Crecimiento microbiano de saccharomyces cerevisiae con extracto de malta como fuente de

carbono.

Emmanuel A. Bern*, Daro Delmoral*, Alejandro Muoz*, Jonathan Riveros*

*Estudiantes ingeniera qumica Universidad Nacional, Sede Manizales

Resumen

En el presente trabajo se estudi el crecimiento microbiano de la cepa Saccharomyces cerevisae

cultivada en 500 mL a 32 C y 10000 rpm, usando como sustrato extracto de malta, se utilizan
diferentes mtodos para la medicin de biomasa como el peso seco, densidad ptica, unidades
formadoras de colonia (UFC), conteo con cmara de Neubauer y el mtodo de DNS para la
determinacin de azucares reductores en el medio a medida que transcurre el experimento. Se
analizan los datos experimentales para proponer la cintica adecuada a los datos arrojados del
crecimiento microbiano la cual se puede encontrar con los mtodos anteriormente mencionados.

1. Objetivo general.

Obtener biomasa a partir de la fermentacin alcohlica usando como sustrato extracto de malta y
como microorganismo Saccharomyces cerevisiae, y analizar los factores que afectan el proceso de
crecimiento para determinar los parmetros cinticos de crecimiento microbiano.

1.1 Objetivos especficos.

Conocer los mtodos de estudio del de conteo de biomasa en el proceso de fermentacin.

Obtener la curva de crecimiento microbiano del proceso de crecimiento de biomasa cabo y

analizar los parmetros cinticos.

Calcular los parmetros relacionados al crecimiento microbiano, como el tiempo de generacin,

las constantes cinticas.

Aplicar mtodos como el DNS, el conteo en cmara de Neubauer, densidad ptica, UFC y peso
seco para analizar cmo avanza el crecimiento de la levadura.
1. Introduccin

Las levaduras son hongos unicelulares, representan un puente biolgico entre bacterias y
organismos superiores, y es un microorganismo de fcil manipulacin y crecimiento rpido. Es
un microorganismo importante ya que es posible utilizarla para diferentes aplicaciones tales
como: produccin de pan, bebidas alcohlicas entre otras. Sus crecimientos optimos de dan a
un PH entre 3,8 - 4,2 y una temperatura optima 28 32 C. Para la produccin de biomasa se
debe tener presente que la levadura debe presentar una respiracin aerobia la cual se enfoca
en la produccin de energa ruta Embden-Meyerhoff. [1]

+ 2 2 + 2 + 38 +

Fermenta soluciones azucaradas con concentraciones menores al 12% ya que por efecto de la
presin osmtica del medio se inactiva cuando la concentracin de azcar supera el 15%.
Industrialmente la levadura se produce utilizando como sustrato las melazas fortificadas con
sales de amonio que contienen 50% de azcar, sales y compuestos orgnicos. [2]

2. Materiales y mtodos

2.1 Materiales, equipos y reactivos

Tubos de ensayo
Camara de Neubauer
Espectrofotmetro
Mecheros
Centrifuga
Cajas de Petri
Gradilla
Cubreobjetos
Micropipetas
Perlas
Pipetas
Azul de metileno
Tubos de Eppendorff
DNS

Nomenclatura:

: Tiempo
: Diferencia de tiempo
: Tiempo de generacin
: Velocidad especfica de crecimiento
microbiano
: Nmero de clulas en el tiempo
: Cantidad de biomasa en el tiempo
: Cantidad de sustrato en el tiempo
: Nmero de clulas en el tiempo
: Constante de velocidad de crecimiento
microbiano
: Constante afinidad al sustrato
A. R. T.: Azucares reductores totales
METODO DNS (Azucares reductores).

Esta prueba se realiza con DNS (cido dinitrosaliclico) con el fin de seguir el consumo de
sustrato, en la cual se debe construir la curva de calibracin con diferentes concentraciones de
sustrato, y as contar con una base para pasar de absorbancia a g/L.

Para la preparacin de la muestra, se tom 2 mL de muestra y se agrega en un tubo de

ensayo, a este se le agrega 1 mL del reactivo DNS. El tubo de ensayo se calienta a bao mara
durante 15 minutos, posteriormente se enfra con un agua y hielo, se adiciona agua, despus
de estos pasos se mide la densidad ptica a 540 nm, en la cual se mide la absorbancia de la
muestra. Con los datos obtenidos de la curva de calibracin, se realiza una regresin y se
procedi a obtener valores que describan el comportamiento de la concentracin de sustrato en
funcin de la absorbancia.

Parmetros de crecimiento celular

Se debe hacer el anlisis de la cintica del crecimiento microbiano, ya que estos factores el
diseo son fundamentales para la operacin y entendimiento de los microorganismos y como
pueden reaccionar en diferentes medios. Para el anlisis del microorganismo se utiliza el
modelo de Monod, ya que describe la interaccin entre el crecimiento de microorganismos en
un cultivo y la utilizacin del sustrato suministrado para su crecimiento.
Es uno de los modelos empleados con mayor frecuencia para comparar el efecto de la
velocidad especfica y la formacin de biomasa. [3]

Para un anlisis correcto las variables de la cinetica deben calcularse durante la fase
exponencial del crecimiento del microorganismo, para esto se debe tener presente las
pendientes porque estas indican una tendencia en aumento la cual es posible analizar y para
minimizar errores se debe calcular en pequeos intervalos de tiempo y son:

Tiempo de generacin (tg)

Es el tiempo necesario para que las clulas o microorganismo se dupliquen, se debe tener
presente el menor tg, ya que este nos dar el valor mximo de velocidad especfica de
crecimiento:

ln(2)
=
ln( ) ln(0 )

Velocidad especifica de crecimiento ()

Indica el cambio en el nmero relativo de clulas en un intervalo de tiempo, la mxima

velocidad especfica ( ) se encuentra con el tg mnimo:

ln(2)
=

Constante de velocidad de crecimiento (k)

La constante de velocidad de crecimiento corresponde al recproco del tiempo de generacin

1
=

La cintica de Monod nos permite hallar los valores de los parmetros ya mencionados
relacionados con la siguiente ecuacin:

[]
=
+ []
La cual se procede a linealizar, obteniendo

1 + []
=
[]

Y con la pendiente y el corte, se procede a hallar los valores

1
=

Curva de calibracin DNS.

Concentracin (g/L) Absorbancia (A)

0,25 0,1134475
0,5 0,237555
1 0,48577
2 0,9822
4 1,97506
Tabla #. Valores curva de calibracin.
Con la tabla #, obtenemos la curva de calibracin del DNS, para poder generar la curva del
consumo de sustrato en el tiempo.

Curva de calibracion (DNS)

2.5
Absorbancia (540nm)

2
1.5
1
y = 0.4964x - 0.0107
0.5
R = 1
0
0 1 2 3 4 5
Concentracion (g/L)

Figura #. Curva de calibracin para los A.R.T.

Obteniendo esta curva podemos calcular los azucares reductores, para analizar como fue el
consumo de sustrato por parte del microorganismo en el tiempo que se analiz el crecimiento.

Tiempo A.R.T./L
1 12,341
2 10,696
3 9,873
4 4,937
5 4,937
6 3,291
7 3,291
 8 3,291
9 1,646
10 1,646
11 1,646
Tabla #, Datos de A.R.T. en el tiempo.

A.R.T. Extracto de malta

14.000
Concentracion sustrato (g/L)

12.000
10.000
8.000
6.000
4.000
2.000
0.000
0 2 4 6 8 10 12
Tiempo (h)

Figura #. Consumo de sustrato extracto de malta en el tiempo.

En la figura #, podemos observar como disminuye el sustrato en este caso extracto de malta a
medida que pasa el tiempo, se puede observar que en el transcurso de la primera hora el
consumo de sustrato es rpido debido a que el microorganismo ya haba sido inoculado y que
al cabo de las 6 horas el microorganismo no sigue consumiendo sustrato, en la hora 8 del
experimento sigue con el consumo de sustrato aproximadamente hasta las 9 horas ya que este
se encuentra en muy poca cantidad por lo cual se detiene el metabolismo de mencionada
levadura.

Mtodo de neubauer para conteo de clulas viables

El Mtodo de neubauer es un proceso que indica la cantidad de clulas viables en un cultivo

microbiano, la teora nos dice que este nmero de clulas viables pasan por una fase de lag o
de latencia en donde usan este tiempo para adaptarse al medio de cultivo, despus empieza la
fase exponencial que se divide en exponencial temprana, media y tarda, en la cual la biomasa
empieza a comerse el sustrato y a crecer como es evidente de forma exponencial, despus el
cultivo pasa por una fase estacionaria donde la cantidad de clulas que se dividen son iguales
a las que mueren dando un cambio de cantidad de clulas viables en el tiempo igual a cero, al
finalizar esta fase tenemos la fase de muerte en donde las clulas y el cultivo en general
muere.
Primero obtuvimos una muestra del cultivo, un mililitro (1ml) despus lo diluimos para que el
conteo fuera posible de hacer, despus lo ubicamos en una cmara de neubauer cubierta por
un cubre objetos la muestra diluida todo esto sobre un microscopio, se cont por cuatro
ocasiones cada vez y se promedi el valor obtenido, la cmara de neubauer tena un factor de
diseo de 10000
En nuestro, obtuvimos los siguientes valores expresados en cantidad de clulas viables por
cada hora de cultivo as:
Tiempo (hr) Clulas/ml
Eliminado 83.200.000
1 38.400.000
2 39.800.000
3 41.600.000
Eliminado 116.000.000
4 59.550.000
5 77.250.000
6 71.100.000
7 64.200.000
8 56.400.000
Tabla #. Valores de la tasa de crecimiento
Datos tomados cada hora del cultivo, los datos se refieren a cantidad de clulas viables por
cada mililitro.
Al Graficar estos datos obtuvimos la siguiente grfica:

CNB vs tiempo
77,000,000
72,000,000
Biomasa (cel/ml)

67,000,000
62,000,000
57,000,000
52,000,000
47,000,000
42,000,000
37,000,000
-1 1 3 5 7 9
Tiempos (hr)

Tabla # ciclo de crecimiento de la poblacin de Saccharomyces cerevisiae

El primer y cuarto dato fueron descartados dado su evidente desviacin respecto a los dems,
esto pudo darse gracias a una mala agitacin a la hora de tomar la cantidad necesaria para
contar las clulas ms un probable error humano a la hora de contar.

La grafica nos muestra que entre la primera y la tercera hora apenas hay un cambio de clulas
viables que puede tomarse como constante, lo cual significara que estamos en fase de lag,
entre la tercera y la quinta hora se nota un incremento lineal de la poblacin de clulas viables
lo que nos indica la fase exponencial, justo despus de llegar a este punto mximo se denota
una importante disminucin de la cantidad de clulas viables que va disminuyendo de manera
constante y casi lineal, lo que nos deja en etapa de muerte de las Saccharomyces cerevisiae
sin pasar por la fase estacionaria, lo cual, no es muy comn que ocurra, lo cual puede deberse
a una ata concentracin del metabolito secundario el cual es el metanol y como se nos fue
indicado en clase, este microorganismo, la Saccharomyces cerevisiae cuando est en un
medio con un volumen de alcohol alto (mayor al 14%) mueren, lo cual podra explicar por qu
no se llega a la fase estacionaria.

Caculo de tiempo de generacin ( ) constante de velocidad (K) y velocidad especifica

de crecimiento

Dado que en la grfica es evidente que la pendiente mxima est en la fase exponencial,
usamos estos datos all obtenidos para encontrar las constantes antes mencionadas usando
tres simples ecuaciones enseadas por el tutor de bioqumica as:

Para hallar la constante de velocidad K que es El recproco del tiempo de generacin

(generaciones/unidad de tiempo) usamos a siguiente ecuacin:

= 3,32 [log( ) (0 )]/( 0 )

Dnde:

= constante de velocidad

0 =Concentracin inicial de clulas o biomasa

=Concentracin final de clulas o biomasa

= Tiempo Final

0 = Tiempo inicial

El resultado de aplicar la ecuacin es de un = 4,328

Usando este valor podemos encontrar el valor de t g o tiempo de generacin que es el tiempo
requerido para duplicar el nmero de clulas de una poblacin de la ecuacin = 1t , el
g
resultado es de t g = 0.231

Por ltimo la velocidad especifica de crecimiento que es e cambio instantneo en el # relativo

de clulas en un intervalo de tiempo la podemos hallar con la ecuacin tambin vista en clase
ln(2)
= dando un resulta de = 2.9998 3.0001 .

Conclusiones
Se pueden presentar errores en los mtodos de medicin ya que muchas personas
manipularon diferentes instrumentos.
Con los A.R.T. se puede observar que aproximadamente desde las 9 horas de iniciado
el experimento, se detiene el consumo de sustrato.

Referencias
[1]. Valdivieso Ugarte Fdo. Obtencin y caracterizacin de cepas de Saccharomyces cerevisiae
superproductoras de glutatin, Universidad de Granada. 2006
[2] Fajardo Castillo E.E, Sarmiento Forero A.C. Evaluacin de melaza de caa como sustrato
para la produccin de Saccharomy cescerevisiae. Pontificia universidad javeriana. Facultad de
ciencias bsicas. Bogot 2007
[3] Alberto Duarte. Evaluacin de los parmetros cinticos de la ecuacin de Monod.
Universidad nacional de Colombia. Facultad de ingeniera. Bogot
[5] Brock. Biologa de los Microorganismos.
Madigan Martinko Dunlap Clark
(12a. ed, 2009) Ed. Pearson