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Departamento de Bioqumica, Gentica e Inmunologa. Facultad de Ciencias. Universidad de Vigo. Lagoas-Marcosende, s/n.
E-36200 Vigo (Pontevedra), Espaa. Correos electrnicos: yruiz@uvigo.es, psuarez@uvigo.es, fsanjuan@uvigo.es
RESUMEN
La enzima glucgeno sintasa del tejido del manto de Mytilus galloprovincialis Lamarck, 1819 se
encuentra principalmente en su forma dependiente (D) de G6P, con una actividad cuatro veces
mayor que la forma independiente (I) de G6P. Ambas formas presentan la mayor actividad a
pH:7, pero la forma D mantiene el 60 % de su actividad a valores extremos de pH, donde la for-
ma I disminuye la suya al 25 %. La temperatura ptima est entre 30 y 35 C en ambos casos, pe-
ro la forma I es ms estable entre 30 y 40 C. Los datos cinticos de ambas formas enzimticas in-
dican la existencia de efectos cooperativos respecto al sustrato y el efector. La constante de
afinidad de la forma I para el sustrato UDPG es 1,9-2,3 mM y la de la D es 0,9-1,3 mM. La forma
D muestra, adems, una constante de activacin de 5,2-5,6 mM para el efector G6P.
ABSTRACT
Glycogen synthase (GS) from Mytilus galloprovincialis Lamarck, 1819 mantle tissue is primarily in
G6P-dependent form, whose activity is four times that of the G6P-independent form. Both forms present high-
er activity to pH: 7, but the D-form mantains 60 % of its maximum activity at extreme pH values, whereas
that of the I-form drops to 25 %. The optimum temperature is 30-35 C for both forms, but the I-form is more
stable between 30 and 40 C. Kinetic data on both enzymatic forms indicate the existence of cooperative effects
with regard to the substrate and effector. The I-form affinity constant for the substrate UDPG is 1.9-2.3 mM
and that of the D-form is 0.9-1.3 mM. Moreover, the D-form shows an activation constant for the efector G6P
of 5.2-5.6 mM.
11
Y. Ruiz Muoz, P. Surez Alonso y F. San Juan Serrano Glucgeno sintasa de Mytilus galloprovincialis
1995; Danton et al., 1996) que indica una ntima co- En previsin de un posterior estudio sobre el es-
ordinacin entre el ciclo gonadal y el del tejido de pecial control que el metabolismo del glucgeneo
reserva. De entre los metabolitos acumulados en el parece ejercer en el tejido del manto de Mytilus ga-
tejido del manto de Mytilus, el glucgeno constitu- lloprovincialis Lamarck, 1819 durante el desarrollo
ye el principal soporte energtico de la gametog- gametognico, el presente trabajo pone de mani-
nesis (Lubet, 1959; De Zwaan y Zandee, 1972; fiesto la actividad glucgeno sintasa en este tejido,
Gabbott, 1983; Surez, 2002). optimiza el mtodo de medida de las dos formas de
En la ra de Vigo (Galicia, noroeste de Espaa), la enzima y las caracteriza cinticamente.
la acumulacin tiene lugar durante primavera-ve-
rano, coincidiendo con los bloom fitoplanctnicos.
En invierno, la escasez de nutrientes en el medio y MATERIAL Y MTODOS
el inicio de la gametognesis imponen la utiliza-
cin del glucgeno almacenado como principal Reactivos
fuente energtica y de precursores biosintticos
(Surez, 2002). A principios de primavera, coinci- Los sustratos, enzimas auxiliares y coenzimas
diendo con un periodo de intensa y rpida game- fueron obtenidos en Sigma Chemical Company.
tognesis que da lugar a las principales puestas, se Las sales, tampones y otros productos qumicos de
observan sucesivos aumentos y cadas del conteni- anlisis eran de la firma Merck.
do en glucgeno del tejido del manto que indican
que Mytilus no utiliza directamente la glucosa inge-
Material biolgico
rida, sino que depende del glucgeno almacenado
para la maduracin de los gametos (Surez, 2002).
Se utilizaron ejemplares de M. galloprovincialis
Esto entraa la activacin simultnea de rutas
recogidos directamente de bateas en la ra de
opuestas como la glucogenognesis y la glucogeno-
Vigo en febrero de 2004, con tallas entre 8 y 10 cm
lisis, que en vertebrados estn sometidas a un rigu-
(medida en su eje mayor) con el objetivo de evitar
roso y antagnico control hormonal, covalente y
posibles diferencias debidas a la edad y grado de
alostrico.
crecimiento. Los individuos recolectados fueron
La enzima clave de la glucogenolisis es la gluc-
trasladados al laboratorio. La diseccin del tejido
geno fosforilasa. Su existencia en el tejido del man-
del manto se realiz tras la apertura de las valvas
to de Mytilus, sus caractersticas moleculares y cin-
de 20 de los mejillones seleccionados, seccionan-
ticas y la variacin durante la gametognesis han do el msculo aductor posterior. Todos los hemi-
sido documentadas por San Juan Serrano et al. mantos fueron escurridos en papel de filtro y reu-
(1991, 1993, 1995a,b, 1998), San Juan Serrano, nidos para la obtencin inmediata del extracto
Snchez Lpez y Garca Martn (1995, 1998) y Su- enzimtico.
rez (2002).
La responsable de la biosntesis de novo del glu-
cgeno es la enzima glucgeno sintasa (GS; EC Obtencin del extracto enzimtico
2.4.1.11), que utiliza como donador glucosdico la
UDP-glucosa (UDPG). Se parti de una cantidad de 30 g de tejido, que
En vertebrados, la GS existe en dos formas inter- se homogeneiz con tampn Tris-acetato 40 mM,
convertibles entre s mediante reacciones de fosfo- pH:7,0, conteniendo 5 mM de imidazol, 5 mM de
rilacin y desfosforilacin: la forma fosforilada, o EDTA, 5 mM de -mercaptoetanol, 10 mM de NaF
forma D, dependiente de glucosa-6-fosfato (G6P) y y 0,12 M de KCl, en una proporcin 1/5 (peso/vo-
la forma desfosforilada, o forma I, independiente lumen). El EDTA, como agente acomplejante de
de G6P. A su vez, la forma D se corresponde con la iones, es un inhibidor de la glucgeno sintasa qui-
forma inactiva de la enzima, o forma b, mientras nasa y estabiliza la forma desfosforilada (forma I).
que la forma I se corresponde con la forma activa, El uso de iones F tiene la finalidad de estabilizar
o forma a, de la enzima. La existencia de esta acti- la forma fosforilada de la glucgeno sintasa (for-
vidad enzimtica ha sido demostrada en Mytilus ma D) por inhibicin de la fosfoprotena fosfata-
edulis L., 1758 (Cook y Gabbott, 1978). sa. El -mercaptoetanol y el imidazol desempean
una funcin protectora de los restos sulfhidrilo de Puesta a punto del mtodo de medida
las estructuras protenicas, evitando su oxidacin, de la actividad enzimtica
y el KCl se utiliza para mantener la isotonicidad
con el tejido del manto de Mytilus. El homogenei- Para la puesta a punto del mtodo se estableci la
zado obtenido se centrifug a 15 400 gav duran- concentracin ptima de sustrato a la cual la enzima
te 30 min a 4 C. El sobrenadante, conteniendo la de Mytilus alcanza la actividad mxima de reaccin,
fraccin citoslica, fue filtrado a travs de una ga- as como la linealidad de la actividad enzimtica
sa para eliminar grasas. El extracto bruto as obte- frente al tiempo de reaccin. Para determinar la
nido fue dividido en alcuotas de 1 ml y congela- concentracin saturante de sustrato se midi la re-
das a 80 C hasta su utilizacin. Previamente a accin de la enzima a concentraciones crecientes
los diversos anlisis realizados cada alcuota de so- del mismo (0,5-6 mM). Para determinar la concen-
lucin enzimtica fue dializada frente a 30 vol- tracin ptima de efector se midi la reaccin de la
menes del mismo tampn de extraccin durante enzima a concentraciones crecientes del mismo (4-
30 min a 4 C en agitacin, con el fin de eliminar 14 mM). Para determinar la linealidad de la reac-
metabolitos contenidos en la muestra que pudie- cin y el tiempo necesario de incubacin, se midi
ran interferir en la medida de la actividad enzi- su actividad a diferentes tiempos hasta 40 min.
mtica.
0,15 120
Actividad (U.I./mL)
% Actividad relativa
A B
0,12
90
0,09
60
0,06
30
0,03
0,00 0
0 5 10 15 20 2 4 6 8 10
Tiempo de reaccin (min) pH
120 120
% Actividad relativa
% Actividad relativa
C D
90 90
60 60
30 30
0 0
0 15 30 45 60 0 15 30 45 60
Temperatura (C) Temperatura (C)
Figura 1. Actividad glucgeno sintasa del tejido del manto de M. galloprovincialis. (): forma I; (o): forma D. (A): lineali-
dad de la reaccin enzimtica; (B): efecto del pH sobre la actividad; (C): efecto de la temperatura sobre la actividad;
(D): estabilidad trmica.
tacin de Michaelis-Menten de velocidad de reac- ma dependiente del efector (D) con una actividad
cin (V) frente a la concentracin del sustrato residual en ausencia del mismo y afinidad muy ba-
([UDPG]) muestra una clara interrupcin o quie- ja por el sustrato (alta Km), y no tanto reflejar la
bro para el valor 4 mM (figura 2A). Igualmente, la existencia de ms de una forma I de la GS. Algo si-
representacin de Lineweaver-Burk de dobles rec- milar est descrito para la enzima glucgeno fosfo-
procos (1/V frente a 1/[S]) no se ajusta a una rec- rilasa del manto de Mytilus, cuya forma dependien-
ta, sino que, a concentraciones por encima y por te de AMP, en ausencia de este activador, muestra
debajo de 4 mM, parece seguir dos cinticas dife- una actividad mnima y la prdida de los efectos
rentes (figura 2B). Esta tendencia indica la presen- alostricos y cooperativos (San Juan et al., 1993).
cia de dos o ms formas enzimticas en la prepara-
cin, con distintas velocidades mximas y constantes
de afinidad. La diferencia entre las dos partes de la Propiedades cinticas de la forma
representacin se acenta con el aumento de la di- dependiente de G6P (forma D)
ferencia entre los valores de sus variables cinticas
(Segel, 1993). La forma fosforilada y dependiente de G6P de la
A concentraciones por debajo de 4 mM de GS de manto de Mytilus, tambin presenta una pe-
UDPG la representacin de dobles recprocos no culiar cintica no lineal respecto a su sustrato
es lineal, indicando cooperatividad e inhibicin UDPG. En este caso, se observa tambin una inte-
por sustrato. Para el clculo de las constantes cin- rrupcin o quiebro para el valor 4 mM de UDPG
ticas en este rango de concentraciones se utilizaron (figura 3A) y la representacin de Lineweaver-Burk
las representaciones de 1/V frente a 1/[S]2 y la re- de dobles recprocos (1/V frente a 1/[S]) no se
presentacin de Hill (log V/(Vmx V) frente a ajusta a una recta, sino que presenta dos tramos
log [UDPG]) (Segel, 1993), obteniendo valores de discontinuos (figura 3B). De forma similar a lo ya
K0,5 de 1,9 mM y Vmx de 0,013 UI y valores de S0,5 discutido, esta tendencia podra indicar la presen-
de 2,3 mM, respectivamente (figura 2C,D). Este va- cia de ms de una forma D o bin la coexistencia
lor de la constante de afinidad es similar a los cita- en el extracto de las dos formas de la enzima: de-
dos en la bibliografa para la forma independiente pendiente e independiente del efector G6P.
(I) de la glucgeno sintasa de M. edulis (Cook y La representacin de Lineweaver-Burk a con-
Gabbott, 1978). El clculo del ndice de Hill (nH) a centraciones de UDPG inferiores a 4 mM tampoco
partir de la representacin de log V/(Vmx V) es lineal (figura 3B), y para el clculo de sus cons-
frente a log [UDPG] arroja valores de 1,9 (figura tantes cinticas se recurri a su transformacin en
2D), mientras que algunos autores citan valores lineal mediante la representacin de 1/V frente a
cercanos a 1 para la forma I de la GS (Roach, 1/[S]2 (Segel, 1993) (figura 3C). De esta forma se
Takeda y Larner, 1976). Segn Segel (1993), este obtuvieron los valores 0,040 UI/ml de Vmx y 0,9
ndice indica el nmero de sitios de unin del sus- mM de K0,5 para la UDPG, que se encuentran den-
trato por molcula de enzima, por lo que un valor tro del rango en el que varan los descritos en la bi-
de 1,9 sugiere que la forma I de la GS de manto de bliografa para la forma D (Passoneau, Schwartz y
Mytilus presenta un segundo sitio de unin dife- Rottenberg, 1975; Huang y Robinson, 1976). La re-
rente del centro activo. presentacin de Hill (figura 3D) corrobora el valor
A concentraciones de UDPG superiores a 4 M, la de K0,5, con un valor de S0,5 de 1,3 mM. Sin embar-
representacin parece seguir una cintica michae- go, en este caso, el ndice nH presenta un valor de
liana, y las variables Km y Vmx, calculadas a partir 0,9, indicativo de un nico sitio de unin para la
de la representacin de Lineweaver-Burk, fueron UDPG sobre la estructura de la enzima. La compa-
11,65 mM y 0,015 UI respectivamente. Este valor de racin de este valor del ndice nH con el obtenido
Km es muy superior a los citados en la bibliografa, para la forma no fosforilada e independiente de
que se encuentran entre 0,113 y 2,8 mM G6P (forma I) (nH 1,9) parece sugerir que la fos-
(Passoneau, Schwartz y Rottenberg, 1975; Cook y forilacin de la enzima conlleva un enorme au-
Gabbott, 1978). mento de la afinidad del sitio efector por la G6P, y
En el caso de la enzima de Mytilus, este compor- que en la forma no fosforilada independiente de la
tamiento podra indicar la presencia de una forma G6P el sitio secundario de unin de la UDPG des-
totalmente independiente del efector (I) y otra for- crito podra corresponderse con el sitio del efector
0,020 400
1/V (U.I./ml)
V (U.I./ml)
A B
0,016
300
0,012
200
0,008
100
0,004
0,000 0
0 1 2 3 4 5 6 7 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
[UDPG] mM 1/[UDPG] mM
400 0,9
lo g V/(Vma x-V)
1/V (U.I./ml)
C D
0,6
300
0,3
200 0,0
-0,3
y = 1,8594x - 0,601
100
y = 256,02x + 77,236 -0,6 R2 = 0,9972
2
R = 0,9702
0 -0,9
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
2 log [UDPG] mM
1/[UDPG] mM
Figura 2. Cintica de la forma independiente de G6P (forma I) de la enzima glucgeno sintasa del tejido del manto de M.
galloprovincialis respecto al sustrato UDPG. (A): representacin de Michaelis-Menten (V frente a [UDPG]); (B):
representacin de Lineweaver-Burk (1/V frente a 1/[UDPG]); (C): representacin de 1/V frente a 1/[UDPG]2 a
concentraciones inferiores a 4 mM; (D): representacin de Hill (log V/(Vmx V) frente a log [UDPG]).
alostrico. La Vmx de esta forma es aproximada- Mytilus. Para ello se midi la actividad enzimtica a
mente cuatro veces mayor que la de la forma I, y la saturacin de sustrato (5 mM) y variando la con-
afinidad por su sustrato es dos veces mayor, a pesar centracin de G6P entre 4 y 14 mM. Este rango de
de estar considerara en vertebrados como una for- concentraciones de G6P fue determinado a partir
ma inactiva o menos activa (forma b). de las concentraciones utilizadas por otros autores
La glucgeno sintasa es una enzima polimrica para la medida de la forma D (Passoneau, Schwartz
cuya dependencia del efector G6P viene determi- y Rottenberg, 1975; Cook y Gabbott, 1978; Hanigan,
nada por la modulacin covalente por fosforilacin Donahue y Masaracchia, 1985). Se observ un efec-
(Killilea y Whelan, 1976; Huang y Cabib, 1974; to inhibidor a concentraciones superiores a 11 mM
Cook y Gabbott, 1978). En algunos organismos se de G6P no representado en las grficas. Entre 4
han descrito formas parcialmente fosforiladas, con y 10 mM de G6P, la cintica respecto al efector
caractersticas de actividad intermedias entre la for- es ligeramente sigmoidal, y la representacin de
ma fosforilada y la no fosforilada (Brown y Larner, Lineweaver-Burk se aleja de la linealidad (figu-
1971; Issa y Mendicino, 1973; Lin y Segal, 1973). Se ra 4A,B).
analiz tambin la dependencia y el efecto del mo- A partir de la representacin de 1/V frente a
dulador G6P sobre la forma D de la enzima de 1/[S]2 se obtuvieron los valores 0,06 UI de Vmx y
0,06 140
V (U.I./ml)
1/V (U.I./ml)
A B
105
0,04
70
0,02
35
0,00 0
0 1 2 3 4 5 6 0,0 0,6 1,2 1,8 2,4
[UDPG] mM 1/[UDPG] mM
0,8
log V/(Vmax-V)
140
1/V (U.I./ml)
D
C
0,4
105
0,0
70
35 -0,4
y = 20,722x + 26,935 y = 0,8783x - 0,1993
R2 = 0,9718 2
R = 0,7792
0 -0,8
0,0 1,4 2,8 4,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8
2
1/[UDPG] mM log [UDPG] mM
Figura 3. Cintica de la forma dependiente de G6P (forma D) de la enzima glucgeno sintasa del tejido del manto de
M. galloprovincialis respecto al sustrato UDPG en presencia de 10 mM del efector G6P. (A): representacin de Michaelis-Menten
(V frente a [UDPG]); (B): representacin de Lineweaver-Burk (1/V frente a 1/[UDPG]); (C): representacin de 1/V frente
a 1/[UDPG]2; (D): representacin de Hill (log V/(Vmx V) frente a log [UDPG]).
0,06 60
V (U.I./ml)
1/V (U.I./ml)
A B
45
0,04
30
0,02
15
0,00 0
2 4 6 8 10 12 0,00 0,06 0,12 0,18 0,24 0,30
[G6P] mM 1/[G6P] mM
60 0,9
1/V (U.I./m)
log V/(Vmax-V)
C D
0,6
45
0,3
30 0,0
-0,3
y = 2,3468x - 1,674
15 2
y = 548,35x + 17,256 R = 0,9338
-0,6
2
R = 0,9587
0 -0,9
0,0 0,0 0,0 0,1 0,1 0,5 0,7 0,8 1,0 1,1
1/[G6P]2 mM log [G6P] mM
Figura 4. Cintica de la forma dependiente de G6P (forma D) de la enzima glucgeno sintasa del tejido del manto de M.
galloprovincialis respecto al efector G6P a saturacin de sustrato (UDPG) (5 mM). (A): representacin de Michaelis-Menten
(V frente a [G6P]); (B): representacin de Lineweaver-Burk (1/V frente a 1/[G6P]); (C): representacin de 1/V frente a
1/[G6P]; (D): representacin de Hill (log V/(Vmx V) frente a log [G6P]).
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