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Marulanda et al.

Actual Biol 27 (82): 5-15, 2005

MICROPROPAGACIN DE GUADUA ANGUSTIFOLIA KUNTH

MICROPROPAGATION OF GUADUA ANGUSTIFOLIA KUNTH

Marta L. Marulanda1, 2, Luis G. Gutirrez1, Mara del Pilar Mrquez1

Resumen

Se obtuvieron plantas a partir de chusquines de Guadua angustifolia mediante regeneracin in vitro de yemas axilares.
En la fase de desinfeccin, se evaluaron el bicloruro de mercurio (HgCl2) y el hipoclorito de sodio (NaClO) con distintos
tiempos de aplicacin. El medio de cultivo en el que se presentaron mejores respuestas estaba compuesto por las sales
y vitaminas MS suplementado con 2,5 mg/l de 6 BAP, 10 mg/l de myoinositol, 30 g/l de sacarosa y gelicado con 2,5 g/l
gelrite. A la cuarta semana de cultivo se evalu el nmero de yemas contaminadas por hongos y bacterias, as como el
nmero nal de yemas establecidas y la inuencia de la edad siolgica de las yemas. En la micropropagacin de G.
angustifolia, se lograron adems resultados en embriognesis somtica. Se obtuvieron callos proembriognicos a partir
de yemas axilares en un medio suplementado con 6 mg/l de 2-4D. Los callos obtenidos fueron transferidos a medios sin
auxinas donde se observ la aparicin de estructuras embriognicas. Los resultados obtenidos sugieren la presencia de un
proceso de regeneracin va embriognesis somtica en G. angustifolia, el cual no ha sido descrito hasta el momento.

Palabras clave: bambusas, cultivo de tejidos in vitro, embriognesis somtica, organognesis, Poaceae.

Abstract

Plants were obtained from chusquines of Guadua angustifolia through in vitro regeneration of axilary buds. The evaluated
desinfection methods were: mercury dichloride (HgCl2) and sodium hipoclorite (NaClO). The best culture medium was
composed by MS salts and vitamins supplemented with 6 Benzylaminopurine 2,5-5,0 mg/l , myo-Inositol 10 mg/l, sucrose
30 g /l and 2,5 g/l Gelrite. Buds were tested during four weeks for contamination; the nal number of established buds and
the inuence of the physiological age were evaluated. Somatic embryogenesis was also achieved. Proembryogenic calli
from axilary buds was induced with 2,4-D. Calli were transferred to media without auxin where embryogenic structures
were observed. The results suggest the presence of a regeneration process through somatic embryogenesis on Guadua
angustifolia, which has not been described before.

Key words: bamboo, in vitro tissue culture, organogenesis, Poaceae, somatic embryo genesis.

INTRODUCCIN

La especie Guadua angustifolia Kunth conocida donde desempea un papel importante en la vida
comnmente como guadua, es el bamb tropical diaria de sus habitantes, quienes le dan usos diferentes
econmicamente ms importante. Esta especie se como lea, construccin, fabricacin de artesanas
extiende en Amrica del Sur hacia el norte, hasta los y muebles, proteccin de suelos y fuentes de agua
Andes venezolanos y hacia el sur hasta la frontera (Cruz, 1994). Puede alcanzar hasta 30 m de altura
entre Ecuador y Per (Judziewicz et al., 1999). y 15-20 cm de dimetro. Su crecimiento ptimo se
estima en altitudes entre 0-1.800 m, temperatura
Esta especie es especialmente abundante a bajas entre 17-24 C y precipitaciones anuales entre
altitudes en los Andes colombianos y ecuatorianos, 2.000-4.000 mm (Castao y Moreno, 2004).

Recibido: junio de 2004; aceptado para publicacin: mayo de 2005.


1 Grupo de Investigacin en Biodiversidad y Biotecnologa, Facultad de Ciencias Ambientales. Universidad Tecnolgica de Pereira. Pereira

(Risaralda), Colombia.
2 Universidad Tecnolgica de Pereira. La Julita, Pereira (Risaralda), Colombia. Correo electrnico: <ubioteve@utp.edu.co>.

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En los ltimos aos el uso del bamb para la cons- del desarrollo de la biotecnologa en bambes con el
truccin se ha incrementado, debido a su bajo costo n de aprovechar el potencial que este tipo de plantas
y a las ventajas que este material ofrece. De todos los posee para la construccin, desarrollo de artesanas,
bambes americanos G. angustifolia es el ms usado proteccin de suelos, etc.
debido a la superioridad mecnica que posee, al bajo
peso, la facilidad para su manejo y procesamiento y La mayora de reportes conocidos sobre la micropropaga-
los bajos costos (Londoo, 1990). cin de bambes se reeren a especies asiticas (Chang
y Hung-Lan, 1995; Prutpongse y Gavinlertvana, 1992;
En Colombia, los guaduales se concentran en la Saxena, 1990; Saxena y Dhawan, 1999) en ellos se han
regin central de los Andes, generalmente entre los desarrollado diferentes mtodos para la propagacin
1.000-1.500 m de altitud. En esta regin los bosques a gran escala con nes principalmente comerciales.
nativos han sido fuertemente deforestados lo que ha Respecto a la multiplicacin in vitro de las especies
conllevado una fuerte presin sobre los guaduales y americanas se conocen pocos reportes (Jimnez et al.,
la destruccin general de sus hbitats y provocado 2004; Manzur, 1988; Woods et al., 1992).
la disminucin evidente de su extensin, afectando
drsticamente sus ecosistemas y la diversidad ge- En este trabajo se investigaron mtodos de propa-
ntica de la especie. A pesar de esto, los guaduales gacin in vitro en G. angustifolia (brotacin axilar
(nativos y plantados) sirven como refugios para y embriognesis somtica), con el n de obtener, a
muchos animales (micos, ardillas, armadillos, aves partir de material seleccionado, produccin a gran
e insectos) y gran diversidad de ora se encuentra escala de plntulas para la reforestacin y el estable-
asociada con ellos (Cruz, 1994). cimiento de plantaciones comerciales.

La reproduccin sexual de la guadua, si bien garantiza MATERIALES Y MTODOS


el mantenimiento de su diversidad gentica, presenta
Micropropagacin a partir de yemas axilares
grandes dicultades, debido a que la especie orece
anualmente despus de un perodo seco, y la obten- Material vegetal de partida. Para la induccin de
cin de la semilla es difcil, ya que alto porcentaje de yemas in vitro, se establecieron en el vivero de la
los orets son parasitados durante estados inmaduros, Universidad Tecnolgica de Pereira chusquines de
dicultando conservar las semillas a largo plazo. Y G. angustifolia obtenidos a su vez del vivero de la
aunque los porcentajes de germinacin de las semi- Corporacin Autnoma Regional de Risaralda (CAR-
llas son altos (95-100%), es muy difcil la obtencin DER) ubicado en la Virginia (Risaralda), Colombia,
de suciente cantidad de forma regular (Gmez y los cuales se sometieron a podas de rejuvenecimiento
Agudelo, 2003). para estimular la produccin de brotes y nuevas
ramas. En esta fase se realizaron aplicaciones sema-
En la propagacin de algunas plantas tropicales no nales con fungicidas (Benlate y Vitavax (1 mg/l)
mejoradas genticamente y de plantaciones espon- y fertilizante foliar de la marca Microfertiza una
tneas como la guadua, se ha utilizado material de vez por semana.
diferente origen y procedencia, lo cual no garantiza
el establecimiento de plantaciones uniformes con las Desinfeccin. De los chusquines establecidos en el
caractersticas deseadas. Debido a esto, se hace impor- vivero se seleccionaron ramas jvenes con yemas
tante establecer mtodos de multiplicacin vegetativa bien denidas, las cuales fueron cortadas y llevadas
que garanticen la obtencin de grandes cantidades de al laboratorio en donde se realiz un lavado con
material con caractersticas idneas, para el estable- abundante agua y detergente comercial Pursue
cimiento de plantaciones (Manzur, 1988). aplicado con algodn (20 a 30 min). Las yemas
(segmentos nodales de 5 a 8 mm con una yema)
Actualmente, en el mundo, la micropropagacin fueron individualizadas y lavadas con abundante
es la principal tcnica aplicada a varias especies de agua. Posteriormente se realiz una predesinfeccin
bamb. Gielis et al. (1995) expresan la importancia con etanol al 70% durante tres minutos. Las yemas

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fueron lavadas con agua destilada estril dentro de en cmaras de cultivo con iluminacin articial
la cabina de ujo laminar. (2.000 lux, 12 horas luz). Los subcultivos se realiza-
ron cada cuatro semanas individualizando los nuevos
Se evaluaron dos tipos de desinfectantes: bicloruro brotes producidos. Para inducir el enraizamiento de
de mercurio (HgCl2) e hipoclorito de sodio (NaClO) los brotes, stos fueron transferidos a un medio con
con distintos tiempos de aplicacin, resultando los 1 mg/l de AIA.
siguientes tratamientos: Tratamiento 1. HgCl2 0,3%
durante 5 min; Tratamiento 2. HgCl2 0,3% durante Aclimatacin en vivero. Las plntulas obtenidas
10 min; Tratamiento 3. NaClO 2% durante 10 min; fueron transferidas a vivero para evaluar su capaci-
Tratamiento 4. NaClO 2% durante 15 min; Tra- dad de aclimatacin a condiciones ambientales, estas
tamiento 5. NaClO 2% durante 20 min. fueron plantadas en bandejas plsticas utilizando
como sustrato una mezcla de suelo y arena (3:1).
Para cada tratamiento se emplearon entre 130 y 180 ex- Durante los primeros ocho das fueron mantenidas
plantes. Registrndose el nmero de yemas conta- en cmara hmeda, transcurrido este tiempo se retir
minadas por hongos y bacterias, as como el nmero la cubierta y se evalu su supervivencia. Las plantas
nal de yemas establecidas (sin contaminacin) a la permanecieron durante seis semanas en el vivero y
cuarta semana de cultivo. luego fueron trasplantadas a bolsas. En esta etapa se
les hicieron aplicaciones semanales con el fertilizante
Establecimiento. Basados en la mayora de los foliar Microfertiza.
reportes previos en micropropagacin de bambusas
(Manzur, 1988; Muoz et al., 1998; Rao y Rao, 1988; Micropropagacin va embriognesis somtica
Saxena, 1990; Woods et al., 1992), el medio de cul-
tivo para el establecimiento estaba compuesto por Material de partida y desinfeccin de explantes.
las sales y vitaminas de Murashige y Skoog (1962) Para la fase de establecimiento se parti del mismo
suplementado con 100 mg/l de myoinositol, 30 g/l de material (yemas provenientes de chusquines) que
sacarosa y gelicado con gelrite a razn de 2,5 g/l. el empleado en los ensayos para micropropagacin
por brotacin axilar. El protocolo de desinfeccin
Edad siolgica de las yemas. Se seleccionaron consisti en un lavado de los explantes con el deter-
yemas de los tercios basal, medio y apical de ramas gente comercial Pursue aplicado durante 20 min,
jvenes de los chusquines mantenidos en vivero. Se posteriormente las ramas se sumergieron en etanol
utilizaron 200-400 yemas para los ensayos de cada al 70% durante un minuto, seguido de tres enjuagues
tercio, evalundose el porcentaje de establecimiento
con agua destilada estril y un tratamiento de 10 min
y brotacin para cada tipo de explante.
en HgCl2 al 0,3% adicionado con 2 gotas de Tween 20,
luego de lo cual se lavaron los explantes con agua
Concentracin de 6-BAP. Se probaron diferentes
destilada estril.
concentraciones de 6-BAP en el medio: 1-2,5 y
5,0 mg/l. En total fueron sembradas 200-250 yemas
por cada tratamiento, y fueron incubadas durante Formacin y multiplicacin de callos e induccin
una semana en condiciones de oscuridad a 28 C y de la respuesta embriognica. Para la induccin de
posteriormente se transrieron a cmaras de cultivo la callognesis, se utiliz el mismo medio de cultivo
con iluminacin articial (2.000 lux, 12 horas luz). Se MS base utilizado para los ensayos de micropropaga-
evalu el nmero de yemas con brotes para cada uno cin por organognesis, pero a la mitad de la concen-
de los tratamientos a la cuarta semana de cultivo. tracin de sales. Y se emple como nico regulador de
crecimiento el 2,4-D en diferentes concentraciones:
Multiplicacin y enraizamiento. Los brotes obte- 6, 8 y 10 mg/l. Para cada tratamiento se emplearon
nidos en la fase de establecimiento fueron multipli- entre 30-60 explantes (yemas axilares). Todos los
cados en un medio MS (similar al ya mencionado) ensayos incluyeron ocho semanas de observacin con
suplementado con 2,5 mg/l de 6-BAP, e incubados incubacin a 28 C en condiciones de oscuridad.

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Una vez obtenidos los primeros callos, stos fueron estadstico se construye a partir de las diferencias
divididos y subcultivados en segmentos pequeos entre las frecuencias observadas y las esperadas bajo
(0,5 cm de dimetro aproximadamente), en medios la hiptesis de independencia. Cuando se encontr
con 6, 8 y 10 mg/l de 2,4-D e incubados en oscuridad dependencia entre las variables se acudi al clculo
a 28 C. Para cada tratamiento se inocularon entre 30 del coeciente de contingencia como una medida del
y 50 callos. Se evalu el crecimiento de los callos, la grado de asociacin entre las variables evaluadas.
oxidacin y el necrosamiento. Para el procesamiento de los datos se emple el pa-
quete estadstico SPSS versin 8.0 para Windows.
Los callos multiplicados en medios con 6, 8 y 10 mg/l de
2,4-D se emplearon tambin para evaluar la respuesta RESULTADOS Y DISCUSIN
embriognica (aparicin de ndulos y proembriones
en los callos). Micropropagacin a partir de yemas axilares

Desinfeccin. El estadstico Chi-cuadrado de Pear-


Diferenciacin de embriones. A partir de la apa- son evidencia que para un nivel de signicancia
ricin de ndulos y de proembriones en los callos de 1%, el tratamiento HgCl2 (0,3%, 10 min) es el
cultivados en 6 y 8 mg/l de 2,4-D, se decidi transferir de mejor respuesta para la desinfeccin de yemas
los callos proliferados en estos mismos medios, a (74,6%), de esta manera, las respuestas evaluadas
medios sin hormonas, y con bajas concentraciones dependen del tratamiento aplicado con un nivel alto
0,5 mg/l de cido indolactico (AIA) y cido giber- de asociacin dado por el coeciente de contingencia
lico (GA3) con el n de promover la diferenciacin (tabla 1). Este resultado, en combinacin con el ma-
de los embriones, en condiciones de luz y oscuridad. nejo de las plantas donadoras en fase 0 (aplicacin
Para cada tratamiento se emplearon entre 30 y 60 callos de bactericidas y funguicidas especcos, tabla 1),
(0,5 cm de dimetro aproximadamente). Se evalu permitieron disponer de un protocolo efectivo para
el crecimiento de los callos, la nodulacin, la pre- la desinfeccin de yemas obtenidas a partir de chus-
sencia de embriones diferenciados, la oxidacin y quines cultivados en vivero. En otros trabajos con
el necrosamiento. bambusas, se ha logrado tambin la desinfeccin de
explantes con HgCl2, (Saxena, 1990; Ramanayake et
Anlisis estadstico. Como mtodo de anlisis es- al., 2001). Sin embargo, en vista de la alta toxicidad
tadstico, para todos los ensayos (brotacin axilar y del HgCl2, Jimnez et al. (2004) en su trabajo sobre
embriognesis somtica), se emple la prueba Chi- micropropagacin de G. angustifolia en Costa Rica,
cuadrado de Pearson, sobre las tablas de contingencia propusieron el uso de NaOCl (10% durante 10 min)
elaboradas como respuesta en cada experimento. Este en combinacin con el producto comercial PPM

Tabla 1. Resultados de la de desinfeccin de yemas de Guadua angustifolia con HgCl2 y NaClO y distintos tiempos de aplicacin

Yemas Yemas
Nmero de Tiempo de aplicacin Yemas
Tratamiento contaminadas por contaminadas por
explantes de partida (minutos) establecidas (%)
bacterias (%) hongos (%)
1. HgCl2 0,3% 140 5 27,8 19,3 52,8
2. HgCl2 0,3% 138 10 18,8 6,5 74,6
3. NaClO 2% 175 10 32,6 52,0 15,4
4. NaClO 2% 147 15 33,3 53,7 12,9
5. NaClO 2% 127 20 41,7 47,2 11,0

Diferencias altamente signicativas entre tratamiento vs. yemas establecidas. Test de Chi-cuadrado de Pearson (p < 0,01) y
Coeciente de contingencia (p < 0,01).

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(Plant Preservative Mixture) en el medio de cultivo crecimiento y la regeneracin (Jimnez, 1998). En ge-
(2 ml) como una alternativa ecaz para la desconta- neral, estos resultados concuerdan con los reportados
minacin de explantes nodales. por Jimnez et al. (2004) quienes micropropagaron
G. angustifolia costarricense y utilizaron para el
Establecimiento: edad siolgica de las yemas. El establecimiento segmentos nodales procedentes de
estadstico Chi-cuadrado de Pearson evidencia que ramas laterales de plantas adultas.
para un nivel de signicancia de 1% existe asociacin
entre la posicin de la yema en la rama con respecto Concentracin de 6-BAP. El estadstico Chi-cua-
al establecimiento in vitro, particularmente el tercio drado de Pearson evidencia que para un nivel de
apical mostr la respuesta ms positiva (73,6%) con signicancia de 5% la brotacin es independiente
nivel medio de asociacin dado por el coeciente de del tratamiento aplicado (tabla 3). Al evaluar las
contingencia (tabla 2). La eciencia en la desinfec- tres concentraciones de 6-BAP (1-2,5 y 5,0 mg/l), si
cin y la regeneracin de los explantes estn asocia- bien no existen diferencias signicativas, la mejor
dos a la edad siolgica y la posicin en la planta de respuesta se obtuvo con la concentracin 2,5 mg/l
los explantes. Segn George y Sherrintong (1984), alcanzndose un 47,6% de yemas brotadas (tabla 3).
el estado de desarrollo de la planta madre y la edad En estos materiales se observ que a partir de los ocho
siolgica del explante son de gran inuencia en el das de cultivo comenzaron a emerger los brotes
xito del cultivo in vitro. (gura 1A) y dos semanas despus aparecieron las
primeras hojas completamente desarrolladas. Nues-
Sin embargo, aunque no existen diferencias signi- tros resultados concuerdan ampliamente con Jimnez
cativas, estas yemas ms jvenes mostraron menores et al. (2004), quienes reportan una concentracin
valores de brotacin (1,8%) que las del tercio medio y de 3 mg/l de BAP para la brotacin de yemas de G.
basal (tabla 2), ya que mientras menor sea el tamao angustifolia en Costa Rica.
y por ende su estado de diferenciacin, menor ser el
riesgo de contaminacin y ms difcil la regeneracin, Los resultados de estos experimentos demuestran la
en tanto que con el aumento del tamao y la madurez, necesidad de la adicin de citoquininas al medio de
es mayor el peligro de contaminacin y ms rpido el cultivo para estimular la brotacin de las yemas axi-

Tabla 2. Evaluacin de la respuesta de la yemas de Guadua angustifolia provenientes de chusquines teniendo en cuenta su posicin
en la rama

Posicin de la yema Nmero de explantes de partida Yemas establecidas (%) Yemas brotadas (%)
Tercio basal 423 31,9 2,8
Tercio medio 353 43,3 4,0
Tercio apical 224 73,6 1,8

Diferencias altamente signicativas entre posicin de la yema vs. yemas establecidas. Test de Chi-cuadrado de Pearson (p < 0,01) y
Coeciente de contingencia (p < 0,01).

Tabla 3. Efecto de la concentracin de 6-BAP sobre brotacin de yemas de G. angustifolia

Concentracin de 6-BAP mg/l Nmero de yemas Brotacin (%)

1,0 255 39,6

2,5 210 47,6

5,0 243 44,0

No existen diferencias signicativas entre concentracin de 6-BAP vs. brotacin. Test de Chi-cuadrado de Pearson (p > 0,05).

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Figura 1. Micropropagacin de Guadua angustifolia Kunth a partir de yemas axilares provenientes de chusquines. 1A. Establecimiento
y brotacin de yemas (12 mm) en medio MS + 2,5 mg/l de 6-BAP. 1B. Multiplicacin de plntulas (55 mm) en medio MS + 2,5 mg/l de
6-BAP. 1C. Plntulas enraizadas (65 mm) en medio MS + 1,0 mg/l de IAA. 1D. Endurecimiento de vitroplantas en vivero (150 mm).
1E. Traslado de plantas a bolsa

lares obtenidas de chusquines. Usualmente durante la de 2 explantes por explante original. Esta baja tasa de
fase de establecimiento, cuando se emplean yemas o multiplicacin es similar a la encontrada por Jimnez
pices, es necesaria la adicin exgena de citoquini- et al. (2004), quienes reportan para la misma especie
nas al medio de cultivo debido a que en estos rganos una tasa de multiplicacin promedio de 2,5 explantes
la concentracin endgena de este tipo de regulador por explante original. En otras especies de bambusas,
del crecimiento es baja (Jimnez, 1998). la tasa de multiplicacin ha sido muy variable (Gielis
et al., 2002; Rao y Rao, 1988; Saxena, 1990).
En otras Poaceae como Bambusa tulda Roxb (Saxena,
1990), Bambusa arundinacea, Dendrocalamus stric- Las plntulas fueron transferidas a un medio MS
tus y Bambusa vulgaris (Rao y Rao, 1988) se reporta con 1 mg/l de AIA. En estas condiciones el 90%
el uso de citoquininas (6-BAP) a concentraciones de las mismas enraizaron y alcanzaron alturas entre
entre 4-10 mg/l durante la fase de establecimiento. 7 y 10 cm (gura 1C). Igualmente la elongacin y
enraizamiento de las plantas es fcilmente inducible
Multiplicacin y enraizamiento. Los brotes al eliminarse las citoquininas del medio de cultivo
obtenidos fueron multiplicados en medio MS con y adicionar concentraciones bajas de una auxina
2,5 mg/l de 6-BAP, realizndose subcultivos cada suave como el AIA. En general, el enraizamiento en
cuatro semanas. Los brotes multiplicados eran de bambusas introducidas in vitro se ha vericado sin
aspecto vigoroso y con buen desarrollo vegetativo mayores problemas (Gielis et al., 2002; Jimnez et al.,
(2 a 4 hojas) (gura 1B). 2004; Rao y Rao, 1988; Saxena, 1990).

Un total de 345 brotes se obtuvieron a partir de Aclimatacin en vivero. Se transrieron a vivero


170 explantes iniciales. As la tasa de multiplicacin fue 300 plntulas de las cuales el 95% endurecieron

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(gura 1D). Una vez aclimatizadas se pasaron a de 2,4-D, con mejores resultados de proliferacin de
bolsas (gura 1E) y se abonaron semanalmente con callos a una concentracin de 4 mg/l. Sin embargo, Yeh
el fertilizante foliar Microfertiza. Las plantas de y Chang (1987) trabajando con embriones cigticos
guadua fueron llevadas a campo y actualmente se de Sinocalamus latiora lograron callo con aspecto
est realizando una evaluacin de su crecimiento nodular slo despus de 90 das de cultivo utilizando
y desarrollo. Para otras Poaceae se han reportado 6 mg/l de 2,4-D + 3 mg/l de kinetina.
tasas de supervivencia, en la fase de endurecimiento,
superiores al 70% (Gielis et al., 2002; Rao y Rao, Los callos formados con 6 mg/l de 2,4-D se multi-
1988; Saxena, 1990). plicaron en medios de cultivo con concentraciones
de 6, 8 y 10 mg/l de esta auxina. Como puede verse
Micropropagacin va embriognesis somtica en la tabla 4, el estadstico Chi-cuadrado de Pearson
evidencia que para un nivel de signicancia de 5% el
Formacin y multiplicacin de callos. La respuesta crecimiento es independiente del tratamiento aplica-
de las yemas axilares a los tratamientos con 2,4-D do. A pesar de no existir diferencias signicativas, la
fue positiva para la formacin de callo slo en el caso tasa de multiplicacin de los callos fue alrededor de
de la concentracin de 6 mg/l (datos no mostrados). 50%, para las tres concentraciones, luego de cuatro
Luego de aproximadamente 90 das de incubacin en semanas en oscuridad (tabla 4).
oscuridad a 28 C, se observ la aparicin de callo
primario (friable y blanco) que se form en la zona De otra parte, a pesar de que el estadstico Chi-cua-
ms juvenil de la yema axilar (gura 2A). Estos re- drado de Pearson evidencia que para un nivel de
sultados contrastan con lo encontrado por Muoz et al. signicancia de 5% la oxidacin es independiente
(1998) con Dendrocalamus giganteus, en el cual se del tratamiento aplicado, el porcentaje de oxidacin
obtuvo respuesta callognica con yemas axilares (a (70%) para los callos proliferados con 10 mg/l es
los 15 das) utilizando concentraciones entre 2-20 mg/l alto, al igual que el 27% de necrosamiento (el cual

Figura 2. Embriognesis somtica en Guadua angustifolia Kunth. 2A. Formacin de callo a partir de segmento nodal (10 mm) en 6
mg/l de 2,4-D. 2B. Callo nodular (15 mm) en medios 6-8 mg/l de 2,4-D. 2C. Proembriones (0,05 mm) en callos en medios 6-8 mg/l de
2,4-D. 2D, E, F. Embriones en fase coleptilar (10 mm) a partir de callo nodular en medio sin auxinas

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Tabla 4. Respuesta de los callos multiplicados (en oscuridad) con 6, 8 y 10 mg/l de 2,4-D

Concentracin de Nmero de callos Necrosamiento


Crecimiento (%) Nodulacin (%) Oxidacin (%)
2,4-D de partida (%)
6 mg/l 50 48 48 52 0
8 mg/l 44 50 50 43 9
10 mg/l 30 57 0 70 27

No existen diferencias signicativas entre concentracin vs. crecimiento y concentracin vs. oxidacin. Test de Chi-cuadrado de
Pearson (p > 0,05).

es estadsticamente signicativo) (tabla 4). El 2,4-D nodulacin (tabla 4). En especies monocotiledneas
es la auxina ms empleada en la induccin de callo- y especialmente en gramneas, los callos que tienen
gnesis en las diferentes especies de bamb, bien sea alto potencial organognico y embriognico son del
slo (Dekkers et al., 1987; Mascarenhas et al., 1988; tipo compacto y nodular (Muoz et al., 1998; Rao
Rao et al., 1985) o en combinacin con citoquininas et al., 1985; Yeh y Chang, 1986). Adems, en el caso
(Muoz et al., 1998; Saxena y Dhawan, 1995; Yeh y del bamb, los callos de tipo friable, son organognicos
Chang, 1986, 1987). y por tanto son capaces de regenerar races (Dekkers
et al., 1989; Muoz et al., 1998). Este ltimo fenmeno
Induccin de la respuesta embriognica. A partir de tambin apareci en los callos de G. angustifolia,
los resultados anteriormente descritos sobre multipli- pero en muy baja frecuencia (datos no mostrados).
cacin, se observ la aparicin de callos compactos
y nodulares (gura 2B) y de proembriones (tanto en Diferenciacin de embriones. Teniendo en cuenta
callos friables como en callos compactos). El estads- tanto la aparicin de callos nodulares como de pro-
tico Chi-cuadrado de Pearson evidencia que para un embriones (gura 2C) se procedi a subcultivar los
nivel de signicancia de 5% existe asociacin entre callos multiplicados en los medios con 6 y 8 mg/l
el tratamiento aplicado y la nodulacin, siendo los de 2,4-D en medios de cultivo sin auxinas, ya que,
de mejor respuesta los tratamientos de 6 y 8 mg/l de para diferentes sistemas de embriognesis somtica
2,4-D (alrededor del 50%), en tanto que los callos se requiere una auxina sinttica para la induccin
multiplicados en 10 mg/l de 2,4-D no mostraron de la embriognesis, seguida por la transferencia a

Tabla 5. Respuesta de los callos multiplicados en oscuridad con 6 y 8 mg/l de 2,4-D y transferirlos a medios sin hormonas y a medios
con AG3 y AIA

Nmero de callos
Tratamientos Crecimiento (%) Nodulacin (%) Oxidacin (%) Necrosamiento (%)
de partida
2,4-D 6 mg/l
Sin hormonas 65 69 69 43 10
AIA 0,5 mg/l 45 88 88 11 0
GA3 0,5 mg/l 48 100 100 21 0
2,4-D 8 mg/l
Sin hormonas 33 42 42 15 0
AIA 0,5 mg/l 44 88 88 11 0
GA3 0,5 mg/l 48 69 69 31 0

Diferencias altamente signicativas entre tratamiento vs. crecimiento, tratamiento vs. nodulacin y tratamiento vs. oxidacin. Test
de Chi-cuadrado de Pearson (p < 0,01) y Coeciente de Contingencia (p < 0,01).

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Marulanda et al. Actual Biol 27 (82): 5-15, 2005

un medio sin auxinas para la diferenciacin de los (Muoz et al., 1998; Yeh y Chang, 1986, 1987).
embriones (Bhojwani y Razdan, 1996; Evans et al., Concretamente para G. angustifolia la oxidacin
1981; Litz y Jarret, 1991). oscila entre un 10-50%, aunque el necrosamiento es
signicativamente bajo (tabla 5). Esta problemtica
Como se observa en la tabla 5, con respecto a la res- se ha tratado de solucionar con subcultivos ms
puesta de los callos en los medios sin hormonas y en frecuentes (cada 15 das) y la utilizacin de antioxi-
condiciones de oscuridad, el estadstico Chi-cuadrado dantes, de acuerdo con lo reportado por otros autores
de Pearson evidencia que para un nivel de signi- (Muoz et al., 1998; Saxena y Dhawan, 1995; Yeh
cancia de 1% existe asociacin entre el tratamiento y Chang, 1986).
y la respuesta al crecimiento y la nodulacin, con
Tambin se realizaron ensayos de respuesta em-
un nivel alto de asociacin dado por el coeciente
briognica de callos multiplicados en 6 y 8 mg/l
de contingencia, siendo mayores los porcentajes en
de 2,4-D e inoculados en medios sin auxinas pero
los inculos provenientes de 6 mg/l de 2,4-D (69%)
en condiciones de luz (fotoperodo de 12 horas).
frente a los inculos con 8 mg/l de 2,4-D (42%).
Las mejores respuestas en este caso, se obtuvieron
para los callos provenientes del medio con 6 mg/l
Con respecto a la oxidacin, el estadstico Chi- (datos no mostrados). Despus de 30 das de obser-
cuadrado de Pearson evidencia que para un nivel de sig- vacin de estos callos embriognicos, se detect la
nicancia de 1% existe asociacin entre el tratamiento presencia de embriones claramente diferenciados.
y la respuesta a la oxidacin con un nivel medio de Es notable la aparicin de estructuras elongadas de
asociacin dado por el coeciente de contingencia, aproximadamente 5-15 mm formadas a partir de
siendo el tratamiento sin hormonas con 6 mg/l el los callos ndulares disgregados y que pueden ser
de mayor oxidacin (43%) (tabla 5). ya catalogados como embriones en fase coleoptilar
(guras 2D, E y F).
En cuanto a las respuestas de los callos que fueron
transferidos a medios de cultivo con AIA y GA3, CONCLUSIONES
stas mostraron valores signicativos en cuanto a
crecimiento y nodulacin. Los callos provenientes de Brotacin axilar. La mejor desinfeccin (75%)
6 mg/l mostraron crecimiento y nodulacin del 100% de las yemas axilares provenientes de chusquines
en giberelina y del 88% para ambas variables en AIA. se logr utilizando bicloruro de mercurio al 0,3%
En tanto que la oxidacin fue ms signicativa en durante 10 min, este protocolo se emple tanto para
GA3 (tabla 5). De otra parte los callos provenientes la micropropagacin por organognesis como por
de 8 mg/l mostraron crecimiento y nodulacin del embriognesis.
orden de 88% en AIA y del 69% para ambas variables
en GA3. Siendo la oxidacin ms signicativa en Aunque la desinfeccin es ms efectiva utilizando
GA3 (tabla 5). Estas respuestas estaran reforzando yemas apicales, y estas yemas ms jvenes mostraron
la necesidad de transferir los callos inicialmente altos porcentajes de establecimiento (73,6%), sus
tasas de brotacin son bajos (1,8%) con respecto a
inducidos en medios con auxinas, a medios sin ellas
las yemas de los tercios medio y basal.
(Bhojwani y Razdan, 1996).
La mejor respuesta para la brotacin de yemas de
Una evaluacin general del comportamiento de los G. angustifolia se obtuvo con 2,5 mg/l de 6-BAP
callos de G. angustifolia en cuanto a oxidacin y (47,6%), siendo la tasa de multiplicacin de 2 ex-
necrosamiento muestra un problema que parece plantes por explante original.
comn con la callognesis de otras especies de bam-
b, pues en el caso de Dendrocalamus giganteus, El enraizamiento de las vitroplantas (90%) se logr
Sinocalamus latiora y Bambusa oldhamii, luego de con 1 mg/l de AIA en el medio de cultivo.
subcultivar en el mismo medio, la tasa de crecimien-
to disminuye y la mayora de los callos presentan Se alcanz el 95% de endurecimiento de las vitro-
zonas necrosadas y oscurecimiento total del tejido plantas transferidas a vivero.

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Actual Biol 27 (82): 5-15, 2005 Marulanda et al.

Embriognesis somtica. A partir de yemas axilares con AIA y con GA3) y en oscuridad a 28 C, se observ
de G. angustifolia, se logr la induccin de callog- la aparicin de estructuras nodulares embriognicas,
nesis utilizando medio MS a la mitad de la concen- fcilmente disgregables.
tracin de sales suplementado con 6 mg/l de 2,4-D
y luego de aproximadamente 90 das de incubacin Al inocular los callos multiplicados en medios con 6 y
en oscuridad a 28 C. 8 mg/l de 2,4-D, a medios sin auxinas pero en condi-
ciones de luz (fotoperodo de 12 horas), se evidenci
Los callos formados con 6 mg/l de 2,4-D se mul- la aparicin de embriones claramente diferenciados
tiplicaron en oscuridad a 28 C en medios de cultivo (fase coleoptilar) en los callos provenientes de 6 mg/l
con concentraciones de 6, 8 y 10 mg/l de esta auxina. de 2,4-D, luego de 30 das de incubacin.
La mejor respuesta se obtuvo en las concentraciones
de 6 y 8 mg/l, en las cuales se observ la aparicin de AGRADECIMIENTOS
callos compactos nodulares y proembriones.
Los autores expresan sus agradecimientos por el
Al transferir los callos multiplicados en medios con 6 apoyo nanciero de COLCIENCIAS, Universidad
y 8 mg/l de 2,4-D, a medios sin auxina (sin hormonas, Tecnolgica de Pereira y al convenio UTP-GTZ.

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