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ANLISIS MICROBIOLGICO EN MACERADOS DE LA MOSCA DOMSTICA MUSCA

DOMESTICA COMO PORTADOR DE AGENTES MICROBIANOS EN EL RESTAURANTE


LA VENADA DE LA UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA SEDE CENTRAL
NEIVA HUILA

LUIS EVELIO JAVELA MSMELA

UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA
FACULTAD DE EDUCACIN
LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES: BIOLOGA, FSICA Y QUMICA
NEIVA HUILA
2017
II
2

ANLISIS MICROBIOLGICO EN MACERADOS DE LA MOSCA DOMSTICA MUSCA


DOMESTICA COMO PORTADOR DE AGENTES MICROBIANOS EN EL RESTAURANTE
LA VENADA DE LA UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA SEDE CENTRAL NEIVA
HUILA

LUIS EVELIO JAVELA MSMELA

Co-investigador: ROSA ALCIRA CARREO RUZ

Trabajo presentado para optar el ttulo:


LICENCIADO EN CIENCIAS NATURALES: BIOLOGA, FSICA Y QUMICA

UNIVERSIDAD SURCOLOMBIANA
FACULTAD DE EDUCACIN
LICENCIATURA EN CIENCIAS NATURALES: BIOLOGA, FSICA Y QUMICA
NEIVA HUILA
2017
3III

DEDICATORIA

Dedico esta tesis a Dios y a mi madre,


Martha Msmela, por el apoyo que me ha brindado
Siempre, a las Profesoras Rosa Alcira Carreo Ruz
y Sonia Echeverry Hernndez, a la auxiliar de
Laboratorio Fabiola Gmez y a todos
Los que me han acompaado
Y me han visto crecer
Para cumplir este logro.
4IV

AGRADECIMIENTOS

A Dios por haberme dado la oportunidad de formarme profesionalmente, a la Universidad


Surcolombiana y a la Vicerrectora de Investigacin por el apoyo econmico.

A mi madre, Martha Msmela Ramrez, por todo su apoyo incondicional durante toda mi vida.

A la Bacteriloga Clnica Rosa Alcira Carreo Ruiz por estar presente en todo el desarrollo de
este trabajo, por ser una gua constante en cada uno de los procedimientos que se realizaron, de
igual manera a la Microbiloga Sonia Echeverry Hernndez por brindarme el espacio en su
semillero de investigacin VIRHOBAC el cual me permiti adquirir el gusto y el amor por la
microbiologa y a todas las personas que tienen a cargo en el laboratorio de Microbiologa en la
Facultad de salud, en especial a la Auxiliar Fabiola Gmez.

Al Dr. Salim Mattar quin colabor y me brind ayuda en su Laboratorio para el anlisis
molecular de las diferentes especies de microorganismos encontrados.

A todos mis profesores por todo su esfuerzo y conocimiento dado.


V5

Pgina de Aceptacin

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Firma Presidente del Jurado

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Firma del Jurado

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Firma del Jurado

Neiva, Julio 22 de 2017


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VI

Contenido

Introduccin .................................................................................................................................. 14
Planteamiento del problema .......................................................................................................... 16
Antecedentes ................................................................................................................................. 18
Fundamento terico ...................................................................................................................... 21
Clasificacin taxonmica de Mosca domstica ........................................................................ 22
Ciclo biolgico .......................................................................................................................... 23
Transmisin de patgenos ......................................................................................................... 24
Moscas eusinantrpicas ............................................................................................................. 25
Moscas endoflicas. ............................................................................................................... 25
Moscas exoflicas. ................................................................................................................. 25
Justificacin .................................................................................................................................. 26
Objetivos ....................................................................................................................................... 27
Objetivo General ....................................................................................................................... 27
Objetivos especficos................................................................................................................. 27
Metodologa .................................................................................................................................. 28
Criterios de inclusin ................................................................................................................ 28
ndice de infestacin.................................................................................................................. 29
Anlisis microbiolgico de la determinacin de enterobacterias .............................................. 29
Identificacin de bacterias ......................................................................................................... 30
Fase1. Campo (captura, recoleccin) ............................................................................................ 32
Recoleccin de muestras en el restaurante la Venada ............................................................... 32
Elaboracin de trampas artesanales........................................................................................... 33
Procesamiento de la muestra (macerado, filtracin y siembra en caldo nutritivo) ................... 34
Siembra en caldo nutritivo ........................................................................................................ 35
Fase 2. Laboratorio: Procesamiento de Patas ............................................................................... 50
Fase 3: Laboratorio (repique, tincin, descripcin, y PCR) ......................................................... 56
Resultados y Discusin ................................................................................................................. 58
Conclusiones ................................................................................................................................. 63
Referencias bibliogrficas e infogrficas ...................................................................................... 65
7
VII

Lista de tablas

Tabla 1. Anlisis comparativo de especies de microorganismos encontrados en los macerados de


la mosca domstica ....................................................................................................................... 58
Tabla 2. Relacin de muestras de acuerdo a su importancia y nivel de purificacin y
concordancia................................................................................................................................. 59
Tabla 3. Relacin de cepas de acuerdo a su importancia epidemiolgica. .................................. 60
Tabla 4. Cuadro comparativo de cepas de acuerdo a su importancia epidemiolgica
recolectadas del restaurante La Venada ...................................................................................... 61
8
VIII

Lista de figuras

Figura 1. Mosca del establo y domstica. Graczyk et al. 2005 .................................................... 21


Figura 2. Mosca domstica. Graczyk et al. 2005 ......................................................................... 23
Figura 3. Ciclo de vida de la mosca ............................................................................................. 25
Figura 4. Trampa artesanal con frasco de gaseosa ....................................................................... 28
Figura 5. Fotos disposicin de trampas ........................................................................................ 32
Figura 6. Elaboracin trampas artesanales ................................................................................... 33
Figura 7. Trampas con carnada .................................................................................................... 33
Figura 8. Foto macerado de las moscas........................................................................................ 34
Figura 9. Foto filtracin y enumeracin de muestras ................................................................... 34
Figura 10. Muestras con 1 ml de filtrado del macerado ............................................................... 35
Figura 11. Muestras con 0,5 ml de filtrado del macerado ............................................................ 36
Figura 12. Muestras con 0,5 ml del macerado ............................................................................. 36
Figura 13. Muestras con 1 ml del macerado ................................................................................ 37
Figura 14. Muestras en incubadora .............................................................................................. 37
Figura 15. Siembra de muestras y lectura de crecimiento............................................................ 38
Figura 16. Siembra de la muestra en los agares - parte 1 ............................................................. 38
Figura 17. Siembra de la muestra en los agares - parte 2 ............................................................. 39
Figura 18. Siembra de la muestra en los agares - parte 3 ............................................................. 40
Figura 19. Repique de la siembra - parte 1 .................................................................................. 41
Figura 20. Repique de la siembre- parte 2 ................................................................................... 42
Figura 21. Muestras Gram ......................................................................................................... 49
Figura 23. Macerado, filtracin, siembra e incubacin de los caldos nutritivos de la muestra ... 51
Figura 24. Siembre en agar .......................................................................................................... 52
Figura 25. Muestra incubada en agar MacConkey....................................................................... 53
Figura 26. Aislamiento de colonias .............................................................................................. 54
Figura 27. Coloracin con gram ................................................................................................... 55
Figura 28. Muestra en medio AMIES .......................................................................................... 56
9IX

Lista de Apndices

Apndice 1. Tincin de Gram. ...................................................................................................... 68


Apndice 2. Pruebas Bioqumicas para la identificacin de los microorganismos. ..................... 72
10
X

Resumen

Mundialmente, la mosca domstica es un vector de agentes patgenos y con la


concentracin en reas urbanas de las poblaciones humanas, este riesgo ha aumentado. Es un
transmisor comprobado de ms de 30 virus, 175 bacterias, 8 especies de espiroquetas, 3
rickettsias, 19 hongos, entre otros. Musca domstica L., es atrada por sustratos: alimentos,
desperdicios, secreciones, etc., convirtindola en un vector mecnico eficiente de patgenos. El
objetivo del estudio es estimar los tamaos poblacionales de los microorganismos en la M.
domstica, evaluar el papel de ellas como vector en el transporte de enterobacterias y otros
microorganismos de importancia para la salud pblica, comparar las vas de contaminacin,
(alimentos-vector) de los productos alimenticios y reconocer el efecto que producen estos
microorganismos en la salud humana. Para ello se realizarn tres etapas.

Durante la primera etapa, se procedi a la captura de los individuos en trampas


artesanales con cloroformo, tres das (entre semana) en el sector del restaurante La Venada. La
segunda etapa consiste en el anlisis microbiolgico para la determinacin de enterobacterias. Se
sembr por agotamiento, el macerado de los insectos, en diferentes medios de cultivo bacteriano,
como son agar MacConkey (agar selectivo para enterobacterias) y agar sangre (medio de cultivo
enriquecido recomendado para el aislamiento y desarrollo de bacterias Gram-positivas y Gram
negativas), se incuba durante 24 horas a 37C. Luego, se efecta el anlisis de la morfologa de
la colonia y la coloracin de Gram para determinar la morfologa bacteriana.

La tercera etapa es la identificacin y posterior confirmacin de bacterias (gnero), se


realizaron pruebas de biologa molecular convencionales PCR. Para la comparacin de las vas
de contaminacin, (alimentos-vector) de los productos alimenticios que se sirven en el
restaurante La Venada, se llev a cabo una triangulacin de datos a partir de los estudios
culminados en los alimentos expendidos en el restaurante y sus alrededores.

Para concientizar a la comunidad universitaria, sobre el manejo de las tcnicas correctas


de asepsia, en la preparacin de los alimentos, y prevenir las diferentes enfermedades, que se
pueden adquirir por la ingesta de alimentos contaminados, consumidos en el restaurante
11
XI

estudiantil La Venada, se trabaj en conjunto con Bienestar Universitario al hacer una campaa
masiva divulgando la informacin recolectada de este proyecto de investigacin mediante una
cartilla o folleto.

Palabras Claves: Anlisis microbiolgico, macerado, mosca domstica, prueba de


biologa molecular PCR y trampa artesanal.
12
XII

Abstract

Globally, house fly is a vector of pathogens and with concentration in urban areas of
human populations, this risk has increased. It is a proven transmitter of more than 30 viruses, 175
bacteria, 8 species of spirochetes, 3 rickettsias, 19 fungi, among others. Musca domestic L., is
attracted by substrates: food, waste, secretions, etc., making it an efficient mechanical vector of
pathogens. The objective of the study is to estimate the population sizes of the microorganisms in
the domestic M., to evaluate the role of them as a vector in the transport of enterobacteria and
other microorganisms of public health importance, ) Of foodstuffs and recognize the effect of
these microorganisms on human health. Three stages will be carried out.

During the first stage, the individuals were caught in handmade traps with chloroform,
three days (weekdays) in the sector of the restaurant La Venada. The second stage consists of the
microbiological analysis for the determination of enterobacteria. Maceration of insects in
different bacterial culture media such as MacConkey agar (agar selective for enterobacteria) and
blood agar (enriched culture medium recommended for the isolation and development of Gram-
positive and Gram-negative bacteria ), Incubated for 24 hours at 37 C. Then, colony
morphology and Gram staining are performed to determine bacterial morphology.

The third stage is the identification and subsequent confirmation of bacteria (genus),
conventional molecular biology PCR tests were performed. For the comparison of contamination
routes (food-vector) of the food products served at the restaurant La Venada, a triangulation of
data was carried out from the studies culminated in food sold in the restaurant and its
surroundings.

In order to raise awareness of the university community, the management of correct


asepsis techniques, the preparation of food, and the prevention of different diseases, which can
be acquired through the intake of contaminated food consumed in the La Venada student
restaurant, Worked in conjunction with University Welfare to make a massive campaign
disseminating the information collected from this research project through a booklet or brochure.
13
XIII

Keywords: Microbiological analysis, maceration, house fly, molecular biology PCR test
and artisanal trap.
14

Introduccin

Las infestaciones por miembros del Orden Dptera, tanto en los animales domsticos
como en el ser humano, son de gran importancia debido a las prdidas econmicas que conlleva,
al provocar la disminucin del rendimiento de productos y subproductos de origen animal. En el
expendio pblico de alimentos en Colombia, se encuentra la frecuente interaccin de la mosca y
los humanos. Mundialmente, se conoce a este insecto, como vector de agentes patgenos y con la
concentracin en reas urbanas de las poblaciones humanas, este riesgo se ha aumentado. Las
moscas, se consideran importantes vectores de infecciones entricas, que afectan a personas y a
los animales domsticos. Es un transmisor comprobado de ms de 30 virus, 175 bacterias, 8
especies de espiroquetas, 3 rickettsias, 19 hongos, ms de 30 protozoarios y numerosos
helmintos.

La Organizacin Mundial de la Salud plantea que la mayora de las contaminaciones de


alimentos que generan enfermedades transmitidas por alimentos ocurren por problemas
sanitarios y de manipulacin, dentro del hogar y en sitios donde se elaboran para la venta. Las
enfermedades transmitidas por alimentos constituyen, a nivel mundial, uno de los problemas ms
generalizados y de mayor repercusin sobre la salud de personas, afectando generalmente a la
poblacin de bajos recursos, nios, mujeres embarazadas y ancianos.

Las Enfermedades Transmitidas por los alimentos (ETAs) ocupan el segundo lugar entre
las diez primeras causas de morbimortalidad en el mundo, y segn la OMS (1996) el 70% de los
casos reportados corresponden a diarreas. El nivel de salud de la poblacin est relacionado
directamente con la higiene y seguridad de los alimentos que puedan adquirirse (Gambirazio,
2002). Se considera que las comunidades propias de reas climticas con predominio de altas
temperaturas, con malos hbitos de higiene, tienen mayor riesgo de contraer algunas ETAs
(Almeida, C. 1996).

Las enfermedades diarreicas representan un problema de salud pblica a nivel mundial,


ocasionando morbilidad y mortalidad, en particular en personas ancianas y nios menores de
cinco aos de edad. Se estima que de 4 a 6 millones de nios fallecen cada ao por enfermedades
15

diarreicas, especialmente en pases en vas de desarrollo, Asia y frica (Luzmilla, Flores,


Mendoza y Mundarain, 2007).

La diarrea se define como una enfermedad gastrointestinal que se manifiesta con un


aumento en el nmero y cantidad de deposiciones, las cuales presentan un contenido de agua
mayor a lo normal, tomando caractersticas macroscpicas de blancas a liquidas. La enfermedad
diarreica puede ser clasificada de acuerdo al tiempo de evolucin, en aguda cuando dura menos
de 14 das y, persistente cuando oscila entre 14 y 30 das (Luzmilla, Flores, Mendoza y
Mundarain, 2007).

Los principales agentes etiolgicos de las diarreas son los virus, protozoarios y bacterias,
la ms frecuentes pertenecen a los gneros de Salmonella, Shigella, Escherichia y Vibrio, las
cuales pueden transmitirse por la va ano-mano-boca o por la ingesta de alimentos y aguas
contaminadas (Olarte, J. 2008). La mayor parte de las diarreas infecciosas agudas son leves y
autolimitadas, siendo la rehidratacin oral el instrumento ms efectivo en el tratamiento del
sndrome diarreico (Luzmilla, Flores, Mendoza y Mundarain, 2007).

La preparacin y manipulacin de los alimentos son factores claves en el desarrollo de las


ETAs, por lo que la actitud de los consumidores resulta muy importante para prevenirlas.

El presente trabajo pretende establecer y demostrar los riesgos microbiolgicos de


ambientes en donde concurre la mosca domstica. El objetivo de este estudio es evaluar el papel
de las moscas como vectores en el transporte de enterobacterias y otros microorganismos de
importancia en la salud pblica. Para ello se realiz un estudio descriptivo del restaurante La
Venada de la Universidad Surcolombiana sede Neiva - Huila. La poblacin universo
correspondi a las moscas presentes en el servicio de alimentacin del restaurante La Venada de
la U. Surcolombiana sede Central Neiva Huila, en donde se practic anlisis taxonmico y
microbiolgico, correspondiente a la determinacin de enterobacterias, y su posterior
verificacin por medio de PCR (reaccin en cadena de la polimerasa).
16

Planteamiento del problema

En la actualidad, existen distintas enfermedades que ocasionan diarreas, las cuales son
responsables de la gran morbilidad y mortalidad que existe en el pas con un resultado
impactante en la salud pblica.

Entre los diferentes factores que incrementan estas enfermedades, como la ausencia de un
abastecimiento adecuado de agua potable y una buena disposicin de excretas, se agrega el papel
que cumple un grupo de seres vivos muy diferentes entre s, pero conocidos en conjunto como
vectores.

Los vectores, que facilitan la difusin del agente infeccioso al transportarlo en su interior,
a veces con cambios morfolgicos (biolgicos), o por su adherencia a estructuras pilosas del
abdomen o patas (mecnicos), merecen ser estudiados por su amplia relacin y contacto con los
alimentos. Uno de ellos, la mosca comn (Musca domestica), muy frecuente en las actividades
del hombre incluyendo su alimentacin, ha sido elegida para este estudio.

La Universidad Surcolombiana al ser una entidad pblica que cuenta con servicios de
cafeteras y restaurante y que los brinda tanto para estudiantes como para la comunidad
educativa, es de vital importancia que el Bienestar Universitario como ente encargado vele por la
calidad de vida de la Comunidad Surcolombiana al hacer un seguimiento a la calidad de los
alimentos que se ofrecen a diario dentro y fuera de la Universidad, con el objetivo de evitar
posibles enfermedades transmitidas por vectores que contaminan los alimentos generando y
promoviendo diferentes programas, estrategias y proyectos que permitan adquirir estilos de vida
saludables.

Por lo tanto, teniendo en cuenta que la mosca es una especie cosmopolita que constituye
un problema de salud pblica en reas urbanas y explotaciones animales con un manejo sanitario
inapropiado, y de comportamiento polfago, es decir, ser atrada por diferentes sustratos
(alimentos, desperdicios, secreciones, y excretas) para alimentarse.
17

Se ha planteado la siguiente pregunta de investigacin:

Qu tipo de microorganismos se encuentran en los macerados de la M. domestica como


portador de agentes microbianos en el Restaurante La Venada de la Universidad Surcolombiana
Sede Central Neiva Huila y qu posibles enfermedades pueden causar estos microorganismos?
18

Antecedentes

Como vemos la Musca Domstica es un importante organismo vector que es


referenciado en mltiples estudios, los cuales son el principal respaldo de este trabajo de
investigacin que tiene un gran impacto socio-ambiental en la conciencia de la comunidad
universitaria.

Segn Estrada S., Ceballos M.T., Vanegas C., et al., 2011., en Bacterias identificadas
en la superficie de M. domstica y su potencial patogenicidad para el humano en la Universidad
de Antioquia, el objetivo que cumpli este estudio fue el de identificar las bacterias que
colonizan la superficie de Musca domstica y su potencial patogenicidad para los humanos,
realizando un estudio descriptivo exploratorio. Donde las moscas fueron atrapadas en diferentes
lugares, stas fueron procesadas con un procedimiento establecido: inicialmente se introdujo la
mosca en un tubo de ensayo seco, hasta que la mosca muri, luego se sumergi en un caldo de
BHI, como medio de enriquecimiento, el caldo se incubo y luego se sembr en diferentes agares,
donde se obtuvo crecimiento de varios gneros de bacterias, las cuales fueron identificadas,
siguiendo el proceso que tiene el Laboratorio Clnico Congregacin Mariana para la
identificacin de bacterias aerobias. A partir de este se concluy que la Musca domestica porta
una gran variedad de bacterias en su superficie, las cuales tienen la capacidad de producir en el
humano una gran variedad de enfermedades.

Segn Ramrez O.Y., Carvajal F.M., Ortega Y.R., Reina A.Y., Rojas M.I., 2012, en
Mosca domstica como vector mecnico de enterobacterias en expendios de embutidos de Tunja
(Boyac Colombia) realizado por la Universidad Pedaggica y Tecnolgica de Colombia
UPTC, el objetivo que cumpli este estudio fue la identificacin de enterobacterias transportadas
de forma mecnica por moscas recolectadas en expendios de embutidos de la plaza sur en Tunja
(Boyac); donde noventa moscas fueron capturadas y procesadas, aislando e identificando las
bacterias colonizantes, empleando tres tcnicas: a partir de patas y alas, de macerado y de
autosiembra. Obteniendo como resultado un total de ocho cepas encontradas, de las cuales cinco
fueron enterobacterias: Escherichia coli, Enterobacter aerogenes, Klebsiella sp., Proteus
mirabilis y Yersinia sp, las dems cepas pertenecen a los gneros Aeromonas, Staphylococcus y
Streptococcus.
19

Segn Quiceno J., Bastidas X., Rojas D., Bayona M., 2010, en la mosca domstica
como portador de patgenos microbianos, en cinco cafeteras del norte de Bogot realizado por
la Universidad de Ciencias Aplicadas y Ambientales U.D.C.A., el objetivo que cumpli este
estudio fue establecer y demostrar los riesgos microbiolgicos de ambientes en donde concurre
la mosca domstica. Se realiz un estudio descriptivo de corte transversal, en cinco cafeteras del
norte de Bogot. La poblacin universo correspondi a las moscas presentes en los servicios de
alimentacin, de una zona del norte de Bogot-Colombia, en las que se practic anlisis
taxonmico y microbiolgico, correspondiente a la determinacin de enterobacterias, parsitos y
hongos.

Para la tabulacin y el anlisis de los datos, se emplearon Microsoft Excel y el


programa estadstico SPSS versin 15. Los microorganismos aislados correspondieron a
bacterias, el 46,8%, (Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae); seguidos por parsitos, 31,9%
(Entamoeba histolytica y Blastocystis hominis) y hongos, 21,3% (Aspergillus fumigatus y
Criptococcus spp). De acuerdo con la carga microbiana por restaurantes evaluados, se registr a
la cafetera 5 con el 34% de todos los microorganismos aislados siguindolo en orden la 4, con
19%, el local 3, con 17% y las cafeteras 1 y 2 con el 14,9%, cada uno, lo cual, se ve
determinado, directamente, por el bajo nivel de aseo de estos puntos y la presencia de animales a
sus alrededores, lo que atrae a estos insectos.

Segn Moissant E., Tkachuk O., Romn R., 2004, en deteccin de agentes
bacterianos en adultos de Musca domstica (Diptera: Muscidae) recolectadas en Maracay, Estado
Aragua, Venezuela. El objetivo fue detectar la presencia de agentes bacterianos en adultos de
Musca domestica recolectadas en Maracay, Estado Aragua, Venezuela. Los ejemplares fueron
individualmente capturados, con trampas domesticas especiales para moscas, elaboradas con
frascos de vidrio de 500 cc, lavados y esterilizados en autoclave a 121 C, 15 lb de presin,
durante 15 minutos. En tres ambientes: galpn con animales, cuarto de basura y restaurante. Se
recolectaron 27 moscas adultas, de las cuales siete efectuaron una autosiembra espontnea en el
medio de cultivo Agar B.H.I. Los resultados bacteriolgicos indican la presencia de bacterias
aerbicas gram negativas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae. De las siete moscas
20

muestreadas se identificaron las siguientes bacterias: Citrobacter spp. Enterobacter spp., y


Escherichia coli en dos moscas capturadas en el galpn con animales, Enterobacter spp., en dos
moscas del cuarto de basura y E. coli de tres moscas recolectadas en el restaurante. Se discute el
papel de la M. domestica como un vehculo transmisor de enfermedades gastrointestinales u
otras en nuestro medio.

Segn Bjar V., Chumpitaz J., Pareja E., Valencia E., et al. 2006, en Musca
domestica como Vector Mecnico de Bacterias Enteropatgenas en mercados y basurales de
Lima y Callao. El objetivo fue demostrar que la mosca domstica (Musca domestica) es un
vector mecnico de bacterias enteropatgenas en distritos de Lima y Callao. El estudio fue de
tipo descriptivo transversal. Entre mayo de 2004 y julio de 2005 se realiz un muestreo en
diferentes distritos de las provincias de Lima y el Callao teniendo en cuenta el ndice de
infestacin de cada zona elegida. Se recolectaron moscas de mercados, periferia y basurales
aledaos. En el laboratorio fueron procesadas en medios de cultivo para aislamiento de
enterobacterias y su identificacin. De un total de 780 moscas domsticas se aisl Escherichia
coli enteropatgena, Salmonella typhi, Shigella flexneri y Yersinia enterocolitica. Se estableci
una relacin directa entre el hallazgo de bacterias enteropatgenas y las zonas de mayor grado de
infestacin (>20 moscas/hora de observacin). El aislamiento de bacterias enteropatgenas en
Musca domestica permiti demostrar su papel vector.

Segn Urdaneta S., Talavera S., Verdn M., et al. 2011-2012, en papel de la mosca
domstica (Musca domestica) como vector de Campylobacter Jejuni y Campylobacter Coli en
granjas de pollos de engorde de Espaa. El objetivo del presente estudio fue evaluar el papel de
las moscas (Diptera: Brachycera) como potencial vector para Campylobacter Jejuni y
Campylobacter coli mediante un estudio de campo longitudinal en 5 granjas de engorde
espaolas, de Abril a noviembre de 2011 y 2012. La prevalencia de moscas positivas a C. Jejuni
y C. coli se determin en 1.304 moscas capturadas de los alrededores de las naves de las granjas.
Tras su captura, las moscas se identificaron taxonmicamente y posteriormente se procedi al
aislamiento individual de Campylobacter. Para ello, las moscas se maceraron individualmente y
se realiz un pre-enriquecimiento en caldo Bolton durante 24 h a 42C. Diez microlitros del
sobrenadante se sembraron en agar selectivo (mCCDA). Las placas se incubaron en condiciones
de microaerofilia durante 48 h a 42C.
21

Fundamento terico

Mosca es el nombre genrico de un extenso grupo de especies de insectos


pertenecientes al orden de los dpteros (Dptera). Se han clasificado unas 120.000 especies de
dpteros, por ello, algunos cientficos estiman que prevalece un milln de especies, donde una de
cada diez especies de animales reconocidas por la ciencia es un dptero, existiendo muchas ms
variedades diferentes de dpteros, que de vertebrados (Graczyk et al. 2005).

Figura

Figura 1. Mosca del establo y domstica. Graczyk et al. 2005

Las organizaciones que regulan la sanidad y la salud pblica han registrado 21


especies de moscas, dentro de las cuales encontramos a la mosca del establo y la mosca
domstica (figura1) como agentes causantes de enfermedades gastrointestinales, por su
predileccin por los ambientes contaminados y endofilia, es decir, tendencia a ingresar a
edificaciones (Graczyk et al. 2005).

Musca domestica L. (Dptera: Muscidae) es atrada por diferentes sustratos:


alimentos, desperdicios, secreciones y excretas para alimentarse, convirtindola en un vector
mecnico eficiente de patgenos; este insecto puede transportar microorganismos, a nivel
externo, por la morfologa de su cuerpo cubierto por setas o, internamente, en su tubo digestivo
(Moissant et al. 2004).
22

La presencia de moscas en zonas prximas a ncleos humanos representa un serio


riesgo sanitario y medio ambiental. Las enfermedades ms importantes transmitidas por las
moscas a las personas y a los animales domsticos son intestinales e infecciones oculares (Bejar
et al. 2006).

Las formas en que este insecto comn puede transmitir los patgenos son: a) a travs
de su superficie corporal; b) por regurgitacin de comida contaminada y c) por defecacin de
patgenos, siendo esta va muy importante debido al efecto protector que le da el interior de su
organismo al patgeno presente (Sasaki et al. 2000).

La fuente de origen de las infecciones microbianas se relaciona, principalmente, con


niveles bajos de higiene, de sanidad y la contaminacin de comida. Estudios de laboratorio han
demostrado que en la mosca comn se pueden hallar ms de cien agentes infecciosos para el
hombre y para los animales, principalmente, aquellos causantes de diarrea (Ugbogu et al. 2006;
Sasaki et al. 2000; Nunes, 2002; Manrique & Delfn, 1997).

Responsabilizar a la M. domestica como vector mecnico de las enfermedades


transmitidas por alimentos es difcil, ya que se sabe que el aislar patgenos demuestra una carga
microbiana y no se confirma si verdaderamente se lleva a cabo su transmisin. El aislar los
microorganismos a partir de moscas es un ndice potencial de contaminacin (Arruma et al.
2005; Bejar et al. 2006).

Debido a lo anterior, se propuso en el presente estudio demostrar que la continua


interaccin de las moscas con los alimentos, en este caso en el restaurante estudiado, predispone
a este tipo de riesgos microbiolgicos, resultando la mosca ser un vector mecnico.

Clasificacin taxonmica de Mosca domstica

La taxonoma de este insecto es la siguiente:


Reino Animal
Phylum Artrpoda
23

Clase Insecta
Subclase Pterygota
Orden Dptera
Suborden Cyclorrapha
Familia Muscidae
Genero Musca
Especie Domestica (Salazar, 1981).

Figura.

Figura 2. Mosca domstica. Graczyk et al. 2005

Ciclo biolgico

La mosca domstica posee varias partes en las cuales se divide su cuerpo (figura2), ojos
compuestos por poderosas lentes, el trax presenta las patas (6, es decir, 3 pares) que se dividen
en 3 (fmur, tibia, tarso), las antenas, donde se encuentra el olfato. El aparato bucal, que
bsicamente est formado por la trompa de tipo chupador y las alas (movidas por unos poderosos
msculos (escudete)). Pone de 100 a 150 huevos en una postura, la que realiza varias veces para
llegar a un total de alrededor de 600 huevos. Las heces frescas de caballos constituyen el medio
predilecto, pero puede hacerlo en heces de otros animales y del hombre o en otro tipo de materia
24

orgnica, principalmente de origen vegetal. Los huevos son color crema, de 1 mm de largo, de
forma alargada. La larva eclosiona en un periodo de12 a 24 horas, despus de 3 a 7 das alcanza
un tamao de 10 a 12 mm. El cuerpo de la larva es puntiagudo anteriormente y ancho
posteriormente. La distancia entre las dos placas estigmticas posteriores es menor que el ancho
de la placa y cada una presenta tres hendiduras. En el extremo anterior del cuerpo tiene un par de
ganchos conectados con el aparato cefalofarngeo.

Durante el desarrollo larvario, suceden tres mudas y la pupa conserva la ltima, sta
es rgida y de color caf. Permanece en el suelo y el desarrollo o metamorfosis tarda de 3 a 26
das, dando lugar a nuevos individuos (figura3). Despus ocurre la fecundacin y se inicia un
nuevo ciclo al comenzar la postura. El ciclo puede desarrollarse en 12 das en condiciones
favorables. Las moscas no hibernan, pero los huevos, las larvas y las pupas pueden sobrevivir al
fro del invierno (Quiroz ,1984; Vera y Domnguez., 1985). El nmero de larvas que se pueden
criar en las excretas es muy alto; Herms encontr un promedio de 685 por libra de estircol de
caballo.

Transmisin de patgenos

Como sucede con otras moscas, el adulto de la mosca domstica emerge de la pupa y se
abre camino a travs del medio en donde se desarroll como larva; por lo anterior, el insecto se
impregna fcilmente de restos de excremento y/o basura, condicin que lo hace un peligroso
portador de patgenos. Para dar una idea al respecto, ciertos investigadores han reportado que
slo un espcimen es capaz de llevar en las patas, alas, cuerpo y partes bucales de 2 hasta 6
millones de bacterias.

El adulto es un organismo muy mvil que vuela y se para en basura, excrementos y


alimentos, para reposar, ovopositar o alimentarse. Como slo puede ingerir lquidos, vomita
ciertas substancias con el propsito de licuar y absorber su propio alimento.
25

Figura 3. Ciclo de vida de la mosca

Moscas eusinantrpicas

En esta clasificacin se agrupan aquellas moscas que habitan cerca de asentamientos


humanos o lugares donde las personas se congregan como tiendas, restaurantes u otros lugares
donde la materia fecal humana o animal se encuentre disponible (Harwood y James, 1979; Vera
y Domnguez, 1985). Esta clasificacin a su vez se divide en moscas endoflicas y exoflicas de
acuerdo a su relacin con el ser humano.

Moscas endoflicas.

Este grupo de moscas dependen de desechos humanos y animales y la mosca domstica


constituye el mejor ejemplo. Tanto la mosca domstica como la mosca del establo Stomoxys
calcitrans se asocian al ser humano, por lo que desde principios de siglo se empez a desarrollar
alternativas de control biolgico, primordialmente introduciendo diferentes enemigos naturales
en reas donde estos insectos constituan un problema serio (Legner, 1995).

Moscas exoflicas.

En especies de comportamiento exoflico (aquellas que entran a la vivienda, se


alimentan y la abandonan antes o al amanecer) la fumigacin ha fallado en reducir su abundancia
intradomiciliaria (Legner, 1995).
26

Justificacin

Debido a su presencia en el ambiente de animales domsticos y a la estrecha relacin de


stos con el hombre, se considera a la mosca domstica (Musca domestica L.) un insecto
importante como vector de enfermedades zoonticas causantes de grandes prdidas econmicas.
Est demostrado que dicho insecto puede ser portador de varias especies de agentes patgenos
como helmintos, bacterias, hongos e inclusive virus. Su hbitat y cualidad de desplazamiento, as
como la predileccin por los lugares habitados por el hombre y los animales aumentan su papel
de vector.

La mosca domstica segn su variedad se alimenta y reproduce en las heces y materia


orgnica en descomposicin; este contacto con fuentes de contaminacin y alimentos la
convierte en un vector eficaz de patgenos potenciales causantes de enfermedades para el
humano y los animales en condiciones naturales (Bjar, et al., 2006).

Existen tres formas en las cuales las moscas pueden transmitir patgenos: a travs de su
superficie corporal (patas, partes bucales), ya que estn cubiertas de espinas y cerdas en las
cuales el material contaminado puede ser atrapado y transportado, por regurgitacin de comida
como preludio al alimentarse, ya que es comn que una pequea gota de la comida ms reciente
sea vomitada sobre el substrato, puede ser una ruta importante de infeccin para patgenos
pequeos y por ingestin y defecacin de patgenos como una de las vas potenciales ms
importantes, ya que el agente infeccioso es protegido mientras se encuentra en el aparato
digestivo del insecto y mantenido por perodos de tiempo mayores que en las rutas anteriores
(Bjar, et al., 2006).

El motivo por el cual se pretende realizar esta investigacin es detectar la presencia de


agentes patgenos en estos insectos, los cuales causan una variedad de enfermedades
perjudiciales para la salud humana y que podran evitarse identificando las tcnicas inadecuadas
que se le da a la preparacin de los alimentos, particularmente, en el restaurante La Venada de la
sede central de la Universidad Surcolombiana en Neiva.
27

Objetivos

Objetivo General

Determinar la presencia de enterobacterias presentes en la M. domstica como vector de


propagacin de enfermedades en el Restaurante La Venada de la Universidad Surcolombiana
sede Central Neiva Huila.

Objetivos especficos

Estimar los tamaos poblaciones de los microorganismos objeto de estudio presentes en


la M. domstica.

Aislar e identificar los agentes microbianos de inters presentes en el vector M. domstica


en el restaurante La Venada.

Comparar las vas de contaminacin (alimentos-vector) de los productos alimenticios que


se sirven en el restaurante y reconocer el efecto que producen estos microorganismos en la salud
humana.

Concienciar a la comunidad universitaria en el manejo de las tcnicas correctas de asepsia


que prevengan la contaminacin de los alimentos que se consumen al hacer uso del servicio de
alimentacin en el restaurante estudiantil La Venada.
28

Metodologa

El presente trabajo de investigacin se realizar en tres etapas. Durante la primera etapa


se procedi a la captura y recoleccin durante tres das (entre semana) del espcimen a estudiar
(M. domestica) en el sector del restaurante La Venada de la Universidad Surcolombiana sede
central Neiva Huila y en diferentes lugares como la cafetera y el restaurante de la sede Salud.

Los respectivos especmenes, se recolectarn por medio de una trampa elaborada


artesanalmente con frascos de gaseosa (como se muestra en la figura 4.), las cuales sern
ubicadas en el sitio especfico donde se consumen los alimentos y que cumplan con los criterios
de inclusin y no hagan parte de los criterios de exclusin.

Figura.

Figura 4. Trampa artesanal con frasco de gaseosa

Criterios de inclusin

Las moscas atrapadas en el restaurante La Venada de la Universidad Surcolombiana sede central


Neiva Huila, retiradas de las trampas artesanales y llevadas al laboratorio.

Criterios de exclusin

Moscas de otras especies, moscas que no pertenezcan al lugar de estudio y moscas que no
tengan adecuada manipulacin durante su recoleccin, es decir, que no estn en las trampas
29

artesanales, o que no sean llevadas directamente al laboratorio para su estudio, con su respectiva
rotulacin.

ndice de infestacin

Antes de iniciar la recoleccin de las moscas se proceder a cuantificar el ndice de


infestacin de la zona de recoleccin de acuerdo con los siguientes intervalos:

ndice de infestacin bajo:< 5 moscas/hora de observacin.


ndice de infestacin mediano: 5 - 15 moscas/hora de observacin.
ndice de infestacin alto:> 20 moscas/hora de observacin (Basualdo W., et, al. 2001)

Los individuos a estudiar sern sacrificados con cloroformo y separados en tubos de


ensayo con seis a diez ejemplares cada uno. Para el macerado de las moscas, se lavan los
especmenes con 2 mL de agua destilada estril con movimientos de agitacin por cinco minutos,
se deja reposar por diez minutos y se elimina el sobrenadante, con los especmenes libres de agua
destilada, se realiza un macerado de las moscas con la ayuda del extremo posterior de un hisopo
estril hasta lograr una masa uniforme. Se agrega 1 mL ms de agua destilada para homogeneizar
la mezcla obtenida, se cultivan por separado el sedimento y sobrenadante de la mezcla en los
medios de cultivos respectivos.

Anlisis microbiolgico de la determinacin de enterobacterias

Para este anlisis, se efectu una siembra de la muestra (macerado de 120 moscas
capturadas) en caldo nutritivo enriquecido; del cual se filtran del macerado 15 ml de extracto
final con papel filtro y se distribuye de la siguiente manera: 10 primeros tubos de ensayo con 1
ml de extracto, del 11 al 15 con 0,5 ml de extracto, y del 16 al 20 con 0,5 ml de macerado
precipitado y del 21 al 25 con 1 ml del macerado precipitado, se lleva a la incubadora a 37C
durante 24 horas.

Posteriormente, siembra por agotamiento, el macerado de los insectos, en diferentes


medios de cultivo bacteriano, como son agar MacConkey Biomerieux (agar selectivo para
30

enterobacterias) y agar sangre Biomerieux (medio de cultivo enriquecido recomendado para el


aislamiento y desarrollo de bacterias Gram-positivas y Gram negativas), se incuba durante 24
horas a 37C. Luego, se efecta el anlisis de la morfologa de la colonia y la coloracin de
Gram para determinar la morfologa bacteriana. Para realizar la tincin de Gram se toma una
muestra pequea de la colonia y se esparce en un portaobjeto, se deja secar a temperatura
ambiente y se fija al calor con mechero. Se agregan los colorantes de Gram en su orden y con los
tiempos ya estandarizados. Finalmente se adiciona una gota de aceite de inmersin y se lleva al
microscopio para hacer la observacin del microorganismo con el objetivo de 100x.

Identificacin de bacterias

La tercera etapa es la identificacin de bacterias (gnero), se realiza la descripcin de las


caractersticas de su morfologa celular y la morfologa de colonia en agar MacConkey y Sangre.
La confirmacin de los gneros estudiados se realizar mediante las tcnicas convencionales o
prueba de PCR.

Para la comparacin de las vas de contaminacin (alimentos-vector) de los productos


alimenticios que se sirven en el restaurante, se realizar una triangulacin de datos a partir de los
estudios culminados de los alimentos expendidos en el restaurante y en los alrededores como
cafetera y ventas ambulantes.

Para reconocer el efecto que producen estos microorganismos en la salud humana, se


concientizar a la comunidad frente a los efectos que tienen estos microorganismos en el cuerpo,
cules son sus enfermedades, que pasa cuando no se tratan a tiempo las enfermedades que estos
producen, para as saber cules son las medidas de asepsia y limpieza que deben tener las
personas que trabajan o manipulan los alimentos en el restaurante La Venada, y su preparacin.

Para concientizar a la comunidad universitaria en el manejo de las tcnicas correctas de


asepsia en el manejo y preparacin de los alimentos, que prevengan la contaminacin de los
alimentos que se consumen al hacer uso del servicio de alimentacin en el restaurante estudiantil
La Venada, se trabajar en conjunto con Bienestar Universitario al hacer una campaa masiva
31

divulgando la informacin recolectada de este proyecto de investigacin mediante una cartilla o


panfletos invitando a toda la comunidad universitaria donde se mostrarn sus enfermedades y los
datos producidos en esta investigacin.

Durante los 6 meses en que transcurri el proyecto se realizaron muestreos regulares


entre semana (lunes, mircoles y viernes), se hizo la colecta final o captura de las respectivas
moscas de cada uno de los sitios estudiados (restaurante La Venada) y como control el
restaurante de la sede de Salud. En total se recolectaron 120 ejemplares de M. domstica, solo el
nmero de muestras recolectado fue del restaurante La Venada. Luego estos se procesaron en un
mortero macerndolas durante un minuto para formar una mezcla compacta del material. Se
agreg 2ml de agua destilada estril y luego se recolect todo el contenido en un beaker el cual
se trasvaso del mortero al beaker con ayuda de un papel filtro el cual separo el lquido
sobrenadante del macerado. Del proceso del macerado se obtuvieron 15 ml de filtrado del
macerado, y 3 ml de macerado.

Luego se recolectaron en 25 tubos de ensayo los cuales se distribuyeron de la siguiente


manera: Tubo muestra #1 al tubo muestra #10 con 1 ml del filtrado del macerado, tubo muestra
#11 al tubo muestra #15 con 0,5 ml del filtrado del macerado, tubo muestra #16 al tubo muestra
#20 con 0,5 ml del macerado, y del tubo muestra #21 al tubo muestra #25 con 1 ml del
macerado. Se llevaron a una incubadora a 37C durante 24 horas.
32

Fase1. Campo (captura, recoleccin)

Recoleccin de muestras en el restaurante la Venada

Estratgicamente se ubicaron las trampas por cada esquina en el rea del restaurante, bajo
el mesn donde se sirven los alimentos, bajo algunas mesas, en las esquinas del servicio de
restaurante. En general, las trampas se dispusieron as:

Figura.

Figura 5. Fotos disposicin de trampas


33

Elaboracin de trampas artesanales

Figura.

Figura 6. Elaboracin trampas artesanales

Para la elaboracin de las trampas artesanales, lo primero que se hizo fue la recoleccin
de 30 frascos de gaseosa de 1,75 ml. Los cuales se recortaron justo por el borde superior donde
est pegada la etiqueta en el envase de gaseosa. Se procedi a realizar la mezcla de vinagre con
azcar y una rodaja de pltano como carnada, la cual se coloc en el fondo del recipiente, luego
se le abrieron unos agujeros al envase por donde ingresa la mosca y queda capturada. Se da la
vuelta a la tapa del frasco de gaseosa y se pega justo a la otra mitad del frasco de gaseosa.

Inicialmente esta tcnica de carnada es poco efectiva por lo que se cambia por pedazos de
carne suspendidos por un hilo dentro del recipiente con el cual se logra atrapar las moscas.

Figura.

Figura 7. Trampas con carnada


34

Procesamiento de la muestra (macerado, filtracin y siembra en caldo nutritivo)

Figura.

Figura 8. Foto macerado de las moscas

Figura.

Figura 9. Foto filtracin y enumeracin de muestras


35

Siembra en caldo nutritivo

Figura.

Figura 10. Muestras con 1 ml de filtrado del macerado


36

Figuras.

Figura 11. Muestras con 0,5 ml de filtrado del macerado

Figura 12. Muestras con 0,5 ml del macerado


37

Figura 13. Muestras con 1 ml del macerado

Los caldos nutritivos despus de sembrarse se llevan a la incubadora a 37C durante 24


horas.

Figura.

Figura 14. Muestras en incubadora

Pasadas las 24 horas de los caldos nutritivos, se observa turbidez en los medios lo que
indica crecimiento bacteriano.

Se repican en los agares MacConkey y agar sangre, sembrando cada muestra en el medio
por la tcnica de agotamiento y utilizando toda la caja de agar (MacConkey y agar Sangre).
38

Figura.

Figura 15. Siembra de muestras y lectura de crecimiento

Se siembran las muestras de colonias de microorganismos en los agares (MacConkey y


Sangre) y se llevan a incubar a 37C durante 24 horas. Su crecimiento se ve reflejado as:

Figura.

Figura 16. Siembra de la muestra en los agares - parte 1


39

Figura.

Figura 17. Siembra de la muestra en los agares - parte 2


40

Figura.

Figura 18. Siembra de la muestra en los agares - parte 3

En los medios de cultivo MacConkey y Agar Sangre observamos que en la mayora de


ellos se ve crecimiento bacteriano de E. Coli, Klebsiella, Proteus, Salmonella, entre otros. La
caracterstica principal de cada medio es el cambio de color de la colonia de acuerdo si es
fermentadora de lactosa o no. Para el caso del agar MacConkey se ve crecimiento de una especie
41

fermentadora por el color rosado o fucsia que presentan y las no fermentadoras son colonias de
color amarillo verdoso, para el agar Sangre solamente se observa el crecimiento y la morfologa
de la colonia.

Para purificar la bacteria, se toma una pequea muestra de la colonia y se siembra por
agotamiento en el agar MacConkey, que es un medio diferencial para grmenes Gram negativos,
lo cual nos ayuda a tener ms especificidad del microorganismo y facilita su identificacin al
estar puro.
Figura.

Figura 19. Repique de la siembra - parte 1


42

Figura.

Figura 20. Repique de la siembre- parte 2

Se toma de cada colonia encontrada en los diferentes medios una muestra con ayuda de
un hisopo estril se coloca sobre una lmina portaobjeto, se deja secar a temperatura ambiente y
se fija al calor, luego se colorea con colorante de Gram. Finalmente, se le agrega una gota de
aceite de inmersin y se observa en el microscopio con el objetivo de 100x, obtenindose:
43

Figura.

Foto63. Muestra 5. Bacilos Gram-Negativos Delgados

Foto64. Muestra 5. Coco Gram-Negativo.


44

Foto65. Muestra 8. Bacilo Gram-Negativo grueso

Foto66. Muestra 8. Coco Gram-Negativo


45

Foto67. Muestra 10. Bacilo Gram-Negativo grueso

Foto68. Muestra 10. Coco Gram-Negativo


46

Foto69. Muestra 11. Coco Gram-Negativo

Foto70. Muestra 11. Diplococo Gram-Negativo


47

Foto71. Muestra 12. Diplococo Gram-Negativo

Foto72. Muestra 15. Coco Gram-Negativo


48

Foto73. Muestra 17. Bacilo Gram-Negativo grueso

Foto74. Muestra 17. Bacilo Gram-Negativo pequeo


49

Foto75. Muestra 13. Coco Gram-Negativo

Figura 21. Muestras Gram

La limitacin presentada hasta el momento es que durante la primera fase al macerarse


toda la mosca hubo una combinacin de diferentes tipos de microorganismos, obtenindose
cultivos polimicrobianos. Debido a esto, se tuvo que hacer mltiples repiques en el agar
MacConkey para obtener cepas puras.
50

Fase 2. Laboratorio: Procesamiento de Patas

Para la segunda fase se delimit solo el macerado de una parte de la mosca, en este caso
las patas del insecto.

Para esta fase se procede a lo mismo que la fase anterior, se hizo la colecta o captura de
las respectivas moscas de cada uno de los sitios estudiados (restaurante La Venada). En total se
recolectaron 22 ejemplares de M. domstica. Luego estos se procesaron en un mortero
macerando solo las patas durante un minuto para formar una mezcla compacta del material. Se
agreg 2ml de agua destilada estril y luego se recolect todo el contenido en un beaker el cual
se recogi 2,7 ml final de sobrenadante del macerado y se trasvas del mortero al beaker con
ayuda de un papel filtro. Del proceso del macerado se obtuvo 2,7 ml de sobrenadante del
macerado el cual se sembr.

Luego se recolect el macerado obtenido en 25 tubos de ensayo los cuales se sembraron y


distribuyeron de la siguiente manera: Tubo muestra #1 al tubo muestra #20 con 50 uL del filtrado
del macerado, tubo muestra #21 al tubo muestra #23 con 10 uL del filtrado del macerado, tubo
muestra #24 con 15 uL del macerado, y el tubo muestra #25 con 1 ml del macerado. Despus se
llevaron a una incubadora a 37C durante 24 horas
51

Figura.

Figura 22. Macerado, filtracin, siembra e incubacin de los caldos nutritivos de la muestra
52

Transcurridas las 24 horas de incubacin de los caldos nutritivos, se observa turbidez en


los medios lo que indica crecimiento microbiano. Se siembra cada cultivo en agar MacConkey
por la tcnica de agotamiento.

Figura.

Figura 23. Siembre en agar

Se siembran en los agares (MacConkey y Sangre) y se llevan a incubar a 37C durante 24


horas. Su crecimiento se ve reflejado as:
53

FOTO93. Muestra 19 y 20 en agar


MacConkey

Figura 24. Muestra incubada en agar MacConkey


54

Se repican las muestras tomando un poco de la colonia del microorganismo ya formada y


se siembra por agotamiento de nuevo en otro medio de cultivo ya preparado (agar MacConkey),
con el objetivo de obtener un cultivo puro y as poder estudiar ms fcilmente el
microorganismo. Aislamiento de colonias:

Figura 25. Aislamiento de colonias


55

Para observar la morfologa de los microorganismos aislados se hace una coloracin de


Gram: tomar una muestra pequea de colonia de los microorganismos con ayuda de un hisopo
estril se esparce la muestra en una lmina portaobjeto, se deja secar a temperatura ambiente, se
fija al calor. Finalmente se colorea con Gram, se le agrega una gota de aceite de inmersin y se
observa en el microscopio con el objetivo de 100x.

Figura.

Foto109. Muestra 24. Gram negativo

Figura 26. Coloracin con gram


56

Fase 3: Laboratorio (repique, tincin, descripcin, y PCR)

Finalmente, para la tercera fase que consiste en la identificacin de cada microorganismo


por una prueba convencional de biologa molecular, PCR. Primero se toma la totalidad del
cultivo de cada una de las muestras recolectadas en las fases anteriores, con ayuda de un
escobilln estril se introduce la muestra en el medio, agitando vigorosamente en el fondo del
tubo que en este caso es el medio de transporte AMIES con carbn activado. Luego se recogen
las muestras cerca de un mechero para evitar la contaminacin del medio, y a ajustar los tubos
con su respectiva tapa.

Este medio por lo general es indicado pues conserva mejor las muestras de
microorganismos recolectadas, al aadir iones de Calcio y Magnesio, que ayudan a conservar la
permeabilidad de la clula bacteriana y la presencia de carbn en el medio neutraliza inhibidores
y toxinas bacterianas, y mejora la recuperacin de diferentes especies microbianas hacindolo un
medio de transporte eficaz para muestras.

Figura 27. Muestra en medio AMIES


57

Los medios de transporte AMIES con carbn activado ajustados y tapados se a incuban
48 horas para permitir que la colonia crezca y despus de esto son embalados segn las normas
de bioseguridad se envan a la ciudad de MONTERIA CRDOBA, al laboratorio de
Microbiologa y Biologa Molecular del Dr. Salim Mattar, quin gentilmente nos colabor en su
laboratorio. Para el anlisis bioinformtico de la amplificacin de ADN se realiz una PCR
convencional de las muestras aisladas de los microorganismos de la M. domestica como vector
de enterobacterias y bacterias en general.
58

Resultados y Discusin

A las 30 muestras aisladas, purificadas y enviadas a Montera para el anlisis


Bioinformtico, se les aisl el DNA y se hizo PCR (Reaccin en cadena de polimerasa)
obtenindose los siguientes resultados:

Tabla 1. Anlisis comparativo de especies de microorganismos encontrados en los macerados


de la mosca domstica

MONTERIA NEIVA
Nmero Cdigo Microorganismos Microorganismos
1 1F E. coli E. coli
2 1 NF K. pneumoniae; Mezclada con
Proteus Proteus
3 2F E. coli E. coli
4 2 F 1 ml E. coli E. coli
5 3F E. coli E. coli
6 3 NF K. pneumoniae Mezclada con
Proteus
7 4F K. pneumoniae K. pneumoniae
8 4 NF K. pneumoniae; Mezclada con
Proteus Proteus
9 5F E. coli E. coli
10 5 NF K. pneumoniae K. pneumoniae
11 6F E. coli E. coli
12 6 NF K. pneumoniae K. pneumoniae
13 7F E. coli E. coli
14 8F K. pneumoniae E. coli
15 8 NF K. pneumoniae K. pneumoniae
16 9 NF E. coli E. coli
59

17 10 F E. coli E. coli
18 10 NF K. pneumoniae; Mezclada con
Proteus Proteus
19 11 NF K. pneumoniae No identificada
20 12 F K. pneumoniae K. pneumoniae
21 13 NF K. pneumoniae No identificada
22 14 NF K. pneumoniae No identificada
23 15 F K. pneumoniae No identificada
24 16 F E. coli E. coli
25 17 F E. coli K. pneumoniae
26 17 F 0,5 ml K. pneumoniae K. pneumoniae
27 17 NF 0,5 ml K. pneumoniae; Mezclada con
Proteus Proteus
28 18 F K. pneumoniae K. pneumoniae
29 19 F 0,5 ml E. coli E. coli
30 20 F K. pneumoniae No identificada
Fuente: Elaboracin propia, 2017

Al analizar el cuadro comparativo de las cepas que se encontr por el mtodo manual en
Neiva y los resultados de las mismas por PCR en Montera, podemos concluir lo siguiente:

Tabla 2. Relacin de muestras de acuerdo a su importancia y nivel de purificacin y


concordancia.

Concordancia 60.00% correspondiente a 18


muestras
Muestras no puras o mezcladas 16,66% correspondiente a 5
muestras
Muestras no identificadas 16.66% correspondiente a 5
muestras
Muestras que no coinciden 6.66 % correspondiente a 2
muestras
Fuente: Elaboracin propia, 2017
60

Como se observa en la tabla 1 hay 18 muestras con concordancia, que es mayor a un


50% como lo expresa la tabla 2, obtenindose un resultado muy satisfactorio y positivo. Se
puede afirmar que las 18 muestras que se transportaron tuvieron un menor grado de
contaminacin en cuanto a las otras 12 muestras transportadas. Dentro de las muestras no puras o
mezcladas, se encuentra 5 muestras equivalente a un 16,66%, de las cuales tambin hay un grado
de relacin o concordancia en s, no se logr identificar la colonia de el microorganismo formado
en el agar porque ste se encontraba mezclado con otra cepa que en este caso era el Proteus; tal
cual como se encontr en las muestras analizadas por PCR.

As mismo las muestras de bacterias que no se lograron identificar, corresponden a 5


muestras equivalente a un 16,66%, no fueron identificadas porque se tuvo dudas respecto a la
coloracin de las cepas de microorganismos observadas al microscopio y sus reacciones
bioqumicas no fueron totalmente claras.

La siembra, el aislamiento e identificacin de los microorganismos por el mtodo


convencional es equivalente al realizado por PCR, esto se afirma porque los resultados obtenidos
de los microorganismos encontrados son exactamente los mismos. A pesar de que los recursos
disponibles no fueron suficientes, se distribuyeron adecuadamente para que esta investigacin
fuera posible. Ahora con respecto a la obtencin de las cepas de importancia epidemiolgica por
confirmar, podemos observar lo siguiente:

Tabla 3. Relacin de cepas de acuerdo a su importancia epidemiolgica.

12 cepas de E. coli, correspondiendo a un 40%.


13 cepas de Klebsiella, correspondiendo a un 43.3%
5 cepas contaminadas, correspondiendo a un 16.66 %
Fuente: Elaboracin propia, 2017

Se observa que el porcentaje de Escherichia coli es muy significativo y da pie para


buscar E. coli 0157:H7 de importancia Clnica, como nos lo indica Restrepo et al. 2003, es una
cepa productora de toxina Shiga la cual provoca calambres abdominales y diarrea, que puede
61

progresar en algunos casos a diarrea sanguinolenta (colitis hemorrgica). Tambin puede generar
fiebre y vmitos.

Ahora para la comparacin de las vas de contaminacin (alimentos-vector) de los


productos alimenticios que se sirven en el restaurante, se realiz un paralelo de datos a partir de
los estudios culminados de los alimentos expendidos en el restaurante y en los alrededores como
cafetera y ventas ambulantes.

Con el estudio de alimentos expendidos en el restaurante y en los alrededores como


cafetera y ventas ambulantes se obtuvo un total de 84 muestreos dando como resultado la
aparicin de 43 aislamientos, con la siguiente distribucin: 13 aislamientos de E. coli, 17 de
Klebsiella spp; 4 de Shigella spp, 2 de Salmonella spp, 2 de Proteus spp, 2 de Enterobacter spp,
1 de Tatumella ptyseos y 2 de levaduras.

Tabla 4. Cuadro comparativo de cepas de acuerdo a su importancia epidemiolgica


recolectadas del restaurante La Venada

Anlisis en Alimentos Anlisis en mosca domestica


Microorganismos Frecuencia Porcentaje Frecuencia Porcentaje
E. coli 13 25 12 40
Klebsiella 17 40 13 43,33
Proteus 2 0 5 16,66
Fuente: Elaboracin propia, 2017

Escherichia coli se detect tanto en el grupo de las comidas preparadas en los


restaurantes de la Universidad como en las ventas ambulantes de los alrededores con un (25%).
Dndonos una clara evidencia de contaminacin por este microorganismo, as como su
capacidad para ser transportada por un vector como la mosca donde este revela un porcentaje de
alrededor del (40%), frente a esto observamos cmo se transfiere de un husped a otro y su
capacidad de adaptabilidad frente a cualquier situacin.
62

Para el caso de la Klebsiella spp se aisl en la mayora de las comidas preparadas en las
ventas ambulantes y en los restaurantes de la Universidad con un (40%). Frente al (43,33%)
encontrado en la mosca, indicndonos que este puede encontrarse no solo en los humanos sino
tambin en un insecto que pudo haber contaminado la comida al posarse sobre ella.

Para el caso de Proteus spp se aisl a partir de dos jugos naturales y arepas de maz,
procedentes de las ventas ambulantes que se encuentran a las afueras de la Universidad y es
representando en un porcentaje del 11%. De la cafetera y el restaurante de la Universidad no se
aisl este microorganismo. Frente a un (16,66%) indicando que este microorganismo si vive
como husped en la mosca y es capaz de contaminar cualquier tipo de comida debido a que es
transportado por el insecto el cual lo transfiere por la regurgitacin al posarse sobre el alimento
que se encuentra servido en los platos y que puede causar una intoxicacin en las personas que
toman el servicio de alimentacin en el restaurante.

Ahora para la elaboracin del material de divulgacin de la cartilla y/o folletos estos
surgen de la necesidad de crear conciencia y ensear a la comunidad educativa en el manejo de
las tcnicas correctas de asepsia y en la preparacin de los alimentos, para prevenir su
contaminacin al ser consumidos en el servicio de alimentacin del restaurante estudiantil La
Venada, donde se trabaj en conjunto con Bienestar Universitario al hacer una campaa masiva
divulgando la informacin recolectada de este proyecto de investigacin y los efectos que
producen estos microorganismos en la salud humana.
63

Conclusiones

Esta investigacin permiti comprender la importancia de conocer cules son los problemas
de salud en los que se ven afectados tanto estudiantes, y comunidad en general frente a la mala
manipulacin de los alimentos, utensilios y la propagacin de los insectos vector como lo es la
mosca, se ha presentado una seria problemtica en los ltimos aos de servicio que brinda el
restaurante La Venada, situacin que conlleva incluso a analizar porque no se han tomado las
medidas necesarias de control frente a la calidad del servicio que lleva prestando la universidad
y como se ve afectada la imagen de la misma, frente a su dficit en el manejo de estas
situaciones.

Se determin la presencia de enterobacterias presentes en la M. domstica como vector de


propagacin de enfermedades en el Restaurante La Venada de la Universidad Surcolombiana
sede Central Neiva Huila, en la que se encontr un porcentaje relativo de Escherichia Coli con
un 40% en 12 muestras recolectadas, un 43,33% de Klebsiella spp en 13 muestras recolectadas y
un 16,66% de Proteus spp en 5 muestras recolectadas.

Se estimaron los tamaos poblacionales de los microorganismos objeto de estudio


presentes en la M. domstica al encontrarse estos microorganismos de importancia clnica como
lo es la E. coli, la Klebsiella spp, y el Proteus spp, indicando que este insecto es un claro vector
de propagacin de enfermedades que causa mltiples infecciones como diarrea, vmito, malestar
general, calambres abdominales o clicos y fiebre como sntomas claros de intoxicacin en los
seres humanos.

Se aislaron los microorganismos a partir de la siembra en agar MacConkey y Sangre por


la tcnica de agotamiento y se repicaron para obtener el cultivo purificado o axnico. Se
identificaron los microorganismos de inters presentes en el vector M. domstica en el
restaurante La Venada, a partir del anlisis microbiolgico, pruebas bioqumicas y la prueba
convencional de reaccin en cadena de la polimerasa PCR por medio de la amplificacin de la
cadena de ADN de la E. coli, Klebsiella spp, y Proteus spp.
64

Se compararon las vas de contaminacin (alimentos-vector) de los productos


alimenticios que se sirven en el restaurante y se reconoci el efecto que producen estos
microorganismos en la salud humana mediante una comparacin de datos analizados a partir del
estudio terminado en anlisis microbiolgico de alimentos del restaurante y sus alrededores,
como de la mosca domstica que porta estos microorganismos, encontrndose similitud en los
organismos identificados por pruebas convencionales de PCR y su alto ndice de infestacin y
propagacin.

Se concientiz a la comunidad universitaria gracias a la recoleccin de toda la


informacin producida en este proyecto de investigacin y su divulgacin a partir de la cartilla y
de los folletos que ilustraron el manejo de las tcnicas correctas de asepsia de manipulacin de
alimentos, sus utensilios y las basuras provenientes de los mismos para prevenir la
contaminacin, al hacer uso del servicio de alimentacin en el restaurante estudiantil La Venada
y as evitar una futura intoxicacin por este vector.
65

Referencias bibliogrficas e infogrficas

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68

Apndice 1. Tincin de Gram.

TINCIN DE GRAM:
1. Realizar frotis, fijar al calor de la llama, dejar secar.
2. Agregar colorante de cristal violeta por 1 minuto.
3. Lavar con agua destilada
4. Agregar lugol de Gram por 1 minuto.
5. Lavar con agua destilada
6. Adicionar alcohol de acetona por 30 segundos.
7. Lavar con agua destilada
8. Agregar fucsina de Gram por 1 minuto y lavar con agua destilada. Dejar secar.

Agar TSI: (Triple azcar hierro):


Este medio es empleado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la fermentacin de
glucosa, lactosa, sacarosa y a la produccin de cido sulfhdrico H2S. Una vez que se ha
reducido toda la glucosa piruvato, este se metaboliza por el ciclo de Krebs formando productos
finales cidos.

El cido en el medio hace virar el amarillo del indicador de pH, rojo fenol. A 6 horas de la
incubacin, la zona de la estra y el fondo del tubo tendrn un color amarillo (fermentador de
glucosa).
Si el fondo permanece rojo, no hay variacin de pH (no fermentador de glucosa). Al agotar la
glucosa la bacteria utiliza la lactosa o sacarosa. Despus de 18 - 24 h, el medio permanece
amarillo, reaccin cido sobre cido (A/A). Fermentador de lactosa. La produccin de gas
romper el agar o lo empujara hacia arriba. Reaccin A/A ms gas. Si no utiliza la lactosa, har
uso de protenas o aminocidos. El metabolismo proteico se produce en la superficie de la zona
inclinada donde el oxgeno es abundante. 18 - 24 h de incubacin: zona inclinada roja fondo del
agar amarillo (metabolismo anaerobio de glucosa inicial). Reaccin alcalina sobre cido K/A.

Para el crecimiento positivo de E. coli y Klebsiella, las colonias deben fermentar los tres
azucares (glucosa, lactosa y/o sacarosa), es decir, debe tener pico cido / fondo cido (A/A). Se
puede presentar ruptura del medio o burbujas lo que indica que el microorganismo produce gas.
En E. Coli y Klebsiella pneumoniae., la produccin de H2S resulta ser negativa, es decir, que no
ennegrece el medio.
69

K/A: fermentacin de glucosa solamente (Pico de flauta alcalino/profundidad cida).


Caracterstico de bacterias no fermentadores de lactosa como Proteus mirabilis y Shigella.

A/A: fermentacin de glucosa y lactosa (Pico de flauta cido/ profundidad cida). Caractersticos
de E. coli y grupo Klebsiella - Enterobacter.

K/K: No fermentacin de glucosa y lactosa (pico de flauta alcalino/profundidad alcalina).


Caracterstico de bacterias no fermentadoras como Pseudomona aeruginosa.

Agar LIA (Lisina Hierro):


Este medio empleado sirve para medir la capacidad enzimtica de un organismo para
descarboxilar un aminocido (lisina y arginina) para formar una amina con la consiguiente
alcalinidad. El indicador de pH utilizado es el prpura de bromocresol. Los sustratos principales
son lisina y glucosa.

K / K: Azul de Prusia / azul de Prusia. Desaminacin oxidativa / descarboxilacin.


K / A: azul de Prusia / lila. No desaminacin.
Produccin de H2S: Ennegrecimiento del medio.
Produccin de gas: burbujas o levantamiento del medio de cultivo de las paredes del tubo.

Inoculacin del medio se da por picadura y estra, inculo liviano. La Temperatura para el
crecimiento bacteriano se da de 35 - 37C. El Tiempo de crecimiento se da de 18 24 h.

Para el crecimiento positivo de E. coli y Klebsiella pneumoniae, las colonias deben realizar una
desaminacin oxidativa o descarboxilacin de la lisina, es decir, debe tener pico alcalino / fondo
alcalino (k/k). Se puede presentar levantamiento del medio o burbujas lo que indica que el
microorganismo produce gas. En E. Coli y Klebsiella pneumoniae., la produccin de H2S resulta
ser negativa, es decir, que no ennegrece el medio.

Para el caso de Proteus mirabilis, este microorganismo no realiza la desaminacin, es decir, debe
tener pico rojo / fondo cido (R/A). Se produce gas y H2S, es decir, hay presencia de burbujas y
ennegrecimiento del medio.

Agar Citrato Simmons:


Este medio es utilizado para la diferenciacin de enterobacterias, en base a la capacidad de usar
citrato de sodio como nica fuente de carbono y energa. El indicador es el azul de bromotimol,
que es amarillo por debajo de pH 6 y azul por encima de pH 7,6. La prueba positiva est
representada por la produccin de color azul oscuro en el trmino de 24 a 48 horas, que indica
que el microorganismo en prueba ha sido capaz de utilizar el citrato contenido en el medio, con
formacin de productos alcalinos.
70

Para microorganismos como E. coli, el medio permanece de color verde debido a que no hay
desarrollo bacteriano y no hay cambio de color. Para el caso de Klebsiella pneumoniae y Proteus
mirabilis, se registra crecimiento y color azul en el pico, alcalinidad.

Caldo Urea:
Este medio es utilizado para la identificacin bacterias que hidrolizan urea. Es una diamida del
cido carbnico y se hidrolizan fcilmente, con liberacin de amoniaco y dixido de carbono. El
amoniaco reacciona en solucin para formar carbonato de amonio, lo que produce alcalinizacin
y aumento de pH del medio.

Para microorganismos como E. Coli, el medio permanece de color amarillo debido a que los
microorganismos no son capaces de hidrolizar la urea y esto hace que el medio permanezca del
mismo color que antes de la incubacin. Para el caso de Klebsiella pneumoniae. y Proteus
mirabilis, se registra crecimiento y por lo tanto se evidencia hidrlisis de urea, cambiando el
medio a color rosado - rojizo.

Produccin de Indol:
El triptfano es un aminocido que puede ser oxidado por ciertas bacterias para formar tres
metabolitos principales: indol, escatol e indolactico. La formacin de indol se produce
solamente en aquellos organismos capaces de fermentar los hidratos de carbono.

Positivo: Anillo rojo en la superficie del medio. Para la E. coli.


Negativo: No se produce color / Color naranja en la superficie del medio indica desarrollo de
escatol, un compuesto metilado que puede ser precursor de la formacin de indol. Para la
Klebsiella pneumoniae, Proteus mirabilis.

Movilidad:
Positiva: los organismos mviles migran de la lnea de siembra y se difunden en el medio
provocando turbiedad.
Negativa: Crecimiento bacteriano acentuado siguiendo la lnea de siembra.

Agar MacConkey:
Las colonias de los microorganismos fermentadores de lactosa (coliformes) en agar MacConkey
son de color rojo ladrillo y eventualmente rodeadas por bilis precipitada. Este es un medio
selectivo para el crecimiento de enterobacterias. Contiene peptona, sales biliares, lactosa y rojo
neutro como indicador de pH (evidencia la fermentacin de la lactosa por el cambio de color a
fucsia o violeta y los no fermentadores a amarillo).
71

Agar Sangre:
Se observa hemlisis de este medio: (hemlisis alfa) lisis parcial de los glbulos rojos, se
observa un halo de color verdoso alrededor de la colonia. Es debido a la oxidacin de la
hemoglobina a metahemoglobina (compuesto de color verdoso) por el perxido de hidrogeno
generado por los microorganismos. Est compuesto por la infusin musculo de corazn y
peptona, la cual permiten el crecimiento de una gran variedad de microorganismos, incluso
algunos que tienen exigencias nutricionales. El cloruro de sodio es el encargado de mantener el
balance osmtico y el agar es el agente solidificante. (Hemlisis beta) en este caso la hemlisis
es total y el halo que rodea a las colonias es totalmente transparente. (Hemlisis gamma) no hay
hemlisis, el microorganismo en cuestin no es capaz de realizar la hemlisis y por tanto no
existe halo alrededor de la colonia.

Descripcin de las colonias en agar MacConkey:

Escherichia coli:
Colonias aisladas, medianas, circulares, convexas, bordes redondeados, lactosa positivas lo que
les da coloracin rosada con consistencia cremosa en agar MacConkey.

Klebsiella pneumoniae:
Colonias grandes planoconvexa, mucoides, forma irregular, tambin se observan redondeadas y
brillantes, bordes ondulados, lactosa positivo (consume el carbohidrato lactosa lo cual acidifica
el medio y el indicador rojo de fenol cambia rojo-rosado, por eso se ven de ese color en agar
MacConkey.

Proteus mirabilis:
En MacConkey las colonias son (no fermentadoras de Lactosa) transparentes o amarillas, se
forma una especie de ola alrededor de las colonias bacterianas y esta se desplaza de forma radial.
En agar sangre presenta el fenmeno se swarming, se caracteriza por la formacin de una
pelcula que se extiende por todo el medio de cultivo.
72

Apndice 2. Pruebas Bioqumicas para la identificacin de los microorganismos.

Nmero Cdigo TSI H2S GAS LIA Cit. Urea Indol Motilidad Microorganismos
S.
1 1F A/A - + K/K - - + + E. coli
2 1 NF K/A + + K/A - + - + Mezclada con
Proteus
3 2F A/A - + K/K - - + + E. coli
4 2 F 1 ml A/A - + K/K - - + + E. coli
5 3F A/A - + K/K - - + + E. coli
6 3 NF K/A + + K/A - + - + Mezclada con
Proteus
7 4F A/A - + K/K + + - - K. pneumoniae
8 4 NF K/A + + K/A - + - + Mezclada con
Proteus
9 5F A/A - + K/K - - + + E. coli
10 5 NF A/A - + K/K + + - - K. pneumoniae
11 6F A/A - + K/K - - + + E. coli
12 6 NF A/A - + K/K + + - - K. pneumoniae
13 7F A/A - + K/K - - + + E. coli
14 8F A/A - + K/K - - + + E. coli
15 8 NF A/A - + K/K + + - - K. pneumoniae
16 9 NF A/A - + K/K - - + + E. coli
17 10 F A/A - + K/K - - + + E. coli
18 10 NF K/A + + K/A - + - + Mezclada con
Proteus
19 11 NF No identificada
20 12 F A/A - + K/K + + - - K. pneumoniae
21 13 NF No identificada
22 14 NF No identificada
23 15 F No identificada
24 16 F A/A - + K/K - - + + E. coli
25 17 F A/A - + K/K + + - - K. pneumoniae
26 17 F 0,5 A/A - + K/K + + - - K. pneumoniae
ml
27 17 NF K/A + + R/A - + - + Mezclada con
0,5 ml Proteus
28 18 F A/A - + K/K + + - - K. pneumoniae
29 19 F 0,5 A/A - + K/K - - + + E. coli
ml
30 20 F No identificada