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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
MANUAL DE LABORATORIO DE
MICROBIOLOGA
AUTORES:
M.E.C. ANA BERTHA ESCOBEDO LPEZ.
M.S.P. CARLOS CABRERA MALDONADO.
M.S.P. MARA DE LA CRUZ MENESES SNCHEZ.
M. en C. ALMA LPEZ GARCA.
M. en C. ALEJANDRO CSAR RUZ TAGLE.
M.S.P. CLAUDY LORENA VILLAGRN PADILLA.
2013
1
BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
ndice
Prctica 2 Microscopio 6
Bibliografa 44
2
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FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
Prctica No. 1
Observacin de grupos microbianos
Introduccin
Bacteriologa (bacterias).
Micologa (hongos)
Ficologa (algas).
Protozoologa (protozoarios).
Virologa (virus).
Hongos: Son clasificados dentro del reino Fungi, siendo organismos multinucleados y
eucariotes, sus nutrientes los obtienen por absorcin. En cuanto a su tamao es variable,
presentan dos tipos de crecimiento: filamentoso y levaduriforme.
3
Los hongos filamentosos tienen como unidad funcional a la HIFA, el conjunto de hifas
es denominado MICELIO, el cual puede estar en contacto con el medio y se le denomina
VEGETATIVO, o bien por encima del sustrato denominndose micelio AREO. Estos
hongos tienen aspecto algodonoso o aterciopelado con crecimiento radial.
Objetivo
Observar diferentes grupos microbianos, detectando forma y agrupacin, usando
microscopa ptica.
Material
Preparaciones fijas de bacterias, hongos y protozoarios.
Placas de cultivo con crecimiento de hongos y bacterias.
Microscopio ptico.
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Desarrollo
Hacer la observacin microscpica y macroscpica de cada preparacin proporcionada y
dibuja tus observaciones.
Cuestionario
1. Qu caractersticas microscpicas diferencian a los hongos de las bacterias?
2. Cul es el tamao promedio de cocos, bacilos, levaduras y virus?
3. Menciona 5 beneficios de los microorganismos para la humanidad.
4. Menciona 5 consecuencias perjudiciales de los microorganismos para la humanidad.
5. Menciona en forma ascendente en tamao, los organismos observados.
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Prctica No. 2
Microscopio
Introduccin
El microscopio ptico es un instrumento que contiene una o varias lentes que permiten
obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por refraccin. El microscopio
ptico puede ser monocular, consta de un solo tubo y para la observacin se utiliza un solo
ojo. El binocular es cuando posee dos tubos y la observacin se hace con los dos ojos.
a) El sistema mecnico constituido por una serie de piezas que permiten el movimiento
para el enfoque del objeto: brazo, base o pie, platina, pinzas de sujecin, tornillo
macromtrico, tornillo micromtrico y tubo.
b) El sistema ptico comprende el conjunto de lentes que permiten el aumento de las
imgenes que se observan a travs de ellas formado por el ocular y objetivos.
c) El sistema de iluminacin comprende una lmpara incandescente de tungsteno
sobrevoltada, el espejo, el diafragma y el condensador; dispuestos de tal manera que
ilumine la preparacin u objeto que se va a observar en el microscopio de la manera
adecuada.
6
La observacin por microscopio es el mtodo ms comn utilizado tanto para la
deteccin directa de microorganismos en las muestras mdicas como para la caracterizacin
de microorganismos desarrollados en los cultivos. La microscopa se define como el empleo
de un microscopio para aumentar de tamao objetos demasiado pequeos que no se pueden
observar a simple vista, de modo que puedan verse con facilidad.
El mtodo empleado para procesar las muestras del paciente est determinado por el
tipo y la fuente corporal de la muestra. Las coloraciones o los colorantes especficos aplicados
a las muestras, combinados con determinados mtodos de microscopa, pueden ayudar a
detectar los agentes etiolgicos de una manera rpida. La microscopia tambin desempea un
papel clave en la caracterizacin de microorganismos cultivados en el laboratorio.
Objetivos
a) Realizar una tincin simple de bacterias procedentes de distintas muestras naturales.
b) Realizar dos tipos de fijaciones bacterianas y saber en qu casos se recomienda una u
otra.
c) Practicar con el microscopio al mximo aumento y con el correcto empleo del aceite
de inmersin.
Material
Muestras bacterianas de origen natural: yogur, vinagre, sarro dental, suelo, etc.
Colorantes para tincin:
Cristal violeta
Safranina
Azul de metileno
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Microscopio y aceite de inmersin
Desarrollo
Bacterias del yogurt
1. Realizar el frotis disolviendo una mnima porcin de yogur en una pequea gota de
agua.
2. Fijar con metanol para eliminar parte de la grasa.
3. Teir con un colorante cualquiera de los arriba indicados durante 1-2 minutos.
4. Observar al mximo aumento del microscopio.
5. Realiza los dibujos de cada observacin
8
Cuestionario:
1. Qu tipos de microscopio existen, en qu se fundamenta cada uno de ellos y cul es
su utilidad?
2. En qu objetivo se usa el aceite de inmersin y cul es su funcin?
3. Cul es la diferencia entre una preparacin en fresco y una preparacin fija?
4. Qu fin tiene la fijacin de muestras al realizar un frotis bacteriano?
5. Investiga las diferentes morfologas que presentan las clulas bacterianas y sus
agrupaciones.
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Prctica No. 3
Preparacin de material y medios de cultivo
Introduccin.
El material del laboratorio de Microbiologa requiere de una preparacin especial, deber ser
estril, para que no ofrezca un riesgo de contaminacin de la(s) muestra(s) ya que de ellos
depender el xito o fracaso del estudio microbiolgico a realizar.
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seco), la filtracin, las radiaciones, ultracentrifugacin y ultrasonido. Dependiendo de la
naturaleza del material (ya sea termorresistente o termolbil) se deber elegir el mtodo de
esterilizacin.
Los medios de cultivo con base a su contenido de material gelificante pueden ser:
lquidos, semislidos y slidos (los lquidos carecen de material gelificante). En
Microbiologa el material gelificante ms utilizado es el agar, qumicamente es un
polisacrido obtenido a partir de algas marinas, presentando entre sus ventajas que la mayora
de los microorganismos no lo utilizan como nutriente. La presencia y cantidad de ste permite
diferenciar los medios semislidos (0.2-0.5% de agar), slidos (1 a 2% de agar) y lquido que
carece de agar.
El medio de transporte tiene como objetivo transportar los especmenes que contienen
a los microorganismos, del sitio de la toma de la muestra hasta el laboratorio donde va a
efectuarse el estudio, aseguran la viabilidad de los microorganismos desde el momento de la
toma de la muestra hasta su siembra en el laboratorio.
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transporte y conservacin de especmenes para cultivos de diversos microorganismos como
estreptococos, enterobacterias, Haemophilus y otros microorganismos exigentes. La siembra
debe efectuarse no ms de las 36 h siguientes a la obtencin de la muestra. Otro medio
utilizado para este fin es el medio de Cary Blair que se utiliza primordialmente en el
transporte de coprocultivos, debido, a que la viabilidad de las especies de Shigella es superior
que en otros medios de transporte.
Objetivo
Material
Algodn
Cajas Petri estriles
Matraz Erlenmeyer
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Pipetas
Mechero
Autoclave
Medios de Cultivo en polvo
Probeta
Balanza
Esptula o cuchara
Parrilla de calentamiento
Guantes para calor
Desarrollo
1. Preparar diferentes materiales que se utilizan para el aislamiento de los
microorganismos.
2. La forma en la cual se preparan los medios de cultivo viene indicada en cada etiqueta
y depende del fabricante. Se recomienda lo siguiente:
a) Utilizar un recipiente de volumen 2.5 veces mayor al que se va a preparar.
b) Al medio se le agrega aproximadamente la mitad del agua total a utilizar dejndolo
reposar unos 15 minutos.
c) Si es necesario calentar, el calentamiento debe ser paulatino y agitando continuamente,
evitar el calentamiento prolongado.
Proceso de esterilizacin
1. Verificar el nivel de agua de la autoclave.
2. Introducir al autoclave los medios de cultivo perfectamente cubiertos, (en el caso de
esterilizar medios de cultivo en tubos con tapn de rosca, estos deben estar tapados
flojamente y cerrados perfectamente despus de esterilizar).
3. Cerrar la tapa de la autoclave y esperar que se sature de aire caliente antes de poner
vlvula de presin.
4. Esterilizar a 121C (15 lbs de presin) por 15 min.
5. Deben incluirse controles de esterilizacin para autoclave.
6. Compuestos termolbiles no deben ser esterilizados en autoclave.
Cuestionario
1. Qu ocurrira si los medios de cultivo no se esterilizaran tras su preparacin?
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2. Qu es y cmo se lleva a cabo la esterilizacin por calor hmedo y por calor seco?
4. Qu es un bioindicador de esterilidad?
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Prctica No. 4
Tcnicas para recuento de bacterias
Introduccin
Si se pretende conocer el nmero total de microorganismos presentes en una muestra lquida
o slida, es recomendable que se encuentren sta ltima en forma lquida y homogenizada,
adems de utilizar un mtodo apropiado. Es importante sealar que el nmero no guarda
relacin con el tipo de microorganismos patgenos, por lo que no puede usarse como ndice
de su presencia y slo debe considerarse como un indicador de las caractersticas higinicas
de la muestra.
Objetivo
Realizar el aislamiento de microorganismos a partir de muestras problema utilizando
el mtodo de diluciones y vertido en placa.
Material
Muestra de agua o de alimento.
Mechero bunsen.
3 Matraces conteniendo 500 mL de agar nutritivo estril cada uno.
30 Pipetas de 10 mL o puntas azules estriles y micropipeta con capacidad de 1000 L.
20 Tubos conteniendo 9 mL de solucin salida isotnica estril (diluyente).
30 Cajas Petri estriles desechables.
Benzal
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Algodn
Marcador de tinta permanente
Desarrollo
1. Colectar 100 mL de muestra en un frasco estril.
2. Limpiar el rea de trabajo con benzal y algodn.
3. Colocar en una gradilla 5 tubos conteniendo 9 mL de solucin salina estril
(diluyente) y numerarlos.
4. Tomar 1 mL de la muestra en condiciones de esterilidad y transferirlo a un tubo que
contenga 9 ml de diluyente, as se obtiene una dilucin 10-1, homogenizar el
contenido.
5. Transferir 1 mL a un tubo de dilucin que contenga 9 mL de diluyente, agitarlo
vigorosamente para homogenizar la muestra y obtener la dilucin 10-2.
6. Realizar sucesivamente las siguientes diluciones, transfiriendo 1 mL de la muestra a
otro tubo con 9 mL de diluyente para obtener las diluciones 10-3, 10-4, 10-5, 10-6 como
se indica en el esquema.
7. Pipetear 1 mL de cada una de las diluciones realizadas y transferirlos por separado a
una caja Petri estril vaca.
8. Adicionar inmediatamente en las cajas Petri de 10 a 15 mL de agar nutritivo
mezclando el inculo con el medio fundido, con movimientos rotatorios a la derecha, a
la izquierda y de arriba abajo.
9. Dejar gelificar las placas.
10. Rotular las placas indicando la dilucin que contienen y el tipo de muestra, incluir su
nombre as como la fecha de ingreso y de salida del material.
11. Colocar las placas en la estufa bacteriolgica y dejarlas durante 24 h a 37 C.
12. Limpiar nuevamente el rea de trabajo con benzal y algodn.
13. Evaluar el crecimiento a las 24 h, hacer el recuento de las unidades formadoras de
colonias (colonias) con ayuda del contador de colonias, registrar los resultados.
14. Seleccionar la placa representativa que corresponde a la dilucin que presente entre
30 y 300 unidades formadoras de colonias (UFC).
15. Multiplicar el No. de UFC por el inverso de la dilucin para obtener el No. de
unidades formadoras de colonias/ mL presentes en la muestra.
16. Colocar el material sucio en el cuarto de lavado.
17. Escribe el nmero de UFC encontradas en las placas sembradas en las diferentes
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diluciones:
Cuestionario
1. Investiga las tcnicas que existen para el conteo total de microorganismos e indica
su fundamento.
2. Qu ventajas e inconvenientes presenta el mtodo utilizado en la prctica?
3. Escribe 3 ejemplos donde se aplique este procedimiento.
4. Por qu es necesario hacer diluciones en esta tcnica?
5. Cul es el criterio para seleccionar la placa representativa?
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Prctica No. 5
Introduccin
Para el microbilogo es de gran utilidad contar en el laboratorio con tcnicas que le permitan
estudiar un nico microorganismo separado del resto de la poblacin. Para lograr este fin se
necesita de un cultivo puro formado por clulas que provienen de una clula nica.
La manera de inocular (sembrar) una muestra depende del tipo de medio de cultivo:
a) Medio lquido: la inoculacin se efecta mediante el asa bacteriolgica, pipeta o
hisopo.
b) Medio semigelificado (semislido): con ayuda del asa bacteriolgica recta, por
puncin.
c) Medio gelificado (slido): en caja Petri o en tubos con agar inclinado, la inoculacin
se realiza por estra o picadura.
Objetivo
Realizar el aislamiento de microorganismos utilizando placas con medio de cultivo
simple, con el asa bacteriolgica por el mtodo de estra cruzada.
Material
2 Placas con agar nutritivo.
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Mechero Bunsen.
Asa bacteriolgica.
Cepa bacteriolgica: Escherichia coli.
Benzal
Algodn
Desarrollo
1. Limpiar el rea de trabajo con benzal y algodn.
2. Flamear el asa bacteriolgica hasta llevarla al rojo vivo.
3. Dejar enfriar el asa.
4. Destapar el tubo o placa conteniendo la cepa problema.
5. Tomar la muestra con el asa bacteriolgica y volver a tapar el tubo.
6. Hacer las estras sobre la superficie del medio de cultivo, como se indica en el
esquema de trabajo teniendo cuidado de flamear el asa antes de cada serie de
estras y enfriarla en una orilla de la placa. Con la ltima serie de estras no volver
a tocar la primera serie de estras (ver fig. 3).
7. Rotular las placas con su nombre, fecha de ingreso y de salida del material que se
va a meter a incubar.
8. Colocar las placas en la estufa bacteriolgica y dejarlas durante 24 horas a 37 C.
9. Limpiar nuevamente el rea de trabajo con benzal y algodn.
10. Evaluar el crecimiento a las 24 horas, identificando la presencia de colonias
aisladas y determinar si hubo cultivo puro o mixto.
11. Colocar el material sucio en el cuarto de lavado.
Otras formas para la siembra de cepas con asa bacteriolgica empleadas en microbiologa
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se muestran en la figura 4.
Cuestionario
1. Por qu se incuban las cajas con las tapas hacia abajo?
2. Qu ventajas e inconvenientes ofrece el mtodo de estra cruzada?
3. Con que propsito se emplean las otras tcnicas de siembra diferentes a la estra
cruzada?
4. Cul es la diferencia entre un medio slido, semislido y lquido?
5. Qu tipo de medio es el agar nutritivo y para qu se utiliza?
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Prctica No. 6
Tcnicas de tincin diferenciales
Introduccin
Los organismos vivos son incoloros y presentan pobre contraste cuando se observan al
microscopio. Cuando los organismos son teidos antes de observarlos, aumenta en gran
medida el contraste de las clulas y su medio. Antes de teir es necesario hacer un frote y
fijarlo. Un frote es una delgada capa de clulas que cubre un rea de un portaobjetos, este
frote debe ser secado al aire y fijado por calor o qumicamente con alcohol. As los frotes no
fijados son lavados en el proceso de tincin.
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La tincin de esporas y tincin negativa son tinciones de estructuras especficas, la
primera permite teir las endosporas bacterianas y la segunda revela la presencia de cpsulas.
Objetivo
a) Aprender el fundamento y la tcnica de la tincin de Gram para determinar la
morfologa microscpica de diferentes cepas bacterianas.
b) Aprender el fundamento de la tincin negativa para levaduras.
c) Aprender el fundamento de la tincin de esporas para bacterias.
Material
Mechero
Asas bacteriolgicas
Placas sembradas con diferentes microorganismos
Portaobjetos
Colorantes
Microscopios
Cepas
Desarrollo
Tcnica de Tincin de Gram
1. Hacer un frote de las colonias caracterizadas, tomando con el asa bacteriolgica una
pequea muestra de una colonia aislada y mezclarla con una gota de agua sobre un
portaobjetos. Extender esta suspensin y dejar secar.
2. Fijar el frote por calor deslizando el portaobjetos sobre la flama del mechero.
3. Cubrir el frote con cristal violeta y dejarlo actuar por un minuto. Escurrir el colorante
y lavar con chorro suave de agua corriente.
4. Cubrir el frote con lugol, dejarlo actuar por un minuto. Escurrir y lavar.
5. Decolorar el frote con alcohol-acetona, de 5-30 segundos. Escurrir y lavar.
6. Cubrir el frote con safranina y dejarlo actuar por 30 segundos. Escurrir y lavar.
7. Dejar secar al aire.
8. Observar el frote con objetivo de inmersin.
9. Determinar la morfologa microscpica y la respuesta a la Tincin de Gram de cada
cepa empleada.
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Tcnica de tincin negativa
1. Mezclar las levaduras con tinta china sobre un portaobjetos y colocar el cubreobjetos.
2. Observar el frote con objetivo seco fuerte.
Cuestionario
1. Qu es un frotis y para qu se utiliza?
2. Qu es un colorante? Cmo est constituido? Cmo es que se combina con los
diferentes componentes celulares?
3. Qu factores intervienen para que los colorantes se combinen con los componentes
celulares?
4. Qu es un mordente? Menciona tres ejemplos.
5. Cul es el objetivo de calentar en la tincin de esporas?
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Prctica No. 7
Efecto de los factores fsicos sobre el crecimiento de los microorganismos
Introduccin
Para que los microorganismos puedan ser aislados en el laboratorio se deben satisfacer todos
sus requerimientos nutricionales, para ello deben sembrarse en condiciones de cultivo que
aseguren por un lado, el suministro de los sustratos adecuados y por otro el mantenimiento de
las condiciones fsicas ptimas, que nos ayuden a obtener un crecimiento satisfactorio. Los
factores fsicos que ms influyen en este aspecto y sobre los cuales se debe mantener un
control preciso, son: temperatura, pH, concentracin de azcares, luz y concentracin de
sales.
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sales y se les denomina halfilos, mientras otros soportan esas altas concentraciones
denominndose como sal tolerantes, debe entenderse entonces que en el primer caso se refiere
a un requerimiento mientras en el segundo es una adaptacin a las condiciones de cultivo.
Objetivos
a) Determinar las condiciones ptimas de crecimiento de microorganismos cultivados
bajo diferentes variables de temperatura, pH, concentracin de sal y de azcar.
b) Determinar las diferencias en los parmetros anteriores de acuerdo al grupo
microbiano.
Material
Cepas de Pseudomonas sp, Escherichia coli, Candida spp, Staphylococcus aureus
Tubos con caldo nutritivo preparados bajo las siguientes variables:
a) pH: 2, 5, 7 y 12.
b) NaCl: 0.85%, 5.0%, 7.0% y 10%.
c) Sacarosa: 2.5%, 5.5%, 10.0% y 20%.
d) Normales para incubacin a diferentes temperaturas.
Desarrollo
1. Formar un grupo de 16 tubos con caldo nutritivo que contengan las cuatro variables de
cada uno de los factores a probar. Estos 16 tubos se emplearn para analizar el
comportamiento de una sola cepa.
2. Sembrar una asada de la cepa correspondiente en cada uno de los 16 tubos anteriores.
El procedimiento se ilustra en el esquema de abajo.
3. Incubar todos los tubos de pH, NaCl y sacarosa a 37C durante 24 h.
4. Incubar los tubos con caldo nutritivo preparado normalmente a las siguientes
temperaturas: 4, 25, 37 y 45C durante 24 h.
5. Observando el crecimiento de las cepas sembradas, reporte sus resultados en el cuadro
de reporte.
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CEPA
pH % Sacarosa % NaCl
Temperatura enC
6. Para el llenado siga el mtodo de las cuatro cruces. Comparando simultneamente los
cuatro tubos de las variantes de un mismo factor, asigna valores de 1-4 cruces segn la
turbidez presente en el medio. Donde no exista crecimiento asigne 0.
7. Construye una grfica para cada factor fsico.
8. Determina las condiciones ptimas de crecimiento para las diferentes cepas empleadas
con respecto a cada factor valorado.
9. Completa la siguiente tabla
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TEMPERATURA
Microorganismo 4C 25C 37C 45C
1
DIFERENTES pH
Microorganismo 2 5 7 12
1
% NaCl
Microorganismo 0.85 5.0 7.0 10.0
1
% SACAROSA
Microorganismo 2.5 5.5 10 20
1
Cuestionario
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Prctica No. 8
Efecto de los agentes qumicos sobre el crecimiento de los microorganismos
Introduccin
Para el control del crecimiento microbiano o la eliminacin total de las poblaciones
microbianas podemos emplear sustancias qumicas conocidas como desinfectantes o
antispticos, que actan sobre el microorganismo por los siguientes mecanismos:
Ruptura de pared.
Alterando la naturaleza coloidal del protoplasma.
Alterando la permeabilidad.
Inactivando enzimas.
Desnaturalizando protenas.
Disminuyendo la tensin superficial.
Entre los agentes qumicos empleados tenemos: cidos, bases, jabones, detergentes,
alcoholes, metales pesados y colorantes. El trmino desinfectante est restringido a las
sustancias que son aplicadas sobre superficies. La accin desinfectante se ve aumentada por la
temperatura y la concentracin.
Un mtodo que permite evaluar la accin de los agentes qumicos sobre el crecimiento
microbiano es el de difusin en disco, consiste en impregnar un disco de papel filtro con una
cantidad determinada del agente qumico a probar y colocarlo sobre una superficie de agar en
la cual se ha distribuido un inculo del microorganismo, se formar por difusin del agente
qumico un gradiente de concentracin alrededor del sensidisco y la sensibilidad del
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microorganismo estar indicada por el tamao de la zona de inhibicin del crecimiento
bacteriano. El gradiente se forma aproximadamente en 6 horas y la zona de inhibicin
depender del equilibrio entre la difusin del agente y la velocidad de crecimiento del
microorganismo.
Objetivo
Observar el efecto de diversos agentes qumicos sobre el crecimiento de los
microorganismos y determinar la diferente susceptibilidad de los organismos.
Material
Placas con agar nutritivo
Hisopos estriles
Discos de papel filtro impregnados con los siguientes agentes:
a) Agentes surfactantes: benzal, jabn, detergente y sales biliares
b) Metales pesados: merthiolate
c) Desinfectantes: Cloro, yodo
d) Colorantes: cristal violeta, safranina
e) Antibiticos
Pinzas
Cepas de microorganismos
Desarrollo
1. Ajustar el inculo a 0.5 de densidad en SSI con un densitmetro.
2. Con la disolucin, sembrar las placas con agar nutritivo en forma masiva, empleando
hisopos estriles con cada uno de los microorganismos proporcionados, en 3 diferentes
direcciones y alrededor de la placa (ver fig. 5 y 6)
29
Crecimiento
Papel filtro
microbiano
impregnado con
agente qumico
Halo de inhibicin
del crecimiento
bacteriano
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Nombre de la cepa:
Cuestionario
1. Menciona, a qu se le llama halo de inhibicin?
2. Indica la importancia de estandarizar el inculo.
3. Indica a cuntas UFC/mL corresponde 0.5 de densidad?
4. Explica, qu indica el dimetro del halo de inhibicin?
5. Menciona un mtodo para realizar un antibiograma y menciona su utilidad.
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Prctica No. 9
Introduccin
El grupo de bacterias Gramnegativas incluye una amplia variedad de tipos bacterianos. Se
encuentran en ambientes como el suelo, mucosas de diversos hospederos como parte de su
flora normal o hasta contaminando alimentos.
Objetivo
Manejar los medios de cultivo adecuados para bacterias Gramnegativas e interpretar
los cambios bioqumicos presentados en ellos.
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Material
Placas de Petri preparadas con los medios de cultivo: Mac Conkey, EMB, Verde Brillante y
Sulfito de Bismuto.
Mechero Bunsen
Asa bacteriolgica
Cepas de bacterias Gramnegativas
Desarrollo
1. Sembrar por el mtodo de estra cruzada cada uno de los medios, con la cepa
seleccionada.
2. Incubar las placas sembradas a 37C por 18-24 h.
3. Hacer la lectura detallando el tipo de crecimiento en cada uno de los medios
sembrados y determinar el medio de cultivo ptimo para el aislamiento de cada cepa.
4. De los medios utilizados en la prctica llena el siguiente cuadro
Cuestionario
1. Menciona la caracterstica de la pared celular de las bacterias Gramnegativas.
2. Da 5 ejemplos de microorganismos Gramnegativos.
3. Qu componentes deben estar presentes en un medio de cultivo?
4. Menciona el fundamento del Mac Conkey.
5. Qu otros medios de cultivo, diferentes a los empleados en esta prctica, pueden ser
utilizados para el crecimiento de gramnegativos?
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Prctica No. 10
Introduccin
El grupo de bacterias Grampositivas comprende un espectro muy amplio de tipos
morfolgicos, la mayora son hetertrofos que crecen como saprfitos viviendo de materia
orgnica muerta. Las bacterias Grampositivas generalmente abundan en el suelo aunque un
nmero importante de ellas son patgenos de plantas y animales. Un nmero menor de las
bacterias Grampositivas son auttrofas y producen cido actico a partir de dixido de
carbono e hidrgeno. Dentro de las bacterias Grampositivas tambin se ha descrito un grupo
fotosinttico, las heliobacterias.
Objetivo
Manejar los medios de cultivo adecuados para bacterias Grampositivas e interpretar
los cambios bioqumicos presentados en ellos.
Material
Placas de Petri preparadas con los medios de cultivo: Sal y Manitol; Agar sangre de carnero y
Agar Chocolate.
Mechero
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Asa bacteriolgica
Cepas de cocos Grampositivos
Desarrollo
1. Sembrar por el mtodo de estra cruzada cada uno de los medios, con la cepa
proporcionada por el profesor.
2. Incubar las placas sembradas a 37C por 18-24 h.
3. Hacer la lectura detallando el tipo de crecimiento en cada uno de los medios
sembrados y determinar el medio de cultivo ptimo para el aislamiento de cada cepa.
4. Para el caso del medio Agar sangre de carnero, determinar el patrn de hemlisis
presentado por cada cepa de acuerdo al siguiente criterio:
Alfa-hemlisis: parcial aclaramiento alrededor de la colonia con decoloracin
verde en el medio.
Beta-hemlisis: zona de completo aclaramiento debido a la lisis total de los
glbulos rojos.
Gamma-hemlisis: no hemlisis.
5.- De los medios utilizados llenar el siguiente cuadro:
Cuestionario
1. Menciona las caractersticas principales de la pared celular de las bacterias
Grampositivas
2. Menciona 5 ejemplos de bacterias Grampositivas
3. Qu otros medios de cultivo, diferentes a los empleados en esta prctica, pueden
ser utilizados para el crecimiento de Grampositivos?
4. Menciona el fundamento del sal y manitol e indica el grupo bacteriano que crece
en este medio.
5. Investiga otros medios utilizados para el crecimiento de Grampositivos.
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DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
Prctica No. 11
Observacin de morfologa colonial
Introduccin
Las muestras sembradas en los medios adecuados y bajo las condiciones ambientales ptimas
crecern como un agregado macroscpico de muchas e idnticas clulas provenientes de una,
formando una colonia en la superficie de un medio de cultivo slido. Una vez aisladas las
colonias los pasos a seguir para llegar a la identificacin del tipo bacteriano son:
a) Determinar las caractersticas de la morfologa colonial.
b) Determinar la pureza de las cepas por medio de tinciones.
c) Observacin de cambios alrededor de las colonias, que reflejan alguna actividad
metablica.
d) Realizar pruebas metablicas diferenciales.
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Fig. 7. Diferentes morfologas coloniales
Objetivo
Aprender a leer la morfologa colonial.
Material
Mechero.
Asas bacteriolgicas.
Placas sembradas con diferentes microorganismos.
Desarrollo
1. Identifique las caractersticas morfolgicas de las colonias crecidas en los
diferentes agares.
2. Realiza la tincin de Gram y dibuja tu observacin.
3. Completa la siguiente tabla:
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Caracterstica Agar: Agar: Agar: Agar:
1. tamao (mm)
2. color
3 Forma:
puntiforme
circular
irregular
4. elevacin:
plana
elevada
convexa
pulvinada
umbonada
5. superficie:
lisa
rugosa
6. aspecto:
hmedo
seco
7. bordes:
enteros
irregulares
filamentosos
8. luz reflejada:
brillante
mate
9.luz transmitida:
opaca
translcida
transparente
10. consistencia:
butirosa
mucoide
friable
Dura
Cuestionario
1. Se present la misma morfologa en los diferentes medios de cultivo?, si hubo
variaciones explica a qu crees que se deban?
2. Qu entiendes por el trmino butirosa?
3. Qu entiendes por el trmino friable?
4. Cul es la importancia de realizar la morfologa colonial de las bacterias?
5. Por qu crees que vara el tamao de las colonias bacterianas?
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BENEMRITA UNIVERSIDAD AUTNOMA DE PUEBLA
FACULTAD DE CIENCIAS QUMICAS
LICENCIATURA: QUMICO FARMACOBILOGO
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGA
Prctica No. 12
Pruebas bioqumicas
Introduccin
Una vez que se obtienen los cultivos puros, el siguiente paso, generalmente para la
identificacin de los microorganismos son las pruebas metablicas o pruebas bioqumicas, las
cuales se basan en la determinacin de enzimas, productos finales del metabolismo, etc.
Dichas pruebas son caractersticas de cada gnero y especie, para esto se siembra a los
microorganismos en medios que contienen un sustrato especfico, un indicador de pH, y los
nutrientes necesarios para su crecimiento (en algunas ocasiones es necesario agregar algunos
reactivos al medio donde se ha desarrollado el microorganismo para visualizar la reaccin
bioqumica).
Objetivos
Conocer el fundamento de las pruebas metablicas
Material
Tubos con agar TSI
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Tubos con agar LIA
Tubos con agar MIO
Tubos con agar Citrato
Tubos con agar Urea
Reactivos para la prueba de Catalasa
Reactivos para la prueba de Oxidasa
Colorantes de Gram
Portaobjetos
Asa bacteriolgica
Mechero
Microscopios
Cepa a estudiar
Desarrollo
Pruebas metablicas
Al trmino de la incubacin pasar a la identificacin de bacterias de inters mdico, para lo
cual se utilizarn las pruebas metablicas o bioqumicas, de la siguiente manera:
1. Realizar tincin de Gram.
2. Con la ayuda de un aplicador estril tomar una colonia de inters y colocarla en un
portaobjetos con una gota de perxido de hidrgeno al 10% (prueba de catalasa).
3. De igual forma hacer prueba de oxidasa.
4. Con el asa bacteriolgica estril en punta tomar una colonia y depositarla en el tubo
con agar TSI.
5. Con la misma asa sin esterilizar sembrar los tubos con el resto de las bioqumicas.
Poner atencin a las indicaciones del maestro para la siembra de estos tubos.
6. Rotular e incubar a 37C por 18-24 h.
7. Leer e interpretar las pruebas bioqumicas. Para la lectura de produccin de indol
agregar una gota de reactivo de Kovacs, (apyese en la siguientes tablas para la
identificacin de enterobacterias).
8. Completa la siguiente tabla
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Todas las Dibujo del
Prueba Fuente de Pruebas a
Indicador posibles medio sin
bioqumica carbono realizar
lecturas inocular
TSI
LIA
MIO
Citrato
Urea
Catalasa
Oxidasa
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Cuestionario
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Bibliografa
a) Cowan y Steel. 1988. Manual para la identificacin de bacterias de inters mdico. Ed.
Editorial Panamericana.
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