TRABAJO PRCTICO

Separacin e identificacin de
biomolculas por
Cromatografa Gaseosa Capilar
 Teniendo en claro los objetivos ,
Emplear GLC
se podr lograr una buena como una tcnica
de separacin de
planificacin del trabajo biomolculas

Introducir en el manejo Conocer y aplicar

de GLC los diferentes
mtodos de
TCNICAS preparacin de
muestras.
Entrenamiento para el
manejo de muestras Reconocer
parmetros que
GENERALES

deben

Especficos
OBJETIVOS

Objetivos
establecerse en el
Identificar las partes de equipo para el
un GLC y sus funciones anlisis
INSTRUMENTAL
Identificar las
Emplear el FID como ventajas y
detector universal desventajas del
uso de FID.

Evaluar los efectos de la

temperatura y la
Calcular los
polaridad de la FE parmetros
ANALISIS DE DATOS bsicos de GLC
Realizar un anlisis
cuantitativo de las
muestras. Identificar y
aplicar las
diferentes
metodologas de
cuantificacin.
 Muestras Plasma Hgado Semillas oleag

Homogenizacin
Con solventes y Folch Prensado/molienda
y extraccin de sales.
lpidos

Saponificacin y Metanlisis alcalina (KOH/ MeOH)

derivatizacin

Separacin: TLC preparativa-Recuperacin

FAMEs de Ch

Separacin de los Inyeccin en CG- FID

diferentes FAMEs

Anlisis de resultados
Relacin: grupos funcionales propiedades y tcnicas apropiadas

Hidrofilico Amino cidos Iones

cidos inorgnicos
carboxlicos Colorantes
sintticos para Enzimas
voltiles Azcares
alimentos
Aldehdos y
cetonas Aflatoxinas
Sulfonamida Glicoles Fenoles, PG,
OG y DG
Antibiticos
Antioxidantes
Nitrilos BHT, BHA,
THBQ Flavonoides
Nitrosaminas Acidos
Polaridad Alcoholes
grasos Colorantes
Pesticidas organo- naturales de
PAHs alimentos
fosforados
Aminas
Derivados TMS aromticas
Vitaminas
de azcares PCB liposolubles

Epxidos Triglicridos
Aceites esenciales
Fosfolpidos
C2/C6 Metilsteres de Esteres aromticas
hidrocarburos
Hidrofbico cidos grasos

GC HPLC

Voltil Volatilidad No voltil

 METANOLISIS ALCALINA
Derivatizacin: proceso en el cual se agrega un grupo funcional en otra molcula,
derivada del reactivo que se emplea en el proceso.
Permite obtener FAME (MEAG) a partir de cidos grasos libres o cidos grasos
esterificados a otras molculas (MG, DG, TG, PL).
Los FAME son derivados ms voltiles que los cidos grasos de los que provienen.
 METANOLISIS ALCALINA EN FRIO
Hgado Tubo de N2 Pesar 100 mg
Extracto
Plasma con precisin la
lipdico muestra
Aceite

Cantidad X de
lpidos

AGITAR 0,2 mL KOH 2N + 2 mL

ENERGICAMENTE en MeOH HEXANO
POR 30 SEGUNDOS

COLECTAR FASE SUPERIOR (medir vol.)

HELADERA 15-20 MIN.
TLC preparativa
ANLISIS DE RESULTADOS
 IDENTIFICACIN Y CUANTIFICACIN
DE LOS PICOS DE LAS MUESTRAS
IDENTIFICACIN CUANTIFICACIN
El rea% del compuesto i como
Con los datos de los estndares metilster, se expresa:
(condiciones isotrmicas), graficar log Tr
en funcin del N de t. C. Ai x 100
Identificar los picos del cromatograma (A)
correspondiente a la muestra, por
comparacin con los Tr de los estndares
y de ser necesario por interpolacin en las
curvas.
 Clculo de parmetros bsicos de CG:
Eficiencia y resolucin
EFICIENCIA RESOLUCIN
N = 5,54 (Tr/W1/2)2 R = 2D / (W1 + W2)

N: nmero de platos tericos. R: resolucin.

Tr: en el mximo del pico, expresado D: distancia (en min) entre el mximo del
en min. pico 1 y del pico 2.

W1/2: ancho a la altura media del pico W: ancho en la base del pico (en min).
expresado en min.
 La proporcin de cada analito que permanece en
la fase mvil depende de su presin de vapor

Punto de Ebullicin > PV < permanencia en FE < Tr

del analito
Presin de
Vapor
Caractersticas de la fase
Temperatura Estacionaria
(interacciones FE- Analito)
Caractersticas de la Fase Mvil
(Densidad y velocidad de Flujo)
 Variables involucradas en el proceso
cromatogrfico

Eficiencia de la Diseo de la columna

columna. HETP
Condiciones de corrida
(Ensanchamiento
Separacin de los de los picos W)
Picos (resolucin)

R
Eficiencia de la Interacciones Analito FE
fase estacionaria
(Posicin relativa
de los picos tr)
Relacin entre los coeficientes
de distribucin de c /

componente a una Temp. dada
 Eficiencia de la columna

N = 5.54 [tr / W1/2]2

Tr = distancia desde la inyeccin hasta el mximo del pico.

W1/2 = ancho del pico a la mitad de la altura.
 Resolucin

Representa la separacin de los picos y es el resultado de la

eficiencia de la columna y de la fase estacionaria

R= 2d
W1 + W2
d = distancia entre los mximos de los picos
W = ancho de los picos en la lnea de base

Si R = 1 la separacin de los picos es de un 98%

Si R = 1.5 la separacin de los picos es de un 99.7%,
se obtiene la separacin a la lnea de base
 Efecto de la Temperatura
Mezclas complejas separadas
ISOTERMICAMENTE:
TCOL BAJA:
- Componentes mas voltiles son
separados. Los menos voltiles tienen
tiempos de retencin altos y eluyen
picos ensanchados.

TCOL ALTA:
- Componentes mas voltiles no son
separados. Los menos voltiles
disminuyen su tiempo de retencin.
 Efecto de la Temperatura
La Temperatura del horno puede ser variada linealmente para la separacin

Se consiguen buenas
separaciones de los
componentes en menor
tiempo

TFIM

TEMPERAT
R
Programa de temperatura:

URA
TINI

tINI tFIM
TIEMPO
 Tiempo de retencin
Interaccin analito / FE
tR Presin de vapor del analito
Condiciones operacionales
Si se fijan las condiciones operacionales, el tiempo de retencin
del analito es constante.

muestra

estandar
 Polaridad
Sobrecarga de la columna
Velocidad de flujo
Van Deemter
https://www.youtube.com/watch?v=iX25exzwKhI