Produccin Biotecnolgica de Condroitina

Resumen: Condroitina Sulfato es una clase de GAGs sulfatados que son polisacridos lineales que
consisten en unidades disacridas repetidas compuestas de cido urnico y N-acetilhexosamina. Debido
a sus unidades disacrido caracterstica, CS puede clasificarse como galactosaminoglucano (Mikami &
Kitagawa, 2013). La condroitina se produce cultivando un microorganismo recombinante que se
obtiene por inactivacin de un gen que codifica una enzima responsable de la adicin de residuos de
fructosa al polisacrido lineal de condroitina en un microorganismo que produce un derivado
fructosilado de condroitina.

Palabras Clave: Sulfato de Condroitina, produccin, PCR, E- Coli

Introduccin puede ser limitada si la demanda de CS sigue

El sulfato de condroitina es conocido como el
polisacrido principal de los proteoglicanos del
cartlago, particularmente en los animales.
Presenta unidades alternativas de cido D-
glucuronico y de 4-sulfato de N-acetil-D-
galactosamina. Los grupos sulfato estn
presentes en las posiciones C4 o C6 de los
residuos de GalNac. La longitud de una cadena
de sulfato de condroitina puede variar de modo
considerable, pues flucta entre 15 y 20
unidades de disacrido en diferentes tejidos
(Melo & Cuamatzi, 2007 )
CS aislado de tejidos de cartlago tiene
sinnmero de aplicaciones en las industrias
farmacutica, cosmtica y alimentaria. En los
mercados de alimentos naturales, el CS es un
suplemento diettico para la prevencin y
tratamiento de las anomalas en las
articulaciones. La administracin oral de CS se
torna beneficiosa en el tratamiento de la
osteoartritis. Dentro de las fuentes comunes de
cartlago se encuentran las de bovino, el
traqueal y el cartlago de tiburn. Sin embargo,
los tejidos de bovino resultan tener riesgos
potenciales de enfermedades infecciosas (por
ejemplo, la encefalopata espongiforme
bovina). El suministro de cartlago de tiburn
en ascenso en el futuro
CS ha sido extrada del cartlago esternn
posterior de pollos. Los autores informan que el
tejido quilla cartlago es una fuente potencial de
CS. Sin embargo, la cantidad de extrables CS
de una pequea de tejido de cartlago quilla es
limitado. Desde esqueletos de los pollos
jvenes en crecimiento son ricos en el cartlago,
una estructura esencial vital para el crecimiento
del hueso, ms CS se puede producir si se usan
todos los cartlagos disponibles de la carcasa
adems de la quilla del cartlago como fuente
de CS.
La protelisis se conoce como el mtodo
comn para liberar GAGs de tejidos como
GAG-pptidos papana dos veces cristalizado es
una de las proteinasas utilizados por muchos
investigadores. Este proteinasa caro altamente
purificado puede llegar a ser sustituido por una
proteinasa ms econmica. El tamao de los
pptidos que se unen a las cadenas de GAG
puede variar dependiendo de la enzima
proteoltica se usa para escindir la protena del
ncleo de proteoglicano.
Hay poca informacin sobre la estructura del
CS-pptidos preparados con diferentes
proteinasas.
Con el envejecimiento de la poblacin mundial,
la demanda de CS en el tratamiento de la
osteoartritis est aumentando de manera
exponencial, el desarrollo de un proceso
biotecnolgico seguro y fiable para sustituir la
tradicional fuente animal de este producto es el
objetivo de la investigacin actual (Nakanoa &
Zeb Pietrasikb, 2012)
Las industrias globales CS se desarrollan
principalmente en China y alrededor del 80%
de los productos CS son de China. Adems, la
mayor parte de los glicosaminoglicanos (GAG
disponibles en el mercado) han sido hasta la
fecha de fuentes animales (por ejemplo, de
cerdos, ovejas trquea y los tabiques nasales
(Shi, Meng, & Li, 2014)
Actualmente en Colombia, los grupos de
investigacin que estudien el tema son muy
reducidos, y con muy poca insistencia en el
mismo, en su mayora estn ms relacionados
con el campo mdico y veterinario, dentro de
ellos se encuentran tales como el semillero de
investigacin SERES de Colciencias.
El objetivo principal de este artculo de revisin
es proporcionar y producir un microorganismo
como la condroitina, por medio de la revisin
de diferentes artculos y patentes que adems de
la patente base hayan obtenido resultados
similares para lograr producir
microorganismo.
Metodologa
De acuerdo con la patente, se dice que debe
proporcionarse un microorganismo
recombinante que produzca condroitina,
caracterizado porque dicho organismo se
obtiene sometiendo un gen originalmente
presente en el mismo, que codifica una protena
responsable de la adicin de residuos de
fructosa al hueso trasero lineal de condroitina.
De manera similar a como lo describe (Cai, y
otros, 2012), donde parten de membranas
plasmticas de las superficies celulares y
contrastando con (Hong, y otros, 2002) en el
cual se aslo la protena por medio de
Bacteroides stercoris que se encuentra en las
clulas intestinales humanas.
Se dio la construccin del fragmento de ADN
lineal (Fig.1) que transporta ambos extremos
homlogos del gen Kan y kfoE se archiv
mediante PCR usando el vector pKD4 como
molde y algunos cebadores de PCR, descrito
Figura 1. Ruta para la formacin del
plsmido.
En cada secuencia de oligonucletidos, los
primeros 40 nucletidos proporcionan la
homologa del gen kfoE y la homologa del
el plsmido templado de pKD4 restante de 20
nucletidos.
La PCR se realiz sobre 120 ng de ADN molde
de acuerdo con las siguientes condiciones:
94Cx 3 min (94Cx1 min, 40Cx1 min, 68Cx
2 min) x 5 ciclos
Se prepar y transform por electroporacin
con el plsmido pKD46.
Con el fin de obtener la cepa K4 de E-Coli
carente del casete de resistencia a la kanamicina
y llevando una delecin de la mayor parte del
gen kfoE con la consiguiente prdida de
funcin, se llev a cabo una nueva
transformacin de la cepa E-Coli K4 con el
plsmido pCP20.
Despus de la electroporacin, los
transformados fueron seleccionados en medio
que contena ampicilina a 30C y luego la se somete a bao Mara este material
colonia fue purificada. Por otro lado, se gelatinoso.
evidencian las similitudes con ya que como se Se utiliz una secuencia de UF-DF (tecnologas
ha descrito anteriormente, se da una secuencia de ultrafiltracin y diafiltracin) usando
de ADN de doble hebra. El aislamiento del membranas de 100 y 30 kDa para la etapa final
ADN cromosmico de P. vulgaris se llev a de purificacin de CS.
cabo por el mtodo estndar descritos por
autores. Desarrollo y discusin
Los oligonucletidos utilizados cebadores y
sonda se sintetizaron con el sintetizador de De acuerdo a lo que se encontr al estudiar los
ADN, Cyclone Plus. La mezcla de ligacin se diferentes artculos y patentes, se dan diferentes
empaquet in vitro y se transfect a E-coli resultados, debido a que dentro de los mismos
P2392 de acuerdo con las instrucciones que da se pueden encontrar diferentes elementos
el autor. particulares de anlisis que relacionan los unos
con los otros haciendo de la patente base un
De esta manera es posible relacionarlo con el enriquecimiento total.
autor (He, Fu, Li, Jones, & Koffas, 2015) , en el
que adems de describir un procedimiento con
En primer lugar, se obtuvo que en la
algunos matices de diferencia (kfoE) se
caracterizacin de dos condroitinas-liasas se
utilizaron por medio de una amplificacin PCR
determinaron las masas moleculares de
otros, como los genes kfoA, kfoC, kfoF, donde
condroitina ABC y AC-liasas bajo condiciones
este caldo se llev a suspensin durante 15
no desnaturalizantes por filtracin en gel, se
minutos con autoclave, en donde el
estim que la condroitina ABC y las liasas AC
sobrenadante se centrifuga, se recoge para
eran 116 y 170 kDa, respectivamente. Esto
eliminar el material insoluble y se lleva a
sugiere que la condroitina ABC liasa est
precipitacin en frio con etanol, permitiendo as
compuesta de una subunidad y la condroitina
una recuperacin de condroitina celular como
AC liasa est compuesta de dos subunidades
extracelular, nuevamente se volvi a precipitar
idnticas. Los valores ptimos de pH de la
y se le aadi una protena K, que se incuba a
condroitina ABC y AC liasas se determinaron
56Cx2 horas y una tercera precipitacin en la
que eran 7.0 y 5.7-6.0 para el sulfato de
cual se granulo, se recogi y se filtr a travs de
condroitina A, respectivamente, y las
una columna de centrifugacin de 10 KDa para
temperaturas ptimas para la actividad mxima
eliminar pptidos pequeos y sal , hasta obtener
eran 40 C y 45-50 C, respectivamente (datos no
el producto terminado.
mostrados). La actividad de la condroitina ABC
liasa fue inhibida por la adicin de Ni2 +, Mg2
Adicionalmente el procedimiento que se
+, Zn2 +, Cu2 + y Co2 +. Particularmente, Cu2
describe en (Articulo1) para la de purificacin
+ y Zn2 + inhibieron potentemente la
de condroitina ABC liasa se midio a travs de
condroitina ABC liasa y la condroitina AC liasa
la columna CM-Sephadex C-50, por otro lado,
(Hong, y otros, 2002). De modo que al
a la condroitina Ac liasa cruda se le aplic una
complementar, se puede decir que un cido
columna de hidroxiapatita previamente
nucleico aislado que tiene una secuencia de
equilibrada con un tampn de fosfato sdico.
nucletidos que codifica para la condroitinasa
Las protenas no unidas se eliminaron
ABC, en el que dicha secuencia de nucletidos
mediante un lavado de 500 mL de tampn de
consiste esencialmente en la secuencia de
fosfato sdico.
nucletidos de la SEQ ID NO: 1. Un vector de
expresin que comprende una secuencia de
Por otro lado, se encuentra la extraccin de
nucletidos que codifica para la condroitinasa
condroitina a partir de los desechos principales
ABC unida operativamente a una secuencia
de tiburn azul (P. glauca), donde inicialmente
reguladora, en el que dicha secuencia de
nucletidos consiste esencialmente en la
secuencia de nucletidos de SEQ ID NO: 1.
Haciendo referencia al artculo de produccin
de condroitina a partir del cartlago de P.
glauca, se puede determinar que La pureza
del producto retenido de CS despus del secado
fue del 98,5%. El rendimiento final de CS fue
de 12,08 0,72% (p / p de cartlago seco).
Aunque la aplicacin de tecnologas de
membrana (UF-DF) es una de las tcnicas ms
comunes utilizadas para la recuperacin de
macromolculas de alto valor obtenidas por
procesos microbianos o enzimticos, su uso en
la purificacin de CS a partir de tejidos
biolgicos no ha sido ampliamente reportado.
Otros protocolos basados en la separacin
cromatogrfica, utilizando diferentes tipos de
columnas y disolventes y gradientes de elucin,
se han aplicado usualmente a escala de
laboratorio para la purificacin de CS
(Vazquez, Blanco, Fraguas, Pastrana, & Prez-
martn, 2016).
A modo de resultado se tiene que los pasos ms
importantes para la produccin de condroitina
son:
El cultivo de un microorganismo recombinante
en el medio adecuado, definido como
glicosaminoglicano constituido por diferentes
residuos alternantes como acido D-glucaronico
y N- acetil-D-galactosamina, caracterizado
porque dicho microorganismo, el gen kfoE
originalmente presente, que codifica una
enzima responsable de la adicin de residuos
de fructosa al esqueleto lineal de condroitina se
inactiva por delecin o sustitucin total, o
parcialmente de dicho gen de disrupcin por
insercin de una secuencia nucleotdica
adicional.
Adems de la purificacin y la recuperacin de
la condroitina presente en el cultivo
microbiano.
El mtodo en el que el gen kfoE esta
comprendido un ADN que contiene la
secuencia de nucletidos de la SEQ ID n1, este
gen tambin es inactivado entero o de manera
parcial con una sustitucin por medio de
resistencia de kanamicina, resultando de esta la
delecin completa o parcial del gen nombrado
anteriormente.
Por otro lado, el microorganismo recombinante
es derivado de una bacteria perteneciente a un
gnero Escrerichia, Haemophilus,
Campylobacter, Gloeocapsa y Vibrio.
Donde en este caso, como lo describe la
mayora de artculos y patentes, se da con
Escherichia Coli.
Conclusin
La fermentacin por medio de cultivos, con
Escherichia Coli es uno de los procedimientos
ms utilizados en para la produccin de
Condroitina.
Aunque la aplicacin de tecnologas de
membrana (UF-DF) es una de las tcnicas ms
utilizadas para la recuperacin de
macromolculas de alto valor obtenidas por
procesos microbianos o enzimticos, no se ha
descrito ampliamente su uso en la purificacin
de CS a partir de tejidos biolgicos.
En conclusin, este review trata sobre la
purificacin y caracterizacin de la
condroitina, ABC y AC liasas hacen parte de
los tipos de condroitina, estudios de HPLC-MS
y RMN pueden confirmar la correcta estructura
qumica de la condroitina, condroitina CTC
fructosilada por E. coli K4 es una clara mejora
para el proceso de produccin.
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