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MARCO TERICO

DETERMINACIN DE PROLINA

Prolina

La prolina es un aminocido que se encuentra en las plantas en cantidades muy pequeas, en


condiciones adecuadas para el desarrollo y crecimiento. Bajo algunas tensiones, se ha reportado
que el contenido de prolina libre puede aumentar con el fin de proteger a la planta contra algunos
tipos de estrs. Se ha propuesto, que la prolina participa con mltiples funciones y que est
relacionada con la expresin de genes de tolerancia de las plantas a diferentes condiciones de
estrs, actuando como osmorregulador (Kavi Kishor et l. 1995; Toshiba et l. 1997, citados por
Moreno L. et al, s/f), estabilizador de protenas y membranas, inductor de genes relacionados con
estrs osmtico (Iyer y Caplan 1998, citados por Moreno L. et al, s/f), fuente de carbono y
nitrgeno fcilmente disponible en la rehidratacin celular (Brugire et l. 1999, citado por
Moreno L. et al, s/f), fuente de equivalentes de reduccin (del catabolismo de prolina) para
sostener la fosforilacin oxidativa y la sntesis de ATP durante la recuperacin del estrs (Hare y
Cress 1997; Hare et l. 1998, citados por Moreno L. et al, s/f). Tambin existe evidencia de su
funcin en el control de la acidosis del citosol y en la regulacin de la relacin NADH/NAD + a
valores compatibles con el metabolismo (Hare y Cress 1997, citados por Moreno L. et al, s/f); en la
detoxificacin del exceso de NH4+ y en eventos de estrs oxidativo (Ramanjulu y Sudharkar 2000;
Moller et l. 2007, citados por Moreno L. et al, s/f). Muchas especies de plantas acumulan prolina
libre en respuesta a la salinidad (Jimnez-Bremont et l. 2006, citados por Moreno L. et al, s/f),
deficiencia hdrica (Avendao et l. 2005) y fro (Konstantinova et l. 2002, citados por Moreno L.
et al, s/f).

Una respuesta comn en plantas estresadas es la acumulacin de prolina, consecuencia del


descenso del potencial hdrico celular. Esta acumulacin, se acompaa de incrementos de las
actividades enzimtica glutamato sintasa, pirroln-5-carboxilato sintasa y pirroln-5-carboxilato
reductasa, e inhibicin de la prolina deshidrogenasa (Daz, P. et al., 1999). La prolina es liberada en
grandes cantidades disminuyendo el potencial hdrico, asocindosele comnmente a plantas
resistentes a la sequa (Arriaga, A. et al., 1999).

Vas de biosntesis y degradacin de prolina

Se han propuesto dos vas biosintticas para la sntesis de prolina en plantas superiores, una en la
va del glutamato y la otra en la va de la ornitina, en las que se usan glutamato (Glu) y ornitina
(Orn) respectivamente (Verslues y Sharma, 2010, Hayat et al., 2012, citados por Mohammad et al.,
s/f). La sntesis de prolina a partir de glutamato requiere de dos enzimas ( 1-pirrolina-5-carboxilato
sintetasa (P5CS, EC 2.7.2.11) y 1-pirrolina-5-carboxilato reductasa (P5CR, EC 1.5.1.2) (Ashraf y
Foolad, 2007, Burritt, 2012, citados por Mohammad et al., s/f). El primer P5CS fosforila y reduce el
glutamato de glutamato-semialdehdo (GSA) que se convierte espontneamente en 1-pirrolina-5-
carboxilato (P5C) y por consiguiente la enzima P5CR convierte el P5C en prolina (Delauney y
Verma, 1993; Burritt, 2012, citados por Mohammad et al., s/f). Recientes estudios metablicos de
las plantas revelaron que la mayor parte de la prolina acumulada en el tratamiento de estrs se
debe a la mayor produccin de glutamato en las clulas de las plantas (Delauney y Verma, 1993,
Hare y Cress, 1997, Witt et al, 2012, citados por Mohammad et al., s/f) y la va del glutamato es la
va principal de la prolina en condiciones de estrs (Lv et al., 2011, citados por Mohammad et al.,
s/f). Adems, la biosntesis de prolina a partir de ornitina se produce a travs de las enzimas
ornitina--aminotransferasa (-OAT). La acumulacin de prolina a travs de la ruta de la ornitina es
muy importante en el momento del establecimiento de las plntulas y en algunas especies de
plantas para el aumento de la prolina mediada por estrs (Armengaud et al., 2004, citados por
Mohammad et al., s/f). La biosntesis de prolina se produce de forma constante en el citosol,
mientras que se aumenta en los cloroplastos durante condiciones de estrs (Szabados y Savoure',
2010, citados por Mohammad et al., s/f). Como la biosntesis de prolina requiere NADPH, la tasa de
su biosntesis en cloroplastos mantiene la baja relacin NADPH: NADP +, resultando una reduccin
de la fotoinhibicin bajo alta irradiacin (Hare y Cress, 1997, citados por Mohammad et al., s/f).

La prolina se acumula en el citosol o en el cloroplasto mientras que la degradacin de la prolina


(oxidacin de la prolina al glutamato) en las plantas ocurre en las mitocondrias (Krasensky y Jonak,
2012, citados por Mohammad et al., s/f) a travs de la accin consecutiva de dos enzimas
diferentes. En primer lugar, la enzima prolina deshidrogenasa (PDH, EC 1.5.99.8) convierte la
prolina en pirrolina carboxilato (P5C) y la enzima pirrolina-5-carboxilato deshidrogenasa (P5CDH,
EC 1.5.1.12) altera el P5C en glutamato. La acumulacin de nivel de prolina endgena bajo
condiciones estresantes es el resultado acumulativo de ambos, incluyendo mayor tasa de sntesis y
alteracin de sus vas de degradacin (Delauney y Verma, 1993; Burritt, 2012, citados por
Mohammad et al., s/f); Por lo tanto, el contenido de prolina intracelular depende de su biosntesis,
degradacin y transporte desde otras partes de la planta (Kavi Kishor et al., 2005, citados por
Mohammad et al., s/f).
Imagen tomada de Proline Protects Plants Against Abiotic Oxidative Stress: Biochemical and
Molecular Mechanisms, Mohammad et al.

Acumulacin de prolina y tolerancia de estrs abitico

El aumento de los niveles de prolina endgena es un importante atributo fisiolgico adaptativo


para contrarrestar los efectos deletreos del estrs ambiental en las plantas y se observ por
primera vez en el centeno marchitado (Kemple y Macpherson, 1954, citados por Mohammad et al.,
s/f). Estudios de investigacin han demostrado que la acumulacin de prolina en plantas bajo
diferentes estreses abiticos est positivamente correlacionada con la tolerancia al estrs oxidativo
(Anjum et al., 2012, y Saeedipour, 2013, citados por Mohammad et al., s/f). Un mecanismo general
conservado de las plantas a diversos estreses abiticos que causan deshidratacin celular, como
salinidad, sequa, fro, calor, metales pesados, es la sntesis y acumulacin de solutos compatibles
(Boscaiu et al., 2012; Hayat et al., 2012, citados por Mohammad et al., s/f). Se encontr que la
acumulacin de prolina se produca cuando las plantas eran sometidas a diversos estreses
abiticos, incluyendo sequa (Choudhary et al., 2005, y al. , 2012, citados por Mohammad et al.,
s/f), salinidad alta (Yazici et al., 2007, Boscaiu et al., 2012, Sripinyowanich et al., 2013, citados por
Mohammad et al., s/f), refrigeracin (Luo et al., 2011, citados por Mohammad et al., s/f) (Xu et al.,
2012, citados por Mohammad et al., s/f), alta irradiacin de luz y UV (Saradhi et al., 1995, citados
por Mohammad et al., s/f), metales pesados (Schat et al., 1997, Sharma y Dietz, 2006, Bao et al.,
2011, citados por Mohammad et al., s/f), la irradiacin gamma (Jan et al., 2012, citados por
Mohammad et al., s/f) y el estrs oxidativo (Yang et al., 2009, citados por Mohammad et al., s/f).
Los estudios que investigan la resistividad y la susceptibilidad de las plantas al estrs abitico han
demostrado la importancia fundamental de la prolina en la tolerancia (Tuarkan et al., 2005; Man et
al., 2011; Saiema et al., 2012; Saeedipour, 2013, citados por Mohammad et al., s/f).

Mtodo de Bates et al.

La determinacin de prolina se realiza desde la antigedad en numerosos trabajos de seleccin


frente a estreses abiticos como la sequa y posteriormente, la salinidad, mediante un mtodo
rpido, sencillo y suficientemente preciso, basado en la reaccin de la prolina con la ninhidrina
(Bates et al., 1973)

El mtodo de determinacin de prolina (Bates et al. 1973) se fundamenta en que la ninhidrina es


un agente oxidante fuerte que efecta la descarboxilacin de los aminocidos. El amoniaco as
formado reacciona con una segunda molcula de ninhidrina protonada para producir un pigmento,
del cual slo el tomo de nitrgeno pertenece al aminocido. Esta es una metodologa especfica
para determinar el contenido de prolina (Moreno L. et al, s/f).

Reactivos utilizados para la determinacin de prolina

cido sulfosalislico al 3%: Es incoloro, un precipitante proteico eficaz en solucin acuosa, y no


interfiere con la reaccin cido-ninhidrina. Materiales interferentes adicionales que normalmente
elevaban la lnea de base de 520 nm, se eliminaron presumiblemente por adsorcin al complejo de
cido proteico-sulfosalislico (Bates et al, 1973).

cido actico glacial: Se le llama as debido a que cristaliza fcilmente formando cristales
semejantes al hielo, a 16.7C. Es el cido actico puro y anhidro y acta como disolvente (Macy, R,
2005).

Ninhidrina: Descarboxila y desamina aminocidos gracias a su poder oxidante. Los aminocidos


tratados con ninhidrina dan un color azul intenso, excepto la prolina, que da un color amarillo
porque contiene un grupo amino secundario (Berg, J. et al., 2007).

Reactivo de ninhidrina cida: Este reactivo ninhidrina-cida de Troll y Lindsley es lo


suficientemente preciso indicar el grado de estrs de la planta (Bates et al, 1973).
BIBLIOGRAFA

Arriaga, A. et al. 1999. Relaciones hdricas en las plantas. 1era edicin. Editorial Plaza y Valdez.
65p.

Bates, L. et al. 1973. Rapid determination of free proline for water-stress studies. Plant and Soil,
205-207p.

Berg, J. et al. 2007. Bioqumica. 6ta edicin. Editorial Revert. 78p.

Daz, P. et al. 1999. Acumulacin de prolina en plantas en respuesta al estrs osmtico. 1p.

Macy, R. 2005. Qumica Orgnica Simplificada. Editorial Revert. 315p.

Mohammad et al. Proline Protects Plants Against Abiotic Oxidative Stress: Biochemical and
Molecular Mechanisms. 479-481p.

Moreno L. et al. PRUEBAS BIOQUMICAS COMO HERRAMIENTAS PARA ESTUDIOS EN FISIOLOGA


(En lnea). Disponible en: http://www.bdigital.unal.edu.co/8545/27/12_Cap10.pdf