
Total 0 47, 0 0 3, 22, 4, 3,05 5,7 2,38 89,
95 25 12 82 27

5. BALANCE DE MATERIA EN EL SISTEMA REACCIONANTE

Masa entra-Masa sale +Masa generada-Masa consumida= Masa acumulada
Se conoce:
Peso molecular de la Biomasa 24.05 g/mol
Peso molecular del dextrano 504.44 g/mol

Suposiciones.
El sistema opera en estado estable.
El aire de entrada y salida se encuentran secos o con un porcentaje de humedad
despreciable.
El nitrgeno que entra en la corriente de aire no reacciona
la conversin de la fuente carbono y nitrgeno es completa.
no existen fugas en el biorreactor.
la agitacin es suficiente para mantener el medio homogneo.
el CO2 producido sale en el gas de salida.
Las sales presentes en el medio se incorporan a la biomasa generada.
Clculos:
Se inyectan 1000 moles de aire el cual est compuesto por 21% O2 y 79% N2
 32 2
21002 = 6720 2
1 2

Para el nitrgeno:
282
790 2 = 22120 2
12

1000 moles de aire equivale a 28840 gramos.

5.1 BALANCE DE MATERIA POR COMPONENTE

Balance de O2
322
3,07 2
5700 [ 1 2 ] = 3469,27 02
504.44
0,32
1
= 3,469 2
6720 3469 = 3251 =3,251
kg oxigeno sale

Balance de N2
22120 = 22120

Balance de sacarosa
342.30
1
5700 [ 1 ] = 12087,1
504.44
0,32
1
= 12,08
12087,1 = 12087,1

Balance de amoniaco

17.03 3
0,05
5700 [ 1 3 ] = 30,403
504,44
0,32
1
= 0,03 3

30,40 3 = 30,40 3
Balance de biomasa

24,05
0,26
5700 [ 1 ] = 220,81
504,44
0,32
1
= 0,2208
220,81 = 220,81

Balance de CO2
44 2
3,1 2
5700 [ 1 2 ] = 4816,86 2
504,44
0,32
1
= 4,82 2
Balance de H2O
18 2
2.82 2
5700 [ 1 2 ] = 1792,40 2
504,44
0,32
1
= 1,80 2
Balance de fructosa

180,16
0,48 2
1
5700 [ ] = 3052,6
504,44
0,32
1
= 3,05

BALANCE DE ENERGA PARA MEDIO DE CULTIVO CELULAR

El cultivo celular es aerobio y se realiza en recipientes a gran escala, donde la
literatura reporta que este tipo de recipientes utiliza un trabajo mecnico de 10-20
kj/s, adems se conoce la cantidad de oxgeno requerida durante el proceso.
Para este procedimiento se calcul el calor transferido hacia el exterior mediante
la frmula:
+ = 0

Suposiciones:
El sistema es homogneo
No existen fugas
El sistema es homogneo.
 No se presentan prdidas por evaporacin

A partir de estas suposiciones realizan los siguientes clculos:

12
= (460 2 ) 3.469 2 1000 12 = 49866.87
2 2 322

= +

= 49866.87 + 10 = 49876.87 /
3

Al Q ser positivo debe eliminarse calor del sistema

Balance de energa en sistemas no reaccionantes (Chaqueta)

Suposiciones
- El proceso opera en estado estacionario
- El agua de entrada tiene una temperatura de 25C
- La temperatura de salida es igual a la temperatura del medio (30C)
- El sistema no tiene fugas
- El volumen de la chaqueta corresponde a la mitad del volumen efectivo del
bioreactor
- El trabajo mecnico es despreciable

= 0

30(104,8 /) 30 (125,7 /) 49876.87 =

= 50503.87,75

Ciclo de esterilizacin.
Suposiciones

Velocidad de calentamiento 1C/min

Calentamiento de 25C a 121C en 21 min
Enfriamiento de 121C a 30C en 21 min
Microorganismos como base de clculo 2.7x106 microorganismos /gramo en
base seca
Microorganismos al final del proceso de esterilizacin 1x10 ^-3
Nmero inicial de microorganismos en la fermentacin:

1000
N0= 2.7x106 microorganismos /g x x 60,4Kg= 1,63x1011microorganismos
1

T= total calentamiento + enfriamiento + mantenimiento

total = Ln (N0/N)

total =Ln ( 1,63x1011microorganismos/ 1x10 - 3 microorganismos)

total =32,725

calentamiento

Por tabla de Richards:

calentamento a 21min = 13,182

enfriamiento a 21min = 13,182

mant= Vtotal - ( Vcal+Venfr)

mant= 32,725 - (13,182+13,182)=6,361

mant= Kd.t

mant/kd= t

6,361/ 2,666 = 2,385 min

Tiempo total de esterilizacin 44,385 min

6. DIAGRAMA DEL BIORREACTOR COMPLETO

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