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FILIAL NORTE

BIOQUMICA
GUA DE PRCTICAS

SEGUNDO AO

Profesores: Bil. Lezama Vigo, Hlmer, MSc. (Responsable)


Ing.Qum. Benel Fernndez, Doyle, Mg (Asesor)
Ing.Qum. Quiones Chapon, Liliana. (Coordinador)
Md. Llimpe Mitme, Rafael
Ing Qum. Monteza Arbul, Csar
Ing. Qum. Coronado Zuloeta, Ivn
Bil. Nolasco Crdenas, Oscar, MSc.
Md. Giles Saavedra, Juan

2017-II

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INTRODUCCIN

La Bioqumica es la ciencia de la vida que estudia el metabolismo de los


organismos vivos, es decir el conjunto de todas las reacciones qumicas, y sus
diferentes mecanismos, vas y regulacin que hacen posible la vida. Las
aplicaciones de la investigacin bsica en bioqumica son numerosas, siendo
indispensable el conocimiento del metabolismo para el desarrollo de cualquier
medicamento, su aplicacin y la determinacin de sus efectos.

La gua de prcticas del curso de Bioqumica tiene como objetivo entrenar al


estudiante con los procedimientos llevados a cabo en el laboratorio y
desarrollar su pensamiento cientfico que lo lleve a comprender los trminos
bsicos de la Bioqumica.

El estudiante debe emplear esta gua en cada prctica de laboratorio y estar


informado sobre la prctica que se llevar a cabo en cada sesin.

El alumno debe cumplir con los objetivos planteados al final de cada prctica.
As mismo debe presentar su gua de prctica terminada la misma.

PROGRAMACIN DE CONTENIDO

PRACTICAS DE LABORATORIO D. Benel


1 JU-10-08 Introduccin y organizacin de grupos. L. Quiones
2 JU-17-08 1. Bioseguridad. C. Monteza
3 JU-24-08 2. Instrumentacin: centrifugacin I. Coronado
4 JU-31-08 3. Instrumentacin: colorimetra
5 JU-07-09 4. Instrumentacin: potenciometra
6 JU-14-09 5. Cintica Enzimtica
7 JU-21-09 1. Digestin de carbohidratos
8 JU-28-09 SEMANA DE EVALUACIONES
9 JU-05-10 SEMANA DE LA MEDICINA
10 JU-12-10 2. Absorcin de carbohidratos
11 JU-19-10 3. Gliclisis
12 JU-26-10 4. Lipoprotenas sanguneas
13 JU-02-11 5. Transaminasas y cromatografa
14 JU-09-11 1. Evaluacin nutricional
15 JU-16-11 SEGUNDA EVALUACIN CONTINUA
16 JU-23-11 SEMANA DE EVALUACIONES

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SEMANA N 1
INTRODUCCION

PRCTICA GUIADA N I.1 SEMANA N 2


BIOSEGURIDAD

El trabajo en el Laboratorio requiere la observacin de una


serie de normas de seguridad que eviten posibles accidentes debido al
desconocimiento de lo que se est haciendo o a una posible negligencia de los
alumnos que estn en un momento dado, trabajando en el Laboratorio.

A continuacin alistamos una serie de medidas e indicaciones de seguridad


que deben tomarse durante las prcticas de laboratorio.

NORMAS PERSONALES

1. Lea con atencin, antes de cada prctica, las indicaciones de su gua. Siga
todas las instrucciones a menos que el profesor realice alguna
modificacin.
2. Cada grupo de prcticas se responsabilizar de su zona de trabajo y de su
material. Se trabajar con cuidado y de manera organizada. As mismo se
mantendr cada mesa de trabajo limpia, seca y ordenada.
3. Es obligatorio la utilizacin de mandil que le cubra brazos, piernas, torso y
pies. Estn prohibidos el uso de sandalias, pantalones cortos, faldas, polos
cortos, etc. en el laboratorio. La persona inapropiadamente vestida para
trabajar en el laboratorio le ser negado el ingreso.
4. No deben llevarse las manos a la boca ni a la cara pues pueden estar
contaminadas.
5. Si tienes el pelo largo, es conveniente que lo lleves recogido.
6. Est terminantemente prohibido fumar, tomar bebidas ni comidas.
7. En caso de derrame, accidente o dao avise inmediatamente al profesor.
8. Al trmino de cada prctica limpiar el rea de trabajo y lavar los materiales
utilizados con agua de cao. Lavarse las manos meticulosamente con agua

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y jabn. Finalmente cerciorares que las llaves de gas y agua estn
cerradas.

REACTIVOS QUIMICOS

1. Usar lentes de seguridad cuando trabaje con reactivos qumicos peligrosos


que puedan salpicar o derramarse.
2. Antes de utilizar un compuesto, asegurarse bien de que es el que se
necesita, fijarse bien el rtulo.
3. Como regla general, no coger ningn producto qumico. El profesor o
profesora te lo proporcionar.
4. Nunca devuelva los sobrantes de los productos a los frascos de origen sin
consultar con el profesor.
5. Es muy importante que cuando los productos qumicos de desecho se
viertan en la pila de desage, aunque estn debidamente neutralizados,
debe dejarse que circule por la misma, abundante agua.
6. No tocar con las manos y menos con la boca, los productos qumicos.
7. No pipetear con la boca. Utilizar una bombilla de succin.
8. Los cidos requieren un cuidado especial. Cuando queramos diluirlos,
siempre echaremos el cido sobre agua.
9. Los productos inflamables (gases, alcohol, ter, etc.) deben estar lejos de
fuentes de calor. Si hay que calentar tubos con estos productos, se har al
bao Mara, nunca directamente a la llama.
10. Manipule con precaucin los solventes voltiles e inflamables como el
ter, acetona y metanol. Nunca evapore estos solventes en una hornilla al
abierto. Utilice siempre un sistema de condensacin eficiente.
11. Si se vierte sobre ti cualquier cido o producto corrosivo, lvate
inmediatamente con mucha agua y avisa al profesor.
12. Al preparar cualquier disolucin se colocar en un frasco limpio y
rotulado convenientemente.
13. Encienda fuego en el laboratorio solo si no existen solventes inflamables
en la vecindad. La persona que encienda el fuego debe primero verificar
que no exista otra persona que este trabajando con solventes inflamables
en el laboratorio.

MATERIAL DE VIDRIO

1 Use material de vidrio limpio y no rajado.

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2 El vidrio caliente no se diferencia a simple vista del vidrio fro. Para evitar
quemaduras use guantes o trapos.
3 Si tienes que calentar a la llama el contenido de un tubo de ensayo,
observa cuidadosamente estas dos normas:

-Ten sumo cuidado y ten en cuenta que la boca del tubo de ensayo no
apunte a ningn compaero. Puede hervir el lquido y salir disparado, por lo
que podras ocasionar un accidente.
-Calienta por el lateral del tubo de ensayo, nunca por el fondo; agita
suavemente (mira la figura).

EQUIPOS ELCTRICOS

1 Manipule cualquier equipo elctrico con las manos secas y asegrese que el
rea de trabajo tambin este seca.
2 Ningn cordn electrifico debe colgar fuera de la mesa de trabajo.
3 Cuando desconecte algn equipo de tomacorriente, jlelo por el enchufe
y no por el cordn.

UTILIZACION DE BALANZAS

1 Cuando se determinan masas de productos qumicos con balanza, se


colocar papel sobre los platos de la misma y si el producto fuera corrosivo,
se utilizar una luna de reloj.
2 Se debe evitar cualquier perturbacin que conduzca a un error, como
vibraciones debidas a golpes, aparatos en funcionamiento, soplar sobre los
platos de la balanza, etc.

MANIPULACIN DE ESPECMENES
1 Manipule los microorganismos crecidos en una placa petri o tubo de cultivo
con extremo cuidado. Siempre utilice tcnicas de esterilidad (a la llama del
mechero, guantes, palillos estriles, etc.).
2 Nunca llevar a la boca plantas o partes de ellas como semillas, frutos y
hojas.

NIVELES DE RIESGO BIOLOGICO EN UN LABORATORIO

Clasificacin de microorganismos por grupos de riesgo para el trabajo de


laboratorio:

Grupo de riesgo 1 (riesgo individual y poblacional escaso o nulo)


Microorganismos que tienen pocas probabilidades de provocar enfermedades
en el ser humano o los animales.

Grupo de riesgo 2 (riesgo individual moderado, riesgo poblacional bajo)

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Agentes patgenos que pueden provocar enfermedades humanas o animales
pero que tienen pocas probabilidades de entraar un riesgo grave para el
personal de laboratorio, la poblacin, el ganado o el medio ambiente. La
exposicin en el laboratorio puede provocar una infeccin grave, pero existen
medidas preventivas y teraputicas eficaces y el riesgo de propagacin es
limitado.

Grupo de riesgo 3 (riesgo individual elevado, riesgo poblacional bajo)


Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales
graves, pero que de ordinario no se propagan de un individuo a otro. Existen
medidas preventivas y teraputicas eficaces.

Grupo de riesgo 4 (riesgo individual y poblacional elevado)


Agentes patgenos que suelen provocar enfermedades graves en el ser
humano o los animales y que se transmiten fcilmente de un individuo a otro,
directa o indirectamente. Normalmente no existen medidas preventivas y
teraputicas eficaces.

BARRERAS DE CONTENCION
Los laboratorios presentan diversas barreras de contencin que previenen el
escape y dispersin de agentes biolgicos de riesgo.

Barrera primaria: Es aquella que protege al personal y al ambiente inmediato


del agente de riesgo (vestimenta de uso exclusivo, cabina de bioseguridad y
equipos provistos de dispositivos de seguridad).

Barrera secundaria: Es aquella que protege el ambiente externo contra los


agentes de riesgo (diseo del laboratorio e implementacin de equipos de
seguridad de acuerdo al nivel de Bioseguridad).

Barrera microbiolgica: Es un dispositivo o sistema que evita o limita la


migracin de microorganismos entre los espacios situados a ambos lados del
mismo y permite controlar la concentracin de microorganismos en el
ambiente, dentro de lmites prefijados. Tiene como objetivo proteger al
operador o al operador y al proceso.

Barrera microbiolgica parcial: Es un dispositivo o sistema que limita la


migracin de microorganismos entre los ambientes situados a ambos lados del
mismo. En este tipo de barrera se recomiendan Prefiltros, Filtros HEPA (Filtros
de alta eficiencia para el control de partculas en suspensin) as como
cabinas de bioseguridad clase I o II, lo cual depender del tipo de trabajo que
se efecta en un determinado laboratorio.

Barrera microbiolgica absoluta: Es un dispositivo o sistema hermtico, a


prueba de filtraciones de aire o gas, que evita en forma total la migracin de
microorganismos entre el ambiente confinado por la barrera y el ambiente
exterior de la misma. La barrera microbiolgica absoluta puede confinar al
producto o proceso, dejando al operador fuera de la misma o viceversa. En
este caso se recomienda una cabina de bioseguridad de tipo III.

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Barrera qumica: Son dispositivos o sistemas que protegen al operador del
contacto con substancias irritantes, nocivas, txicas, corrosivas, lquidos
inflamables, sustancias productoras de fuego, agentes oxidantes y sustancias
explosivas. En este caso se recomiendan una cabina de seguridad qumica.

Barrera fsica: Son dispositivos o sistemas de proteccin individual o colectiva


que protegen contra las radiaciones ionizantes, no ionizantes, ruidos, carga
calrica, quemaduras y vibraciones excesivas.

NIVELES DE BIOSEGURIDAD

De acuerdo con el nivel de riesgo, el tipo de laboratorio, la barrera de


contencin requerida, los procedimientos y tcnicas a usar, se han establecido
los siguientes niveles de Bioseguridad.
Nivel de Bioseguridad I: Es aquel que corresponde a las actividades
desarrolladas en un laboratorio bsico, por personal adiestrado en los
procedimientos que se ejecutan en l. En este nivel se trabaja con agentes
clasificados en el Grupo de riesgo I por presentar un peligro mnimo para el
personal del laboratorio y para el ambiente. En el nivel de Bioseguridad I no se
requiere equipo especial ni un diseo especfico de las instalaciones. El
personal de estos laboratorios es generalmente supervisado por un cientfico
con entrenamiento en microbiologa.

Nivel de Bioseguridad II: Es aquel que corresponde a las actividades


desarrolladas en un laboratorio bsico, por personal adiestrado en el manejo de
agentes de riesgo del grupo II. Es similar al nivel I y en l se manejan agentes
de peligro moderado hacia el personal y el ambiente, pero difiere del nivel I en
las siguientes caractersticas:
1. El personal de laboratorio tiene entrenamiento especfico en el manejo de
agentes patgenos.
2. El acceso al laboratorio es restringido cuando se est realizando algn
trabajo.
3. Se toman precauciones extremas con instrumentos punzo cortantes
contaminados.
4. Ciertos procedimientos en los cuales pueden salpicar los agentes o
aerosoles se llevan a cabo en cabinas de trabajo microbiolgico.

Nivel de Bioseguridad III: Es aquel que corresponde a las actividades


desarrolladas en el laboratorio de contencin. El personal debe contar con
adiestramiento especfico para el manejo de agentes de alto riesgo clasificados
en el grupo de riesgo III. En el laboratorio se realiza trabajo con agentes que
pueden causar un dao serio y potencialmente mortal como resultado de la
inhalacin o exposicin a los mismos. El laboratorio cuenta con un diseo y
caractersticas especiales tendientes a proteger al operador y al ambiente.
Todos los materiales son manipulados utilizando vestimenta y equipo de
proteccin siguiendo protocolos rigurosos. Los laboratorios se mantienen con
una presin de aire negativa, lo cual ayuda a impedir que los agentes nocivos
escapen al ambiente.

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Nivel de Bioseguridad IV: Es aquel que corresponde a las actividades
desarrolladas en el laboratorio de contencin mxima. Este nivel es el que se
utiliza para trabajar con agentes biolgicos clasificados en el grupo de riesgo IV
por representar un alto riesgo individual de contagio y que adems son un
riesgo para la vida. Los agentes nuevos que presentan caractersticas
antignicas, patognicas u otras similares a agentes de nivel III y IV son
confinados a nivel IV hasta que exista suficiente informacin cientfica para
establecer a cual grupo de riesgo pertenecen.
El personal que trabaja en los laboratorios de nivel IV tiene entrenamiento
especfico y extensivo en el manejo de agentes infecciosos, y cuenta con
entrenamiento para trabajar en el ambiente estril y controlado. El laboratorio
cuenta con un diseo y caractersticas especiales tendientes a proteger al
operador y al ambiente. Todos los materiales son manipulados utilizando
vestimenta y equipo de proteccin de caractersticas superiores a las exigidas
para el trabajo en un laboratorio de nivel III. Los trajes estn diseados para
cubrir la totalidad del cuerpo, presentan un sistema de respiracin individual
asociado y una leve sobrepresin interna para evitar as la entrada accidental
de partculas infecciosas. Los laboratorios se mantienen con una presin de
aire negativa, lo cual ayuda a impedir que los agentes nocivos escapen al
ambiente.

TIPOS DE LABORATORIOS
En relacin con el grado de riesgo los laboratorios combinan las caractersticas
de diseo, construccin, medios de contencin, equipo, prcticas y
procedimientos de operacin necesarios para trabajar con agentes patgenos
de los distintos grupos de riesgo. De esta manera los laboratorios se clasifican
en 3 categoras:
Laboratorio bsico: Dividido en dos grupos, el de nivel de bioseguridad 1;y el
de nivel de bioseguridad 2;
Laboratorio de contencin: con nivel de bioseguridad 3, y
Laboratorio de contencin mxima: con nivel de bioseguridad 4.

PRCTICA GUIADA N 1

1.-Complete los nombres de los distintos smbolos de bioseguridad que


se presentan a continuacin.

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1.- complete el recuadro :

NIVEL DE CARACTERISTICAS EJEMPLOS DE


BIOSEGURIDAD PATOGENOS

Firma del alumno Firma del profesor

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PRACTICA N I.2 SEMANA N 3

INSTRUMENTACIN: CENTRIFUGACION

P
rocedimiento por el cual se aplica la FUERZA CENTRFUGA para
separar partculas que se encuentran en suspensin en un medio
lquido. El incremento de la fuerza centrifuga condicionar que las
partculas migren alejndose del eje de rotacin de la centrifuga. El
proceso migratorio de las partculas se denomina sedimentacin y la velocidad
con que sedimentan es proporcional a la fuerza centrifuga expresada como
incrementos de la gravedad (G).
La constante gravitatoria es proporcional a la velocidad de giro del rotor
soporte del medio que se centrifuga y del radio del mismo. El radio del rotor
de la centrifuga depende si sta es del tipo ngulo fijo o flotante. En el primer
caso es un promedio entre el radio mnimo y el mximo, y en el segundo es la
distancia entre fondo del tubo y el eje.

La velocidad de la sedimentacin se altera por la fuerza centrfuga, pero


adems por la forma de las partculas, y por la viscosidad del medio lquido que
las suspende. Tambin depende de la temperatura en cuanto sta altere la
viscosidad del medio o de las cargas elctricas de las partculas.
Los equipos que permiten la centrifugacin se llaman centrfugas y constan de
un motor con controles, que mueven un rotor que sostiene los tubos de
centrifugacin. Los rotores son de dos clases, de ngulo fijo y flotantes, tal
como se ve ms arriba.
La mayora de la centrfugas de laboratorio alcanzan las 5000 rpm, aunque
algunas alcanzan los 16 000 rpm. Algunas centrfugas tienen refrigeracin lo
que permite separar partculas biolgicamente activas tales como factores de
coagulacin, enzimas, etc.
Las ultracentrfugas son centrfugas con vaco, refrigeracin y velocidades de
ms de 500 000 x g. Permiten la separacin de los componentes tisulares, tal
como se aprecia en el cuadro adjunto y poder estudiar cada uno de ellos a
partir del homogenizado de un tejido cualquiera.

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Para evaluar con certeza la capacidad de una centrfuga para separar los
componentes celulares debemos manejar gravedades en lugar de revoluciones
por minuto, por lo que frecuentemente usamos el nomograma de Dole y Cotziar
que presentamos a continuacin.
Suspender el tejido al 10%
Homogenizar en Potter E.

Centrifugar a 600g x 10

Sedimento: ncleos, restos


celulares

Centrifugar el sobrenadante
a 4000g x 15

Sedimento:
mitocondrias

Centrifugar el sobrenadante
a 16 500g x 15

Sedimento:
lisosomas

Centrifugar el sobrenadante
a 100 000g x 40

Sedimento:
microsomas

Sobrenadante: citosol

TIPOS DE CENTRIFUGACIN

1. Diferencial: separa de acuerdo a las diferentes velocidades de


sedimentacin de distintas partculas. La usamos en la clnica para
separar sedimentos de orina, o componentes del plasma.
2. Zonal: usando una gradiente de densidad lograda con un soluto denso,
la ms usada la sacarosa, las molculas sedimentan de acuerdo a su
coeficiente de sedimentacin. La sacarosa densa evita que las bandas
se mezclen.

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La gradientes pueden ser discontinuas preparadas mediante la colocacin de
soluciones de diversa densidad una sobre otra- y continuas preparada
mediante un equipo de mezcla de soluciones, que va incrementando la
densidad progresivamente.

NOMOGRAMA DE CALCULO VELOCIDAD Y RADIO DE CABEZAL DE CENTRFUGA


TUBOS DE CENTRIFUGACIN:

Existen tubos de centrfuga de diversa composicin:


1. Policarbonato: vidrio transparente, autoclavable y resistente a los
cidos y bases de baja dilucin.
2. Borisilicato: vidrio muy resistente a qumicos de alta concentracin .
3. Polietileno: plstico muy resistente a los qumicos, pero sensible a la
temperatura.
4. Propileno: plstico bastante resistente a la temperatura autoclavable-
y resistente a casi todos los qumicos.

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PORTATUBOS
Son de plstico o de metal y poco resistente a cidos y bases fuertes. Deben
ser conservados muy limpios.

Firma del alumno Firma del profesor

PRACTICA N I.3 SEMANA N 4

INSTRUMENTACIN: COLORIMETRIA
Es el anlisis de la concentracin de una muestra por el color que presenta.
Todos hemos tenido la experiencia de valorar la concentracin de sustancias
coloreadas en solucin, por observacin directa, una taza de caf o t, un vaso
de refresco, son apreciados de esa manera. El examen se funda en la mayor o
menor absorcin de luz de acuerdo al mayor nmero de molculas y tonalidad
depender de la capacidad de absorber una u otra longitud de onda de luz,
especficamente. La fotocolorimetra manipula las variables de este fenmeno
controlando la luz incidente proveniente de un foco luminoso y su pureza, de
modo tal que slo incida aquella luz que es especficamente absorbida por la
partcula que medimos. 450nm
Rayos X 540nm Microondas:
1nm a 1pm 640nm 25um a 1mm

Rayos Ultravioleta: Infrarrojo: Ondas de radio


< 1pm 400nm a 1nm 750nm a 25 um > 1mm
Los cuerpos luminosos como el sol o las lmparas elctricas emiten un gran
espectro electromagntico que comprende amplias longitudes de onda, de las
cuales muy pocas corresponden al espectro visible. En el cuadro anterior se
aprecian todas las radiaciones electromagnticas conocidas.
Los cuerpos coloreados, absorben luz de determinada longitud de onda y
reflejan el resto del espectro luminoso visible e invisible (colores
complementarios) Esta luz reflejada es la que observamos como color propio
del cuerpo coloreado. No interesa particularmente los colores que absorbe la
solucin que queremos medir. La selectividad de absorcin que queremos
medir. La selectividad de absorcin de una partcula por una longitud de onda
se basa en el hecho de que cada longitud de onda de luz corresponde a un

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distinto nivel de energa, y para excitar los electrones de cada partcula
necesitamos un particular nivel de energa.
Si consideramos que cada molcula absorbe luz de acuerdo a la concentracin
en que se encuentre dentro de la solucin, a mayor absorcin de luz y menor
luz trasmitida. Estos factores estn considerados en la ley de Lambert y Beer.

Longitud de onda Color Colores complementarios


400-435 violeta amarillo-verde
435-480 azul amarillo-verde
480-490 verde-azul anaranjado
490-500 azul-verde rojo
500-560 verde purpura
560-580 amarillo-verde violeta
580-595 amarillo-verde azul
595-610 anaranjado verde-azul
610-750 rojo azul-verde
Los cuerpos coloreados, absorben luz de determinada longitud de onda y
reflejan el resto del espectro luminoso visible e invisible (colores
complementarios). Esta luz reflejada es la que observamos como color propio
del cuerpo coloreado. Interesa particularmente los colores que absorben la
solucin que queremos medir. La selectividad de absorcin de una partcula
por una longitud de onda se basa en que cada longitud de onda de luz
corresponde a un distinto nivel de energa y para excitar los electrones de cada
partcula se necesita un particular nivel de energa.
S consideramos que cada molcula absorbe luz de acuerdo a la concentracin
en que se encuentre dentro de la solucin, a mayor concentracin de
sustancia, mayor absorcin de luz y menor luz trasmitida. Estos factores estn
considerados en la Ley de Lambert y Beer, que es la siguiente:

Log Io/It = e.l.c


Donde: Io = Luz incidente, It = Luz transmitida, C = concentracin, L =
longitud de paso, e = constante.

FOTOCOLORIMETRIA ESPECTROFOTOMETRIA

La fotocolorimetra es la medida de la luz absorbida por una solucin mediante


un aparato que es un fotocolormetro. El equipo consta de una fuente de luz
artificial, un monocromador que separa exclusivamente luz de una sola longitud
de onda (la que sea preferente para la medida), un recipiente o tubo de vidrio
(que alberga la solucin a medir), una clula fotoelctrica que transforma la luz
trasmitida en corriente elctrica y una unidad de medida de la corriente
elctrica o galvanmetro.

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Luz Incidente Io Luz trasmitida It

La calificacin de colormetro o espectrofotmetro depende del


monocromador, s ste es un filtro tendremos un fotocolormetro, pero si es un
prisma, o cualquier aditamento que proporcione luz de diversas longitudes de
onda tendremos un espectrofotmetro.

Fuente de luz blanca Muestra: Absorcin Galvanmetro

Monocromador Celda

Los fotocolormetros y los espectrofotmetros reportan sus resultados bajo dos


formas: absorbancia o luz absorbida por las partcula de la solucin y
transmitancia a o luz transmitida luego de atravesar el tubo con la solucin. La
transmitancia se expresa en valores numricos entre 0 y 100%, es decir que
una solucin que no tiene particular trasmitir el 100% y una perfectamente
opaca el 0%. La absorbancia, tambin llamada densidad ptica DO, se expresa
en valores semilogartmicos entre 0 y 2 correspondiendo el 0 a la solucin que
no tiene partculas y por lo tanto no absorbe la luz.
Para encontrar la concentracin de una solucin problema, debemos comparar
su lectura frente a un blanco agua destilada o reactivos sin modificarse con
la lectura de un patrn o solucin estndar bajo las mismas condiciones. Una
solucin estndar es generalmente una que contiene el problema con una
concentracin perfectamente medida en el laboratorio.

CLCULO DE LA CONCENTRACIN DE UN PROBLEMA

Para hallar la concentracin de una muestra problema tenemos dos


procedimientos:

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1. Factor de Calibracin
2. Curvas de calibracin

Factor de calibracin: es la concentracin de sustancia que corresponde a


una unidad de medida, generalmente 0,001 de absorbancia.

Se obtiene Factor de calibracin: concentracin del patrn

Lectura del patrn (en absorbancia)

Esta frmula deriva de la densidad ptica o absorbancia del problema:

DOP= eP lP cP

Si el coeficiente de extincin (e) es el mismo en ambos casos y el dimetro del


tubo de lectura(l) es el mismo, la nica diferencia est en la concentracin.
Luego:

DOst CS
=
DOp CP

Despejando la concentracin del problema cp, se obtiene:


cs
cp=Dp x --------
Dost

Concentracin del problema = Densidad ptica del Problema X Factor de


calibracin
La curva de calibracin consiste en la obtencin de las lecturas de absorcin 0
de % de trasmitancia que corresponde a una secuencia creciente de
concentraciones, estas son graficadas en un papel milimtrico si se trata de
absorbancia o densidad ptica y de papel semilogartmico si se trata de % de
transmitancia.

PARTE EXPERIMENTAL

PREPARACIN DE UNA CURVA DE CALIBRACIN


El experimento consiste en preparar tubos de concentracin creciente de un
colorante y leerlos al fotocolormetro o al espectrofotmetro, llevando a cero (0)
el aparato con agua destilada. Construir una grfica usando papel milimetrado
para las lecturas hechas en DO (densidad ptica) o papel semilogartmicos
para las lecturas hechas en % transmitancia.
Para el efecto, preparar cinco tubos de acuerdo al esquema y leer las
soluciones al espectrofotmetro a 540 nm de longitud de onda. Practicar esta
lectura tanto en DO como en % de transmitancia.

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Construir dos curvas de calibracin, una en papel milimetrado y otra en papel
semilogartmico.

Tubo N
Contenido 1 2 3 4 5
mL Azul metileno al (5 mg/mL) 2 4 6 8 10
mL Agua destilada 8 6 4 2 0

Concentracin (mg/mL) %T A (A=2-logT%)

Desconocido 1
Desconocido 2

1.40
1.20
Abs (540 nm)

1.00
0.80
0.60
0.40
0.20
0.00
0 1 2 3 4 5 6 7
Concentracin (mg/mL)

COMENTARIO


...
Usando los valores obtenidos en % de trasmitancia, grafique usando el papel
semilogartmico de esta pgina.

17
100
80

% T (540 nm)
60
40
20
0
0 1 2 3 4 5 6 7
Concentracin (mg/mL)

COMENTARIO

Firma del alumno Firma del profesor

PRACTICA N I.4 SEMANA N 5

INSTRUMENTACIN: POTENCIOMETRIA
La potenciometra es el procedimiento de eleccin para la medida del pH. El pH
en una expresin numrica que corresponde al logaritmo de la inversa de la
concentracin de iones H+. La potenciometra se basa en la diferencia de
potencial (voltaje) entre dos electrodos, el de medida y el de referencia, ambos
sumergidos en la solucin y bajo condiciones de equilibrio.
El instrumento consta de un ELECTRODO DE REFERENCIA que se mantiene
constante durante la medida, un ELECTRODO DE MEDIDA que varia de
acuerdo a la concentracin de hidrgeno de la solucin y un dispositivo o
potencimetro que mide la diferencia de potencial. El electrodo de referencia
puede ser de dos clase: de calomel, mercurio metlico y cloruro mercurioso y

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de plata plata y cloruro de plata. El potencial de ese electrodo depende de la
solucin de cloruro de potasio en que est sumergido internamente.
El electrodo de medida, es tambin llamado electrodo de vidrio, est constituido
por un tubo de vidrio cuyo extremo es particularmente selectivo al paso de
iones hidrgeno. En su interior hay cido clorhdrico HCl 0,1 M y un alambre de
plata, cloruro de plata,

Batera

0V 1V

AAg.Aa Solucin KCl.Hg2Cl2.Hg


HclgCl.HCl.Vidrio
Problema
.

En el potencimetro, un voltaje variable se opone al de la celda de medida. Un


galvanmetro acta como detector del punto nulo para indicar que es igual al
voltaje opuesto de la celda de medida. Conectando la celda desconocida al
circuito se produce un desnivel de voltaje que debe corregirse hasta alcanzar el
punto nulo. La magnitud de la correccin puede leerse como fuerza
electromotriz o como pH directamente.
En la prctica se ha usado los electrodos de pH para medir la concentracin de
otros iones. Los electrodos tienen una membrana adicional que slo es
selectiva al paso de determinado electrolito, sodio, potasio, calcio son medidos
bajo esta manera con facilidad. Tambin existe el electrodo de CO2 que deja
pasar molculas se este gas las que modifican el pH y por lo tanto son medidas
con el electrodo de vidrio de pH.

PARTE EXPERIMENTAL

TITULACIN DE UN CIDO DBIL CON UNA BASE FUERTE.

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Se trata de determinar el pH de un grupo de tubos con varios niveles de
titulacin de cido actico con hidrxido de sodio. Cuando se titula un cido
dbil con una base fuerte se produce un aumento de pH inicialmente rpido
para luego hacerse lento, dentro de ciertos mrgenes y al final se alcaliniza
rpidamente. La identificacin del cambio de pH en cierto perodo de la
titulacin, se debe a la formacin transitoria de una combinacin de cido dbil
y la sal correspondiente. En el caso del experimento ser la combinacin de
cido actico y acetato de sodio y son los componentes ordinarios de una
solucin amortiguadora o solucin buffer.
Para la experiencia preparar 11 tubos de acuerdo al siguiente esquema:

Tubo No mL actico 0,1 N mL NaOH 0,1 N mL agua destilada

1 5,0 0,0 5,0


2 5,0 0,5 4,5
3 5,0 1,0 4,0
4 5,0 1,5 3,5
5 5,0 2,0 3,0
6 5,0 2,5 2,5
7 5,0 3,0 2,0
8 5,0 3,5 1,5
9 5,0 4,0 1,0
10 5,0 4,5 0,5
11 5,0 5,0 0,0

Leer los tubos en el potencimetro y graficar los resultados

14
13
12
11
10
9
8
pH

7
6
5
4
3
2
1
0
4 5 6 7 8 9 10 11 12
Volumen (mL)

20
COMENTARIO

Firma del alumno Firma del profesor

PRACTICA N I.5 SEMANA N 6

CINETICA ENZIMATICA
Las enzimas son protenas que aceleran las reacciones qumicas hasta su
punto de equilibrio.

La ecuacin general de las enzimas es:

E + S ES E+P
C C

La actividad enzimtica se manifiesta y mide por:

Desaparicin de sustrato
Formacin de producto
Modificacin de cofactor

Muchos factores modifican la actividad enzimtica:

pH
Temperatura
Concentracin de sustrato
Concentracin de enzima
Tiempo de incubacin

21
En nuestra prctica observamos el efecto de la pepsina sobre la albmina del
huevo. La actividad enzimtica se apreciar por la prdida de la turbidez
proteica. La actividad enzimtica reportar en funcin del % de formacin de
producto par ello hacer uso de la siguiente ecuacin:
% Formacin de producto (FC) = 100 (Abs tubos/Abs albmina)*100
Donde: Abs tubo = Absorbancia de los tubos despus del incubado.
Abs albmina = Absorbancia de la albmina (Abs = 0.995)

3. EXPERIMENTO.- Efecto del pH

El pH acta sobre los grupos ionizados que pertenecen a los centros activos
de las enzimas. Los grupos que pierden la ionizacin pierden la capacidad de
interaccionar con el sustrato. Cada enzima tiene un pH ptimo de trabajo.

Preparar cinco tubos con:

TUBO N 1 2 3 4 5
pH 1,0 1,5 6,0 9,5 11
mL albmina 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
mL HCL 1N 2,0 0,5 0,0 0,0 0,0
mL CO3Na2 0,0 0,0 0,0 0,5 2,0
mL agua destilada 0,0 1,5 2,0 1,5 0,0

Preincubar los cinco tubos ms un tubo conteniendo 20 mL de pepsina al 1%


a 37C por 5 minutos. Luego aadir rpidamente 3 mL de la pepsina
preincubada a cada uno de los tubos 15. Mezclar e incubar a 37C por 10 min.
Observar la diferencia o leerla en fotocolormetro con filtro azul (420 nm).

4. EXPERIMENTO: Efecto de la temperatura.

Todo aumento de temperatura incrementa la actividad enzimtica por aumento


de la energa de activacin. Pero paralelamente se va produciendo una
desnaturalizacin parcial de la enzima que la inactiva.

Preparar cinco tubos con:

TUBO N 1 2 3 4 5
mL albmina 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
mL HCL 1N 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
mL agua destilada 3,5 3,5 3,5 3,5 3,5

Preparar otros cinco tubos con:

TUBO N 6 7 8 9 10
mL pepsina 1% 1,0 1,0 1,0 1,0 1,0

22
Incubar por 5 minutos de acuerdo al siguiente esquema de temperatura:

TUBO N 1y6 2y7 3y8 4y9 5 10


Temperatura O C Amb. 37 C 70 C 37 C 100 C

Agregar los respectivos tubo N 6 al N 10 a los que hay que incubar a las
temperaturas a que se pre-incuban los tubos 1 5.

5. EXPERIMENTO. -Efecto de la concentracin de la enzima

Aunque las enzimas no se destruyen ni con las reacciones, el aumento de ellas


en la cubeta de reaccin incrementa la velocidad.

Preparar 5 tubos con:

TUBO N 1 2 3 4 5
mL albmina 5,0 5,0 5.0 5,0 5,0
mL HCL 1N 0,5 0,5 0.5 0,5 0,5
mL agua destilada 1,5 2,5 3.5 4,0 4,5
mL pepsina 0,0 0,0 0.0 0,0 0,0

Incubar los 5 tubos a 37C por 5 minutos y enseguida aadir:

TUBO N 1 2 3 4 5
mL pepsina incubada 3,0 2,0 1,0 0.5 0,1

Incubar por cinco minutos a 37C. Observar al fotocolormetro a 420 nm


(filtro azul), contra una lectura de agua.

6. EXPERIMENTO.-Efecto de la concentracin del sustrato

Si es una reaccin enzimtica incrementamos progresivamente la


concentracin del sustrato, aumentar la velocidad enzimtica (velocidad
inicial) hasta un punto en que la velocidad llega a una meseta plana que no
modifica aunque sigamos aumentando el sustrato, habremos saturado la
enzima.
Preparar 6 tubos con:

TUBO N 1 2 3 4 5 6
mL albmina 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0
mL HCL 1N 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5
mL agua destilada 7,0 6,0 5,0 4,0 3,0 2,0

23
mL pepsina 1% 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0 0,0

Leer a 420 nm (filtro azul). Anotar los resultados: incubar a 37C. Colocar 0,5
mL que pepsina pre-dirigida. Incubar por otros 5 minutos a 37C. Leer al
fotocolormetro a 420 nm (filtro azul). Restar la segunda lectura de la primera.
Graficar y comentar los resultados.

Experimento: Efecto del pH Experimento: Efecto de la


100
temperatura
100
% Formacin producto

% Formacin producto
80
80
60
60

40
40

20
20

0 0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 0 20 40 60 80 100
pH Temperatura (C)
Comentario: Comentario:




Experimento: Efecto de la Experimento: Efecto de la


concentracin de enzima
concentracin de sustrato
% Formacin producto
% Formacin producto

100 100
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
0 2 4 6 8 10 12 0 1 2 3 4 5 6
Concentracin enzima (mg/mL) Concentracin de sustrato

Comentario: Comentario:




24
Firma del alumno Firma del profesor

PRACTICA N II.1 SEMANA N 7

DIGESTION DE CARBOHIDRATOS
El carbohidrato ms importante en la alimentacin es la glucosa, la cual
ingerimos bajo la forma de disacridos (maltosa, sacarosa y lactosa) o de
almidn, polisacridos formado por muchas molculas de glucosa. El almidn
es el constituyente esencial de cereales, leguminosa, tubrculos y races. La
digestin del almidn se produce en el intestino delgado gracias a la presencia
de enzimas digestivas producidas por las glndulas salivares, el pncreas y la
pared intestinal. Estas enzimas son:
La alfa amilasa salivar
La alfa amilasa pancretica
La amilo 1,6 glucosidasa de la pared intestinal

Las alfa amilasas son enzimas que actan a pH neutro y en presencia de iones
cloro. Rompen los enlaces amilo 1,4 dando como resultado oligosacridos y
glucosa.
Existe dos formas de evaluar la actividad enzimtica de la amilasa:
Por desaparicin de sustrato: forma como desaparece el almidn el que
se aprecia por la reaccin del lugol.
Por formacin de producto: forma como aparecen carbohidratos
reductores (glucosa) en el medio, los que se aprecian por reduccin del
cobre.

En nuestra prctica evaluaremos la actividad enzimtica de la amilasa sobre el


almidn mediante la reaccin del remanente de almidn frente al yodo a mayor
decoloracin, mayor actividad enzimtica.

1. EXPERIMENTO.- Digestin del almidn por la amilasa salivar.

Para la experiencia preparar cuatro tubos de ensayo de acuerdo al siguiente


esquema.

TUBO 1 2 3 4

25
ml almidn 1% 2 2 2 2
ml Buffer fosfato pH 6,6 1 1 1 0
ml HCL 0,3N 0 0 0 3,4
ml Suero fisiolgico 3 2,4 0 0
ml Agua destilada 0 0 2,4 0
Colocar en bao de Mara a 37C por 5 minutos. Agregar:
ml solucin de saliva 0 0,6 0,6 0,6
Colocar en bao de mara a 37C por 20 minutos
Pasado este tiempo tomar 0,5ml de cada tubo y preparar cuatro tubos
ms de acuerdo al esquema

TUBO
1 2 3 4
ml digestin tubo 1 0, 5 0 0 0
ml digestin tubo 2 0 0,5 0 0
ml digestin tubo 3 0 0 0,5 0
ml digestin tubo 4 0 0 0 0,5
ml HCL 0,05N 5 5 5 5
ml Solucin yodada 0,5 0,5 0,5 0,5
Dejar en reposo por 15 minutos. Leer al fotocolormetro con filtro rojo
(660nm)

INFORME DE LA PRCTICA III

Nombre:
Grupo : Fecha:

Experimento 7.- Digestin del almidn por la amilasa salivar


1.05

0.90

0.75

0.60
Abs

0.45

0.30

0.15

0.00
Tubo 1 Tubo 2 Tubo 3 Tubo 4 Tubo 5
26
COMENTARIO:

Firma del alumno Firma del profesor

SEMANA N 8

SEMANA DE EVALUACIONES

SEMANA N 9

SEMANA DE LA MEDICINA

27
PRACTICA N II.2 SEMANA N 10

ABSORCION DE CARBOHIDRATOS
Despus de la digestin de los carbohidratos por efecto de amilasas salivar y
pancretica, amilo 1,6 glucosidasa, y disacarasas tenemos como resultado
monosacridos: glucosa, fructosa, galactosa, que debern ser absorbidos por
la mucosa intestinal para su ingreso a la circulacin sangunea. Los
carbohidratos se absorben en el yeyuno mediante dos mecanismos, la simple
difusin favorecida por la gradiente de concentracin y el transporte activo, an
contra la gradiente. El orden de facilidad en la absorcin es de galactosa
glucosa: ribosa.
El borde en cepillo de las clulas intestinales tiene varios sistemas
trasportadores. Un transportador de glucosa dependiente del sodio (SLGT1) se
enlaza tanto a la glucosa como al sodio en sitios separados aumentando el
tenor de sodio intracelular.
La energa necesaria para este transporte se obtiene de la hidrlisis del ATP
vinculado a una bomba de sodio que intercambia sodio con potasio.

Tambin participa un transportador facilitador independiente del sodio llamado


GLUT 5. La hidrlisis de los polisacridos, oligosacridos y disacridos es muy
rpida por lo que usualmente los procedimientos de absorcin se saturan con
rapidez.

1. EXPERIMENTO.-Absorcin de la glucosa por el intestino de la rata

28
1. Se usan ratas con 24 a 36 horas de ayuno. Se les anestesia con eter
bajo una campana de vidrio. Abrirles el abdomen y se retira una porcin
de 5 cm de intestino, de modo que no quede mesenterio adherido.

2. Se lava la luz intestinal varias veces mediante una jeringa con solucin
Ringer Fosfato pH 7,4 Mediante el uso de una baqueta de vidrio se
empuja un extremo del intestino dentro del mismo buscando evertir la
porcin mucosa hacia fuera. Mantener el intestino en solucin Ringer
Fosfato pH 7,4 a temperatura ambiente.

3. Cerrar un extremo del intestino con hilo y dejar otra ligadura suelta en el
otro extremo del intestino.

4. Introducir en el saco intestinal formato 2 ml de solucin Ringer Fosfato


pH 7,4 con 0,2% de glucosa. Cerrar la ligadura suelta y revisar que no
haya prdida de lquido.

5. Introducir el saco lleno en un tubo con 2 ml solucin Ringer Fosfato pH


7,4 con glucosa 0,2% Incubar a 37C por 30 minutos. Pasado del tiempo
sacar el saquito, secarlo por fuera con papel de filtro. Cortarlo con tijera
y vaciar el contenido en u tubo de ensayo.

6. Diluir 1:10 con agua destilada, tanto el contenido del saquito, como el del
tubo que lo recibi durante la incubacin. Luego proceder a preparar 4
tubos de acuerdo al siguiente esquema.

TUBO 1 2 3 4
ml reactivo para glucosa 2 2 2 2
l agua destilada 50 0 0 0
l patrn 20 mg/dL 0 50 0 0
l solucin diluida intra saco 0 0 50 0
l solucin diluida extra saco 0 0 0 50
Incubar a 37C por 10 minutos. Enfriar y leer en el fotocolormetro a
520nm. Usando el tubo 1 como blanco

COMENTARIO:

Firma del alumno Firma del profesor

29
PRACTICA N II.3 SEMANA N 11

GLICOLISIS
La va metablica ms importante para la glucosa es la va glicoltica o de
Embden Meyehof. Esta presente, naturalmente, en todos los tejidos y es
responsable del aprovechamiento energtico de la glucosa y an de otros
carbohidratos. Tiene dos formas de manifestarse: la forma anaerbica cuando
la concentracin de oxgeno es baja, produce cido pirvico y cido lctico, y
genera escasamente dos molculas de ATP, tal como se aprecia en la
siguiente frmula global.

GLUCOSA + 2ADP + Pi 2 lactato + 2ATP + 2H2O

Cuando la gliclisis transcurre en presencia abundante de oxgeno, tiene


como producto final el cido pirvico, el cual se transforma en actil CoA
mediante el proceso de decarboxilacin oxidativa, en ingresa al Ciclo de Krebs
donde produce 38 molculas de ATP.

30
1. EXPERIMENTO.- Gliclisis.

La gliclisis anaerbica (parcialmente) se demuestra por el aumento


de compuestos cidos (pirvico y lctico) en el tubo de reaccin.
Para el efecto preparar cuatro tubos de acuerdo al esquema.

TUBO
1 2 3 4
ml solucin de Potter pH 7,4 2,5 2,5 2,5 2,5
ml Glucosa 0,1 m 0,5 0,5 0,5 0,5
ml NAD 10m g/ml 0,2 0,0 0,2 0,2
ml ATP 5m g/ml 0,2 0,2 0 0,2
ml Nicotinamida 0,4m 0,1 0,1 0,1 0,1
ml Yodoacetato 0,1m 0 0 0 0,1
ml Agua destilada 0,1 0,3 0,3 0
Colocar en bao de mara 37C por 5 minutos
Gotas de rojo de fenol Ii Ii ii Ii
ml homogenizado de hgado 0,5 0,5 0,5 0,5

31
Tapar e incubar 1 hora a 37C
Titular cada tubo con NaOH 0,01N hasta el color original

COMENTARIO:

RESPIRACIN TISULAR

La respiracin tisular es el proceso por el cual se


aprovecha la energa almacenada en los
nutrientes (glucosa, cidos grasos, aminocidos)
a travs del Actil CoA, mediante procesos de
oxidacin.
Durante el proceso de oxidacin del Acil Coa se
forman equivalentes reductores en forma de
hidrgeno o electrones que ingresan a la cadena
respiratoria, localizada en las mitocondrias y
genera muchas molculas de ATP. Como puede
apreciarse en el esquema adjunto hay tres
fuentes de generacin de electrones que
producen 3 molculas de ATP, el isocitrato, el
cetoglutarato y el malato y una que slo
proporciona dos ATP que es el succinato, debido
a que ingresa al ciclo de Krebs a nivel de la
Coenzima Q y no del NAD como las otras.
El punto final del transporte de los electrones por
la cadena respiratoria es el oxgeno. Dos tomos de hidrgeno se unen a
molcula de oxgeno para forma una molcula de agua. El proceso
oxidativo de los nutrientes se puede seguir por el consumo de oxgeno. .

2. EXPERIMENTO: Respiracin Tisular

El experimento estudia la respiracin tisular mediante la manometra. Un


manmetro es un instrumento que mide los cambios en la presin de los
gases. Esta basado en el principio de vasos comunicantes, si colocamos un
lquido en dos recipientes que se comunican entre s, ambas ramas sern
iguales siempre que sobre ellas exista la misma presin sobre una de ellas
disminuye los niveles de lquido se desigualan. Los equipos que usaremos
sern iguales o semejantes a los que se observan en el grfico, es decir
constan de un ambiente cerrado para la reaccin, un medio de absorcin de
CO2 que puede combinar

Preparar dos frascos de acuerdo al siguiente esquema:

FRASCO N 1

32
ml Solucin de Potter pH 7,4 3
ml Succinato de potasio 0,5m 0,3
ml Agua destilada 0,7
ml Homogenizado 0,5

Cerrar bien los frascos. Incubar a temperatura ambiente. Medir cada 2 minutos
la modificacin del nivel del manmetro. Prepara un grfico de consumo de
oxgeno vs tiempo.

Consumo de oxgeno en el tiempo

0.5
Volumen O2 consumido

0.4

0.3
(cm3)

0.2

0.1

0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Comentario: Tiempo (Minutos)

Firma del alumno Firma del profesor

PRACTICA N II.4 SEMANA N 12

33
COLESTEROL DE FRACCIONES LIPOPROTEICAS
Las protenas son lpidos complejos resultado de unir la grasa con protenas.
Los lpidos sanguneos se encuentran bajo esta forma y divididos en cuatro
tipos de lipoprotena:

Alfa lipoprotena (HDL) ricas en protenas y fosfolpidos


Pre beta lipoprotenas (VLDL): ricas en triglicrido
Beta lipoprotenas (LDL): ricas en colesterol
Quilomicrones (Q): ricos en triglicridos dietticos

Toda las lipoprotenas tienen colesterol, triglicridos, fosfolpidos y protenas,


pero en distinta concentracin relativa.
El colesterol es la grasa que genera la arterioescleroris al depositarse en las
paredes de los vasos sanguneos. El colesterol de las betalipoprotenas est en
actitud de depositarse en los vasos constituye la mayor parte del colesterol
sanguneo. El colesterol de las alfa lipoprotenas (HDL) es aquel que est
siendo retirado de los vasos, por lo que su presencia es beneficiosa.
Para investigar el colesterol de las alfa lipoprotenas usamos un reactivo
precipitante (fosfotngstico-cloruro de calcio) que precipita a las betas y
prebetalipoprotenas dejando en solucin a las alfa, sobre las que se realiza la
reaccin de color tpica del colesterol.

1. EXPERIMENTO Dosaje colesterol total y colesterol HDL en sangre.

Se toma una muestra de sangre del paciente en ayuno de por lo menos 24


horas. La sangre se coloca en tubo limpio sin anticoagulante.

Preparar un tubo al que se le coloca:

1ml de suero lmpido


0.1 ml de reactivo precipitante HDL o II gotas

34
Agitar y dejar en reposo por minutos al ambiente Centrifugar a 3 000 por 10
minutos separar el sobrenadante.

Preparar cuatro tubos lmpidos y colocar:

TUBO N 1 2 3 4
ml Suero lmpido
0,02 0 0 0
ml Sobrenadente anterior
0 0,02 0 0
ml Patrn de colesterol
0 0 0,02 0
ml Agua destilada
0 0 0 0,02
ml Reactivo de color
2 2 2 2

Agitar: Incubar por 15 minutos a 37C.

Leer al fotocolormetro a 520 mu los tubos 1,2 y 3, llevando a cero con el


blanco (tubo4)
Clculos
200

Colesterol mg/dl= -------- X D.O.(1 2)


D.O (3)

2. EXPERIMENTO : Dosaje de triglicridos

Preparar tres tubos con:

TUBO N 1 2 3
ml Suero
0 0,02 0
ml Patrn de triglicridos
0 0 0,02
ml Reactivo de color
2 2 2

Agitar, incubar a 37C por 15 minutos

Leer al fotocolormetro a 520 nm los tubos 2 y 3 llevando a O con el tubo 1

Conc. patrn

Triglicridos mg/dl = ------- x D.O.(2)


D.O (3)

35
INFORME DE LA PRCTICA : RIESGO CORONARIO

Nombre:
...............................................................................................................................
...............................................................................................................................
...............................................................................................................................
....................................

Experimento 3: Dosaje de colesterol total y colesterol HDL en sangre

Patrn:
Lectura:
Concentracin:
Factor de Calibracin:
Colesterol total:

3. EXPERIMENTO : Valoracin de las lipoprotenas por electroforesis


en acetato de celulosa

La electroforesis es una tcnica para la separacin de molculas (protenas o


cidos nucleicos) sobre la base de su tamao molecular y carga elctrica. Los
cidos nucleicos ya disponen de una carga elctrica negativa, que los dirigir al
polo positivo, mientras que las protenas son molculas cuya carga neta
depende del contenido de una serie de aminocidos (fundamentalmente cido
glutmico, cido asprtico, lisina, arginina e histidina). Para la separacin se
usa un gel de agarosa, poliacrilamida o acetato de celulosa. Al poner la mezcla
de molculas y aplicar un campo elctrico, stas se movern y debern ir
pasando por el papel, por la que las pequeas se movern mejor y
rpidamente. As, las ms pequeas avanzarn ms y las ms grandes
quedarn cerca del lugar de partida.
En resumen, puede decirse que cuando una molcula cargada se coloca en un
campo elctrico se mover hacia uno u otro electrodo dependiendo de:
1) su carga elctrica
2) su tamao
3) la intensidad del campo elctrico y
4) la temperatura del medio.
Las protenas estn compuestas de aminocidos que poseen grupos ionizables
(principalmente -COO-y -NH3+), pueden encontrarse cargadas positiva o
negativamente, o bien permanecer elctricamente neutras segn la proporcin
de los diversos grupos ionizados a un determinado pH.

En suero humano la composicin normal es:


Protena total: 6,4 a 8,3 g/dL
Albmina: 3,5 a 5,0 g/dL
Alfa-1 globulina: 0,1 a 0,3 g/dL
Alfa-2 globulina: 0,6 a 1,0 g/dL
Beta globulina: 0,7 a 1,2 g/dL
Gammaglobulina: 0,7 a 1,6 g/dL

36

ELECTROFORESIS EN ACETATO DE CELULOSA

Se usa para la separacin y caracterizacin de protenas y otras molculas. El


soporte consiste en tiras delgadas de acetato de celulosa, con propiedades de
adsorcin mnimas, por lo que se evita la formacin de colas y los solutos
pueden ser separados en bandas bien definidas. Otras ventajas son:
1) La separacin es muy rpida
2) Se pueden analizar cantidades de muestra pequeas
3) Las tiras pueden hacerse transparentes
4) La tira se puede disolver, recuperando los componentes separados
5) Presentan un fondo bajo cuando se separan compuestos radiactivos

MATERIAL Y REACTIVOS

Material
- Tiras de acetato de celulosa (Cellogel)
- Papel de filtro para secar las tiras de acetato
- Cubeta de electroforesis
- Aplicador
- Fuente de electroforesis

Reactivos
-Tampn Tris-HCl 10 mM y EDTA 1 mM pH=8,6
-Solucin de tincin: 0.1% (p/v) ponceau S stain en cido actico 1%
-Solucin de lavado: cido actico 1%
-Suero

PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Electroforesis:
- Humedecer en tampn las tiras de acetato de celulosa 10 minutos antes de su
uso, para su equilibrado.
- Extender las tiras sobre el puente de la cubeta de modo que la superficie
- penetrable quede hacia la parte superior. El lado penetrable es el que se ve
cuando la tira se coloca en vertical delante de nosotros con el corte en la
esquina inferior derecha
- Depositar la muestra de suero en la tira de acetato de celulosa, en el extremo
prximo al ctodo.
- Conectar la corriente, aplicando una diferencia de potencial de 100 voltios
durante 60 minutos.
Revelado:
- Finalizada la separacin, depositar las tiras en una cubeta con solucin de
tincin, de modo que queden cubiertas por el lquido, durante 10 minutos.
- Lavar las tiras en solucin de destincin hasta que se observen bien las
bandas de protena (rojo) sobre un fondo blanco.

TRATAMIENTO Y DISCUSION DE LOS RESULTADOS


Dibujar el patrn de bandas que se ha obtenido tras la electroforesis de
protenas sricas, indicando la posicin de nodo y ctodo as como el punto

37
de aplicacin de la muestra. Identificar las protenas que corresponden a cada
banda y justificar el orden.

Comentario:

Firma del alumno Firma del profesor

PRACTICA N II.5 SEMANA N 13

TRANSAMINASAS
Una de las reacciones generales de los aminocidos es la transaminacin o
trasporte de un grupo amino de un aminocido a un cetocido, trasformado al
primero en cetocido y al segundo en aminocido.
Esta transformacin posibilita la formacin de carbohidratos a partir de
aminocidos, esto es el fenmeno de la neoglucognesis.
LA ecuacin general de estas reacciones es:

R=CH-COOH + R-C-COOG R-C-COOH+R-CH-COOH

Nh2 O O NH2

En el caso de nuestro experimento la transaminasa que estudiaremos es la


transaminasa glutmico pirvica que transforma el alfa cetoglutrico (cetocido)
en glutmico (aminocido) y a la alanina (animocido) en pervico (cetocido).
Esa enzima que es particularmente rica en el tejido heptico es un excelente
herramienta de estudio clnico de ese rgano, en problemas como la hepatitis o
la cirrosis heptica.
El procedimiento de anlisis se llevar a cabo mediante la cromatografa en
capa fina.

38
PROCEDIMIENTO CROMATOGRFICOS

La cromatografa es un procedimiento de anlisis por el cual una mezcla de


molculas es separada en sus componentes mediante el uso de una fase
estacionaria y una mvil.
La fase estacionaria o soporte da nombre al tipo de cromatografa: papel,
columna, capa fina y la fase mvil es lquida o gaseosa.
La separacin de componentes se produce por el fenmeno de particin por
solventes, esto es ante una mezcla de lquidos no miscible entre s, algunos
componentes tendrn mayor posibilidad de localizarse en uno u otro
componente, aquellos que se localicen en el componente ms lejano del
soporte migraran ms y aquellos cercanos sern adsorbidos por el soporte.
Existen una forma identificatoria de medir la migracin de las molculas
analizadas y es el Rf. Este valor corresponde a la relacin entre los cm
migrados por la molcula y aquellos migrados por el medio mvil.

1. EXPERIMENTO: Demostracin de transaminacin por cromatografa

Preparar 4 tubos de acuerdo la esquema:

TUBO N 1 2 3 4
ml cetoglutarato 0,2 M
0,3 0,3 0 0
ml alanina 0,2M
0,3 0,3 0 0
ml piruvato 0,2M
0 0 0,3 0,3
ml glutamato 0,2M
0 0 0.,3 0,3
ml arsenito 0,1M
0,4 0,4 0,4 0,4
ml Enzima activa
0 1 0 1
ml Enzima inactiva
1 0 1 0

39
a
RF =-----------------
b

b a
a

Incubar todos los tubos por 45 minutos a 37C. Retirar los tubos del bao de
Mara y agregar 6ml de alcohol etlico a cada tubo. Agitar y esperar por dos
minutos. Centrifugar y usar los sobrenadantes para la cromatografa.

Cromatografa
Marcar a 3 cm del borde una lnea suave con un lpiz, tratando de no daar la
slica gel. Marcar en esa lnea seis puntos separados por 2 cm cada uno.
Colocar en cada punto cinco gotas del respectivo sobrenadante y en las dos
ltimas 5 gotas de alanina y cinco de glutamato respectivamente. Dejar secar
Colocar la cromatoplaca en una cmara de cromatografa con una mezcla de
propanol: agua en la proporcin de 8: Dejar correr hasta que el nivel lquido le
falte 1 cm para llegar al extremo de la placa. Marcar el nivel al que alcanz el
lquido con un lpiz y dejar secar.

Aplicar con un spray una solucin de ninhidrina al 0,1% e butanol. Colocar a la


estufa por 10 minutos. Marcar las manchas obtenidas.

Obtener el Rf de cada mancha mediante la frmula:

Distancia de origen al punto medio de la mancha


Rf:

Distancia de origen al nivel mximo del solvente

Comentario:

Firma del alumno Firma del profesor

40
PRACTICA N III.1 SEMANA N 14

EVALUACION NUTRICIONAL
Experimento 1.- Manejo de Tablas de Composicin de Alimentos

La forma ms exacta de evaluar la ingesta de nutrientes por un sujeto es a


travs del clculo de la ingesta alimentaria, bien documentada y exacta y
mediante las Tablas de Composicin de Alimentos. En la presente prctica
analizaremos:

1. Las necesidades calricas de un sujeto: tomando en cuenta, peso y


trabajo. As conocemos que una persona gasta como Metabolismo Basal
1 kcalora /kg. Peso/hora. A ello aadimos aproximadamente un 50% por
trabajo de mediana intensidad.
2. Las necesidades protecas de un sujeto: tomado su peso, aceptamos
una necesidad de 1g/kg de peso/da( en condiciones mnimas 0,5/kg
peso/da).
3. Las necesidades de nutrientes (protena, carbohidratos y grasa) de un
da al azar. Con ello podemos establecer su ingesta calrica y proteca y
por lo tanto su dficit o adecuacin.

Para el efecto usaremos la siguiente Tabla de Composicin de Alimentos


resumida.

TABLA DE COMPOSICIN DE ALIMENTOS


g/100g de alimento

Alimento Protena Lpido Carbohidratos

Atn (conserva) 29,0 4,8 0,0


Bacalao (seco) 81,8 2,8 0,0
Calamar 16,4 0,9 0,0
Camarn 17,3 0,2 2,5
Carne (cerdo) 15,0 15,1 0,0
Carne (Pavo) 20,1 20,2 0,0
Carne (pollo) 18,2 10,2 0,0
Carne (pulpa) 21,3 1,6 0,0
Carne Seca 48,1 9,4 0,0
Chicharrones 11,3 61,4 0,0
Cojinova 20,2 0,7 0,0
Corvina 19,9 0,9 0,0
Hgado 19,5 6,6 3,6
Huevo (total) 12,8 11,8 1,0
Jamn del Pas 15,9 26,6 0,0

41
Jamn Ingls 25,8 20,5 0,0
Leche fresca 2,9 3,3 7,0
Lenguado 19.0 0,5 0,0
Merluza 19,3 0,8 0,0
Pejerrey 18,7 1,2 0,0
Queso Fresco 16,0 10,3 3,7
Queso mantecoso 25,8 20,2 7,4
Tocino 9,1 65,0 1,6
Trucha 18,2 1,0 0,0

Alimento Protena Lpido Carbohidratos

Arroz (seco) 6,5 0,7 78,1


Arveja (verde) 8,3 0,7 24,2
Avena 10,6 0,9 68,5
Bizcocho 8,8 6,9 64,4
Camote 1,2 0,2 27,1
Fideos 8,7 0,3 78,3
Frejol negro 21,2 1,7 53,3
Frejol soya 33,4 16,4 35,5
Frejol tarhui 40,9 13,4 27,3
Galletas (soda) 9,4 14,7 67,9
Galletas (Vainilla) 6,0 12,7 75,0
Garbanzo 19,1 5,1 61,4

Alimento Protena Lpido Carbohidratos

Lentejas 22,8 1,2 59,4


Maz (cancha) 6,7 2,7 79,8
Maz (choclo) 3,3 0,8 27,8
Man 28.8 46,9 18,1
Nuez 13,7 67,2 13,2
Olluco 0,8 0,1 14,2
Pallares 19,9 1,1 61,8
Pan (frances) 9,2 0,3 68,2
Papa blanca 2,1 0,3 22,4
Papa Seca 8,3 0,5 73,2
Quinua 11,9 4,7 67,6
Yuca 0,8 0,2 39.3
Aceitunas 1,2 33,2 6,8
Blanquillo 0,6 0,1 17,1
Cebolla 0,9 0,1 7,4
Coco 3,8 18,9 19,7
Col 1,4 0,0 5.2
Coliflor 2,0 0,6 5,8

42
Lechuga 1,4 0,2 3,3
Nabo 0,8 0,2 5,2
Pepina 0,5 0,1 2,7
Rabanitos 0,8 0,0 3,1
Tomate 0,8 0,2 4,0
Zanahoria 0,6 0,4 9,5
Zapallo 0,7 0,2 6,4

Alimento Protena Lpido Carbohidratos

Aceite 0,0 100 0,0


Azucar 0,0 0,0 99,5
Chocolate 2.0 30,0 60,0
Cocoa 9,0 19,0 31,0
Gelatina(seca)* 85,6 0,1 0,0
Limn 0.5 0,0 11,2
Maizena 8,0 3,0 74,0
Margarina 0,6 81 0,4
Naranja 1.2 0,0 11,2
Palta 1,7 12,6 6,5
Papaya 0,4 0,1 8,3
Platano isla 0,8 0,2 23,8
Uva negra 0,3 0,1 17,9

* Se usan al 3-4g%

GASTOS DE ENERGIA DE ACUERDO A ACTIVIDAD Y SEXO

ACTIVIDAD MUJER : HOMBRE :


Kcal /kg/hora Kcal /k Kg/hora
Durmiendo 1,1 1,0 1,2 ,9-
Muy Ligera: manejo de auto, 2,0 1,2 2.5
laboratorio, mecanografa, coser 1,1-
y planchar
Ligera: caminar, carpintera, 3,9 2,5-4,9
mecanica, lavado de ropa 2,0-
Moderada: fregar pisos, 5,9 5,0-7,4
ciclismo, tenis, baile 4,0-
Pesada: albail, natacin, ftbol, 10,0 7,5-12,0
bsquetbol. 6,0-

Firma del alumno Firma del profesor

43
SEMANA N 15

EVALUACION CONTINUA

SEMANA N 16

SEMANA DE EVALUACIONES

44