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ChemInform Resumen: El Enzimas central de la familia aspartato de


la Sntesis de Aminocidos

Artculo en Accounts of Chemical Research Julio 2010

DOI: 10.1002 / chin.200129280 Fuente: PubMed

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1 author:

Universidad de Toledo

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Acc. Chem. Res. 2001, 34, 339-349

combatir la creciente amenaza de microorganismos resistentes a los


The Enzymes central de la familia antibiticos. Mi laboratorio se ha centrado en mejorar nuestro conocimiento

aspartato de la Sntesis de Aminocidos de las estructuras y mecanismos de las enzimas centrales en esta va, el
conocimiento que proporcionar la base para el logro de cada uno de estos
objetivos.

RONALD E. VIOLA *
Departamento de Qumica de la Universidad de Toledo, Toledo,
Ohio 43606 Visin de conjunto
Recibido el 23 de octubre de, el ao 2000 Los organismos que utilizan esta va contienen varios aspartokinases
isofunctional que catalizan la etapa de compromiso inicial en la va, la
ABSTRACTO fosforilacin de
La va de aspartato es responsable de la biosntesis de lisina, treonina, isoleucina y metionina en L- cido asprtico. En muchos de estos organismos al menos una de estas
la mayora de plantas y microorganismos. La ausencia de esta va en seres humanos y animales
enzimas es bifuncional, que cataliza tanto la primera y, sorprendentemente,
hace que las enzimas centrales objetivos potenciales para la inhibicin, con el objetivo de
desarrollar nuevos herbicidas y biocidas, y tambin para la mejora, para mejorar el valor
la tercera reaccin en esta secuencia metablica. Muchas bacterias
nutricional de los cultivos. Nuestro estado actual del conocimiento de estas enzimas se revisa, contienen varias isoformas de aspartokinases, algunos de los cuales son
incluyendo informacin estructural determinado recientemente y las enzimas de fusin bifuncionales. 2 Estas enzimas isofunctional estn sujetos a regulacin
bifuncional de nueva construccin.
diferencial, tanto por inhibicin de la retroalimentacin y por la represin a
nivel gentico, de los aminocidos del producto final. En

Escherichia coli hay tres aspartokinases. Isoforma I es bifuncional y es


tanto inhibida y reprimidos por treonina. Isoforma II tambin es bifuncional y
Introduccin
se reprime por la metionina, mientras que la isoforma III es una enzima
La va aspartato (Figura 1) usa L- cido asprtico como el precursor para la monofuncional inhibida por la lisina. 3 En Bacilo hay dos aspartokinases, uno
biosntesis de los aminocidos lisina, metionina, isoleucina y treonina. 1 Esta
que est regulada por los niveles de diaminopimelato, y uno que se inhibe
es una va esencial en plantas andmicroorganisms que implica, como lo
por tanto treonina y lisina. 4 Como es tpico en las vas metablicas
hace, una cuarta parte de los aminocidos de bloques de construccin que
altamente ramificados, existe una regulacin adicional, ms all de este
se requieren para la sntesis de protenas. Adems, hay varios productos
primer paso, en cada uno de los puntos de ramificacin (Figura 2). Este
intermedios importantes metablicos y productos de esta va, incluyendo el
sistema de regulacin permite el control exquisito sobre no slo el flujo total
cido diaminopimlico, un componente clave requerida para la reticulacin
a travs de esta va, sino tambin las velocidades relativas de la produccin
en la biosntesis de la pared celular bacteriana, y el cido dipicolnico,
de cada uno de estos aminocidos. Todas las enzimas centrales en la
importantes para la esporulacin en las bacterias Gram-positivas. Durante
familia aspartato se han purificado, y sus propiedades catalticas se han
miembros evolucin del reino animal han perdido las enzimas que catalizan
elucidado en cierta medida. Estos estudios han incluido un examen de la
las reacciones en esta va, y por lo tanto los aminocidos que se derivan del
especificidad de sustrato y tambin la identificacin de algunos sustratos
cido asprtico son componentes esenciales de la dieta. Como
alternativos e inhibidores. grupos de unin al sustrato y los grupos
consecuencia de esta especializacin evolutiva, esta va se ha convertido
catalticos sitio activo han sido identificados por los estudios de
en el foco de dos objetivos divergentes. Mejora del flujo a travs de esta va,
modificacin clsicos y por mutagnesis dirigida al sitio. estudios
ya sea por el aumento de la expresin de estas enzimas centrales o
estructurales de alta resolucin han proporcionado una imagen detallada
mediante la alteracin de su regulacin, mejora el valor nutricional de las
del sitio activo para dos de estas enzimas, y estas estructuras de soporte
plantas de cultivo importantes mediante el aumento de los niveles de estos
hiptesis razonables para los mecanismos catalticos. Los estudios
aminocidos esenciales, en particular el aminocido lisina. Por el contrario,
estructurales similares estn llevando a cabo para las otras enzimas
el diseo de inhibidores especficos de las enzimas centrales de esta va
centrales. Por ltimo, la separacin y caracterizacin de los dominios
proporcionar compuestos de plomo para el desarrollo de nuevos,
catalticos individuales de la enzima bifuncional, y fusin de genes para
herbicidas seguras, y tambin nuevos biocidas a
crear nuevas enzimas bifuncionales, ha permitido un examen de los
mecanismos de regulacin de las enzimas centrales de la va de aspartato.

Ronald E. Viola naci y se cri en Brooklyn, Nueva York, y recibi una licenciatura de la Universidad de
Fordham en el Bronx. Despus de una pausa de dos aos en Alemania, cortesa del Ejrcito de Estados
Unidos, complet su formacin de posgrado en la Universidad Estatal de Pensilvania, obteniendo una
maestra en qumica y un Ph.D. en bioqumica. Fue presentado en el maravilloso mundo de las enzimas con el Aspartokinases
una beca postdoctoral en el laboratorio del Dr. Mo Cleland de la Universidad de Wisconsin. Despus de una
En E coli, las enzimas bifuncionales aspartokinasehomoserine
cita inicial en la facultad de la Universidad del Sur de Illinois en Edwardsville, se traslad a la Universidad de
Akron en 1984. Se ha incorporado recientemente a la facultad de la Universidad de Toledo como un profesor deshidrogenasa I y II (AK-HDH I y
de Qumica. Sus lneas de investigacin abarcan la aplicacin de una amplia gama de tcnicas para elucidar
la estructura y los mecanismos de enzimas. * Direccin postal del autor en el Departamento de Qumica de la Universidad de Toledo,
2801 W. Bancroft St., Toledo, OH 43606-3390. Telfono: 419-530-1582. Fax: 419-530-1583.
E-mail: ron.viola@utoledo.edu.

10.1021 / ar000057q CCC: US $ 20,00 2001 American Chemical Society VOL. 34, NO. 5, 2001 / Accounts of Chemical Research 339
Publicado el 03/01/2001 Web
Las enzimas central de la familia aspartato Viola

FIGURA 1. va Aspartato de la biosntesis de aminocidos. Cada flecha representa una conversin catalizada por la enzima, y se enumeran las enzimas centrales que catalizan las
reacciones fundamentales de la va. AK, aspartoquinasa isoenzimas; ASADH, aspartato un- semialdehdo deshidrogenasa; HDH, isoenzimas homoserina deshidrogenasa; HSK, homoserina
quinasa.

Tabla 1. Los sustratos alternativos para la aspartoquinasa


isoenzimas un

aspartoquinasa I aspartoquinasa III

sustrato k gato (%) K m ( mM) k gato (%) K m ( mM)

L- cido asprtico 100 1 100 0.6


15 50 53 184
L- aspartato R- amida
L- aspartato R- ster benclico 17 4 84 5.3
57 41
NORTE- formil- L- aspartato
NORTE- acetilo- L- aspartato 30 68
15 4 45 diecisis
L- asparagina segundo
L- aspartato un- ster benclico segundo 11 3 86 2.5
L- aspartato un- ster metlico segundo sesenta y cinco 20 88 4.9

un Las condiciones de reaccin: La actividad se determin con un ensayo de piruvato


deshidrogenasa quinasa acoplado / lactato contena HEPES 100 mM (pH 8,0), KCl 100 mM,
MgATP mM 2, PEP 0,7 mM, NADH 0,1 mM, concentraciones variables de los sustratos
alternativos, y 8- 15 g de AK. segundo La fosforilacin en el R- grupo carboxilo.
FIGURA 2. Regulacin de la va en aspartato Escherichia coli.
El flujo a travs de las ramas de esta va est regulada en dos niveles, por la inhibicin de
la retroalimentacin de los aminocidos del producto final ( ,,,,) y por la represin de la
purificacin, con cromatografa hidrfoba como el paso final, condujo a la
sntesis de enzimas reguladoras clave (- - -).
produccin de puro AK III. 9

La especificidad de sustrato. Aspartoquinasa I tiene una especificidad algo


AK-HDH II) catalizan una fosforilacin y, a continuacin, despus de una relajada hacia su sustrato de aminocidos (Tabla
reduccin de intervenir catalizada por una enzima separada, una segunda 1). Mientras L- cido asprtico es el sustrato de aminocidos de eleccin, una
reduccin para producir el homoserina intermedio. Una tercera enzima libre R- grupo carboxilo no es esencial para el reconocimiento del sustrato.
monofuncional, aspartoquinasa III, tambin cataliza la fosforilacin de cido los R- amida y varios diferentes
asprtico que es el paso compromiso en esta va biosinttica. AKHDH I (EC R- steres de aspartato se encontr que eran sustratos alternativos
2.7.2.4) en esta bacteria es un tetrmero compuesto por subunidades competentes. 10 Sin embargo, los anlogos de aspartato en la que el R- grupo
idnticas de peso molecular 86 000, con una secuencia de aminocidos amino es o derivado o reemplazados son ni sustratos ni inhibidores de AK I, lo
conocida. 5,6 Cada cadena de polipptido contiene ambas actividades que indica la importancia de la R- grupo amino como un determinante de unin.
catalticas; Sin embargo, estas actividades residen en dominios estructurales A diferencia de, NORTE- anlogos de aspartato derivatizados tales como NORTE-
distintos. El resto amino-terminal lleva la actividad de la quinasa y la regin formilo y NORTE- acetil aspartato son sustratos para AK III con slo ligeramente
carboxi-terminal contiene la actividad de la deshidrogenasa, con el dominio reducida k gato valores (Tabla 1), pero con significativamente elevados K metro valores.
de interfaz central informado de que el sitio de regulacin alostrica. 7 Un 9 Estas diferencias de especificidad puede ser explotado para desarrollar
esquema de purificacin mejorado, utilizando elucin ternario de una inhibicin diferencial de estas enzimas altamente homlogas y para diseccionar
columna de colorante-ligando, 8 ha llevado a la produccin de altamente los elementos de reconocimiento de sustrato en el sitio activo. Los requisitos
purificado AKHDH I con un excelente rendimiento global. A similares para un donante de fosforilo tambin se investigaron mediante anlogos
mejorada estructurales de ATP. Con la excepcin

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Las enzimas central de la familia aspartato Viola

el producto con la escisin del enlace ster. Cuando la produccin


enzimtica de estos productos fosforilados se lleva a cabo en 50% 18 O
agua, una sola oxgeno marcado se encuentra en medio del fosfato que se
libera tras la hidrlisis (Figura 3B). 10 A mayores hidrxido de pH se
convierte en las especies que atacan y el mecanismo cambia a atacar en el
carbono carbonilo. Esto conduce a la incorporacin del oxgeno marcado
en el anlogo de cido asprtico y la liberacin de fosfato no marcado
(datos no mostrados).

Claramente, la nica explicacin viable para los productos obtenidos a partir


de estas reacciones catalizadas por enzimas es que
un- anlogos derivatizados de aspartato son capaces de unin productiva a
aspartoquinasa a travs de una inversin de regioespecificidad para hacer la R-
grupo carboxilo disponible como un aceptor de fosforilo. En apoyo de esta
hiptesis es la observacin de que los anlogos en los que tanto el R- y el un- grupos
carboxilo han sido derivatizados hay sustratos ms largos para AK I. Muchos,
pero no todos, de estos R- fosfatos de acilo tambin se han demostrado,
mediante ensayos de enzimas acopladas, a ser sustratos viables para los
dos pasos siguientes enzymecatalyzed en esta va metablica. 10 Este
escenario plantea la posibilidad de producir sustratos alternativos generados
por enzimas que pueden servir potencialmente como antimetabolitos para las
reacciones de aguas abajo en esta ruta biosinttica.

FIGURA 3. 31 espectro P RMN para la reaccin de L- aspartato un-


ster de metilo con aspartoquinasa I. (A) Reaccin de ejecucin en diecisis agua O. El pico a -2,3
ppm es el producto de fosfato de acilo de la enzima catalizada de reaccin. (B) ejecucin de la
reaccin en 50% 18 agua O. Esta reaccin se llev a cabo hasta que el PEP se haba agotado. El Identificacin de funcionalmente importantes Amino Acids.
recuadro ampliado muestra el marcado y el mono 18 picos de fosfato de O-etiquetados. Los estudios de modificacin qumica anteriores 12,13 de AK haba indicado la
posible participacin de grupos sulfhidrilo; Sin embargo, esas cistenas
cin de 2 '- desoxi ATP, 11 todos los trifosfatos probados, incluyendo CTP, parecan jugar ms de un estructural y no una funcin cataltica. Un examen
GTP, UTP, y varios derivados de ATP, resultaron ser no reactivo hacia AK de los perfiles de pH de la actividad quinasa de AK-HDH I muestra una
I. prdida de actividad cerca de pH neutro a la protonacin de un nico grupo
Reversin de regioespecificidad. Aspartato anlogos con de cido catinico. 14 Nos dirigimos a estudios de modificacin qumica con
derivatizado un- grupos carboxilo se examinaron como potenciales reactivos especficos para el grupo para ayudar en la identificacin de este
inhibidores competitivos de las aspartokinases. Inesperadamente, estos grupo funcional. La inactivacin de la enzima con dietilpirocarbonato, y la
inversin de esta inactivacin por hidroxilamina, es compatible con la
anlogos, incluyendo compuestos tales como asparagina, aspartato un- hidroxamato,
y tanto el un- metilo y un- steres de bencilo de aspartato, parecen ser identificacin de este aminocido esencial como un residuo histidilo. Esta
sustratos alternativos y no inhibidores. 10 Esto es sorprendente debido a que enzima tambin pierde actividad a pH alto como consecuencia de la
el un- grupo carboxilo de aspartato es el sitio aceptor para la fosforilacin, y ionizacin de grupos de cido neutros con p K
el bloqueo de este grupo por derivatizacin debe evitar la transferencia de
fosforilo. Es posible ya sea que la enzima podra hidrolizar estos derivados
antes de la fosforilacin, o que la unin de estos anlogos de sustrato a la Los valores cercanos a 10. Estudios modificacin qumica con NORTE-

enzima permite que el agua acta como el nuclefilo atacante para acetilimidazol (NAI) y con tetranitrometano (TNM) apoyaron la asignacin
hidrolizar ATP (una reaccin trifosfatasa de adenosina inducida). Para de estos grupos como tirosilo residuos, aunque la modificacin observada
determinar si la fosforilacin de estas un- aspartatos derivatizados en de mltiples grupos por este reactivo tambin sugiere una estructural en
realidad se haban producido, los productos de fosfato de acilo putativos lugar de un papel cataltico para estos grupos funcionales en AKHDH I. 14

que se obtendran a partir de estos sustratos alternativos se buscaron y


luego caracterizan por ensayos de enzimas acopladas y tambin por
espectroscopa de RMN. Estos estudios confirmaron la produccin de un estudios de inactivacin con AK III, y estudios posteriores de proteccin
producto fosforilado de cada una de las un- aspartatos derivatizados, de sustrato, tambin confirmaron la presencia de una histidina reactivo
productos que pueden ser observados directamente por 31 P RMN (Figura esencial en este aspartoquinasa. Sin embargo, un anlisis cuidadoso de la
3A). En adicin, 18 O estudios de marcaje han verificado no slo la inactivacin de AK III por los reactivos-tirosina especficos proported NAI y
produccin de estos productos de fosfato de acilo, sino tambin su TNM expuesto la posibilidad de cierta reactividad cruzada con grupos
mecanismo de hidrlisis no enzimtica despus de que los productos se sulfhidrilo enzimticas. 9 estudios de proteccin en presencia de MgATP
liberan de la enzima. A pH neutro esta hidrlisis implica el ataque del agua sugieren que esta cistena puede estar situada en o cerca del sitio de unin
sobre el fosfato de de nucletidos. La conclusin de estos estudios de modificacin es una
leccin que se ha aprendido antes. reactivos especficos para el grupo
pueden proporcionar apoyo para la identificacin de un elemento esencial

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Las enzimas central de la familia aspartato Viola

grupo funcional aminocido en una enzima. Sin embargo, incluso con muchos de Tabla 2. Cintica de mutado aspartato semialdehdo
los reactivos de modificacin ms nuevos y ms selectivos, es importante para deshidrogenasas un

ejecutar los controles para comprobar la naturaleza de la modificacin y no confiar L- COMO UN segundo fosfato

en estudios de modificacin qumica como el nico criterio para la identificacin k gato k gato K metro k gato/ K metro

de grupo funcional. enzima (s- 1) (%) (MM) (METRO- 1 s- 1) K metro (MM) k gato/ K
(METRO-
metro 1 s- 1)

de tipo salvaje 610 100 0,17 3,6 10 6 4.8 1.3 10 5


C135A < 0,005 <0,001
C135S 2.0 0.3 0,15 1,3 10 4 1,2 1,5 10 3
aspartato un- semialdehdo deshidrogenasa Q162N 47 8 0,15 3,1 10 5 4,6 1,0 10 4
Q162H 177 29 0,25 7,1 10 5 4,7 3,8 10 4
L- aspartato un- semialdehdo deshidrogenasa (ASADH, EC Q39D 290 48 0,13 2,3 10 4,7 6,2 10 4
1.2.1.11), la segunda enzima de la va central, es un dmero compuesto de R267L 58 10 5.3 1.1 10 4 19 3.0 10 3

subunidades idnticas. La secuencia de ADN codifica para una subunidad un La reaccin se control siguiendo la fosforilacin oxidativa de L- COMO UN. Condiciones
de reaccin: tampn 200 mM Ches (pH 8,6), 25 C, saturando (1 mM) NADP, variando la
compuesta de 367 aminocidos con un peso molecular total de 39 950. 15 En
concentracin de ASA y fosfato, y 0,055 a 3,8 enzima g / mL. segundo L- ASA, L-aspartato un- semialdehdo.
la direccin de biosntesis ASADH cataliza la formacin de L- aspartato

un- semialdehdo (ASA) por la desfosforilacin reductiva de L- un- aspartil


direccin no fisiolgica, la fosforilacin oxidativa de ASA, tanto para la
fosfato (BAP), utilizando el poder reductor del NADPH. La reaccin ASADH
enzima y mutantes nativa en la que Cys-135 se sustituye con o bien una
est relacionada con la reaccin catalizada por la gliceraldehdo-3-fosfato
alanina o una serina. Una prdida completa de la actividad enzimtica se
deshidrogenasa, y se han propuesto mecanismos qumicos similares para
observa en la sustitucin de alanina en esta posicin en ASADH (Tabla
cada enzima. 16-18 Este mecanismo implica la formacin de un producto
intermedio resultante tioster de ataque de un tiolato de cistena del sitio
2). Mientras que el mutante de alanina est inactivo, el mutante de serina
activo en el grupo carbonilo de BAP, seguido por la expulsin de fosfato.
correspondiente (C135S) hace mostrar alguna actividad enzimtica, con la
La transferencia de hidruro a partir de NADPH y el colapso de los
velocidad mxima reducida en aproximadamente 500 veces en comparacin con
conductores intermedios tetradricos resultantes para la liberacin del
la de la enzima de tipo salvaje. 20 En este mutante la K metro para ASA no ha
producto ASA.
cambiado desde que en la enzima nativa, mientras que la K metro para el fosfato es
en realidad 4 veces menor en el mutante Ser-135. Estos resultados sugieren que
no hay grandes cambios conformacionales que resultan de la sustitucin de serina
Identificacin de funcionalmente importantes Amino Acids.
que afectara negativamente a la capacidad de la enzima para unirse a sus
estudios de modificacin qumica con 2,2 '- ditiobis (5-nitrobenzoato) (DTNB) diecisis
sustratos. Tomados en conjunto con los estudios de modificacin anteriores, estos
y NORTE- etilmaleimida (NEM) 18
resultados presentan un caso convincente para la funcin cataltica esencial de la
han indicado un papel esencial para un tiolato de cistena en la reaccin
Cys-135.
ASADH. estudios de proteccin contra Substrato NEM inactivacin, llevada a
cabo en presencia de ASA, han sugerido que esta cistena esencial se
encuentra en o cerca del sitio activo de la enzima. Adems, estudios de perfil
Una bsqueda de homologa de secuencia entre las ASADHs que han
de pH han indicado un papel para un grupo de cido neutral, con ap K valor
sido aislados de otras especies, y las comparaciones con las estructuras de
similar a la observada durante la modificacin NEM, que debe ser ionizado
funcionalmente similar RE- deshidrogenasas gliceraldehdo-3-fosfato (GAPDH)
para la actividad enzimtica. 18 L- 2-Amino-4-oxo5-cloropentanoico cido, un
que han sido resueltos de varias especies, se han utilizado para seleccionar
anlogo de sustrato de alquilacin de ASA, inactiva irreversiblemente ASADH.
los objetivos apropiados para la mutagnesis (Figura 4). Un histidina del sitio
Un pptido aislado que contiene el cido amino modificado, tentativamente
activo altamente conservada en la familia GAPDH (Su-176) ha sugerido para
identificado como una histidina, se inform de que la secuencia de
mejorar la catlisis por desprotonacin de la cistena del sitio activo (Cys-149)
aminocidos Phe-Val-Gly-Gly-Asp- Su- Thr-Val-Ser. 19 Haziza et al.
para generar el tiolato nuclefilo. 21,22 Sin embargo, una glutamina totalmente
posteriormente determinado la secuencia de nucletidos de la totalidad asd gen
conservada se encuentra en la familia ASADH en la posicin correspondiente
de E coli que codifica para ASADH 15
a esta histidina. Mientras que no es qumicamente factible para una amida
para sustituir el cido-base papel cataltico de la histidina, glutamina este debe
ser jugar algn papel esencial. Una sustitucin conservadora de una
y se encontr una correspondiente secuencia que codifica para los residuos de asparagina para la glutamina en esta posicin (Q162N) resulta en una
aminocidos 130-138 de su secuencia deducida. Sin embargo, encontraron una disminucin de la k gato a menos del 10% de la de la actividad nativa. 23 La
sustitucin de asparagina para el cido asprtico y cistena para histidina en los sustitucin de una histidina en esta posicin en ASADH, para imitar el
residuos 134 y 135, respectivamente. Estos resultados son consistentes con la aminocido que se encuentra en esta posicin en GAPDH, da una mejora de
cistena localizado en la posicin 135 de la secuencia de aminocidos como el la actividad de 4 veces sobre el Q162Nmutant (Tabla 2). sin embargo, el k gato de
candidato ms probable para el nuclefilo de cistena del sitio activo. este mutante es todava menos de 30% de la de la actividad nativa, apoyando
un esencial, pero en este papel no determinado punto para este residuo de
glutaminilo.
Estudios de mutagnesis. Los mutantes de ASADH se construyeron
mediante mutagnesis dirigida por oligonucletidos para examinar el papel de
este putativo cistena del sitio activo, y para identificar aminocidos adicionales
grupos funcionales que pueden desempear un papel en el mecanismo de la
reaccin catalizada por la enzima. Los parmetros cinticos se determinaron de la A arginina conservada (Arg-267) se ha encontrado para alinearse con
la Arg-231 en GAPDH (Figura 4) que ha sido

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Las enzimas central de la familia aspartato Viola

FIGURA 4. La homologa de secuencia entre el aspartato un- semialdehdo deshidrogenasa (asadh) de la familia y la alineacin con secuencias de gliceraldehdo-3-fosfato
deshidrogenasa (GAPDH representante). Las secuencias se muestran en todo el nuclefilo del sitio activo (Cys-135), el residuo de orientacin putativo (Gln-162), y la unin del
sustrato grupo propuesto (Arg-267).

asignado el papel de unir el grupo fosfato del sustrato. 21 La sustitucin de este tiolato. Sin embargo, el contacto ms directo a Cys-135 es de otro residuo,
residuo de arginina en ASADH conduce a una disminucin en la renovacin Su-274, con el nitrgeno- del anillo de imidazol solamente 3,8 UN desde el
cataltica, y es la nica mutacin examinado que tambin se traduce en una tiolato Cys-135 (Figura
disminucin de la afinidad tanto para ASA y fosfato (Tabla 2). Por tanto, este 6). La posicin de este histidina es consistente con un papel en la
residuo se le asigna un papel en la unin de la aspartato sustrato un- semialdehdo. desprotonacin del tiol. 18 Aunque este histidina est completamente
23 Secuencia de la alineacin de ASADH con otra NADP y las enzimas conservada en la familia ASADH, su posicin en el sitio activo de la enzima
dependientes de NAD tambin ha conducido a la identificacin de una regin no se anticip a la luz de los alineamientos de secuencia entre estas familias
de unin putativo piridina nucletido. La sustitucin de dos aminocidos en homlogas. Como se mencion anteriormente, la histidina del sitio activo en
esta regin, ya sea con cadenas laterales neutras o cargadas positivamente se GAPDH es una glutamina conservado en esa posicin en ASADH, y la
ha traducido en un cambio en la especificidad de coenzima. NADP est histidina del sitio activo en ASADH es una serina conservadas en esa
fuertemente favorecida por mayor que 9000 veces sobre NAD como la posicin en la familia GAPDH. Sin embargo, el papel esencial de su-274 se
coenzima para de tipo salvaje ASADH, mientras que en esta enzima mutada la confirm en un mutante donde esta histidina es reemplazada por una
selectividad se ha reducido por un factor de 60, y esta enzima tiene afinidades glutamina en ASADH, y la actividad se reduce en un 10 3 en comparacin con
comparables, ya sea para la piridina nucletido. 23 la de la enzima nativa. 25

En el enzima libre los tres residuos, Su-274, Gln-162 y Arg-267, estn


Los estudios estructurales. La estructura de ASADH de E coli implicados en enlaces de hidrgeno a una sola molcula de agua que
recientemente se ha resuelto por difraccin de rayos X a 2,5 UN aparece para aproximar el sitio de unin del sustrato. En esta estructura
resolucin utilizando tomo pesado sustitucin isomorfa y la simetra no Gln-162 est justo fuera de la distancia normal de enlaces de hidrgeno del
cristalogrficos. Cada monmero en este dmero funcionalmente activo tiene nitrgeno de Su-274. Este grupo funcional amida puede desempear un
una NORTE- terminal de dominio de unin de nucletidos y un dominio de papel en la orientacin de la histidina, y la prdida de actividad que se
unin a sustrato, que tambin proporciona la mayora de la superficie de observa cuando este glutamina est sustituido con el asparagina homloga
contacto entre las subunidades (Figura 5). La presencia de la Cys135 esencial apoya esta hiptesis. Los actores clave en el sitio activo (Cys-135, His-274,
localiza el sitio activo, y esto nuclefilo se encuentra en la interfaz entre los Gln-162) son una reminiscencia de la trada cataltica observada en
dos dominios, en consonancia con su papel en la catlisis. 24 Dos otros residuos cistena proteasas. La cistena y la histidina se colocan adecuadamente
que fueron identificados por mutagnesis dirigida al sitio como jugando un para jugar los mismos papeles en ASADH. El papel del tercer residuo,
papel en la catlisis 23

tambin se encuentran en el sitio de hendidura activa (Figura 6). Arg-267 est


haciendo una interaccin electrosttica con el grupo carboxilo de la inactivador
activo dirigido de sitio S- sulfxido metilcistena que es consistente con su papel
propuesto en la unin del sustrato. La glutamina (Gln-162) que se identific Mecanismo de enzima. El mecanismo cintico de ASADH,
por homologa de secuencia y se sond por mutagnesis sitedirected se determinado a partir de la velocidad inicial, el producto y los estudios de
encuentra para estar en estrecha proximidad a Cys-135, con el oxgeno del inhibicin de remate, es un mecanismo secuencial orden preferido
carbonilo de menos de 6 UN desde el aleatorio. 18 Para la reaccin examinado en la direccin fisiolgica, fosfato
aspartil une preferible

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Las enzimas central de la familia aspartato Viola

FIGURA 5. dibujo de la cinta de la estructura de aspartato un- semialdehdo deshidrogenasa de Escherichia coli. 24 Se muestra el dmero catalticamente activo, con una de las subunidades
de sombra en rojo. La posicin de encuadernado NADP se muestra (en azul) en la subunidad no sombreada, as como el sitio activo cistena-135 modificado con S- sulfxido metilcistena
(en verde).

por protonacin de Su-274) genera ASA. La desprotonacin de Cys-135 se


requiere para iniciar otro ciclo cataltico.

Especificidad oxianin. La estructura de un anlogo de


enzymeNADP-sustrato ( S- sulfxido) complejo metilcistena se ha
determinado; sin embargo, una estructura an ms informativo sera que
del intermedio de acil-enzima. Esta forma de acil-enzima es
razonablemente estable, hasta el punto en que puede ser aislado por
cromatografa de filtracin en gel en ausencia de fosfato. diecisis Adems la
estabilizacin de este intermedio puede permitir la cristalizacin de este
complejo. Para este fin una variedad de oxianiones han sido probados
como posibles sustratos alternativos o inhibidores competitivos frente a
fosfato para la reaccin inversa (oxidativo). Arseniato y vanadato se
encontr que eran buenos sustratos alternativos (Tabla 3), con V mx valores
que son 50-70% que con fosfato y una K metro para vanadato que es 20
veces menor que la de fosfato. 26
FIGURA 6. la estructura del sitio activo de aspartato un- semialdehdo deshidrogenasa
que muestra el nuclefilo (Cys-135) covalentemente inac- activa con S- sulfxido
metilcistena (mostrado en verde), la base cataltica (Su-274), el grupo de orientacin
para la base cataltica (Gln-162), y los grupos de unin a sustrato (Glu-241 y Arg-267). 40
Peryodato, telurato, fosfonato, tungstato y perrenato se encontr que todos
los inhibidores competitivos de ASADH, con K yo valores que van de 0,2 mM
para peryodato a 140 mM para perrenato. Estos resultados han sido
entially al complejo E-NADPH, y no se ordena la liberacin de productos de analizados para determinar la geometra, el tamao de aniones, y densidad
ASA y NADP. El mecanismo qumico propuesto para de tipo salvaje de carga molecular contribuyen a la capacidad de la enzima para
ASADH sigue una secuencia fourstep (Esquema 1). El nuclefilo sitio discriminar entre los posibles sustratos o inhibidores. Se requiere geometra
activo es generado por desprotonacin de Cys-135 por la adyacente de tetradrica, y una alta densidad de carga negativa en los oxgenos
His-274. Su-274 est posicionada para este papel por un enlace de perifricos es un componente importante para el reconocimiento del

hidrgeno a Gln-162. La unin de fosfato aspartil es asistido por una sustrato por ASADH. 26

interaccin electrosttica del grupo carboxilo de sustrato con el grupo


guanido de Arg-267. Ataque de la tiolato sitio activo en el carbono carbonilo La unin de inhibidores competitivos en el sitio de unin de fosfato se
de fosfato de aspartilo, seguido por el colapso del intermedio tetradrico encontr para estabilizar el producto intermedio de acil-enzima. La
con expulsin de fosfato, conduce a la transferencia de hidruro a este hidrlisis lenta de este intermedio se reduce adicionalmente por al menos
intermedio. La expulsin de tiol (asistido 20 veces al cambiar de pH 8 a pH 7 en presencia de niveles saturantes de
peryodato. La cristalizacin de esta voluntad complejo intermedio

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Esquema 1. Mecanismo qumico de aspartato un- semialdehdo deshidrogenasa

Tabla 3. Cintica para oxianiones Interactuar con La estructura de este HDH levadura se ha resuelto recientemente. 32 La
Aspartato semialdehdo deshidrogenasa un enzima es un dmero, con cada monmero compuesta de una regin de unin
oxianin V max ( min- 1) K m ( mM) V max / K m ( METRO- 1 s- 1) a nucletidos, una regin cataltica, y una regin de interfaz de subunidad. La
fosfato 710 2.9 4.1 10 3 estructura del sitio activo de HDH identifica dos grupos de unin, Asp-214 y
arseniato 510 1.6 5.3 10 3 Glu-208, que ayuda a orientar el ASA sustrato. El mecanismo propuesto,
vanadato 330 0.14 3.9 10 4
basado en ambos estudios estructurales y mutagnicos, es inusual para una
un Condiciones de reaccin: tampn 200 mM Ches (pH 8,6), 25 DO,
deshidrogenasa piridina-vinculado. En lugar de los donantes de protones
saturando (1 mM) NADP, saturando (0,5 mM) ASA, y concentraciones variables de los
tpicas que se encuentran en estas enzimas, una lisina del sitio activo
oxianiones.
(Lys-223), colocado a travs de una interaccin electrosttica con Asp-219, se
propone para donar un protn al alcxido de ASA que se forma durante la
proporcionar una instantnea de un paso importante en el ciclo cataltico de
transferencia de hidruro a partir de NADPH. Este papel es apoyado por una
ASADH.
mutacin de este lisina que se traduce en una enzima completamente inactivo. 32

homoserina deshidrogenasa
Homoserina deshidrogenasa (HDH) cataliza la reduccin
NADPHdependent de ASA para producir homoserina. Esta reaccin se En este punto de la homoserina va puede ser dirigida, por
produce en un punto de ramificacin clave en la va, con el sustrato que condensacin con succinil-coenzima A, para la produccin de metionina.
sirve como precursor para la biosntesis de la lisina y el producto que Alternativamente, homoserina puede ser fosforilado por la quinasa
conduce a la metionina, treonina, isoleucina y (Figura 1). Regulacin de la homoserina, que conduce a la treonina y posteriormente a isoleucina
reaccin catalizada por HDH es crucial para controlar el flujo a travs de (Figura 1).
esta va ramificado. En las bacterias Gram-negativas tales como E coli, HDH
se encuentra como un dominio cataltico en una enzima bifuncional con
homoserina quinasa
aspartoquinasa, y la regulacin alostrica de ambas actividades est
mediada a travs del dominio aspartoquinasa. 27 En contraste, HDH en homoserina quinasa (HSK, EC 2.7.1.39), la cuarta enzima en la va
bacterias Gram positivos es una enzima independiente y un mecanismo aspartato de la biosntesis de aminocidos, cataliza la fosforilacin de L- homoserina
diferente de la regulacin ha evolucionado. La regulacin por treonina de la a L-
homoserina deshidrogenasa de Corynebacterium glutamicum es abolida por fosfato homoserina. Este intermedio activado es el precursor para la
mutaciones cerca de la C-terminal. 28,29 El HDH monofuncional de Bacillus sntesis de treonina, catalizada por la sintasa treonina.
subtilis es altamente homloga a la de C. glutamicum.
La especificidad de sustrato. Como es cierto para todas las quinasas, un
ion de metal divalente, normalmente de magnesio, es esencial para la actividad
cataltica. Pero, adems, tambin se han informado de iones metlicos divalentes
Un examen de las secuencias de estas enzimas muestra que contienen un para aumentar la afinidad de la enzima por L- homoserina. 33 Una amplia gama de
dominio C-terminal adicional de aproximadamente 100 aminocidos que no anlogos estructurales de L- homoserina han sido examinadas como posibles
se encuentra en el E coli sustratos alternativos para la reaccin catalizada por HSK. Tanto cintica y 31 estudios
enzima. 30 Sobre la base de alineamientos de secuencias, la hibridacin y P RMN han demostrado que la enzima es capaz de fosforilar un grupo hidroxilo
estudios de delecin, este dominio parece ser el sitio de regulacin en cualquiera de carbono 4 o 5 de L- anlogos homoserina, pero tampoco L- treonina
alostrica por treonina. La enzima que se ha aislado de la levadura es la ni L- serina es un sustrato de la enzima. Para cuatro carbonos
ms pequea homoserina deshidrogenasa conocida. Esta enzima
monofuncional no se encuentra la extensin C-terminal que se encuentra en
las bacterias Gram positivos y por consiguiente no est regulada por L- anlogos de homoserina, el grupo carboxilo en el R- posicin puede ser un
treonina. 31 carboxilo, o podra ser sustituido con un ster o incluso un grupo
hidroximetilo. La enzima puede

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Tabla 4. Cintica de la homoserina quinasa mutantes un El mutante R234C no tiene actividad homoserina quinasa observable, medida
k gato ( s- 1) usando un ensayo de enzima acoplada; Sin embargo, ahora tiene una actividad

enzima quinasa ATPasa quinasa relacin / ATPasa


de ATPasa que es casi 20 veces mayor que la de la enzima de tipo salvaje. El
mutante R234H tambin tiene actividad disminuida quinasa (0,4% de tipo
tipo salvaje 18.3 0,016 1140
R234L 0.20 0,049 4.1 salvaje) y una actividad ATPasa mejorada.
R234C 0.02 segundo 0.28 0.08
R234H 0,073 0.37 0,19
H202L 9.06 0,071 128
Hay tres histidinas que se conservan parcialmente en HSK. La
H139L 0.5 segundo 2.51 0.21 mutacin de la histidina ms conservada (His-
H205Q 0,005 segundo 0,036 0.14 139) para leucina conduce a una enzima con actividad de ATPasa mejorada de
un Condiciones de reaccin: la actividad se monitoriz mediante un ensayo de piruvato manera espectacular, sobre 150 veces mayor que la de la enzima de tipo salvaje, y
deshidrogenasa quinasa acoplado / lactato que contiene 100 mM de Hepes / Tris (pH 8,0), KCl
con la actividad de quinasa disminuida (Tabla 4). Cuando se calcula a partir de la
100 mM, MgATP 2 mM, PEP 0,7 mM, y 0,1 mMNADH. segundo Estimado a partir de la relacin de
particin de quinasa a la actividad ATPasa determinado por el fsforo-31 RMN espectroscopia relacin de quinasa a los productos ATPasa utilizando 31 espectroscopa de RMN P,
copia la actividad quinasa de H139L es de menos de 3% de la de la enzima de tipo
salvaje. Sustitucin de histidina-202 con leucina conduce a slo una disminucin del
50% en k gato, mientras que la sustitucin de la histidina-205 con glutamina conduce a
tambin acomodar a grupos grandes, hidrfobos en el extremo carboxilo una enzima con un inalterada K metro para ATP y una actividad de ATPasa que est
del sustrato. L- steres homoserina con grupos ster de hasta cuatro dentro de un factor de 2 de la enzima de tipo salvaje. 34 Sin embargo, la actividad
carbonos larga estn procesados sin un sacrificio sustancial de la eficiencia quinasa de H205Q, como se determina a partir de 31 P RMN, es de menos de 0,03%
cataltica, aunque la selectividad ( k gato/ K metro) para homoserina es de 20 a 80 de la del enzima de tipo salvaje (Tabla 4).
veces mayor que para estos steres homoserina. 34 Estos resultados
sugieren la presencia de un bolsillo hidrofbico adyacente al sitio de unin
del grupo carboxilo del sustrato en el sitio activo, con interacciones
Estos estudios de mutagnesis dirigida han confirmado un papel para
hidrofbicas entre los grupos alquilo y los alrededores de la bolsa, al
la arginina-234 en la unin del grupo carboxilo de L- homoserina, y la
menos parcialmente compensar la prdida de una interaccin inica para
participacin de dos histidinas (HIS-139 y Su-205) en el sitio homoserina.
ayudar en la orientacin productiva de estos sustratos alternativos.
Las mutaciones en estos sitios han dado lugar a la disociacin de la
actividad quinasa de una actividad ATPasa inherente a la enzima. Estos
resultados sugieren la presencia de dominios independientes para la unin
de ATP y homoserina en HSK. Las alteraciones que interfieren con la unin
Identificacin de funcionalmente importantes Amino Acids.
de homoserina en realidad aumentar la capacidad de homoserina quinasa
Un examen del perfil de pH muestra que esta enzima pierde actividad tras la para hidrolizar ATP.
protonacin de un nico grupo funcional y sobre desprotonacin de un
segundo grupo funcional, con ambos grupos que aparecen a ser del tipo de
cido catinico. 35 La incubacin de la enzima con DEP conduce a la prdida
completa de la actividad enzimtica. Caracterizacin espectral y qumica de
la enzima derivatizada ha demostrado que esta prdida de actividad es Creacin de nuevas enzimas bifuncionales
causada por la modificacin de un residuo histidilo, y la presencia de Las enzimas bifuncionales existente. Hay muchos ejemplos de enzimas
sustratos protege una sola histidina de la modificacin. El tratamiento de la bifuncionales bien caracterizados, en particular en el metabolismo de
enzima con piridoxal-5 '- fosfato tambin resulta en la inactivacin de la aminocidos. Por ejemplo, en amino aromtico biosntesis de los cidos de
enzima. La evidencia espectral para la formacin de una base de Schiff es la R- subunidad de triptfano sintasa cataliza la produccin de indol, que a
compatible con la presencia de una lisina reactiva. La proteccin completa continuacin se canaliza a la un- subunidad se condense con serina para la
contra la modificacin proporcionada por sustratos e inhibidores tambin sntesis de triptfano. 36 Dos enzimas bifuncionales diferentes catalizan la
indica que la quinasa de homoserina contiene una lisina que es esencial conversin de corismato, dirigiendo el prefenato intermedio para la sntesis
para la actividad cataltica. 35 de cualquiera de tirosina, en el caso de corismato mutasa
deshidrogenasa-prefenato, 37 o fenilalanina cuando catalizada por corismato
mutasa deshidratasa-prefenato. 38 En estos, y en prcticamente todos los
otros ejemplos, las enzimas bifuncionales catalizan reacciones
Estudios de mutagnesis. La eleccin de los objetivos de aminocidos consecutivas ya sea para canalizar un intermedio metablico al siguiente
apropiadas para el sitio-directedmutagenesis se basa en los estudios de pH y de sitio cataltico, o para dirigir el flujo metablico hacia abajo una rama de
modificacin qumica anteriores, y tambin en las comparaciones de secuencias una va. Una notable excepcin a la utilidad de la catlisis de reaccin
entre enzimas relacionadas. Arg-234, la nica arginina conservada, se sustituy consecutivos es las isoenzimas deshidrogenasa
en primer lugar con el aminocido leucina neutral. los K metro de R234L de aspartoquinasa-homoserina que catalizan reacciones no consecutivos.

L- homoserina aumenta en casi 300 veces y la k gato


disminuye en 90 veces en comparacin con las de la enzima de tipo salvaje
(Tabla 4). Sin embargo, hay menos de un cambio de 2 veces en el K metro para Para examinar los mecanismos de regulacin en esta va, y para tratar
ATP, y la actividad de ATPasa inherente de HSK (<0,1% de la actividad potencialmente la cuestin de la canalizacin metabolito, hemos escindido
quinasa en la enzima nativa) en realidad aumenta por 3 veces en el mutante el gen que codifica para la bifuncional AK-HDH I y han expresado por
R234L. 34 Arg 234 tambin fue reemplazado por cistena e histidina. separado cada uno de los dominios catalticos. Para estudiar

346 Accounts of Chemical Research / VOL. 34, NO. 5, 2001


Las enzimas central de la familia aspartato Viola

Tabla 5. Cintica de las monofuncionales Aspartokinases y homoserina deshidrogenasas

actividad aspartoquinasa un homoserina deshidrogenasa actividad un

parmetros cinticos AK-HDH I segundo me AK segundo AK III segundo AK-HDH I segundo HDH I ' segundo HDH I segundo

k gato ( s- 1) 0.39 6.3 98 0.24 3.30 0.51


K m ( aspartato o homoserina) (mM) 0.63 0.47 0.51 1.2 0.68 17.2
k gato/ K m ( METRO- 1 s- 1) 6.3 10 2 1.4 10 4 1.9 10 5 2.1 10 2 4.9 10 3 3.0 10 1

un actividad aspartoquinasa se control mediante un ensayo de piruvato deshidrogenasa quinasa acoplado / lactato mientras homoserina deshidrogenasa actividad se control directamente por la
reduccin del NADP. segundo AK-HDH I, I nativo deshidrogenasa bifuncional aspartoquinasa-homoserina; AK I, aspartoquinasa I dominio cataltico; AK III, aspartoquinasa nativa III; HDH I ', homoserina
deshidrogenasa dominio cataltico con regin de interfaz adjunto; HDH I, homoserina deshidrogenasa dominio cataltico.

Tabla 6. Cintica de las enzimas Nueva bifuncionales

actividad aspartoquinasa un homoserina deshidrogenasa actividad un

parmetros cinticos DH AK I-ASA segundo AK III-HDH I ' segundo AK-HDH I segundo AK III-HDH I ' segundo

k gato ( s- 1) 1.35 0.16 0.24 24


K m ( aspartato o homoserina) (mM) 0.59 0.51 1.2 0.41
k gato/ K m ( METRO- 1 s- 1) 2.3 10 3 3.1 10 2 2.1 10 2 5.9

un actividad aspartoquinasa se control mediante un ensayo de piruvato deshidrogenasa quinasa acoplado / lactato mientras homoserina deshidrogenasa actividad se control directamente por la
reduccin del NADP. segundo AK I-ASA DH, la fusin de aspartoquinasa I dominio cataltico con el aspartato semialdehdo deshidrogenasa; AK III-HDH I ', fusin hbrida de aspartoquinasa nativo III con la
regin de dominio y la interfaz cataltica de I homoserina deshidrogenasa; AK-HDH I, nativa aspartoquinasa homoserina-deshidrogenasa I.

el flujo y la regulacin de metabolitos a travs de esta va que se han se elimina el dominio cataltico AK. Estos resultados estn en contraste con los
combinado diferentes dominios catalticos para crear varias nuevas informes previos de que la regulacin de HDH por treonina est mediada por el
enzimas bifuncionales artificiales. dominio aspartoquinasa. 27 Sin embargo, adems de truncamiento, de la

La expresin de nuevas enzimas monofuncionales. El gen eliminacin de la regin de la interfaz, causa una disminucin mayor que 400
veces en la sensibilidad de HDH a la inhibicin por retroalimentacin por
bifuncional AK-HDH I, thrA, de E coli ha sido dividida en sus dominios
treonina. 39
catalticos separados y completamente funcional. 39 El dominio
aspartoquinasa I abarca aproximadamente los primeros 250 aminocidos
en el NORTE- terminal de la bifuncional AK-HDH I enzima. El fragmento de Para la fusin FormBifunctional enzimas. Ahora que cada dominio
gen que codifica este dominio, llamado thr UN 1, se escindi del cataltico se ha demostrado que es completamente activa cuando se expresa
por separado, la siguiente pregunta que abordar es si estos genes pueden
thr Un gen y se expres por separado. Este dominio monofuncional purificada fusionarse para formar nuevas enzimas bifuncionales que pueden catalizar
AK I tiene una alta actividad cataltica, con una mejorada k gato en comparacin reacciones consecutivas. La separados thrA 1 fragmento del gen que codifica
con la de la enzima bifuncional intacto (Tabla 5). La porcin restante de la thr Un para AK I se uni en marco a la asd gen que codifica para ASADH para crear
gen, llamado thr UN 2 ', consiste en la regin de interfaz y la homoserina una nueva enzima bifuncional que podra ahora potencialmente catalizar la
deshidrogenasa dominio cataltico. La expresin de este fragmento de gen conversin acoplado de aspartato a aspartato un- semialdehdo. Junto a AK I a
produce una monofuncional HDH I ' que tambin es altamente activo, con ASADH resultado en una disminucin de 5 a 6 veces tanto en k gato y en k gato/ K metro
ms de un aumento de 10 veces en para AK I en comparacin con los valores para la enzima
isolatedmonofunctional (Tabla 6). Sin embargo, estos valores son todava 4
k gato y una disminucin de 2 veces en K metro en comparacin con esta actividad en la veces mayores que las observadas en la enzima bifuncional nativo.
enzima bifuncional nativa (Tabla 5).

Para examinar el efecto que la presencia de la regin de interfaz podra


tener sobre la actividad cataltica del dominio HDH, esta regin fue retirado
de la HDH monofuncional. Este fragmento de gen, llamado thr UN 2, codifica Para examinar el mecanismo de la inhibicin del producto final, una
para slo el dominio 41 kDa HDH. El dominio cataltico separado tiene una enzima bifuncional hbrido se prepar uniendo el
menor k gato sin la regin de interfaz presente, y una K metro para homoserina lysC gen que codifica para la monofuncional AK III con el thrA 2 ' gen que
que se ha incrementado en 40 veces. Sin embargo, esta disminucin de la codifica para HDH I ' con el dominio de interfaz. Nativo AK III est sujeto a
catlisis es solamente 7 veces menor que el medido para la enzima inhibicin por retroalimentacin por el producto final aminocido lisina. Esta
bifuncional nativa (Tabla 5). inhibicin se retiene en la enzima bifuncional hbrido con HDH I, mientras
que la actividad HDH en esta enzima sigue siendo sensible a la inhibicin
treonina. Sin embargo, adems de la inhibicin por treonina, la actividad
La regulacin de las enzimas monofuncionales. Nativo AK-HDH I es deshidrogenasa ha ahora llegar a ser bastante sensibles a la inhibicin por
sujeto a inhibicin por retroalimentacin por el cido amino producto final L- treonina,la lisina. 39 Por lo tanto, la fusin de estos dos dominios catalticos ha
con una constante de inhibicin de aproximadamente 0,3 mM. El dominio permitido la unin de un inhibidor alostrico (lisina), cerca de un dominio
AK I separados ha perdido esta capacidad de regulacin alostrica, y ya no cataltico (AK III) para ser comunicado a travs de la interfaz de fusin para
es inhibida por treonina en concentraciones de hasta 200 mM. El dominio influir en la actividad del otro dominio cataltico (HDH).
HDH I separada todava est regulado, y se hace an ms sensibles a la
inhibicin treonina cuando

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Las enzimas central de la familia aspartato Viola

Andrea Hadfield (Universidad de Bristol) por su solucin de la aspartato un- semialdehdo


Conclusiones y direcciones futuras
deshidrogenasa estructura. Este trabajo ha sido financiado por una subvencin de
Enzimas, con pocas excepciones, son notables por su capacidad para rea de los Institutos Nacionales de Salud (GM57626) y ms recientemente por una
catalizar transformaciones estereoselectivas y regioselectivas. Estas beca de la Fundacin Nacional de Ciencia (MCB9816745).
especificidades son ciertamente presente en la fosforilacin de cido
asprtico que es catalizada por la aspartokinases. Solo el L- ismero de
cido asprtico es un sustrato y slo el un- grupo carboxilo del sustrato es referencias
fosforilado. Sin embargo, se han encontrado estas enzimas para unir un- anlogos (1) Cohen, GN The Common Camino a la lisina, metionina, y
Treonina. En Aminocidos: Biosntesis y Reglamento gentica;
derivatizados de cido asprtico, los compuestos que normalmente no se Herrmann, KM, Somerville, RL, Eds .; Addison-Wesley: ing Lectura-, MA, 1983; pp
encuentran in vivo. Al hacerlo, la regioselectividad se invierte y el 147-171.
(2) Cohen, GN El aspartokinases y homoserina deshidrogenasa
de Escherichia coli. Curr. Temas Cell. Regulat. 1969, 1, 183-231. (3) Cohen, GN;
Dautry-Varsat, A. La Aspartokinases-homoserina
R- grupo carboxilo se convierte en el aceptor fosforilo. Varios de estos R- fosfatos deshidrogenasas de Escherichia coli. En Protenas multifuncionales;
Bisswanger, H., Schmincke-Ott, E., Eds .; JohnWiley & Sons: Nueva York, 1980; pp
de acilo tambin se han demostrado ser sustratos alternativos para los 49-121.
pasos enzymecatalyzed subsiguientes en esta va metablica. Al permitir (4) Rosner, A .; Paulus, H. Reglamento de aspartoquinasa en Bacilo
subtilis. La separacin y las propiedades de dos enzimas isofunctional. J. Biol. Chem. 1971,
que estas enzimas para llevar a cabo la sntesis, los productos de estas
246, 2965-2971. (5) Falcoz-Kelly, F .; Janin, J .; Saari, JC; Vern, M .; Truffa-Bachi, P .;
reacciones alternativas se convierten en candidatos potenciales para
Cohen, GN estructura revisada del aspartoquinasa I-homoserina deshidrogenasa I de Escherichia
inhibidores o inactivadores de las enzimas aguas abajo en la va
coli K12. EUR. J. Biochem. 1972,
dirigidas-sitio activo. 28, 507-519.
(6) Wampler, DE Treonina sensible aspartoquinasa-homoserina
complejo deshidrogenasa de Escherichia coli. Subunidad ometry stoichi- y tamao de la
La estructura de alta resolucin de la aspartato semialdehdo unidad cataltica. Bioqumica 1972, 11, 4428-
deshidrogenasa confirm las asignaciones estructurales del sitio activo que 4435.
(7) Fazel, A .; Muller, K .; Le Bras, G .; Garel, JR; Vern, M .; Cohen,
se hicieron sobre la base de estudios de modificacin y mutagnesis GN Un modelo triglobular para la cadena de polipptido de aspartoki- nase I-homoserina
qumica. A histidina no reconocido previamente fue descubierto en esta deshidrogenasa I de Escherichia coli. bioqumica 1983, 22, 158-165.

estructura que desempea el papel de una base de sitio activo para


(8) Karsten, WE; Hunsley, JR; Viola, Purificacin RE de aspartasa
desprotonar la cistena cataltica y generar el nuclefilo de tiolato. Los y aspartoquinasa homoserina deshidrogenasa I de Escherichia coli por ligando colorante
cromatografa. Anal. Biochem. 1985,
ASADHs de una gama de microorganismos infecciosos tienen el mismo
147, 336-341.
conjunto de los aminocidos funcionalmente importantes que han sido (9) Keng, YF; Viola, RE Especificidad de la aspartoquinasa III de
identificados en el E coli enzima; sin embargo, su identidad de secuencia Escherichia coli y un examen de importantes cuotas resi- catalticos. Arco. Biochem.
Biophys. 1996, 335, 73-81. (10) Angeles, TS; Hunsley, JR; Viola, RE Reversin de la enzima
global vara de ms del 80% a menos del 25%. La purificacin, mecanismos
y estructuras de estas enzimas estn siendo investigados con el objetivo de regioespecificidad con sustratos alternativos para aspartoquinasa I desde Escherichia
coli. Bioqumica 1992, 31, 799-805. (11) Angeles, TS; Viola, RE Los mecanismos cinticos de
identificar las diferencias entre estas enzimas que pueden usarse para la
la
inhibicin especfica. Enzima bifuncional aspartoquinasa homoserina deshidrogenasa I de Escherichia coli.
Arco. Biochem. Biophys. 1990, 283, 96-
101.
(12) Patte, JC; Truffa-Bachi, P .; Cohen, GN La treonina sensible
actividades deshidrogenasa y aspartoquinasa homoserina de Escherichia coli. I. La
No est claro por qu la naturaleza opt por fusionar los genes que
evidencia de que las dos actividades se realizan por una sola protena. Biochem. Biophys.
codifican para aspartoquinasa homoserina deshidrogenasa y hacer una Acta 1966, 128, 426-439. (13) Truffa-Bachi, P .; Van Rapenbusch, R .; Janin, J .; Gros, C .;
enzima bifuncional que cataliza reacciones no consecutivos. La separacin Cohen,
GN Las actividades homoserina deshidrogenasa y aspartoquinasa treonina sensible de Escherichia
de estos genes conduce a dos enzimas totalmente funcionales coli K 12. 4. Aislamiento, peso molecular, anlisis de aminocidos y el comportamiento
independientes. Unindose a la monofuncional recin producido de los grupos sulfhidrilo de la protena que cataliza las dos actividades. EUR.

aspartoquinasa I aspartato semialdehdo deshidrogenasa crea una enzima


J. Biochem. 1968, 5, 73-80.
bifuncional artificial que ahora pueden catalizar reacciones consecutivas. (14) Angeles, TS; Smanik, PA; Borders, CL; Viola, RE aspartato
tokinase-homoserina deshidrogenasa I de Escherichia coli: pH y qumicas Estudios
Los experimentos preliminares han demostrado una canalizacin directa
modificacin de la actividad de la quinasa. bioqumica 1989, 28, 8771 a 8779. (15) Haziza,
del fosfato de acilo inestable intermedia entre los sitios activos en esta C .; Stragier, P .; Patte, Secuencia de nucletidos del JC
enzima de fusin de nueva construccin. Los estudios futuros se centrarn
asd gen de Escherichia coli: Ausencia de una seal de atenuacin tpica. EMBO J. mil
en la produccin de construcciones bifuncionales adicionales, una enzima novecientos ochenta y dos, 1, 379-384. (16) Biellmann, JF; Eid, P .; Hirth, C .; Jornvall, H.
trifuncional que puede catalizar la conversin directa de cido asprtico a aspartato un-
Semialdehdo deshidrogenasa de Escherichia coli. EUR. J. Biochem. 1980, 104, 53-58.
homoserina, y un examen de canalizacin intermedia y la regulacin en
esta va. La finalizacin de estos estudios ser la base para el desarrollo (17) Holland, MJ; Westhead, EW Purificacin y caracterizacin
de asprtico- un- Semialdehdo deshidrogenasa de la levadura y la purificacin de una
de inhibidores y activadores de esta va esencial.
isozima de gliceraldehdo-3-fosfato deshidrogenasa. Bioqumica 1973, 12, 2264-2270. (18)
Karsten, WE; Viola, RE qumica y mecanismo cintico de

aspartato un- semialdehdo deshidrogenasa de Escherichia coli. Biochem. Biophys. Acta 1991,
1077, 209-219. (19) Biellmann, JF; Eid, P .; Hirth, C. aspartato un- semialdehdo

deshidrogenasa de Escherichia coli. De marcaje por afinidad con el sustrato anlogo


Doy las gracias a los muchos y excelentes compaeros de trabajo que han
L-2-amino-4-oxo-5-cloropentanoico cido: un ejemplo de medio sitio reactividad. EUR. J.
contribuido a nuestra comprensin mejorada de esta va, incluyendo Jim Hunsley, Biochem. 1980, 104, 59-
Thelma ngeles, Yen-fang Keng y Julio Blanco sobre los aspartokinases, Bill 64.
(20) Karsten, WE; Viola, RE Identificacin de una cistena esencial
Karsten, Jun Ouyang, Cindy James, y Michelle Kish el aspartato un- semialdehdo
en la reaccin catalizada por la aspartato un- semialdehdo deshidrogenasa de genase Escherichia
deshidrogenasa, y Xuewen Huo en homoserina quinasa. Un agradecimiento especial coli. Biochem. Biophys. La protena Acta Struct. Mol. Enzymol. 1992, 1121, 234-238.
a

348 Accounts of Chemical Research / VOL. 34, NO. 5, 2001


Las enzimas central de la familia aspartato Viola

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AR000057Q

VOL. 34, NO. 5, 2001 / Accounts of Chemical Research 349

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