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IIB-UNSAM
Introduccin a los
Bioprocesos
Gastn Ortiz
gas.ortiz@gmail.com
Introduccin a los Bioprocesos
Una breve historia
Desde 5000 AC las civilizaciones egipcias y ms tarde las
chinas comienzan a producir alimentos y bebidas
fermentadas.
Sin embargo, pasan casi 7000 aos para descubrir el
origen microbiano de la fermentacin (1856).
Otros 50 en utilizar las bacterias para producir compuestos
qumicos industriales (1900).
70 aos ms para obtener el primer organismo transgnico
(1972).
Y 5 aos ms para la obtencin de la primera protena
humana expresada en bacteria. (somatostatina 1977)
Introduccin a los Bioprocesos
Que es un bioproceso?
Es todo proceso industrial que involucra la manipulacin
Biocatalizador
Enzimas,
clulas
inmovilizadas
Downstream Process
Introduccin a los Bioprocesos
Aspectos bsicos de un proceso Biotecnolgico
Upstream Processing Process Downstream Processing
Antibiticos
Enzimas
Sistemas de expresin heterloga
Son utilizados para la produccin de protenas
recombinantes
Ventajas
Sistemas preparados para una finalidad determinada
Amplia variedad de hospedadores
Gran variedad de herramientas moleculares disponibles
(vectores, marcadores de seleccin, etc.)
Desventajas
No siempre el producto final posee las mismas
caractersticas que el deseado.
Es por eso que debemos poner nfasis en elegir el mejor
sistema de expresin para nuestro fin
Sistemas de expresin heterloga
Ventajas
Unicelular eucariota, fcil crecimiento y manipulacin
Capacidad para realizar modificaciones postraduccionales
(glicosilacin, acetilacin, fosforilacin, eliminacin del Met-
1, procesamiento proteoltico de precursores)
Fcilmente escalable
Bajo o nulo nivel de endotoxinas
Protenas extracelulares e intracelulares
Desventajas
Baja eficiencia de transformacin
Hiperglicosilacin (S. cerevisiae principalmente)
Crecimiento microbiano
En un medio de cultivo apropiado los microorganismos se dividen
hasta que algn nutriente del medio de cultivo se agota (sustrato
limitante)
Tambin puede detenerse el crecimiento por acumulacin de
alguna substancia inhibidora formada por los mismos
microorganismos.
Hay dos aspectos claramente diferenciables que nos permiten
interpretar al crecimiento microbiano ya sea en un erlenmeyer como
en un reactor:
Estequiomtrico:
Nos permite conocer la concentracin final de microorganismos a
obtener a partir de datos de la composicin del medio de cultivo,
saber si hay formacin de algn producto, etc.
Cintico:
Nos dice con qu velocidad se lleva a cabo el proceso.
Crecimiento microbiano (Estequiometra)
Rendimientos
Dada la ecuacin de crecimiento microbiano
Para poder conocer la Estequiometra del proceso es necesario conocer los coeficientes
(S, N, B, X, P, W y C) para ello introduciremos el concepto de:
Rendimiento: Se define como la cantidad en gramos de producto formado (biomasa,
EtOH, CO2,H2O etc) o reactivos consumidos (FN, Oxigeno), sobre gramos de fuente de
carbono y energa consumida FCE (glucosa, glicerol, etc)
Supuestos de Monod
El proceso difusin del sustrato limitante
es rpido comparado con la cintica de
crecimiento
El sustrato es metabolizado por una
nica E que controla la velocidad de todo
el metabolismo
El proceso sigue la cintica de
Michaelis-Menten
Crecimiento microbiano (Cintica)
De que factores depende el ?
La composicin del medio de
cultivo (FCE, FN) afectan al
El sustrato limitante
S >> Ks = m
S<< Ks = f (S)
Crecimiento microbiano (Cintica)
De que factores depende el ?
pH
10 g/l FCE
Crecimiento microbiano (Cintica)
Mantenimiento celular
Vimos que el rendimiento celular puede expresarse como
Fick
JO2 = -DO2 . (dC/dL)
Henry
C* = PO2 / H
Transferencia de Oxigeno.
Factores que afectan al Kla.
Agitacin: si aumenta la agitacin aumenta el Kla por que:
Disminuye el espesor de la pelcula (pendiente mas pronunciada)
Tipo Celular
max Kla apropiado
Velocidad de Velocidad de
salida consumo
Velocidad de Velocidad de Velocidad de
acumulacin ingreso formacin
Acumulacin de volumen
Como V= cte
Descripcin matemtica del Batch en fase
exponencial
En estas condiciones el
proceso ser mayor Por
microorganismo continua creciendo qu?
pero quien manda a que velocidad
debe hacerlo es el sustrato limitante
en este caso el Oxigeno
Caractersticas de un cultivo batch
La duracin del cultivo batch depende
esencialmente de las condiciones iniciales del
cultivo.
Una vez inoculado el medio, la concentracin de
biomasa aumenta a expensas de los nutrientes
disponibles.
Cuando el sustrato que limita el crecimiento se
agota, finaliza el batch.
El crecimiento puede cesar tambin por la
acumulacin de algn producto toxico. (esto se puede
solucionar con un cultivo continuo)
Cultivo continuo
Batch Cult. continuo
Se inicia
con un
batch
Ecuacin de diseo de un cultivo continuo
Cult. continuo
Despejando V Donde D = F / V y es la
velocidad de dilucin.
En el estado estacionario
Balances de materia en continuo
Biomasa
Situacin real
cuando tengo
mantenimiento
Velocidad Dc
ptima de Dilucin critica
operacin 80% cuando el D es
del max igual al max
Cultivo continuo
Aplicaciones del cultivo continuo
Permite obtener los parmetros de crecimiento max, ms,
Ks, Yx/s, entre otros.
Permite realizar estudios fisiolgicos.
Podemos discriminar los efectos de la velocidad de
crecimiento , de la composicin del medio de cultivo y del pH
y la Temperatura, sobre la fisiologa celular del
microorganismo.
Permite realizar estudios de ingeniera metablica.
Inconvenientes del cultivo continuo
Inestabilidad gentica de la cepa en cultivos extendidos
(perdida de plsmidos)
Riesgos de contaminacin en cultivos extendidos.
Cultivo Batch Alimentado
En este tipo de cultivos el volumen
varia con el tiempo debido a la
alimentacin esto permite mantener
controlada la concentracin Ci
dentro del reactor.
unicelulares.
Productos
Productos de bajo peso molecular: alcoholes,
c. orgnicos, aa, nucletidos, antibiticos, etc.
Tipo I: Productos finales del catabolismo anaerbico
Bajo
(la formacin de Batch alimentado
III Aerobio producto consume
Bajo
Cultivo continuo
energa)
Alto
(siempre y cuando a m
altos no forme
Biomasa Aerobio Bajo
productos).
Batch alimentado
Ej. efecto crabtree en
S. cereviciae
Productos de alto peso molecular
En este grupo tenemos: polisacridos, protenas,
antgenos, enzimas, etc.
Es importante entender la cintica de formacin le estos
productos, para ello definimos:
La concentracin intrnseca de nuestro producto i (enzima,
antgeno, etc) se define como: (Ri = Xi/X)
Donde Xi es la cantidad de producto que obtenemos g.protenas, UE, etc y X son los g.biomasa.
Por otra parte la velocidad neta de formacin de nuestro producto ser igual
a lo que se forma menos lo que se degrada.
D (h-1) Ri (UE/mg.biomasa)
0,1 8,25
0,25 18,3
Downstream Processing
1. SEPARACI
SEPARACIN CELULAR Intracelular
remoci
remocin del
componente mms 2. DISRUPCI
DISRUPCIN CELULAR
abundante
3. REMOCI
REMOCIN DE RESTOS CELULARES
Es muy importante la elecci
eleccin del Y DESECHOS
PASO INICIAL, ya que es el que debe
eliminar la mayor
mayora de los Extracelular
contaminantes. Los pasos 4. CONCENTRACI
CONCENTRACIN
subsiguientes son empleados para
eliminar los contaminantes de menor
importancia 5. PURIFICACI
PURIFICACIN DE ALTA RESOLUCI
RESOLUCIN
6 ACABADO
Downstream Processing
1. Remocin celular: centrifugacin y filtracin.
2. Disrupcin celular y separacin de restos celulares:
Homogenizadores: La tcnica ms recomendada para alta escala son los
homogeinizadores (Gaulin homogenizer).
Operan a densidades celular del 15 a 20 % del peso seco.
La concentracin celular no afecta la eficiencia
Es necesario refrigerar (4-5C)
Los modelos ms grandes operan a 6,000 L/h (levaduras y bacterias)
Molinos de perlas
Las clulas se rompen mediante la abracin generada por pequeas perlas de vidrio
(0.3-0.4mm )
concentracin de clulas afecta la eficiencia, la concentracin ptima 30-60% peso
hmedo
Los modelos mas grandes operan a 2000 L/h
Ruptura qumica o enzimtica
Limitado a baja escala (Lysozyme, Triton, otras)
Downstream Processing
3. Separacin de restos celulares
centrifugacin (no adecuada)
Ultrafiltracin (300,000 500,000 o mayor)
Microfiltracin (0.1 m.)
Particin en dos fases acuosas
CDR (cell Debris Remover: Whatman)
4. Concentracin
Los productos deben concentrarse hasta 10-50 veces.
Tcnica preferida : Ultrafiltracin
particin lquido-lquido. Extraccin con solventes
Precipitacin (sulfato de NH4)
Evaporacin o destilacin
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