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Aislamiento e identificacin de metabolitos secundarios y actividad

antibacteriana de hojas de Lippia alba (Pronto alivio) frente a cinco


4,7 extractos.

Isolation and identification of secondary metabolites and antibacterial


activity of leaves Lippia alba (Pronto alivio) against five extracts.

Valentina de los ngeles Carvajal Ocampo/ Bibiana Garces Lanchero.


Estudiante de pregrado/ Estudiante de pregrado.
Programa de Biologa.
Universidad de Caldas, Colombia.

RESUMEN
INTRODUCCIN: Una de las familias de plantas que actualmente llaman la
atencin de los investigadores por los diferentes usos medicinales que se le dan
es la familia Verbenaceae, a la cual pertenece la especie Lippia alba Mill N.E.
Brown, conocida comnmente en Colombia como Pronto alivio, Curatodo u
Organo de cerro; que se caracteriza por su intenso y penetrante olor 2,
asociado a la presencia de metabolitos secundarios, a los cuales se les atibuye
propiedades curativas como, analgsico, antiinflamatorio, antipirtico, sedante,
antimicrobial, antiviral, antifngico, digestivo, diurtico y expectorante.
OBJETIVO: Se determin los metabolitos secundarios presentes en las hojas de
L. alba y evalu la actividad antibacteriana de cinco extractos obtenidos con
diferentes solventes frente a Escherichia coli y con los resultados obtenidos se
elabor una crema antibacterial.
MTODOS: Se realiz extraccin por agotamiento con solventes de diferente
polaridad; cromatografa de capa de capa fina; antibiogramas y por ltimo se
elabor la crema antibacterial a base de glicerina y vaselina.
RESULTADOS: En el antibiograma se obtuvieron resultados negativos para los
extractos acetato de etilo y acetona. Tambin se observa que E. coli es ms
sensible a los componentes qumicos extrados con el solvente metanol,
polifenoles de tipo flavonoide. Es por ello que con este extracto se procedi a
elaborar una crema Antibacterial.
Palabras clave: Lippia alba, Verbenaceae, cromatografa de capa fina,
metabolitos secundarios, antibiograma, Escherichia coli.

1
SUMMARY
INTRODUCTION: One of the plant families that currently attracts the attention of
researchers for its different medicinal uses is the Verbenaceae family, to which
belongs the specie Lippia alba Mill NE Brown, commonly known in Colombia as
"Soon relief", "Curatodo" or "oregano de cerro"; which is characterized by its
intense and pungent odor associated to the presence of secondary metabolites, to
the which are attributed healing properties as analgesic, anti-inflammatory,
antipyretic, sedative, antimicrobial, antiviral, antifungal, digestive, diuretic and
expectorant.
OBJECTIVE: were determined secondary metabolites of the leaves of L. alba and
evaluated the antibacterial of activity five extracts obtained with different solvents,
against Escherichia coli and with the results obtained it elaborated an antibacterial
cream.
METHODS: We performed extraction for solvent depletion of different polarity;
chromatography of thin layer; antibiograms and finally the antibacterial cream was
elaborated to base glycerin and petrolatum.
RESULTS: In the antibiogram were obtained results negative for the extracts of
ethyl acetate and acetone. It is also noted that E. coli is more sensitive to chemical
components extracted with the solvent methanol, polyphenols of flavonoid type.
That is with this excerpt was drawn up an antibacterial cream.
Keywords: Lippia alba, Verbenaceae, thin layer chromatography, secondary
metabolites, antibiograms, Escherichia coli.

INTRODUCCIN

Desde inicios el hombre ha hecho uso de las plantas como base para la
elaboracin de preparaciones tradicionales tales como infusiones, ts o jugos,
todo ello con el fin de controlar la predominancia de ciertas enfermedades
infecciosas, solventar problemas de resistencia de los microorganismos y los
efectos adyacentes de algunos antimicrobianos sintticos 1. La persistente
bsqueda de nuevos productos y combinacin de sustancias qumicas de origen
natural con gran capacidad en diferentes industrias, como la farmacutica, la
alimenticia, la textil, la qumica y sobre todo la cosmtica y de perfumes ha
impulsado el estudio de los metabolitos secundarios de estas plantas, con buena
actividad biolgica2.
Una de las familias de plantas que actualmente llaman la atencin de los
investigadores es la familia Verbenaceae, no solo por su alta variabilidad botnica,

2
su amplia distribucin en todo el mundo, sino tambin por sus diferentes usos 2.
Esta familia incluye cerca de 70 gneros y 2.000 especies, siendo abundante en
regiones tropicales y subtropicales, donde se encuentra como hierbas, arbustos y
rboles3.
La especie Lippia alba Mill N.E. Brown, perteneciente a esta familia, conocida
comnmente en Colombia como Pronto alivio, Curatodo u Organo de cerro 4,
es un subarbusto que se caracteriza por su intenso y penetrante olor 2, est
ampliamente distribuida por Amrica Central y del Sur5, puede alcanzar una
altura de 2 metros, perenne, con hojas pequeas, opuestas, de color verde y
lminas ovado-oblongas de 2 a 7 cm, pecioladas y sin estpulas. Sus ramas son
de tipo homomrfico, es decir, que no se percibe especializacin en ramas frtiles
y vegetativas6; sus inflorescencias de color purpura, lilas o blancas3, producen
nctar y polen durante todo el ao6. En Colombia, se encuentra distribuida en casi
todo el territorio hasta los 1.900 msnm, y con mayor presencia en las regiones del
Valle del Cauca, Bolvar, Amazonas, Guajira, Magdalena, Atlntico,
Cundinamarca, Santander, Antioquia y Quindo7.
En Colombia generalmente a los metabolitos secundarios encontrados en
extractos de diferentes partes de esta planta, se le confieren diferentes
propiedades como, antiespasmdico, analgsico, diafortico, emenagogo,
antiinflamatorio, antipirtico, sedativo, antimicrobial, antiviral, citosttica,
anticonvulsionante8, antiedematognico10, antifngico, antidiabtico9, carminativa1;
y en otros pases de Iberoamrica se le atribuye tambin otros usos, como
expectorante, para la recuperacin posparto, para inducir el sueo, contra
enfermedades venreas, artritis, dolores musculares, hipertensin, astringente y
febrfuga7.
En las hojas de L. alba ,los principales metabolitos secundarios detectados han
sido taninos, flavonoides, esteroides, saponinas, fenoles, y flavonoles 9; por otra
parte estudios realizados en Colombia han mostrado que la composicin qumica
del aceite esencial es rico en: Carvona (40-57%) como componente mayoritario,
seguido de limoneno (24-37%), biciclosesquifelandreno (2-22%), piperilenona (1-
2%), piperitona (0,8-1,2%) y burboneno (0.6-1.5%)2-4-5-6.La diversidad de

3
compuestos qumicos y caractersticas biolgicas de L.alba, depende de factores
como el origen geogrfico de la planta, las condiciones de su cultivo, la edad y de
la parte de la planta empleada para la extraccin y de algunos otros factores
geobotnicos2.
En la presente investigacin, se determin los metabolitos secundarios por medio
de la tcnica de cromatografa de capa fina, se evalu la actividad antibacteriana
de los extractos (Hexano, acetona, acetato de etilo, metanol y agua destilada)
obtenidos de las hojas de la planta Lippia alba, conocida popularmente como
Pronto alivio frente a Escherichia coli y con los resultados obtenidos se elabor
una crema antibacterial.

MTODOS.

Material vegetal.
El material vegetal fue recolectado en un campo libre de insecticidas (Fig. A), en el
municipio de Manizales, localizado en la parte sur del departamento de Caldas, en
11
la vertiente occidental de la cordillera Central, 459-509N y 7521-7543W ;a
una altitud de 2150 m, con temperatura promedio 18C12. El espcimen fue
llevado al Herbario de la Universidad de Caldas (Herbario FAUC) para su
identificacin.

Extraccin por agotamiento con solventes de diferente polaridad.


Para llevar a cabo la extraccin de metabolitos secundario de Lippia alba, se
utilizaron solamente hojas frescas (8 g), las cuales fueron sometidas a maceracin
con 5 solventes de diferentes polaridad. Catalogados como no polares: Hexano y
Acetona; polaridad intermedia: Acetato de etilo; y polares: Metanol y Agua
destilada (Fig.B).
El primer solvente que se adicion para iniciar la maceracin fue 60 mL de
Hexano. La solucin que qued en el mortero despus de la maceracin se filtr y
se deposit en un frasco. Luego sobre el material vegetal anteriormente utilizado
se agreg el segundo solvente, 20 mL de acetona, se macer, filtr y almacen
en otro frasco. Con los otros tres solventes restantes (acetato de etilo, metanol y

4
agua destilada), 20 mL de cada uno, se realiz el mismo procedimiento
mencionado. Posteriormente, a cada uno de los frascos con los diferentes
extractos se adicion 10 sensidiscos necesarios para la realizacin de la prueba
de sensibilidad antimicrobiana.

Cromatografa de capa fina.


Se emplearon 5 placas de silica gel como fase estacionaria, sobre cada una se
sembr por banda con un capilar los diferentes extractos obtenidos. Luego se
introdujeron todas las placas en una cmara cromatogrfica, la cual contena
como fase mvil una solucin, adecuada para el arrastre de los diferentes
componentes qumicos, compuesta por: tolueno, acetato de etilo y dietilamina.
Para el revelado de las placas se emple cido sulfrico catalogado como
revelador universal. Los diferentes colores observados a lo largo de la placa
muestran los tipos de compuestos contenidos en el extracto. As los colores: azul,
verde y amarillo intenso indica la presencia de polifenoles de tipo flavonoide; el
rojo tambin revela flavonoides; el morado: acetogeninas y el color caf muestra
la presencia de taninos o terpenos (Fig.C).

Antibiograma.

Para esta prueba fue empleada la metodologa establecida por el Comit Europeo
de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana (EUCAST)13, donde se emplea
como control el antibitico de amplio espectro Sultamicilina14 en una cantidad de
0,04mg/L. Se utilizaron 3 cajas de Petri con agar Meller-Hinton, por cada uno de
los cinco extractos. En cada una se sembr 100 L de Escherichia coli, bacteria de
gran importancia clnica por las patologas que origina y por la actual resistencia
que ha mostrado frente a los antibiticos convencionales1.Las cepas fueron
suministradas por el Laboratorio de Microbiologa de la Universidad de Caldas. A
su vez se sembraron 3 sensidiscos impregnados de extracto en cada una de las 3
cajas de Petri respectivas para cada extracto (Fig.D). Por ltimo se incubaron las
cajas a 37 C por 24 h y despus de este periodo se midieron los halos de

5
inhibicin en mm. Las pruebas se consideraron negativas cuando se present
crecimiento microbiano alrededor del disco.

Elaboracin de la crema Antibacterial.


Con el extracto que mayores halos de inhibicin dio en el antibiograma, se
procedi a elaborar una crema antibacterial de uso externo. Para ello, se adicion
2mL de extracto en un beaker, ms 0.2 mL de trietanolamina, 0.2 mL de vaselina,
0.2 mL de glicerina y 0,2 mL de cido esterico. Los volmenes fueron tomados
con exactitud en una micropipeta. Luego esta mezcla fue sometida a bao mara
durante 30 minutos a 37C con agitacin suave y constante. Al final de este tiempo
se obtuvo una pasta muy viscosa (Fig.E).

RESULTADOS

Cromatografa de capa fina.

En la Tabla 1 se registran los compuestos qumicos mayoritarios aislados por


medio de la tcnica de cromatografa de capa fina, de los diferentes extractos
obtenidos de las hojas de la planta de L. alba (Fig.C).

Tabla 1. Metabolitos secundarios identificados en la cromatografa de capa fina


para cada extracto.

Cromatografa de Capa fina.


Extracto Metabolito
Hexano Taninos y terpenos
Acetona Acetogeninas
Polifenoles de tipo
Metanol flavonoide y taninos
Acetato de Polifenoles de tipo
etilo flavonoide

6
Antibiograma.

En las Tablas 2, 3, 4, 5 y 6 se muestran los halos de inhibicin de cada uno de los


extractos: hexano (Fig.F), acetona (Fig.G), acetato de etilo(Fig.H), metanol (Fig.I),
y agua destilada (Fig.J), contra la bacteria Gram negativa E. coli. Es importante
recordar que para cada extracto se realizaron tres rplicas.

Tabla 2. Promedio de los halos de inhibicin (mm) de cada una de las 3 rplicas
del extracto de la planta L. alba obtenido con hexano.

Trat: Tratamiento; RP: Replica.

Tabla 3. Promedio de los halos de inhibicin (mm) de cada una de las 3 rplicas
del extracto de la planta L .alba obtenido con acetona.

Tabla 4. Promedio de los halos de inhibicin (mm) de cada una de las 3 rplicas
del extracto de la planta L. alba obtenido con acetato de etilo.

Tabla 5. Promedio de los halos de inhibicin (mm) de cada una de las 3 rplicas
del extracto de la planta L. alba obtenido con metanol.

7
Tabla 6. Promedio de los halos de inhibicin (mm) de cada una de las 3 rplicas
del extracto de la planta L. alba obtenido con agua destilada.

En la Grafica 1. se observa la variacin que tubo cada uno de los tratamientos en


cuanto al promedio de sus halos de inhibicin. El extracto de metanol es el que
presenta una inhibicin ms constante de E.coli.

Promedio de Halos de Inhibicion para cada


Replica en los Cinco Tratamientos contra
E.coli.
2
PROMEDIO HALOS DE INHIBICION

1,57
1,4
1,5 1,4
Hexano
1
1,3 Acetato de etilo
1
0,57
Agua destilada
0,5
0 0 0 Acetona
0
Metanol
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3 3,5
REPLICAS

Grafica 1. Representacin grfica de los promedios de los halos de inhibicin para


cada una de las tres replicas en los cinco tratamientos (Hexano, acetato de etilo,
agua destilada, acetona y metanol).

8
Crema Antibacterial.

Segn los resultados obtenidos para la prueba antibiograma se eligi el extracto


con mejor actividad inhibitoria frente a E. coli, observndose que este
microorganismo es ms sensible a los componentes qumicos extrados con el
15
solvente metanol, polifenoles de tipo flavonoide .Es por lo anterior que la crema
Antibacterial se elabor con el extracto obtenido con dicho compuesto (Fig.K). La
crema puede ser aplicada en laceraciones presentes en la piel.

DISCUSIN

En la actualidad existen diversas investigaciones que han sido encaminadas a


favorecer y crear alternativas que beneficien o mejoren la calidad de vida de las
personas, y ms an que se aproveche la riqueza natural autctona de cada pas
para la elaboracin de nuevos tratamientos16, debido a la alta prevalencia de
enfermedades asociadas a infecciones causadas por diferentes microorganismos,
a los efectos indeseados de la terapia combinada de medicamentos, a la
resistencia de microorganismos a antibiticos y por ende a fracasos teraputicos17
se hace necesaria la bsqueda de opciones que permitan erradicar estos
problemas.

Una de estas opciones puede ser la especie L. alba, una de las tantas plantas a la
que se le atribuyen ciertas propiedades curativas por poseer molculas y
sustancias qumicas en su estructura fitoqumica1.

En la Tabla 1. Se identifican cada uno de los metabolitos secundarios presentes


en L. alba para cada extracto, obtenindose taninos, terpenos, acetogeninas y
flavonoides; lo que es aceptado, puesto que en el trabajo realizado por Vera et al 1
tambin se evidencio la presencia de estos; adems de esteroides, saponinas,
cumarinas y lactonas terpenicas. Sin embrago en el trabajo realizado por Vera et
al1 no se evidencia la presencia del metabolito secundario acetogenina, ni en
ninguno de los trabajos revisados3-4-5-8, lo cual nos lleva a concluir que este
metabolito pueda ser un nuevo quimiotipo para esta planta y en esta regin.

9
Es importante mencionar que la composicin qumica del aceite esencial de
L. alba depende del origen geogrfico de la planta, las condiciones de su cultivo, la
edad y la parte de la planta empleada para la extraccin, y de algunos otros
factores geobotnicos4. Es por ello, que para la misma especie se han reportan
diferentes quimiotipos mayoritarios. Siendo comnmente extrados dos
compuestos pertenecientes al grupo de los terpenos: el limoneno y la carvona, ya
sea por mtodos de extraccin de metabolitos secundarios voltiles o no voltiles2.

18-19-20
Autores que tambin han trabajado solo con las hojas de L .alba y que han
tenido en cuenta el ciclo circadiano de esta planta, afirman que cuando se
presentan condiciones de alta radiacin solar y temperaturas elevadas, se
obtienen contenidos altos de metabolitos secundarios, en especial carvona.

Estudios en los que se ha utilizado etanol como solvente de extraccin, se han


determinado compuestos fenlicos de tipo taninos, flavonoides y cumarinas, as
como tambin lactonas y metabolitos de naturaleza terpnica o esteroidal; a la
presencia de estas sustancias de naturaleza fenlica, encontradas en las clulas
de las plantas verdes se les atribuye actividad antioxidante y bactericida9, siendo
considerado como beneficio teraputico de las plantas medicinales.

Por otra parte, los resultados arrojados por la prueba antibiograma representados
en las Tablas 2,3,4,5 y 6, y en la Grfica 1, es posible inferir que a pesar de que
los extractos mostraron poca actividad, la bacteria E.coli no fue resistente a los
extractos obtenidos con hexano, metanol y agua, y que en el caso del extracto
metanlico se observa una buena actividad contra E.coli, mostrando una inhibicin
constante de la bacteria, siendo este extracto elegido para la elaboracin de la
crema antibacterial por su eficacia.

En la literatura se reporta que el efecto inhibitorio contra microorganismos,


bacterias especficamente, es mayor en los aceites esenciales de Lippia alba, en
comparacin con los extractos. Adems se ha demostrado que las especies de
bacterias Gram positivas presentan mayor sensibilidad al aceite esencial, con

10
respecto a las Gram negativas. Esta diferencia entre las respuestas a los
tratamientos, podra deberse a la composicin de la pared celular, que presentan
los dos tipos de bacterias1.Lo anterior, es una de las razones por las cuales se
puede decir que se obtuvieron pruebas antibiogramas negativas, debido a que la
bacteria utilizada es Gram negativa y los extractos obtenidos presentaban baja
concentracin de metabolitos secundarios.

Estos resultados muestran un potencial teraputico de los extractos de L. alba


frente a la actividad inhibitoria de E.coli; por lo que se propone realizar estudios
sobre otros tipos de microorganismos por ejemplo Staphylococccus aureus,
Bacillus cereus, candida albicans, Klebsiella pneumonia, Micrococus luteus,
Bacillus subtilis, Mycobacterium smegmatis y Monilia sitophila, de los cuales ya se
1-17
han registrado buenos resultados ; y tambin sobre actividad antimictica
contra Aspergillus Nger, Aspergillus fumigatus y Candida krusei17, en los que
17
algunos estudios tambin reportan su eficacia. Adems, segn Henao et al
recientemente se ha demostrado efecto inhibitorio sobre virus patgenos humanos
de alta prevalencia en Amrica latina como son el virus de la fiebre amarilla y virus
del dengue.

AGRADECIMIENTOS.
Los autores expresan sus ms sinceros agradecimientos a Jhon Henry Galvis
Garca docente de la Facultad de Ciencias Exactas y Naturales de la Universidad
de Caldas, por la contribucin con sus conocimientos y sugerencias para la
realizacin de este trabajo, de igual manera a las auxiliares de laboratorio Beatriz
y ngela Patricia Alzarte Ocampo por su gran colaboracin en todo el proceso.

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14
ANEXO (Figuras).

Fig. B. Solvente de diferente polaridad.

Fig. A. Material vegetal recolectado

Fig. C. Cromatografa de capa fina. Revelado de las cinco placas de silica gel.

15
Hexano

1 2 3

Fig. D. Algunos ejemplos de cajas de Petri con agar Meller-Hinton, con


siembra de Escherichia coli y 3 sensidiscos impregnados de extracto.

16
Fig. E. Mezcla de extracto, trietanolamina, vaselina, glicerina y acido esterico.

1 2 3

Fig. F. Resultados obtenidos de los halos de inhibicin en cada una de las 3 rplicas de
extracto hexano.

Acetona

1 2 3

Fig. G. Resultados obtenidos de los halos de inhibicin en cada una de las 3 rplicas de
extracto acetona.
17
Acetato de etilo.

1 2 3

Fig. H. Resultados obtenidos de los halos de inhibicin en cada una de las 3 rplicas de
extracto acetato de etilo (se observa crecimiento de la bacteria).

Metanol

1 2 3

Fig. I. Resultados obtenidos de los halos de inhibicin en cada una de las 3 rplicas de
extracto metanol.

Agua destilada

1 2 3
Fig. J. Resultados obtenidos de los halos de inhibicin en cada una de las 3 rplicas de
extracto Agua destilada. 18
Fig. K. Crema antibacterial elaborada con el extracto metanol.

19