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Las tcnicas de recoleccin y transferencia embrionaria en los caballos

se desarrollaron en los ltimos aos de 1970. ltimamente, la tecnologa


de reproduccin asistida, que ya se aplica con xito en el ganado,
tambin ha progresado considerablemente en la especie equina.
Los grandes avances en el rea, como son la fertilizacin in vitro, la
clonacin y la inyeccin intracitoplasmtica de espermatozoides tienen
en comn la necesidad de utilizar ovocitos de alta calidad o
capacidad de desarrollo, factor que es clave para lograr una alta
eficiencia de estas tecnologas.
Entre un 50 y 70% de los ovocitos obtenidos son aptos para la fertilizacin
in vitro, alrededor del 90% de estos son fertilizados y entre el 20 y 40%
alcanzan el estadio de blastocisto. Por lo tanto, mantener una fuente
constante de ovocitos de alta capacidad de desarrollo, alto valor
gentico y mxima calidad sanitaria es uno de los puntos claves para
garantizar un sistema comercial de produccin in vitro de embriones.
El 95% de los embriones transferidos a nivel mundial son producto de
superovulacin; sin embargo, el nmero de embriones producidos por
tratamiento superovulatorio es altamente variable dependiendo de la
raza de la donante, de los tratamientos superovulatorios previos, de la
hormona superovulatoria a utilizar y del da del ciclo en que se inicie el
tratamiento, entre otros.

La obtencin de ovocitos de una hembra viva mediante la aspiracin


folicular transvaginal representa la alternativa ms viable para lograr
satisfacer las necesidades de ovocitos de un sistema de produccin de
embriones. Esto es probablemente debido a que combina lo mejor de
diversas tecnologas como la superovulacin, la ultrasonografa y la
produccin in vitro de embriones. Adems, la aspiracin folicular
transvaginal es una tcnica confiable, poco invasiva y con gran
repetibilidad.

SUPEROVULACIN:

La tcnica de superovulacin en la yegua, consiste en causar la


ovulacin de un mayor nmero de folculos de lo normal.
Econmicamente, sera muy interesante aumentar la tasa de ovulacin
de las yeguas donantes, en un intento de aumentar la tasa de recogida
de embriones por lavado uterino. Sin embargo, esta tcnica tiene varias
limitaciones en las yeguas, siendo pocas las que responden, siendo el
tratamiento muy caro y sobre todo, porque se disminuye la viabilidad de
los embriones obtenidos. En el bovino, ovino y otros, el tratamiento con
la eCG (PMSG) o gonadotropina srica de yegua gestante, o el
tratamiento con hormona folculo-estimulante (FSH) siempre induce la
ovulacin mltiple de las hembras. Sin embargo, la especie equina es
muy resistente al tratamiento con eCG .
A continuacin se describen los principales tratamientos de
superovulacin que se han ensayado en yeguas.

Hormona liberadora de gonadotropina (GnRH).


Esta hormona se ha descrito como capaz de inducir la ovulacin en las
yeguas anestro, fuera de la temporada de reproduccin. Sin embargo,
cuando las yeguas estn cclicas, esta hormona no tiene ninguna
eficacia en el la induccin de la ovulacin mltiple

El extracto de pituitaria equina (EPE)


La EPE proviene de hipfisis de matadero. Se trata de un extracto crudo
que contiene de 6% a 10% de LH y de 2% a 4% de FSH. La respuesta de
las yeguas cclicas depende de su poblacin folicular al comienzo del
tratamiento. Idealmente, la administracin de la EPE o FSH equina (se
detalla a continuacin) se inicia al principio de una onda folicular, antes
de que aparezcan folculos dominantes. As, si el tratamiento se inicia el
da 5 del ciclo, la respuesta ser mejor que si comienza a los 12 das
despus de la ovulacin. Esta respuesta se puede mejorar mediante
monitorizacin ecogrfica de los ovarios, con el fin de identificar las
yeguas que tengan en un momento dado todos sus folculos con un
dimetro inferior a 25 mm. Tambin se pueden administrar soluciones
oleosas de progesterona y estradiol que disminuyan el desarrollo
folicular antes del inicio del tratamiento con EPE. Es posible mejorar la
respuesta al tratamiento cuando se administra 2 veces al da en lugar
de una. La mejor opcin sera la administracin de 25 mg dos veces al
da de la EPE. La eficacia en las yeguas en anestro profundo es bastante
baja (en torno a un 20%) mientras que en las yeguas en el perodo de
transicin, se obtiene casi un 90% de efectividad con un tratamiento de
12 das. Al parecer, los folculos de yeguas en anestro profundo no
disponen de suficientes receptores de FSH para responder al EPE. Por
otro lado, la cantidad de FSH y LH equina inyectada no siempre se sabe
y la EPE no est disponible comercialmente.

Sin embargo se ha llegado a comercializar una FSH equina (e FSH)


purificada a partir de estos extractos. Esta eFSH produce un aumento de
las tasas de ovulacin y la recogida de de embriones de yeguas
donantes.

FSH equina (eFSH)


Los estudios iniciales sobre el uso de FSH utilizaron la FSH porcina (FSHP)
obtenindose tasas de ovulacin de un promedio de 1,7 0,6 ovocitos
frente a 1,0 en el grupo de control. Recientemente, ha aparecido en el
mercado una FSH equina comercial. En los ltimos aos, se ha
incrementado el uso de esta hormona en los programas de TE. Sin
embargo, una vez ms, su efecto no es siempre coherente y predecible.
En algunos casos, las yeguas tratadas pueden ovular un solo folculo,
mientras que en otros la respuesta folicular y la tasa de ovulacin puede
ser mayor que las deseadas. En la actualidad, el protocolo
recomendado en yeguas es la administracin de 12,5 mg eFSH,
intramuscular, 2 veces al da, a partir del 5 a 7 das despus de la
ovulacin, sin ninguna verificacin de la tamao de los folculos, y la
administracin de prostaglandinas el segundo da de la terapia con
eFSH para producir la luteolisis Por ltimo, un agente la induccin de la
ovulacin se administra cuando el desarrollo de folculos es de un
dimetro menos de 35 mm, y se suspende el tratamiento con e FSH ese
mismo da. Hace poco se hizo una modificacin de este protocolo,
incorporando un periodo de descanso al final del tratamiento con eFSH.
Se tratara de un intervalo de tiempo entre el final de la terapia con
eFSH y la induccin de la ovulacin, durante la cual no se administra
ninguna gonadotropina. Este perodo se ha incorporado con la
intencin de reducir la cantidad de eFSH utilizada y para prevenir la
sobrestimulacin de los ovarios.

PUNCIN FOLICULAR GUIADA POR MEDIO DE ULTRASONOGRAFIA:

Mejor conocida por sus siglas, OPU (Ovum Pick-up), la aspiracin


folicular transvaginal es una tcnica mediante la cual los ovocitos
inmaduros son recolectados de los folculos en los ovarios de una yegua
viva por aspiracin guiada mediante ultrasonografa a travs de la
pared vaginal. Es un mtodo que se puede repetir cada 10-15 das y no
interfiere con la actividad normal del donante incluso si es un sujeto en
el entrenamiento deportivo. Se puede realizar en cualquier poca del
ao, incluso fuera de la temporada de cra.

El Ovum Pick Up, est dirigido a:

- Yeguas con problemas reproductivos (enfermedades de los


ovarios, trompas y tero) tambin vinculadas a la vejez.
- Yeguas con antecedentes de abortos involuntarios recurrentes.

- Yeguas en deportes que no quieren impregnar.


- Yeguas desde las que desea mas potros o mas embriones.
- Sementales con subfertilidad.

Para llevar a cabo esta tcnica de aspiracin folicular in vivo se requiere


contar con un equipo de ultrasonografa, un transductor sectorial, una
bomba de aspiracin y un sistema de gua de la aguja. La sonda
ultrasonogrfica para OPU ha sido construida con la finalidad de que
permita la manipulacin de la aguja desde el exterior del animal y que
el transductor est en contacto con los ovarios; de ese modo, el
extremo de la aguja pueda ser visualizado cuando penetra dentro de
los folculos que sern aspirados. La aguja est conectada a la bomba
de vaco por medio de una tubera plstica o de silicona, lo que permite
que el contenido folicular sea vaciado directamente al filtro, que es
similar al utilizado para la recoleccin de embriones.

Tcnica:

Durante el aspirado folicular transvaginal, es reflejado mediante


ultrasonido. Se requiere una maquina ultrasonido, una sonda y un fiador.
Se pueden usar una sonda lineal o curvilnea para la recoleccin de
oocitos. Cuando utilizamos la lineal tenemos que colocar la cara de la
sonda dorsalmente. El ovario estar colocado con el folculo
preovulatorio en el extremo posterior de la cara de la sombra. Con la
sonda curvilnea el ovario se mantendr anterior a la sonda. Para
hembras con vaginas cortas la curvilnea suele ser ms fcil de usar ya
que la distancia entre la cara de la sonda y el fiador es ms corta.

Antes de la aspiracin de oocitos, se puede administras flunixin


meglumine si queremos dar analgesia. Para el proceso de recoleccin,
la hembra debe estar colocada en un potro de contencin, la cola
sujeta y cubierta, el recto evacuado y el perineo lavado. Se seda con
una combinacin de butorfanol y xilacina o detomidina, dependiendo
del individuo. Para reducir las contracciones del recto, administrar
Buscapina. Las hembras son inmovilizadas durante el proceso de
recoleccin de oocitos para minimizar movimientos. La existencia de
aire en el recto hace ms dificultoso el procedimiento y potencia los
riesgos en la hembra, por ello, el veterinario tiene que prevenir la
entrada de aire en el recto. Un tubo blando en forma de Y unido a
una jeringa de 500 ml puede ayudar a succionar rpidamente el aire
del lumen rectal.

Antes de introducir la sonda, hay que administrar un lubricante no txico


para mejorar el contacto con la pared vaginal. Sin meter aire en la
vagina, la sonda se desplaza por la vagina lateral al crvix e ipsilateral al
folculo preovulatorio. Las manipulaciones transrectales se utilizan para
posicionar el folculo con el pex yuxtapuesto al fiador. La cara ventral
del ovario puede ser palpada para evitar ser puncionado el ligamento
ancho, el oviducto y la fosa ovulatoria. Se pueden usar agujas de una

sola luz, sin embargo, agujas de doble luz 12G son las que usan
normalmente para la recoleccin de oocitos en yeguas. La aguja se
avanza a travs del fiador para puncionar las paredes foliculares. La
succin puede aplicarse usando jeringas largas o un set de bombas a
presin de 150 mmHg. Las agujas de doble luz tienen un tubo de
entrada de flujo y otro de salida, por lo que el folculo puede ser lavado
con 50-150 ml de medio de flushing a la vez que se aspira el contenido
folicular.

Aproximadamente, 10 IU/ml de heparina se pueden aadir al flushing


medio para prevenir la coagulacin. Durante la aspiracin del
contenido folicular, el medio puede ser alternativa o simultneamente
recolectado o inyectado, mientras el folculo es masajeado por el recto.
Unos 30 ml de lquido amarillo folicular es inicialmente recolectado del
folculo preovulatorio. Durante el lavado folicular, el medio, a veces,
llega a ser sanguinolento al alterar la vascularizacin del folculo.

Antes de la recoleccin del oocito, el equipo es conservado a 38C, ya


que el fro del equipo puede afectar potencialmente el desarrollo del
oocito. El medio y el lquido folicular es depositado en una placa, y se
realiza un examen riguroso para localizar el oocito. El aspirado no es
filtrado si el complejo cmulus-oocito est pegajoso y con tendencia a
adherirse al filtro. El oocito equino tiene aproximadamente un dimetro
de 160 nanmetros, sin embargo, el complejo cmulus-oocito puede
llegar a medir 1 ml de dimetro, por lo que ser fcil identificarlo y se
podr ver normalmente sin necesidad de estereoscopio. Las clulas del
cmulus aparecen como una masa translcida en la solucin
sanguinolenta del flushing. Aunque las clulas de la granulosa aparecen
similares a las del complejo del cmulus, tienen diferencias
caractersticas de textura y color. El oocito es gris con variaciones, con
el complejo del cmulus habr un anillo de clulas (corona radiada)
alrededor del oocito. Despus de la identificacin del complejo
cmulus-ocito, se realiza el lavado en un medio para quitar posible
sangre y restos.

En general, la recoleccin de oocitos de folculos maduros es


satisfactoria con experiencia en la tcnica.

Cuando la recoleccin de oocitos se realiza 39 horas despus de la


administracin de un anlogo de GnRH, se obtienen ms oocitos de los
folculos maduros significativo que si la recoleccin se hiciera de folculos
inmaduros (79% vs 18% respectivamente). El nmero de oocitos
recolectados por folculo no va a variar si son de 22 a 33 horas despus
de la administracin de hCG (75% y 82% respectivamente) en la
aspiracin transvaginal, en variaciones de 24-35 horas despus de
hCG (66% y 73% respectivamente) usando la aspiracin flank.

Con personal con experiencia limitada en la tcnica OPU, la


recoleccin de oocitos va a ser significativamente inferior, sin embargo,

si sta tcnica es realizada por personal con experiencia tendr un 70%


de xito. Estas diferencias corresponden con la habilidad de los clnicos
a la hora de la manipulacin de los folculos durante el procedimiento.

BIBLIOGRAFA:

- Libro: Equine reproduction, segunda edicin, autores: Angus


O.McKinnon, Edward L.Squires, Wendy E.Vaala y Dickson D.Varner.
Editorial: Wiley-Blackwell. USA 2011.
- Libro: Current Therapy in Equine Reproction, Autores: Juan
C.Samper, Jonathan F.Pycock y Angus O.McKinnon. Editorial:
Saunders Elsevier. USA 2007.
- Artculo: Transferencia de embriones y biotecnologa asociadas
en la especie equina. Autor: Ian Gordon.
- Artculo: Aspiracin folicular transvaginal. Autor: Hector Nava-
Trujillo y Hugo Hernndez Fonseca.

Autores: Anabel Navarro Rodrguez/Mercedes Garca Marchal


EQUISAN Veterinaria Equina Integral