Qumica Biolgica para Farmacia y Medio Ambiente

Curso 2008

TRABAJO PRCTICO: CUANTIFICACIN DE PROTENAS

La determinacin de protenas que se realizar en el TP se har por dos mtodos: el

de Lowry.

Mtodo de Bradford: (Bradford, M. Anal. Biochem., 72:248, 1976), el mismo est

basado en el cambio de color del colorante Coomassie brilliant blue G-250 en
respuesta a diferentes concentraciones de protenas. Este compuesto interacciona con
aminocidos bsicos (especialmente arginina) y aromticos. Esta unin del colorante
con las protenas provoca un cambio en el mximo de absorcin del colorante desde
465 a 595 nm. Por lo tanto, este mtodo se basa en la propiedad del Azul Brillante de
Coomasie G-250 de presentarse en dos formas con colores diferentes, rojo y azul. La
forma roja se convierte en azul cuando el colorante se une a la protena.
Experimentalmente se mide la diferencia de Absorbancias entre 595 y 465 nm (595-
465nm).

Estructura qumica del colorante Coomassie brilliant blue G-250.

Algunas ventajas y/o desventajas del Mtodo

La intensidad de absorcin depende del contenido de aminocidos bsicos y

aromticos.
El complejo colorante-protena tiene un alto coeficiente de extincin lo cual es
imprescindible para aumentar la sensibilidad en la medicin de protenas.
La unin colorante-protena es un proceso muy rpido (2min) y el complejo
permanece estable durante un tiempo relativamente largo, una hora. Haciendo
de este un proceso muy rpido, y que no requiere un tiempo crtico para el
ensayo.
Se pueden utilizar un gran nmero de muestras (muy reproducible) y es
adaptable a la automatizacin.
Las interferencias o no existen o son mnimas por cationes tanto sodio como
potasio y carbohidratos como la sacarosa. Otras sustancias que interfieren en
el ensayo son los agentes fuertemente alcalinos (fcilmente solucionable con la

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 utilizacin de buffers). Los nicos componentes encontrados que dan una
excesiva interferencia en el color del ensayo, son altas concentraciones de
detergentes como el SDS, Triton X-100, etc.

Mtodo de Lowry: (1951) es un mtodo colorimtrico de valoracin cuantitativa de las

protenas.
Bajo condiciones alcalinas el Cu++ forma un complejo con los enlaces peptdicos de las
protenas y se reduce a Cu+. El Cu+ as como los grupos R de Tirosina, Triptofano y
Cisteina reaccionan con el reactivo de Folin. Este reactivo reacciona primero
produciendo un producto inestable que se reduce lentamente a azul de
molibdeno/tungsteno esta reaccin ocurre en medio cido.
Comentarios: aquellos agentes que acidifican las soluciones (por ejemplo: cidos
fuertes o buffers), los quelantes de Cu (por ej. EDTA) o los reductores de Cu (por ej.:
mercaptoetanol, ditiotreitol, fenoles) sern interferentes de la reaccin. Las protenas
producirn distintas intensidades de color dependiendo primariamente de su contenido
de Tyr y Trp.

DESARROLLO EXPERIMENTAL
En el trabajo prctico usted realizar una curva de calibracin con alguno de los
mtodos anteriores y con el mismo determinar la concentracin proteica de una
muestra problema.

A- MTODO DE LOWRY
Preparacin de reactivos
Reactivo A = Na2CO3 2% P/V en NaOH 0,1N.
Reactivo B = CuSO4 0.5% P/V en tartrato de sodio y potasio 1% P/V.
Reactivo C = 50 ml de A + 1 ml de B.
Reactivo D = Folin diluido al medio con H2O bidestilada (HCl 0,2N)
Solucin stock de seroalbumina bovina (BSA)
Se prepara un patrn stock de BSA pesando la misma y se lleva a volumen con agua,
hasta obtener una concentracin final de 1,0 mg/ml.

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Curva de calibracin: Completar la siguiente tabla antes de comenzar con el trabajo
experimental para la curva de calibracin:

Tubos Cantidad de l de sol. Stock de BSA l de l de l de

protena (g) H2O solucin C solucin D
1, 2 0 500 50
3, 4 25 500 50
5, 6 30 500 50
7, 8 45 500 50
9,10 50 500 50

Procedimiento experimental
1) A 100 l de muestra agregar 0,5 ml de solucin C.
2) Mezclar bien e incubar 10 minutos a temperatura ambiente.
3) Agregar 50 l de solucin D. Homogeneizar inmediata y vigorosamente en
vortex.
4) Incubar 30 minutos a Temperatura ambiente, cargar 250 l de cada tubo en
microplaca y leer Absorbacia a 700 nm.

Utilizar el mismo procedimiento para la determinacin de protenas en la

muestra problema.

B-MTODO DE BRADFORD
Preparacin del colorante
Azul Brillante de Coomasie G-250 (100mg) es disuelto en 50 ml de etanol 95%. A esta
disolucin se le aade 100ml de cido fosfrico 85% p/v. La solucin resultante se
diluye llevndola hasta un litro de volumen final. La concentracin en la disolucin final
es 0,01% p/v de azul, 4,7% p/v de etanol y 8,5 % p/v de cido fosfrico.
Solucin stock de BSA
Se utilizar la misma que en el Mtodo de Lowry.

Curva de calibracin
El rango lineal para este mtodo en microplaca es 0.05 mg/ml a 0.5 mg/ml
A-Calcule el volumen a utilizar del Solucin stock BSA para obtener el siguiente rango
de concentraciones: 0.2 mg/ml, 0.3 mg/ml, 0.5 mg/ml. Complete la siguiente tabla de
referencia con lo calculado.

Tubos 1, 2 3, 4 5, 6 7, 8
Concentracin 0,0 0,2 0,3 0,5
Final (mg/ml)
Volumen de stock
sol. BSA
Volumen de H2O
Volumen final (l) 10 10 10 10

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B) Procedimiento experimental
a) Agregar 200 l del reactivo Bradford diluido 1/5 a cada pocillo.
b) Colocar 10 l de cada patrn (o de muestra) en cada pocillo de una placa de 96
pocillos. (Realizar duplicados para cada muestra).
Mezclar cuidadosamente con la micropipeta evitando la formacin de burbujas.
c) Incubar a temperatura ambiente por lo menos 5 minutos (no ms de una hora, la
absorbancia aumentar con el tiempo).
d) Medir la absorbancia a 595-465 nm en un lector de microplacas.

Utilizar el mismo procedimiento para la determinacin de protenas en la

muestra problema.

C-SEMINARIO
1-Graficar la curva de calibracin de BSA, Absorbancia (595-465 nm o 700 nm segn
corresponda) vs Concentracin de BSA para cada mtodo.
2-Utilizando la recta obtenida, calcular la concentracin para cada muestra testeada.
3-Graficar adems para cada mtodo: una curva de Absorbancia a 595-465 nm vs mg
de BSA.
4-Comparar los resultados obtenidos con cada Mtodo.

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 Uso de las pipetas automticas

Las pipetas automticas son instrumentos delicados y

costosos, que deben cuidarse dado que de ellos depende
gran parte de nuestro trabajo. Dichas pipetas son muy
precisas si se las utiliza correctamente. Existen varios tipos
de pipetas y cada marca provee un juego para diferentes
rangos de volmenes. Cada pipeta est rotulada en el
mbolo y posee un color distintivo, para su funcionamiento
la mayora tiene caractersticas anlogas. A continuacin se ejemplifican dos tipos de
pipetas.

Ante la menor duda, consulte antes de usar. Es preferible preguntar lo mismo

veinte veces antes que romper una pipeta.

Juego de pipetas tipo A

Una pipeta rotulada P-20 mide entre 2 l y 20 l.
Una pipeta rotulada P-200 mide entre 20 l y 200 l.
Una pipeta rotulada P-1000 mide entre 200 l y 1.000 l 0,2 y
1,0 ml.
Juego de pipetas tipo B
Una pipeta de botn rojo mide con precisin entre 1 l y 5 l.
Una pipeta de botn verde mide con precisin entre 5 l y 50 l.
Una pipeta de botn marrn mide con precisin entre 50 l y 250 l.
Una pipeta de botn azul mide con precisin entre 200 l y 1.000 l
0,2 y 1,0 ml.

Para poder tomar lquido con estas pipetas, deben tener en su

extremos las puntas plsticas descartables (tips), amarillas para P-
20 y P-200, y azules para P-1000.

Antes de utilizar la pipeta asegrese conocer cmo fijar el volmen. La P-20 mide
hasta la dcima de microlitro. En la P-20 los dos nmeros superiores indican el
volumen en microlitros, en tanto que el nmero inferior es la cantidad fraccional La P-
200 y P-1000 miden hasta el microlitro por lo tanto, el nmero superior de la P-200
nunca debe superar el 2.

Por ejemplo:

En una p20 equivalen En una p200 En una p1000

a 3,8ul equivalen a 38ul equivalen a 380ul

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Recuerde que las micropipetas tienen dos topes, antes de tomar un volumen
solamente debe bajar hasta el primero, y cuando baje el volumen hgalo hasta el
primer tope, en caso de que aun quede solucin en el tips puede bajar hasta el
segundo tope.

NUNCA

1- Nunca forzar la pipeta por encima del volumen indicado por su nombre. No mide
ms de lo establecido y descalibrar o romper la pipeta.
2- Nunca utilice la pipeta para medir un volumen menor a la dcima parte de su
nombre. No es precisa.
3- Nunca utilice una pipeta sin su punta (tips) amarilla o azul.
4- Nunca utilice la pipeta con soluciones cidas concentradas. Los vapores pueden
oxidar las partes metlicas interiores de la pipeta.