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Bol. Inst. Esp. Oceanogr. 23 (1-4). 2007: 11-20 BOLETN.

INSTITUTO ESPAOL DE OCEANOGRAFA


ISSN: 0074-0195
Instituto Espaol de Oceanografa, 2007

Glucgeno sintasa del tejido del manto


de Mytilus galloprovincialis Lamarck, 1819

Y. Ruiz Muoz, P. Surez Alonso y F. San Juan Serrano

Departamento de Bioqumica, Gentica e Inmunologa. Facultad de Ciencias. Universidad de Vigo. Lagoas-Marcosende, s/n.
E-36200 Vigo (Pontevedra), Espaa. Correos electrnicos: yruiz@uvigo.es, psuarez@uvigo.es, fsanjuan@uvigo.es

Recibido en septiembre de 2005. Aceptado en junio de 2007.

RESUMEN

La enzima glucgeno sintasa del tejido del manto de Mytilus galloprovincialis Lamarck, 1819 se
encuentra principalmente en su forma dependiente (D) de G6P, con una actividad cuatro veces
mayor que la forma independiente (I) de G6P. Ambas formas presentan la mayor actividad a
pH:7, pero la forma D mantiene el 60 % de su actividad a valores extremos de pH, donde la for-
ma I disminuye la suya al 25 %. La temperatura ptima est entre 30 y 35 C en ambos casos, pe-
ro la forma I es ms estable entre 30 y 40 C. Los datos cinticos de ambas formas enzimticas in-
dican la existencia de efectos cooperativos respecto al sustrato y el efector. La constante de
afinidad de la forma I para el sustrato UDPG es 1,9-2,3 mM y la de la D es 0,9-1,3 mM. La forma
D muestra, adems, una constante de activacin de 5,2-5,6 mM para el efector G6P.

Palabras clave: Mytilus galloprovincialis, glucgeno sintasa, caractersticas cinticas.

ABSTRACT

Glycogen synthase in mantle tissue of Mytilus galloprovincialis Lamarck, 1819

Glycogen synthase (GS) from Mytilus galloprovincialis Lamarck, 1819 mantle tissue is primarily in
G6P-dependent form, whose activity is four times that of the G6P-independent form. Both forms present high-
er activity to pH: 7, but the D-form mantains 60 % of its maximum activity at extreme pH values, whereas
that of the I-form drops to 25 %. The optimum temperature is 30-35 C for both forms, but the I-form is more
stable between 30 and 40 C. Kinetic data on both enzymatic forms indicate the existence of cooperative effects
with regard to the substrate and effector. The I-form affinity constant for the substrate UDPG is 1.9-2.3 mM
and that of the D-form is 0.9-1.3 mM. Moreover, the D-form shows an activation constant for the efector G6P
of 5.2-5.6 mM.

Keywords: Mytilus galloprovincialis, Glycogen synthase, kinetic characteristics.

INTRODUCCIN El tejido del manto de Mytilus tiene dos funcio-


nes fisiolgicas: la acumulacin de sustancias de re-
La reproduccin y el engorde son aspectos clave serva y el desarrollo de la gnada, por la que es in-
en el cultivo de Mytilus, y ambos estn relacionados vadido y que prolifera a sus expensas. Las clulas
con la capacidad de almacenar sustancias de reser- del tejido de reserva siguen una evolucin inversa
va en el tejido del manto, principalmente en forma al desarrollo gametognico (Lubet, 1959; Lubet
de glucgeno (80 % del peso seco). et al., 1976; Lowe, Moore y Bayne, 1982; Villalba,

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Y. Ruiz Muoz, P. Surez Alonso y F. San Juan Serrano Glucgeno sintasa de Mytilus galloprovincialis

1995; Danton et al., 1996) que indica una ntima co- En previsin de un posterior estudio sobre el es-
ordinacin entre el ciclo gonadal y el del tejido de pecial control que el metabolismo del glucgeneo
reserva. De entre los metabolitos acumulados en el parece ejercer en el tejido del manto de Mytilus ga-
tejido del manto de Mytilus, el glucgeno constitu- lloprovincialis Lamarck, 1819 durante el desarrollo
ye el principal soporte energtico de la gametog- gametognico, el presente trabajo pone de mani-
nesis (Lubet, 1959; De Zwaan y Zandee, 1972; fiesto la actividad glucgeno sintasa en este tejido,
Gabbott, 1983; Surez, 2002). optimiza el mtodo de medida de las dos formas de
En la ra de Vigo (Galicia, noroeste de Espaa), la enzima y las caracteriza cinticamente.
la acumulacin tiene lugar durante primavera-ve-
rano, coincidiendo con los bloom fitoplanctnicos.
En invierno, la escasez de nutrientes en el medio y MATERIAL Y MTODOS
el inicio de la gametognesis imponen la utiliza-
cin del glucgeno almacenado como principal Reactivos
fuente energtica y de precursores biosintticos
(Surez, 2002). A principios de primavera, coinci- Los sustratos, enzimas auxiliares y coenzimas
diendo con un periodo de intensa y rpida game- fueron obtenidos en Sigma Chemical Company.
tognesis que da lugar a las principales puestas, se Las sales, tampones y otros productos qumicos de
observan sucesivos aumentos y cadas del conteni- anlisis eran de la firma Merck.
do en glucgeno del tejido del manto que indican
que Mytilus no utiliza directamente la glucosa inge-
Material biolgico
rida, sino que depende del glucgeno almacenado
para la maduracin de los gametos (Surez, 2002).
Se utilizaron ejemplares de M. galloprovincialis
Esto entraa la activacin simultnea de rutas
recogidos directamente de bateas en la ra de
opuestas como la glucogenognesis y la glucogeno-
Vigo en febrero de 2004, con tallas entre 8 y 10 cm
lisis, que en vertebrados estn sometidas a un rigu-
(medida en su eje mayor) con el objetivo de evitar
roso y antagnico control hormonal, covalente y
posibles diferencias debidas a la edad y grado de
alostrico.
crecimiento. Los individuos recolectados fueron
La enzima clave de la glucogenolisis es la gluc-
trasladados al laboratorio. La diseccin del tejido
geno fosforilasa. Su existencia en el tejido del man-
del manto se realiz tras la apertura de las valvas
to de Mytilus, sus caractersticas moleculares y cin-
de 20 de los mejillones seleccionados, seccionan-
ticas y la variacin durante la gametognesis han do el msculo aductor posterior. Todos los hemi-
sido documentadas por San Juan Serrano et al. mantos fueron escurridos en papel de filtro y reu-
(1991, 1993, 1995a,b, 1998), San Juan Serrano, nidos para la obtencin inmediata del extracto
Snchez Lpez y Garca Martn (1995, 1998) y Su- enzimtico.
rez (2002).
La responsable de la biosntesis de novo del glu-
cgeno es la enzima glucgeno sintasa (GS; EC Obtencin del extracto enzimtico
2.4.1.11), que utiliza como donador glucosdico la
UDP-glucosa (UDPG). Se parti de una cantidad de 30 g de tejido, que
En vertebrados, la GS existe en dos formas inter- se homogeneiz con tampn Tris-acetato 40 mM,
convertibles entre s mediante reacciones de fosfo- pH:7,0, conteniendo 5 mM de imidazol, 5 mM de
rilacin y desfosforilacin: la forma fosforilada, o EDTA, 5 mM de -mercaptoetanol, 10 mM de NaF
forma D, dependiente de glucosa-6-fosfato (G6P) y y 0,12 M de KCl, en una proporcin 1/5 (peso/vo-
la forma desfosforilada, o forma I, independiente lumen). El EDTA, como agente acomplejante de
de G6P. A su vez, la forma D se corresponde con la iones, es un inhibidor de la glucgeno sintasa qui-
forma inactiva de la enzima, o forma b, mientras nasa y estabiliza la forma desfosforilada (forma I).
que la forma I se corresponde con la forma activa, El uso de iones F tiene la finalidad de estabilizar
o forma a, de la enzima. La existencia de esta acti- la forma fosforilada de la glucgeno sintasa (for-
vidad enzimtica ha sido demostrada en Mytilus ma D) por inhibicin de la fosfoprotena fosfata-
edulis L., 1758 (Cook y Gabbott, 1978). sa. El -mercaptoetanol y el imidazol desempean

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una funcin protectora de los restos sulfhidrilo de Puesta a punto del mtodo de medida
las estructuras protenicas, evitando su oxidacin, de la actividad enzimtica
y el KCl se utiliza para mantener la isotonicidad
con el tejido del manto de Mytilus. El homogenei- Para la puesta a punto del mtodo se estableci la
zado obtenido se centrifug a 15 400  gav duran- concentracin ptima de sustrato a la cual la enzima
te 30 min a 4 C. El sobrenadante, conteniendo la de Mytilus alcanza la actividad mxima de reaccin,
fraccin citoslica, fue filtrado a travs de una ga- as como la linealidad de la actividad enzimtica
sa para eliminar grasas. El extracto bruto as obte- frente al tiempo de reaccin. Para determinar la
nido fue dividido en alcuotas de 1 ml y congela- concentracin saturante de sustrato se midi la re-
das a 80 C hasta su utilizacin. Previamente a accin de la enzima a concentraciones crecientes
los diversos anlisis realizados cada alcuota de so- del mismo (0,5-6 mM). Para determinar la concen-
lucin enzimtica fue dializada frente a 30 vol- tracin ptima de efector se midi la reaccin de la
menes del mismo tampn de extraccin durante enzima a concentraciones crecientes del mismo (4-
30 min a 4 C en agitacin, con el fin de eliminar 14 mM). Para determinar la linealidad de la reac-
metabolitos contenidos en la muestra que pudie- cin y el tiempo necesario de incubacin, se midi
ran interferir en la medida de la actividad enzi- su actividad a diferentes tiempos hasta 40 min.
mtica.

Determinacin del pH ptimo


Determinacin de la actividad glucgeno sintasa
El pH ptimo de la glucgeno sintasa fue deter-
La determinacin de la actividad GS se llev a ca- minado analizando el efecto de este parmetro so-
bo siguiendo el mtodo descrito por Passonneau y bre la actividad de cada forma enzimtica (I y D).
Rottenberg (1973), acoplando la liberacin de Los ensayos se realizaron a 20 C utilizando una
UDP a su fosforilacin a UTP va piruvato quinasa mezcla de tampones tris-maleato y actico-acetato
(PK) y la produccin de piruvato en esta reaccin en concentraciones variables para obtener el valor
a la oxidacin de NADH va lactato deshidrogena- de pH deseado en cada medida. El rango de valo-
da (LDH). La disminucin de densidad ptica res de pH utilizado fue de 3 a 5,5 con el tampn
(DO) provocada por la desaparicin de NADH se actico-acetato y de 5,5 a 9,5 con el tris-maleato.
midi espectrofotomtricamente a 340 nm en rela-
cin con el tiempo. La mezcla de reaccin emplea-
da, en un volumen de 1 ml, contena tampn Tris- Efecto de la temperatura
acetato 40 mM, pH:7,0, imidazol 5 mM, EDTA 2
mM, -mercaptoetanol 1,4 mM, NaF 10 mM, aceta- Se estudi el efecto de la temperatura, tanto so-
to magnsico 5 mM, UDPG 5 mM, glucgeno 2 bre la estabilidad como sobre la velocidad de reac-
mg/ml, G6P 10 mM, PEP 5 mM, NADH 0,15 mM, cin de ambas formas enzimticas. Para determi-
3 unidades internacionales (UI) PK, 5 UI LDH y 20 nar la temperatura ptima se ensay la actividad
l de muestra. Preparada la mezcla de reaccin, se enzimtica en un rango de temperaturas de 5 a
incub durante 20 minutos a 20 C y posterior- 55 C. Para el estudio de la termoestabilidad se
mente se midi el descenso de absorbancia tam- incubaron las muestras durante 1 h a diferentes
bin durante 20 min. temperaturas entre 15 y 50 C. Transcurrido este
Se midi as la actividad conjunta de las dos for- tiempo, se ensay la actividad enzimtica como se
mas presentes en el extracto enzimtico (I  D). La describe en apartados anteriores.
forma I se midi en las mismas condiciones en au-
sencia de G6P. Posteriormente, la actividad de la
forma D se calcul como la diferencia de la activi- Propiedades cinticas
dad conjunta (I  D) y la actividad de la forma I. La
actividad enzimtica se expres en UI, medida de- Las variables y constantes cinticas fueron anali-
finida como la cantidad de enzima necesaria para zadas bajo las condiciones ptimas de pH y tempe-
catalizar la formacin de 1 mmol de glucgeno por ratura determinadas previamente, variando respec-
minuto en las condiciones de ensayo. tivamente las concentraciones de sustrato y efector

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en la mezcla de reaccin entre rangos de 0,5 a hasta valores inferiores al 25 %. La diferencia de


6 mM de UDPG y de 4 a 14 mM de G6P. Para el an- actividad entre las dos formas parece ms notable
lisis cintico se emplearon las representaciones de en la parte cida del rango de pH.
Michaelis-Menten, de Lineweavr-Burk, 1/V frente El mejilln es un organismo que presenta en mu-
a 1/[S]2 y de Hill. chos momentos una acusada dependencia del meta-
En las representaciones grficas de estas varia- bolismo anaerbico, el cual conlleva una disminu-
bles cada punto corresponde a la media de tres de- cin del rendimiento energtico y la acumulacin
terminaciones independientes, y las diferentes rec- de productos finales como cetocidos, que disminu-
tas de regresin y sus coeficientes de correlacin yen el pH del entorno celular. La sntesis de gluc-
han sido calculados teniendo en cuenta todos los geno a partir de glucosa requiere un paso previo de
ensayos realizados. activacin de la glucosa para originar UDPG, proce-
so que consume energa. La disminucin del pH
cuando el metabolismo anaerbico se incrementa
RESULTADOS Y DISCUSIN podra implicar en el manto de Mytilus un factor de
control de la actividad de la glucgeno sintasa I, dis-
Linealidad de la actividad enzimtica minuyendo, de esta forma, el gasto energtico.
en funcin del tiempo

La linealidad de la reaccin de la glucgeno sin- Determinacin de la temperatura ptima


tasa se determin midiendo la actividad enzimtica
en funcin del tiempo de reaccin (figura 1A). La temperatura es uno de los principales facto-
Puede observarse un aumento de la actividad enzi- res ambientales determinantes de la velocidad del
mtica proporcional al tiempo de reaccin desde los metabolismo en animales poiquilotermos, princi-
primeros 20 minutos, en los que la reaccin co- palmente de hbitats intermareales, como Mytilus.
mienza a ser estable, hasta los 40 min. Se establecie- Estos organismos, aunque son incapaces de regular
ron as sendos periodos de 20 min para la incuba- su temperatura corporal frente al medio externo,
cin de la mezcla de reaccin y la medida de la presentan mecanismos de aceleracin o disminu-
actividad enzimtica. Se observa tambin en esta cin de su metabolismo, as como modificaciones
grfica que la forma D presenta una actividad cuatro de la actividad de molculas particulares que los
veces mayor que la forma I, reflejando que la enzima mantienen relativamente protegidos de los cam-
glucgeno sintasa del manto de Mytilus se encuentra bios bruscos de temperatura.
principalmente en su forma dependiente de G6P. Los resultados de temperatura ptima obtenidos
para ambas formas de la glucgeno sintasa se mues-
tran en la figura 1C. La forma I parece responder a
Determinacin del pH ptimo temperaturas algo mayores que la forma D, alcan-
zando su actividad mxima a 35 C, mientras que la
El efecto del pH sobre la actividad de la gluc- forma D lo hace a temperaturas ms bajas y alcan-
geno sintasa del tejido del manto de Mytilus se re- za su mxima actividad a 30 C. Estos valores de
coge en la figura 1B. Las dos formas de la enzima temperatura ptima obtenidos para la enzima de
(I y D) presentan un pH ptimo de 7,0, similar al Mytilus se encuentran dentro del rango de tempe-
descrito para la enzima de hgado humano y de ra- raturas ptimas descritas para esta enzima en otras
ta (Westphal y Nuttall, 1992) y dentro del amplio especies (Takahara y Matsuda, 1978; Westphal y
rango citado en la bibliografa para esta enzima Nuttall, 1992). A temperaturas extremas (5 y 55 C),
(desde pH:6,0 hasta pH:9,0) (Brown y Larner, la actividad de ambas formas disminuye hasta al-
1971; Issa y Mendicino, 1973; Killilea y Whelan, canzar valores mnimos. El descenso de actividad a
1976; Hanigan, Donahue y Masaracchia, 1985). altas temperaturas es debido al aumento de la agi-
Aunque no se observa una diferencia significati- tacin trmica de las molculas de enzima y sustra-
va entre los ptimos encontrados para ambas for- to, y a la desnaturalizacin trmica de la enzima. A
mas de la enzima del manto de Mytilus, la forma D bajas temperaturas, el descenso de la actividad es
conserva ms del 60 % de su actividad a valores de provocada por la disminucin de la energa cinti-
pH extremos, donde la actividad de la forma I cae ca de las molculas (Robyt y Whelan, 1968).

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0,15 120
Actividad (U.I./mL)

% Actividad relativa
A B
0,12
90

0,09
60
0,06

30
0,03

0,00 0
0 5 10 15 20 2 4 6 8 10
Tiempo de reaccin (min) pH

120 120
% Actividad relativa

% Actividad relativa
C D
90 90

60 60

30 30

0 0
0 15 30 45 60 0 15 30 45 60
Temperatura (C) Temperatura (C)

Figura 1. Actividad glucgeno sintasa del tejido del manto de M. galloprovincialis. (): forma I; (o): forma D. (A): lineali-
dad de la reaccin enzimtica; (B): efecto del pH sobre la actividad; (C): efecto de la temperatura sobre la actividad;
(D): estabilidad trmica.

Determinacin de la termoestabilidad puede alcanzar temperaturas crticas de hasta 38-


40 C en el interior de las valvas (Bayne, Widows y
La estabilidad de la enzima fue determinada co- Thompson, 1976). Teniendo esto en cuenta, los re-
mo su actividad residual despus de una hora de in- sultados mostrados parecen indicar que la tempe-
cubacin a cada temperatura indicada. Los resulta- ratura podra constituir otro importante factor de
dos obtenidos se muestran en la figura 1D. Las dos control de esta enzima en el manto de Mytilus y su
formas de la glucgeno sintasa (I y D) presentan di- significado adaptativo deber ser analizado en pos-
ferentes mrgenes de estabilidad trmica. La forma teriores trabajos.
I conserva una alta actividad entre 30-40 C y la for-
ma D entre 20 y 30 C.
Aunque los ejemplares de mejilln utilizados en Propiedades cinticas de la forma
este estudio proceden de sistemas de cultivo (bate- independiente de G6P (forma I)
as) constantemente sumergidos, el hbitat natural
de esta especie es la zona intermareal, donde prin- Como primera aproximacin al estudio cintico
cipalmente se recoge la semilla que es encordada de la forma desfosforilada e independiente de G6P
para su engorde en batea. En determinadas condi- de la enzima de Mytilus, se analiz el efecto de la
ciones de bajamar y exposicin solar, el mejilln concentracin de su sustrato, UDPG. La represen-

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tacin de Michaelis-Menten de velocidad de reac- ma dependiente del efector (D) con una actividad
cin (V) frente a la concentracin del sustrato residual en ausencia del mismo y afinidad muy ba-
([UDPG]) muestra una clara interrupcin o quie- ja por el sustrato (alta Km), y no tanto reflejar la
bro para el valor 4 mM (figura 2A). Igualmente, la existencia de ms de una forma I de la GS. Algo si-
representacin de Lineweaver-Burk de dobles rec- milar est descrito para la enzima glucgeno fosfo-
procos (1/V frente a 1/[S]) no se ajusta a una rec- rilasa del manto de Mytilus, cuya forma dependien-
ta, sino que, a concentraciones por encima y por te de AMP, en ausencia de este activador, muestra
debajo de 4 mM, parece seguir dos cinticas dife- una actividad mnima y la prdida de los efectos
rentes (figura 2B). Esta tendencia indica la presen- alostricos y cooperativos (San Juan et al., 1993).
cia de dos o ms formas enzimticas en la prepara-
cin, con distintas velocidades mximas y constantes
de afinidad. La diferencia entre las dos partes de la Propiedades cinticas de la forma
representacin se acenta con el aumento de la di- dependiente de G6P (forma D)
ferencia entre los valores de sus variables cinticas
(Segel, 1993). La forma fosforilada y dependiente de G6P de la
A concentraciones por debajo de 4 mM de GS de manto de Mytilus, tambin presenta una pe-
UDPG la representacin de dobles recprocos no culiar cintica no lineal respecto a su sustrato
es lineal, indicando cooperatividad e inhibicin UDPG. En este caso, se observa tambin una inte-
por sustrato. Para el clculo de las constantes cin- rrupcin o quiebro para el valor 4 mM de UDPG
ticas en este rango de concentraciones se utilizaron (figura 3A) y la representacin de Lineweaver-Burk
las representaciones de 1/V frente a 1/[S]2 y la re- de dobles recprocos (1/V frente a 1/[S]) no se
presentacin de Hill (log V/(Vmx  V) frente a ajusta a una recta, sino que presenta dos tramos
log [UDPG]) (Segel, 1993), obteniendo valores de discontinuos (figura 3B). De forma similar a lo ya
K0,5 de 1,9 mM y Vmx de 0,013 UI y valores de S0,5 discutido, esta tendencia podra indicar la presen-
de 2,3 mM, respectivamente (figura 2C,D). Este va- cia de ms de una forma D o bin la coexistencia
lor de la constante de afinidad es similar a los cita- en el extracto de las dos formas de la enzima: de-
dos en la bibliografa para la forma independiente pendiente e independiente del efector G6P.
(I) de la glucgeno sintasa de M. edulis (Cook y La representacin de Lineweaver-Burk a con-
Gabbott, 1978). El clculo del ndice de Hill (nH) a centraciones de UDPG inferiores a 4 mM tampoco
partir de la representacin de log V/(Vmx  V) es lineal (figura 3B), y para el clculo de sus cons-
frente a log [UDPG] arroja valores de 1,9 (figura tantes cinticas se recurri a su transformacin en
2D), mientras que algunos autores citan valores lineal mediante la representacin de 1/V frente a
cercanos a 1 para la forma I de la GS (Roach, 1/[S]2 (Segel, 1993) (figura 3C). De esta forma se
Takeda y Larner, 1976). Segn Segel (1993), este obtuvieron los valores 0,040 UI/ml de Vmx y 0,9
ndice indica el nmero de sitios de unin del sus- mM de K0,5 para la UDPG, que se encuentran den-
trato por molcula de enzima, por lo que un valor tro del rango en el que varan los descritos en la bi-
de 1,9 sugiere que la forma I de la GS de manto de bliografa para la forma D (Passoneau, Schwartz y
Mytilus presenta un segundo sitio de unin dife- Rottenberg, 1975; Huang y Robinson, 1976). La re-
rente del centro activo. presentacin de Hill (figura 3D) corrobora el valor
A concentraciones de UDPG superiores a 4 M, la de K0,5, con un valor de S0,5 de 1,3 mM. Sin embar-
representacin parece seguir una cintica michae- go, en este caso, el ndice nH presenta un valor de
liana, y las variables Km y Vmx, calculadas a partir 0,9, indicativo de un nico sitio de unin para la
de la representacin de Lineweaver-Burk, fueron UDPG sobre la estructura de la enzima. La compa-
11,65 mM y 0,015 UI respectivamente. Este valor de racin de este valor del ndice nH con el obtenido
Km es muy superior a los citados en la bibliografa, para la forma no fosforilada e independiente de
que se encuentran entre 0,113 y 2,8 mM G6P (forma I) (nH  1,9) parece sugerir que la fos-
(Passoneau, Schwartz y Rottenberg, 1975; Cook y forilacin de la enzima conlleva un enorme au-
Gabbott, 1978). mento de la afinidad del sitio efector por la G6P, y
En el caso de la enzima de Mytilus, este compor- que en la forma no fosforilada independiente de la
tamiento podra indicar la presencia de una forma G6P el sitio secundario de unin de la UDPG des-
totalmente independiente del efector (I) y otra for- crito podra corresponderse con el sitio del efector

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0,020 400

1/V (U.I./ml)
V (U.I./ml)

A B
0,016
300

0,012
200
0,008

100
0,004

0,000 0
0 1 2 3 4 5 6 7 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2
[UDPG] mM 1/[UDPG] mM

400 0,9

lo g V/(Vma x-V)
1/V (U.I./ml)

C D
0,6
300
0,3

200 0,0

-0,3
y = 1,8594x - 0,601
100
y = 256,02x + 77,236 -0,6 R2 = 0,9972
2
R = 0,9702
0 -0,9
0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 1,2 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8
2 log [UDPG] mM
1/[UDPG] mM

Figura 2. Cintica de la forma independiente de G6P (forma I) de la enzima glucgeno sintasa del tejido del manto de M.
galloprovincialis respecto al sustrato UDPG. (A): representacin de Michaelis-Menten (V frente a [UDPG]); (B):
representacin de Lineweaver-Burk (1/V frente a 1/[UDPG]); (C): representacin de 1/V frente a 1/[UDPG]2 a
concentraciones inferiores a 4 mM; (D): representacin de Hill (log V/(Vmx  V) frente a log [UDPG]).

alostrico. La Vmx de esta forma es aproximada- Mytilus. Para ello se midi la actividad enzimtica a
mente cuatro veces mayor que la de la forma I, y la saturacin de sustrato (5 mM) y variando la con-
afinidad por su sustrato es dos veces mayor, a pesar centracin de G6P entre 4 y 14 mM. Este rango de
de estar considerara en vertebrados como una for- concentraciones de G6P fue determinado a partir
ma inactiva o menos activa (forma b). de las concentraciones utilizadas por otros autores
La glucgeno sintasa es una enzima polimrica para la medida de la forma D (Passoneau, Schwartz
cuya dependencia del efector G6P viene determi- y Rottenberg, 1975; Cook y Gabbott, 1978; Hanigan,
nada por la modulacin covalente por fosforilacin Donahue y Masaracchia, 1985). Se observ un efec-
(Killilea y Whelan, 1976; Huang y Cabib, 1974; to inhibidor a concentraciones superiores a 11 mM
Cook y Gabbott, 1978). En algunos organismos se de G6P no representado en las grficas. Entre 4
han descrito formas parcialmente fosforiladas, con y 10 mM de G6P, la cintica respecto al efector
caractersticas de actividad intermedias entre la for- es ligeramente sigmoidal, y la representacin de
ma fosforilada y la no fosforilada (Brown y Larner, Lineweaver-Burk se aleja de la linealidad (figu-
1971; Issa y Mendicino, 1973; Lin y Segal, 1973). Se ra 4A,B).
analiz tambin la dependencia y el efecto del mo- A partir de la representacin de 1/V frente a
dulador G6P sobre la forma D de la enzima de 1/[S]2 se obtuvieron los valores 0,06 UI de Vmx y

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Y. Ruiz Muoz, P. Surez Alonso y F. San Juan Serrano Glucgeno sintasa de Mytilus galloprovincialis

0,06 140
V (U.I./ml)

1/V (U.I./ml)
A B
105
0,04

70

0,02
35

0,00 0
0 1 2 3 4 5 6 0,0 0,6 1,2 1,8 2,4
[UDPG] mM 1/[UDPG] mM

0,8

log V/(Vmax-V)
140
1/V (U.I./ml)

D
C
0,4
105

0,0
70

35 -0,4
y = 20,722x + 26,935 y = 0,8783x - 0,1993
R2 = 0,9718 2
R = 0,7792
0 -0,8
0,0 1,4 2,8 4,2 -0,8 -0,4 0,0 0,4 0,8
2
1/[UDPG] mM log [UDPG] mM

Figura 3. Cintica de la forma dependiente de G6P (forma D) de la enzima glucgeno sintasa del tejido del manto de
M. galloprovincialis respecto al sustrato UDPG en presencia de 10 mM del efector G6P. (A): representacin de Michaelis-Menten
(V frente a [UDPG]); (B): representacin de Lineweaver-Burk (1/V frente a 1/[UDPG]); (C): representacin de 1/V frente
a 1/[UDPG]2; (D): representacin de Hill (log V/(Vmx  V) frente a log [UDPG]).

5,6 mM de K0,5 (figura 4C). La representacin de AGRADECIMIENTOS


Hill ofrece el valor 5,2 de S0,5, confirmando as el
obtenido a partir de la representacin anterior. El Este trabajo est incluido dentro de un proyecto
valor del ndice nH es 2,3 (figura 4D), indicando subvencionado por la Xunta de Galicia (PGI-
ms de un sitio de unin para el efector sobre la es- DIT03RMA30102PR) y la Universidad de Vigo.
tructura de la enzima. Este sitio de unin secunda-
rio de la G6P podra corresponder al centro activo,
de forma que a altas concentraciones desplazara al BIBLIOGRAFA
sustrato, provocando un efecto inhibidor. Estos da-
tos sugieren que la G6P desempea un papel im- Bayne, B. L., J. Widdows y R. J. Thompson. 1976.
portante en la activacin y regulacin de la activi- Physiological integrations. En: Marine Mussels: their
dad glucgeno sintasa de este organismo. No Ecology and Physiology. B. L. Bayne (ed.): 261-299.
obstante, estos resultados respecto a la enzima glu- Cambridge University Press. Londres.
Brown, N. E. y J. Larner. 1971. Molecular characteristics of
cgeno sintasa del manto de Mytilus debern ser
the totally dependent and independent forms of glyco-
confirmados tras la separacin y purificacin de ca- gen synthase of rabbit skeletal muscle. I. Preparation and
da una de las posibles formas existentes, con un es- characteristics of the totally glucose-6-phosphate depen-
tudio ms profundo a escala molecular. dent form. Biochim. Biophys. Acta 242: 69-80.

18 Bol. Inst. Esp. Oceanogr. 23 (1-4). 2007: 11-20


Y. Ruiz Muoz, P. Surez Alonso y F. San Juan Serrano Glucgeno sintasa de Mytilus galloprovincialis

0,06 60
V (U.I./ml)

1/V (U.I./ml)
A B
45
0,04

30

0,02
15

0,00 0
2 4 6 8 10 12 0,00 0,06 0,12 0,18 0,24 0,30
[G6P] mM 1/[G6P] mM

60 0,9
1/V (U.I./m)

log V/(Vmax-V)
C D
0,6
45
0,3

30 0,0

-0,3
y = 2,3468x - 1,674
15 2
y = 548,35x + 17,256 R = 0,9338
-0,6
2
R = 0,9587
0 -0,9
0,0 0,0 0,0 0,1 0,1 0,5 0,7 0,8 1,0 1,1
1/[G6P]2 mM log [G6P] mM

Figura 4. Cintica de la forma dependiente de G6P (forma D) de la enzima glucgeno sintasa del tejido del manto de M.
galloprovincialis respecto al efector G6P a saturacin de sustrato (UDPG) (5 mM). (A): representacin de Michaelis-Menten
(V frente a [G6P]); (B): representacin de Lineweaver-Burk (1/V frente a 1/[G6P]); (C): representacin de 1/V frente a
1/[G6P]; (D): representacin de Hill (log V/(Vmx  V) frente a log [G6P]).

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