Está en la página 1de 98

ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE

Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIN TRMICA,


SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus.

DIANA DEL PILAR GIZA PREZ


LINA MARA RINCN PRIETO

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA


FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
Bogot, D.C.
Octubre de 2007
ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE
Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIN TRMICA,
SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus.

DIANA DEL PILAR GIZA PREZ


LINA MARA RINCN PRIETO

TRABAJO DE GRADO
Presentado como requisito parcial
para optar el ttulo de:

MICROBILOGO INDUSTRIAL

ANA KARINA CARRASCAL. Directora

PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA


FACULTAD DE CIENCIAS
CARRERA DE MICROBIOLOGA INDUSTRIAL
Bogot, D.C.
Octubre de 2007
Artculo 23 de la Resolucin No 13 de Julio de 1946

La universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus


alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velar porque no se publique nada
contrario al dogma y a la moral catlica y porque las tesis no contengan
ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo
de buscar la verdad y la justicia.
ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE
Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIN TRMICA,
SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus.

DIANA DEL PILAR GIZA PREZ


LINA MARA RINCN PRIETO

APROBADO

_______________________________
ANA KARINA CARRASCAL CAMACHO. MSc
Directora

_________________ __________________
NADENKA MELO ADRIANA PEZ
Jurado Jurado
ESTUDIO DEL EFECTO ANTIMICROBIANO DEL ACEITE ESENCIAL DE
Minthostachys mollis COMBINADO CON INACTIVACIN TRMICA,
SOBRE CEPAS DE Listeria monocytogenes y Bacillus cereus.

DIANA DEL PILAR GIZA PREZ


LINA MARA RINCN PRIETO

APROBADO

______________________ ____________________
ANGELA UMAA MUOZ JANETH ARIAS PALACIOS
BIOLOGA PhD MICROBILOGA MSc.
Decana Acadmica Director de Carrera
AGRADECIMIENTOS

A la Dra. Ana Karina Carrascal por su direccin, apoyo y oportunidades


que nos brind para complementar los conocimientos en la realizacin
de este trabajo.

A Luz Marina Melgarejo por su oportuna colaboracin.

A Nathalia Chica por su paciencia, optimismo y gran ayuda.

A Fabin Torres por su valiosa asesora.

A Aura Marina Pedroza por su contribucin en el anlisis estadstico.

A Inesita y al personal de lavado y esterilizacin por su paciencia y


colaboracin.
A Dios, por iluminarme y acompaarme en todos mis proyectos
A mi mam, por ser mi amiga, por tanto amor y por estar siempre ah
A mi pap por sus consejos y apoyo
A Yiya, por compartir tantas cosas
A mis tos y primos por su ayuda y apoyo incondicional
A Luz Amanda por ser tan especial
A Diana, por su amistad y por vivir conmigo la gran experiencia de iniciar
y culminar este trabajo.

Lina Mara.
A Dios, por darme la sabidura, fuerza y paciencia en la
culminacin de este trabajo y de esta etapa de mi vida.
A mi mam y mi pap por esa confianza que depositaron en
m, por ser mis amigos y por darme todo su apoyo y amor.
A mi hermano por desearme lo mejor.
A Luis Gabriel Rivera Mora por ese amor y compaa
incondicionales.
A mis familiares y amigos por su inters.
A Lina, por su amistad, por su comprensin y por hacer
posible la finalizacin de este trabajo.

Diana del Pilar.


TABLA DE CONTENIDO

1. INTRODUCCIN ........................................................................................... 3
2. MARCO TERICO ......................................................................................... 5
2.1 Enfermedades transmitidas por alimentos ................................................ 5
2.1.1 Mtodos de prevencin de enfermedades transmitidas por alimentos . 8
2.2 Tratamiento trmico .................................................................................. 8
2.2.1 Esterilizacin comercial ......................................................................... 9
2.2.2 Pasteurizacin ..................................................................................... 10
2.2.3 Causas de la muerte trmica y mecanismo de termorresistencia ........ 11
2.2.4 Valores D y Z ....................................................................................... 12
2.2.5 Factores que influyen sobre la determinacin de la termorresistencia. 13
2.2.6 Las conservas y el tratamiento trmico................................................ 13
2.2.7 Transmisin del calor en el alimento envasado ................................... 14
2.3 Productos de plantas como agentes antimicrobianos ............................ 15
2.3.1 Principales compuestos antimicrobianos derivados de plantas ........... 16
2.3.2 Mtodos para evaluar la actividad antimicrobiana de aceites esenciales
...................................................................................................................... 18
2.3.2.1 Mtodo de difusin en agar .............................................................. 19
2.3.2.2 Mtodo de dilucin ............................................................................ 19
2.4 Minthostachys mollis ............................................................................... 20
2.5 Listeria monocytogenes .......................................................................... 23
2.5.1 Generalidades ..................................................................................... 23
2.5.2 Termorresistencia de L.monocytogenes .............................................. 24
2.6 Bacillus cereus ........................................................................................ 25
2.6.1 Generalidades ..................................................................................... 25
2.6.2 Termoresistencia de Bacillus cereus ................................................... 25
3. JUSTIFICACIN .......................................................................................... 28
4. OBJETIVOS ................................................................................................. 29
4.1 Objetivo general ...................................................................................... 29
4.2 Objetivos especficos .............................................................................. 29
5. MATERIALES Y MTODOS ........................................................................ 30

1
5.1. Obtencin de cepas ............................................................................... 30
5.2 Elaboracin del banco de clulas primario (BCP) ................................... 30
5.3 Curvas de crecimiento ............................................................................ 30
5.4 Evaluacin de la termorresistencia ......................................................... 32
5.4.1 Elaboracin de curvas de inactivacin trmica .................................... 32
5.4.2 Elaboracin de la salsa y evaluacin de termorresistencia en salsa. .. 32
5.5 Obtencin de la planta ............................................................................ 33
5.5.1 Obtencin del aceite esencial de Minthostachys mollis ....................... 33
5.6 Evaluacin de la actividad antimicrobiana. ............................................. 33
5.6.1 Mtodo difusin en agar con disco para bacterias ............................... 33
5.6.1.1. Preparacin del inculo ................................................................... 33
6. RESULTADOS Y DISCUSIN ..................................................................... 35
6.1 Prueba de pureza y viabilidad de los bancos de clulas......................... 35
6.2 Cintica de crecimiento de Listeria monocytogenes y Bacillus cereus. .. 37
6.3 Elaboracin de la conserva..................................................................... 41
6.4 Evaluacin de la termorresistencia de L. monocytogenes y B. cereus (en
caldo BHI y sobre alimento) .......................................................................... 43
6.4.1 Inactivacin trmica de L. monocytogenes .......................................... 43
6.4.2 Inactivacin trmica de Bacillus cereus ............................................... 46
6.5 Extraccin del aceite esencial de Minthostachys mollis y evaluacin de la
actividad antimicrobiana ...................................................................................
...................................................................................................................... 51
7. RECOMENDACIONES ................................................................................ 59
8. CONCLUSIONES ......................................................................................... 59
9. REFERENCIAS ............................................................................................ 60
Recursos electrnicos .................................................................................. 71

2
1. INTRODUCCIN

La mayora de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA), son de


origen microbiano, siendo uno de los problemas con mayor impacto en el
mundo. Debido a que estas enfermedades se adquieren por el consumo de
alimentos y/o agua contaminados, representan un gran riesgo para la poblacin
en general.

De acuerdo con lo anterior, es importante considerar la existencia de


microorganismos de carcter patgeno que son los principales responsables de
dichas enfermedades y la aparicin de graves intoxicaciones alimentarias.
Algunos de los microorganismos que se han asociado a las ETA son Listeria
monocytogenes y Bacillus cereus, ya que han tenido gran impacto en salud
pblica. L. monocytogenes, tiene mayor trascendencia ya que el consumo de
este microorganismo, puede generar tasas de mortalidad altas (30 %).
(Vzquez et al, 2001). Por otra parte, B. cereus tiene un efecto mayor en
cuanto a la cantidad de personas que afecta, porque no tiene grupos blanco
especficos, generando tasas de morbilidad altas (ICMSF, 2000).

Por lo anterior, la presencia de estos microorganismos en los alimentos


conduce a buscar alternativas de inhibicin y eliminacin con una mayor
posibilidad de aplicacin como pueden ser las sustancias naturales, y al mismo
tiempo fusionarlas con mtodos convencionales como el tratamiento trmico
con altas temperaturas.

El estudio de la inactivacin trmica es importante pues es uno de los mtodos


ms aplicables, con una efectividad comprobada en el control y prevencin de
la transmisin de estas enfermedades, al mismo tiempo puede reemplazar
otros mtodos ms complejos como la irradiacin, almacenamiento a bajas
temperaturas, conservantes qumicos, entre otros. No obstante el tratamiento a
temperaturas altas modifica el valor nutricional de los alimentos, lo que explica

3
la tendencia actual a utilizar sustancias antimicrobianas debido a su conocido
efecto microbicida.

De acuerdo con esto, es importante resaltar que el estudio de sustancias de


origen natural tales como extractos y aceites vegetales se ha llevado a cabo
para evaluar su efecto antimicrobiano, fungicida, insecticida y plaguicida.

Algunas especies vegetales tales como Minthostachys mollis se han reportado


como poseedoras de caractersticas antimicrobianas, antifngicas y
fitoteraputicas, las cuales la hacen una especie promisoria para su uso en
actividades farmacuticas, control de plagas en el sector agrcola y la
preservacin de los alimentos para evitar la proliferacin de microorganismos
causantes de enfermedades. Esto conlleva a la realizacin de una
investigacin con el propsito de evaluar la actividad bactericida del aceite
esencial extrado de M. mollis sobre dos microorganismos causantes de
enfermedades transmitidas por alimentos como L. monocytogenes y B. cereus.
Lo anterior debido a que M. mollis ha sido utilizada en Colombia como
condimento para alimentos, por lo que podra utilizarse como antimicrobiano en
la industria de alimentos.

Por lo descrito anteriormente, se pretende llevar a cabo la obtencin del aceite


esencial de M. mollis por medio de una tcnica de hidrodestilacin, para su
posterior evaluacin mediante un protocolo donde se evaluar el aceite en una
prueba in Vitro determinando la actividad antimicrobiana frente a los
microorganismos mencionados anteriormente; luego probarlo en un producto
inoculado y al mismo tiempo alternar este protocolo con un mtodo ms
convencional como el tratamiento trmico.

4
2. MARCO TERICO

2.1 Enfermedades transmitidas por alimentos

La enfermedad transmitida por alimentos (ETA) ha sido definida por la


Organizacin Mundial de la Salud (OMS) como una enfermedad de carcter
infeccioso o txico causada por, o que se cree que es causada por, el consumo
de alimentos o de agua (Adams, 1997). Las ETA pueden manifestarse a
travs de:
Infecciones transmitidas por alimentos: son enfermedades que resultan
de la ingestin de alimentos que contienen microorganismos
perjudiciales vivos. Por ejemplo: salmonelosis, hepatitis viral tipo A y
toxoplasmosis (www.panalimentos.org).

Intoxicaciones causadas por alimentos: ocurren cuando las toxinas o


venenos de bacterias u hongos estn presentes en el alimento ingerido.
Estas toxinas generalmente no poseen olor o sabor y son capaces de
causar enfermedades despus que el microorganismo es eliminado.
Algunas toxinas pueden estar presentes de manera natural en el
alimento, como en el caso de ciertos hongos y animales como el pez
globo. Ejemplos: botulismo, intoxicacin estafiloccica o por toxinas
producidas por hongos (www.panalimentos.org).

Toxi-infeccin causada por alimentos: es una enfermedad que resulta de


la ingestin de alimentos con una cierta cantidad de microorganismos
causantes de enfermedades, los cuales son capaces de producir o
liberar toxinas una vez que son ingeridos. Ejemplos: clera
(www.panalimentos.org)

5
Las enfermedades causadas por el consumo de alimentos contaminados tienen
un amplio impacto en la salud pblica y en la economa en todo el mundo
(Gandhi y Chikindas. 2007). Entre los factores asociados a estos cambios
globales se pueden sealar el crecimiento de la poblacin, la pobreza, la
urbanizacin en los pases subdesarrollados, el comercio internacional de
alimentos para humanos y animales as como tambin la aparicin de nuevos
agentes productores de ETA o nuevas mutantes con una mayor patogenicidad.
Otros factores importantes en cuanto a la manipulacin incorrecta de los
alimentos que contribuyen a los brotes producidos por estos se muestran a
continuacin en la figura 1 (McCabe-Sellers y Beattie. 2004). La temperatura
inadecuada es el principal factor reportado que contribuye a la transmisin de
enfermedades producidas por alimentos (Olsen, et al, 2000).

Figura 1. Factores que contribuyen a los brotes producidos por los alimentos a
partir de 1993 - 1997
Fuente: McCabe-Sellers y Beattie. 2004

6
Por esta y otras razones en pases latinoamericanos, donde estos problemas
se intensifican desde 1989, la Organizacin Panamericana de la Salud (OPS)
ha estado trabajando con sus Estados Miembros para formar la capacidad
nacional de vigilancia de ETA. Las debilidades todava persisten en muchos
pases en la vigilancia epidemiolgica: notificacin de enfermedades, deteccin
e investigacin de los brotes y el anlisis de datos para la toma de decisiones
en las polticas y programas. Es por consiguiente difcil evaluar
adecuadamente la situacin de las ETA en la regin latinoamericana
(www.aam.org.ar). En el caso particular de Colombia y de la capital del pas,
las enfermedades transmitidas por alimentos constituyen un grave problema de
salud pblica (www.comunidadandina.org), pues se ha demostrado un
incremento en los ltimos aos. Entre 1991 y 1998 se han reportado 21443
casos individuales de ETA. En cuanto al reporte de brotes de las ETA, ha
mostrado un leve incremento desde 1998 hasta el ao 2000. Para 1998 fueron
reportados por el Sistema Alerta Accin un total de 28 brotes de ETA, y para
los siguientes dos aos un total de 35 y 37 brotes, con rangos de variacin de
dos a cuatrocientas personas afectadas (http://www.saludcapital.gov.co). Para
el 2007 se notificaron al sistema nacional de vigilancia 1594 casos de
enfermedades transmitidas por alimentos, lo que representa una disminucin
del 22.65 % con respecto al mismo periodo del ao anterior en el cual se
notificaron 2061 casos. Hasta el tercer periodo epidemiolgico del 2007, se
present el mayor nmero de casos, debido a la ocurrencia de cuatro brotes,
uno en el Municipio de Soledad (Atlntico) que aport 199 casos, otro en el
municipio de Tena (Cundinamarca) que aport 69 casos, otro en Maicao (La
Guajira) que aport 53 casos y otro en el municipio de Chinchin (Caldas) que
aport 48 casos de los 469 notificados en esa semana.

De las 36 Unidades Notificadoras Departamentales y Distritales, el 80.55%


notific casos de ETAs al SIVIGILA: La Secretara de Salud de Atlntico
notific el 14.49 %, siendo el mayor notificador, seguida de Bogot D.C con el
8.59 %, Cundinamarca con el 7.15 %, Sucre con el 6.34, Caldas con el 5.90 %,
Antioquia con 5.83 %, La Guajira con el 5.58 %, Crdoba con el 4.33 %, Bolvar

7
con el 4.27 %, Magdalena con el 4.20%, Boyac con el 4.14 % y en menor
porcentaje: Santander, Quindo, Meta, Valle, Huila, Vichada, Arauca, Cesar,
Casanare, Nario, Choc, Cauca, Putumayo, Amazonas, Barranquilla,
Risaralda, Norte de Santander, Cartagena. No notificaron casos de ETA:
Caquet, Guaina, Guaviare, San Andrs, Santa Marta, Tolima y Vaups.
Por lo anterior es necesario que la comunidad en general tenga y maneje
algunos elementos mnimos que le permita prevenir estas enfermedades.
(ttp://www.ins.gov.co).

2.1.1 Mtodos de prevencin de enfermedades transmitidas por


alimentos

Se han utilizado diversos procesos que tienen como fin evitar la proliferacin
microbiana en los alimentos, evitando as la aparicin de ETA. Dentro de los
mtodos de control ms utilizados se encuentran el tratamiento trmico
(pasteurizacin, esterilizacin), irradiacin (radiacin UV), almacenamiento a
bajas temperaturas (congelacin, refrigeracin), conservantes qumicos
(nitritos), conservacin por medio de sustancias naturales que poseen actividad
antimicrobiana, tales como los aceites esenciales derivados de plantas, entre
otros (Adams, 1997).

2.2 Tratamiento trmico

Desde hace varias dcadas, el tratamiento de conservacin por calor, ha sido


la tecnologa ms utilizada para la conservacin de alimentos. A travs de los
aos, se ha conseguido la elaboracin de alimentos microbiolgicamente
seguros y con baja actividad enzimtica (Torres, 2007).

El objetivo primordial de un tratamiento trmico consiste en la destruccin de


microorganismos capaces de multiplicarse en el producto a la temperatura
prevista de distribucin o de poner en peligro la salud del consumidor. Para un
nmero cada vez mayor de productos, el tratamiento trmico representa

8
solamente una parte del proceso de conservacin, y suele aplicarse en
combinacin con otros procesos. Actualmente, el tratamiento trmico es uno
de los tratamientos que hacen posible la existencia de productos sanos de
larga vida comercial. El tratamiento trmico permite que las conservas se
puedan almacenar a temperatura ambiente garantizando su seguridad (Rees,
1994).
Las formas vegetativas de bacterias, levaduras y hongos se destruyen casi
instantneamente a 100C y normalmente no constituyen ningn problema en
el tratamiento trmico de las conservas, pero las esporas de ciertas especies
bacterianas son extraordinariamente resistentes al calor y para su destruccin
se necesita exponerlas, durante periodos prolongados de tiempo a altas
temperaturas. La velocidad de destruccin es funcin del tiempo y la
temperatura y varia con las diferentes especies; permaneciendo constantes los
dems factores, la destruccin es tanto mas rpida cuanto ms alta sea la
temperatura. Por ello, las condiciones letales para un microorganismo no
pueden expresarse diciendo que muere a tal temperatura, si no que es preciso
sealar un tiempo de exposicin a una temperatura determinada. (Herson,
1980).

Los dos mtodos mas utilizados hoy en da para la conservacin de alimentos


son la esterilizacin y la pasteurizacin (Torres, 2007).

2.2.1 Esterilizacin comercial

La esterilizacin comercial es un tratamiento de conservacin por calor que


tiene como objetivo inactivar la totalidad de microorganismos patgenos y
alteradores, y de enzimas presentes en el alimento permitiendo prolongar la
vida til del producto en condiciones microbiolgicamente seguras a
temperatura ambiente. Por lo general este tratamiento se denomina tambin
HTST (high temperature-short time) o UHT (ultra high temperature) que supone
aplicar temperaturas de proceso entre 100-120 C durante un periodo corto de
tiempo (2-5 s) (Torres 2007).

9
La esterilizacin, como mtodo de conservacin se aplica con el fin de evitar la
entrada de microorganismos y de oxgeno. El objetivo de la conserva, cuyo
punto principal es la esterilizacin comercial, es destruir todos los
microorganismos patgenos que puedan existir en el producto y prevenir el
desarrollo de aquellos que puedan causar deterioro (Paltrinieri y Figuerola,
1993).

La esterilizacin evita que sobrevivan los organismos patgenos o productores


de enfermedades cuya existencia en el alimento y su multiplicacin acelerada
durante el almacenamiento, producira serios daos a la salud de los
consumidores. Los microorganismos se destruyen por el calor, pero la
temperatura necesaria para destruirlos vara. Muchas bacterias pueden existir
en dos formas, vegetativa o de menor resistencia a las temperaturas, y
esporulada, o de mayor resistencia. Los microorganismos esporulados son los
ms difciles de destruir mediante tratamientos trmicos, de manera que si el
tratamiento es eficiente con ellos lo ser con mayor razn con aquellos
microorganismos ms termosensibles (Paltrinieri y Figuerola, 1993).

2.2.2 Pasteurizacin

La pasteurizacin es una de las ms antiguas tcnicas sabidas para la


preservacin de alimentos, basado en la degradacin trmica parcial de
microorganismos y en la desnaturalizacin de enzimas que presentan un riesgo
potencial para los alimentos. Los procesos industriales de la pasteurizacin
tienen que asegurar la prolongacin del curso de la vida del alimento, mientras
que por otra parte la calidad del producto debe ser preservada. La realizacin
de ambos propsitos depende de las condiciones del proceso que aseguran el
curso adecuado de la temperatura durante el proceso, donde est la
consideracin del perfil de temperatura dentro del producto de gran importancia
(Plazl, 2006).

10
2.2.3 Causas de la muerte trmica y mecanismo de termorresistencia

Estudios realizados por algunos autores reportan diferentes aspectos de la


lesin trmica y recuperacin de formas vegetativas. Estos autores concluyen
que los datos que relacionan la estabilidad trmica de los ribosomas con la
mxima temperatura de crecimiento indican que el RNA ribosmico juega un
papel clave. Estudios recientes han demostrado que las alteraciones del DNA
de las bacterias despus de su choque trmico, son debidas posiblemente a la
accin de las nucleasas nativas que se liberan o activan con tratamientos
trmicos suaves. La lesin de la membrana citoplasmtica que da lugar a una
salida de los componentes celulares tambin se ha sealado como una causa
que lleva a la incapacidad de recuperarse de la lesin trmica de las formas
vegetativas. (Herson y Hulland, 1980).

Durante el desarrollo de las esporas aumenta la termorresistencia de los


microorganismos. Se han avanzado una serie de teoras en torno a la
diferencia entre las clulas vegetativas y las esporas. Una de esas teoras es
la deshidratacin protoplasmtica y la corteza contrctil y la otra teora es la
que implica el papel del cido dipicolnico (DPA). Se ha descrito que la
termorresistencia esporular es debida a que una gran porcin de su contenido
acuoso se encuentra en forma no disponible para participar en la coagulacin
de la protena celular. La termorresistencia aumenta de forma gradual a
medida que la concentracin de agua del entorno disminuye. La gran
resistencia de ciertas esporas en medios acuosos exige que la cubierta
esporular tenga una permeabilidad acuosa muy baja, lo que es difcil por la
permeabilidad de los materiales orgnicos. Por esta razn, otros autores
postularon la corteza contrctil, segn la cual la corteza de la espora se
mantiene en un estado seco ejerciendo presin hidrosttica a continuacin de
la contraccin. Murrel y Warth lo interpretaron como apoyo a que la contraccin
de la corteza esporular estaba relacionada con la termorresistencia; sugirieron
que en el mecanismo de contraccin poda estar implicada la significativa
relacin entre cociente Mg/Ca y termorresistencia (Herson y Hulland, 1980).

11
Por otro lado Powell y Starng comprobaron que la sal clcica del DPA
constituye hasta 15% del peso seco de la espora, pero no de las formas
vegetativas. Despus de la germinacin se libera esta sustancia con perdida
de termorresistencia. Otras teoras apoyan la explicacin que se basa en la
deshidratacin osmtica del protoplasma por la corteza que lo rodea, que es
expansible e impermeable a los cationes multivalentes. Las condiciones ms
rigurosas exigidas para la destruccin de las esporas por calor seco son
probablemente necesarias para los efectos deshidratantes suplementarios y la
temperatura mayor que la necesaria puede lesionar el DNA de la espora.
(Herson y Hulland, 1980).

2.2.4 Valores D y Z

Para establecer la reduccin en el nmero de microorganismos se requiere


conocer el nmero inicial de microorganismos presentes en el alimento y
someter los productos a diferentes mtodos de eliminacin. La grfica que
representa el logaritmo del nmero de clulas que permanecen vivas, en una
suspensin bacteriana o esporular, en funcin del tiempo de exposicin, a una
temperatura constante, se le conoce como curva de supervivencia trmica
(Herson y Hulland, 1980). En el caso de la inactivacin trmica como es el
secado (calor-seco) y coccin (calor-hmedo), la mortalidad de los
microorganismos necesita ser determinada estimando el valor total de la
destruccin (valor F0). La destruccin de microorganismos por calor es uno de
los objetivos en el secado y la coccin. Estimar los valores F0 en las
condiciones especificas de proceso, es importante para conocer los valores D y
Z. El valor D es el tiempo de reduccin decimal (h), indica el tiempo requerido
para matar al 90% de poblacin bacteriana a una temperatura especfica.
Otros autores resaltan que es el tiempo requerido para una reduccin unidad
log10 en el nmero de microorganismos a una temperatura del sistema (James,
2006). Valor Z, es la constante de resistencia trmica (C), es la medida del
incremento de temperatura requerida para causar una reduccin del 90% en el

12
tiempo de reduccin decimal, se puede calcular si la inactivacin trmica de las
pruebas se realiza con diferentes temperaturas (James, 2006). Estos dos
valores ofrecen la base para calcular el tiempo en los procesos del sector
alimenticio. (Rahmana, 2004).

2.2.5 Factores que influyen sobre la determinacin de la


termorresistencia.

Por otra parte, la disponibilidad del agua tiene tambin un gran impacto en la
transferencia del calor a los microorganismos. La influencia de la actividad de
agua en los microorganismos es compleja, combinando los factores intrnsecos
(el potencial nutritivo, el pH, y los compuestos antimicrobianos como el SO2,
nitratos, y nitritos) y factores extrnsecos (temperatura, oxgeno, tratamientos
qumicos, e irradiacin), que varan en funcin de las clases de alimentos y de
microorganismos. Los estudios han demostrado que la resistencia trmica de
microorganismos aumenta mientras que su contenido en agua disminuye y ese
nivel ptimo de la resistencia ocurre entre aw = 0.20 y 0.50, dependiendo del
microorganismo estudiado (Larochea et al, 2005).

Con independencia de las influencias evidentes del medio de suspensin, pH,


actividad de agua, concentraciones de sal, etc. El factor ms importante a
tener en cuenta en un estudio de termorresistencia es la velocidad y el
mecanismo de transferencia de calor. La penetracin de calor es ms lenta en
alimentos ms viscosos que en los tampones o en agua (Rees, 1994).

2.2.6 Las conservas y el tratamiento trmico

Las conservas son productos que se mantienen durante largo tiempo


contenidos en recipientes (de metal, vidrio o material flexible) hermticamente
cerrados. La capacidad de conservacin se logra con preferencia mediante
tratamiento trmico, cuya accin consiste en reducir, destruir o frenar el notable
desarrollo de los microorganismos presentes en las materias primas

13
conservadas (Sielaff, 2000). Durante el proceso es necesario, conservar las
cualidades organolpticas y nutritivas (Hersom y Hulland, 1980).

Para alcanzar la deseada capacidad de conservacin resultan determinantes la


temperatura utilizada y el tiempo de actuacin de sta. Los mtodos ms
importantes de conservacin son la pasteurizacin y la esterilizacin. En ellos,
la temperatura y el tiempo de actuacin son distintos. En la pasteurizacin se
suelen aplicar temperaturas inferiores a 100C y no se logran destruir las
esporas de los gneros Bacillus y Clostridium, pero si se garantiza la muerte de
los microorganismos vegetativos. La esterilizacin se realiza con temperaturas
superiores a 100C, con lo cual se logra la eliminacin de las esporas de los
gneros mencionados (Sielaff, 2000).

2.2.7 Transmisin del calor en el alimento envasado

La velocidad con que se difunde el calor en el producto, depende


decisivamente de la composicin de ste. Los principales factores de
influencia son la estructura, densidad, proporcin entre componentes slidos y
lquidos, viscosidad y tamao de los trozos o partculas.
Atendiendo al mecanismo de transmisin del calor, los contenidos de las
conservas pueden clasificarse as:
1. Productos en los que el calor se transmite por conveccin sin
obstculos. Entre ellos se cuentan por ejemplo, la leche condensada sin
azcar y determinadas salsas y sopas.
2. Productos calentados por conduccin, como el jamn cocido y
embutidos escaldados.
3. Productos calentados simultneamente por conduccin y conveccin.
En este grupo se incluyen la mayora de los productos crnicos y
preparados de pescado, fruta y verduras (Sielaff, 2000).

14
2.3 Productos de plantas como agentes antimicrobianos

Las sustancias esenciales naturales, se han utilizado desde pocas antiguas,


como sustancias aromticas y como preservantes. Los aceites esenciales
cubren un amplio espectro de actividades tales como efectos farmacolgicos,
antiinflamatorios, antioxidantes y anticancergenos. Otros son biocidas contra
una amplia gama de organismos como bacterias, hongos, virus, protozoos,
insectos y plantas. Tambin se ha estudiado la importancia de estos aceites
debido a su disponibilidad, a los pocos efectos secundarios o a la toxicidad que
puedan causar, as como la mejor biodegrabilidad comparado con antibiticos y
preservativos disponibles (Kalemba, 2003). Por todas estas propiedades, se
ha evaluado el control que pueden ejercer estos compuestos contra
microorganismos patgenos en alimentos, y por tanto, la posibilidad de ser
utilizados como un mtodo de eliminacin.

Muchas hierbas y especias han sido usadas durante siglos para proporcionar
sabores diferentes a los alimentos y stas pueden presentar tambin actividad
antimicrobiana (Ultee et al, 2002). Los compuestos responsables de esta
actividad son a menudo fracciones del aceite esencial, las cuales consisten
principalmente en compuestos fenlicos (Conner, 1993). Los aceites
esenciales de plantas y sus componentes que presentan actividad
antimicrobiana (Akgul y Kivanc, 1988), tienen gran aplicacin para el control del
crecimiento de patgenos de alimentos por lo que se utilizan como mtodo de
preservacin (Hao et al, 1998). Se ha reportado que la actividad
antimicrobiana se deriva de terpenoides y compuestos fenlicos en los aceites
(Yamazaki et al, 2003).

Las plantas producen una gran cantidad de compuestos secundarios como


proteccin contra ataques microbianos e insectos. De hecho muchos de stos
compuestos han sido usados en forma pura o extractos vegetales como
alimento o aplicaciones mdicas en humanos (Wallace, 2004).

15
Los aceites esenciales comnmente se concentran en una regin particular
como hojas, corteza o frutos; y cuando esto ocurre en diferentes rganos en la
misma planta, frecuentemente su composicin es diferente (Oussalah et al,
2005). Aunque comnmente se piensa que son derivados de hierbas y
especias, estn presentes hasta cierto punto en muchas plantas con un papel
protector contra el ataque de bacterias, hongos o insectos. stos comprenden
principalmente monoterpenos, hidrocarburos cclicos y su alcohol, aldehdo o
derivados esteres.

Recientemente, por ejemplo, se han demostrado los efectos positivos contra


bacterias patgenas (Wallace, 2004). Se ha comprobado que los aceites de
Cinnamomum osmophloeum poseen actividad antimicrobiana frente a
Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Salmonella
spp y Vibrio parahemolyticus, donde el cinamaldehdo es el principal
componente de la mezcla (Chang et al, 2001). E.coli O157:H7 es inhibido por
el aceite del organo (Elgayyar et al, 2001), de la hierbabuena (Imai et al, 2001)
y aceites esenciales de otras plantas (Marino et al, 2001). Helicobacter pylori
es altamente sensible al aceite de la menta verde (Imai et al, 2001).

2.3.1 Principales compuestos antimicrobianos derivados de plantas

Las plantas tienen una capacidad casi ilimitada para sintetizar sustancias
aromticas, siendo la mayora fenoles o sus derivados oxgeno sustitudos.
En general son metabolitos secundarios (es decir, que no tienen un papel
esencial en el metabolismo de las plantas) (Walton et al, 1999), de los cuales
por lo menos el 10% se han aislado. En muchos casos, estas sustancias
sirven a la planta como mecanismos de defensa contra el ataque de
microorganismos, insectos y herbvoros. Algunos como los terpenoides,
proporcionan a la planta sus olores, otros (quinonas y taninos) son
responsables del pigmento de la planta (Murphy, 1999).

16
Dentro de los compuestos presentes en los extractos vegetales que poseen
actividad antimicrobiana, se pueden mencionar el timol, el carvacrol, o el
eugenol; algunos autores como Conner en 1993, reportaron la alta actividad
antimicrobiana de stos compuestos en forma pura.

Con respecto al carvacrol, se ha visto que se encuentra presente en aceites


esenciales de organo (60% a 70% de carvacrol) y tomillo (45% de carvacrol).
La inhibicin del crecimiento de muchos patgenos por el carvacrol, ha sido
reportada en varios artculos, sin embargo no se ha definido el mecanismo de
accin de ste. Usando B. cereus, un esporoformador patgeno en alimentos,
como organismo modelo, se ha demostrado que la exposicin de las clulas
vegetativas a concentraciones de carvacrol mayores a 1 mM, conduce a una
extensin de la fase de latencia, una tasa baja de crecimiento mximo
especfico y una densidad final de poblacin baja. Tambin se ha visto que a
concentraciones por encima de 1 mM, la viabilidad de B. cereus decrece
exponencialmente. Al mismo tiempo hay un incremento en la fluidez de la
membrana y salida de protones e iones potasio, conduciendo a una
disminucin en el gradiente de pH a travs de la membrana citoplasmtica, un
colapso en el potencial de membrana e inhibicin de la sntesis de ATP.
Finalmente estos eventos, son seguidos por la muerte celular (Ultee et al,
2002).

Por otra parte, el timol es un ismero del carvacrol que se ha visto implicado en
la desintegracin de la membrana externa y en el incremento de la
permeabilidad de la membrana citoplasmtica al ATP en clulas de Escherichia
coli y Salmonella thyphimurium. El timol y el cimol (precursor biosinttico del
timol) son ejemplos de preservativos naturales que han sido reportados por
tener efectos inhibitorios sobre bacterias y hongos (Delgado et al, 2003).

Otros de los compuestos derivados de plantas que poseen actividad


antimicrobiana son los fenlicos y polifenoles dentro de los cuales se
encuentran: quinonas; flavonas, flavonoides y flavonoles; taninos; y cumarinas.

17
Otros son los terpenoides y aceites esenciales, los alcaloides, lecitinas y
polipptidos, entre otros (Murphy, 1999).

2.3.2 Mtodos para evaluar la actividad antimicrobiana de aceites


esenciales

Para la evaluacin antimicrobiana de aceites esenciales, se aplican


generalmente mtodos convencionales probados con capacidades antibiticas.
Hay dos tcnicas bsicas usadas para la valoracin de ambas actividades,
antibacteriales y antimicticas de los aceites esenciales: 1. El mtodo de
difusin en agar (pozo o disco de papel) y 2. El mtodo de dilucin (agar o
caldo lquido). Las pruebas y evaluacin de la actividad antimicrobiana de los
aceites esenciales son difciles debido a su volatilidad, insolubilidad en agua y
complejidad (Kalemba y Kunicka, 2003).

Los aceites esenciales son de naturaleza hidrofbica y de gran viscosidad.


Estas caractersticas pueden reducir la capacidad de la dilucin o pueden
causar distribucin desigual del aceite a travs del medio, an si se usa un
agente correcto disgregante o solubilizante. Se tiene que comprobar si las
concentraciones aplicadas del emulsor o del solvente no afectan el crecimiento
y la diferenciacin de los microorganismos de prueba (Kalemba y Kunicka,
2003).

Los cultivos de microorganismos se realizan en medios lquidos, bajo


condiciones fsicas ptimas para las especies individuales. Los
microorganismos tienen que alcanzar una fase apropiada del crecimiento, y un
nmero especificado de clulas tiene que ser utilizado para la prueba (Kalemba
y Kunicka, 2003).

18
2.3.2.1 Mtodo de difusin en agar

El mtodo permite estimar el grado de inhibicin del crecimiento de los


microorganismos y sus cambios morfolgicos de una manera simple. En las
cajas de Petri con agar se inocula el microorganismo de prueba; existen dos
mtodos posibles para la incorporacin del aceite esencial que son: en un disco
de papel (Omer et al, 1998.) o en un pozo hecho en medio del agar (Lis-
Balchin et al, 1998).

El aceite esencial no se usa a menudo en forma pura, generalmente se utilizan


sus soluciones. Se preparan en cajas de Petri, soluciones del aceite esencial
en diferentes concentraciones y los discos de papel son sometidos a inmersin.
Las placas se almacenan durante algn tiempo para permitir que todos los
componentes del aceite esencial se difundan dentro del agar, despus se
incuban. La eficacia del aceite esencial es demostrada por tamao de la zona
de inhibicin del crecimiento del microorganismo alrededor del disco y se
expresa generalmente como el dimetro de esta zona (milmetros o
centmetros) (Kalemba, 2003).

2.3.2.2 Mtodo de dilucin

El mtodo de dilucin en serie en agar se utiliza para bacterias y hongos y su


modificacin con caldo lquido se usa solo para hongos. Los cultivos de agar
se realizan en cajas de Petri o en tubos, mientras que los cultivos lquidos se
realizan en frascos cnicos con un volumen de 100 ml de medio. Para el caldo
lquido en frascos cnicos, el ndice de crecimiento inhibitorio se calcula (% de
los cambios en la biomasa del hongo comparando con el cultivo control)
(Kalemba y Kunicka, 2003).

Los resultados se pueden presentar en dos maneras:


*El ndice de inhibicin de crecimiento definido como la proporcin porcentual
para el cultivo de crecimiento de control sin aceite esencial.

19
* La concentracin mnima inhibitoria (MIC) o la mxima dilucin inhibitoria
(MID). La restriccin en el crecimiento de los microorganismos (anlisis de la
actividad bacteriosttica y fungisttica) o la concentracin mnima letal (MLC)
(anlisis de la actividad bactericida y fungicida) (Kalemba, 2003).

La actividad de aceites esenciales contra hongos puede ser tambin


investigada comprobando la inhibicin de la esporulacin (Akgl et al, 1988) y
productividad de la toxina. La concentracin mnima inhibitoria se define como
la concentracin ms baja del aceite esencial en el caldo, dando por resultado
la carencia de los cambios visibles del crecimiento del microorganismo
(Kalemba, 2003).

Para estimar la actividad letal del aceite esencial, los microorganismos se


transfieren del caldo lquido o al agar donde no se observa crecimiento en un
nuevo medio. La concentracin ms baja del aceite esencial que da por
resultado la inhibicin total del crecimiento, se reconoce como la concentracin
mortal mnima, MCB para las bacterias (concentracin mnima bactericida) y
MCF para los hongos (mnima concentracin fungicida). A veces MCL
(concentracin mnima letal) se define como la concentracin resultante dando
por resultado una reduccin del >99.9% del nmero de microorganismos en el
inculo (Kalemba, 2003).

2.4 Minthostachys mollis

Una especie promisoria por sus aceites esenciales es Minthostachys mollis


(Lamiaceae), planta nativa de la cordillera de los Andes desde Venezuela hasta
Bolivia, con amplio rango altitudinal (1000-3400 m). Es un subarbusto
aromtico de hasta 50 cm de altura, leoso hacia la base, con hojas ovadas y
pubescentes e inflorescencias axilares en cimas (Alkire et al, 1994) (Figura 2).
En Colombia sta se encuentra en las tres cordilleras y la Sierra Nevada de
Santa Marta (Chica-Balaguera et al, 2006).

20
Figura 2. Fotografa de Minthostachys mollis
Fuente: Autores

M. mollis es conocida como mua en el Per, peperina en Argentina y organo


en Colombia, y es utilizada en medicina popular para tratar los clicos
estomacales y ciertos trastornos gripales (White, 1985; Acero Coral y Rive,
1994; Beltrn y Cedillo, 1994). El uso ms conocido tiene que ver con la
preservacin de la papa en condiciones de almacenamiento; se ha sealado
que los campesinos de la sierra peruana la han utilizado desde hace muchos
aos con este fin, igualmente ha tenido uso como condimento y preservativo de
alimentos. En Colombia es utilizada en forma similar por los campesinos del
altiplano cundiboyacense. De otro lado, Raman y Booth (1987) encontraron que
posee propiedades repelentes que controlan la polilla de la papa (Phthorimaea
operculella); adems segn Aliaga y Feldeheim (1985) reduce el brotamiento y
dao de este tubrculo al ser almacenado en cmaras que contengan esta
planta. En algunos lugares de Colombia la emplean como repelente contra las
pulgas y podra igualmente utilizarse para el control del gorgojo del frjol,
Acanthoscelide obtectus (Chica-Balaguera et al, 2006).

21
Diferentes estudios de la composicin qumica del aceite esencial de
Minthostachys han reportado los compuestos carvacrol , pulegona, mentona,
isomentona, -pineno y limoneno, mentol en cantidades relativas que varan
desde 9.3% hasta 65.8% (Figura 3)

Figura 3. Algunos de los componentes de Minthostachys mollis determinada


por Chica, et al 2006, con su respectiva estructura.
Fuente: (Kalemba y Kunicka, 2003)

22
2.5 Listeria monocytogenes

2.5.1 Generalidades

Listeria monocytogenes es un bacilo Gram positivo, aerobio, psicrtrofo, halo


tolerante, no mvil, no esporulado, este microorganismo se ha aislado de
muchos alimentos, tales como carnes y productos crnicos, quesos blandos,
helados, verduras y hortalizas y alimentos de origen marino (ICMSF, 2000). L.
monocytogenes es un microorganismo que no era considerado como un
importante patgeno transmitido a travs de los alimentos hasta hace
relativamente poco tiempo y, en consecuencia, no haba recibido mucha
atencin por parte de la industria alimentaria (Bell et al, 2000); sin embargo
actualmente L. monocytogenes es un microorganismo zoontico emergente en
la industria de alimentos (Torres et al, 2004), es un contaminante ambiental
ampliamente distribuido cuyo medio primario para la transmisin al hombre es
a travs de la contaminacin de los alimentos en cualquier punto de la cadena
alimentaria, desde el origen hasta la cocina y ha sido reportada como la
causante de la listeriosis humana, por esta razn resulta de gran inters para
la salud pblica (Bell et al, 2000). Es importante enfocarse en la enfermedad
producida por el consumo de alimentos contaminados con este
microorganismo, pues la listeriosis humana ha sido reportada y es considerada
de grave naturaleza desde la dcada de los 80, puesto que cursaba con altos
ndices de mortalidad, en particular sobre los miembros mas vulnerables de la
poblacin como son los nios neonatos, los ancianos y los inmunosuprimidos.
(Bell, et al, 2000).

Los individuos susceptibles tienden a ser muy jvenes, mayores o mujeres


embarazadas quienes son particularmente susceptibles a la listeriosis.

23
2.5.2 Termorresistencia de L.monocytogenes

L. monocytogenes ha causado una considerable preocupacin en la industria


alimenticia, a funcionarios reguladores de la salud y consumidores (Selby et al,
2006), pues este microorganismo puede adaptarse para sobrevivir, crecer en
una gran variedad de condiciones ambientales y causar listeriosis (Mead et al.
1999), entre stas condiciones se encuentra la capacidad de crecer sobre una
amplia gama de temperaturas (2-45C), su supervivencia y crecimiento en las
temperaturas de refrigeracin (2-4C) (Gandhi y Chikindas, 2007) y la mayor
resistencia trmica concerniente a otros patgenos transmitidos por los
alimentos (Piyasena, 1998).

Se sabe que las clulas contienen varios blancos para la accin trmica, pero
ha sido propuesto por Miller, et al (2006) que la resistencia basal de calor de
estos microorganismos podra ser debida a la estabilidad intrnseca de
macromolculas, o sea ribosomas, cidos nucleicos, enzimas y protenas
dentro de la clula y la membrana (Miller et al, 2006).

Los lpidos en las membranas de las clulas bacterianas son un fluido, su


condicin cristalina y sta condicin fsica es importante para mantener la
fluidez y la funcin de la membrana. Los cambios en la temperatura conducen
a una alteracin en la composicin de los lpidos de la membrana para
mantener la fluidez ideal requerida para la actividad enzimtica y el transporte
de solutos a travs de la membrana. Una proporcin alta de cidos grasos iso
y anteiso con nmeros impares de cadenas conectadas, caracterizan la
membrana de la clula de Listeria (Gandhi y Chikindas. 2007).

24
2.6 Bacillus cereus

2.6.1 Generalidades

B. cereus es un microorganismo esporoformador, aerobio facultativo, Gram


positivo, mvil que se puede aislar de una variedad de sitios diferentes.
(Kotiranta et al, 2000). Este microorganismo es capaz de causar enfermedad
transmitida por alimentos. Dos sndromes pueden ser distinguidos, un
sndrome emtico y un sndrome diarreico. El sndrome emtico es causado
por la toxina cereulida, un pptido estable al calor y al pH. El sndrome
diarreico es causado por enterotoxinas que son producidas durante el
crecimiento de B. cereus en el intestino delgado. Se presentan tres
enterotoxinas capaces de causar el sndrome diarreico y pueden ser descritas
como: hemolisina BL (HBL), enterotoxina no hemoltica (NHE) y citotoxina K.
HBL Y NHE tienen tres componentes proteicos, mientras que la cititoxina K es
una sola protena. El mecanismo del sndrome se cree que es: el consumo de
comida contaminada con las esporas y/o las clulas vegetativas de B.cereus.
Las esporas pasan a travs del estmago y alcanzan el intestino delgado,
germinan, crecen y de este modo se producen las enterotoxinas. Las clulas
vegetativas se cree que son muy susceptibles a las condiciones del estmago
por lo tanto es difcil el alcance al intestino delgado. (Wijnands et al, 2006).

La forma clsica de intoxicacin alimentaria por B .cereus se conoce desde


comienzos del siglo, pero es a partir de 1950 cuando se han escrito numerosos
brotes atribuibles de forma definitiva a este microorganismo (ICMSF, 2000).

2.6.2 Termorresistencia de Bacillus cereus

Los microorganismos aerbicos formadores de esporas como las especies de


Bacillus reciben especial atencin en produccin de alimentos, por su amplia
distribucin en el ambiente. Se ha demostrado la resistencia de sus
endosporas a condiciones adversas y a varias condiciones de estrs debido a

25
su aislamiento de muchos alimentos crudos y procesados alrededor del mundo
(Claus y Berkeley, 1986).

Debido a la capacidad de B. cereus para producir esporas que sobreviven a


altas temperaturas y crecer a bajas temperaturas (Gonzles et al, 1995), este
microorganismo representa un riesgo asociado a enfermedad transmitida por
alimentos (Amodio et al, 1998). Se ha reportado que la resistencia al calor de
las esporas bacterianas depende de la actividad del agua del medio en el cual
stas son suspendidas durante el calentamiento. La mxima termoestabilidad
para esporas de muchos microorganismos fue encontrada en una actividad de
agua de un rango entre 0.2 0.4 (Pfeiffer y Kessler, 1994); tambin se ha visto
que la resistencia al calor de las esporas microbianas incrementa cuando se
someten al calor en presencia de altas concentraciones de soluciones de sales
y azcares ( Bell y De Lacy, 1984).

En general, las esporas son resistentes a los tratamientos de pasteurizacin, el


tratamiento trmico en productos procesados (90-95C por 6-10 min)
usualmente no es suficiente para inactivar todas las esporas (Rozier y Carlier,
1997). Es importante conocer y predecir la habilidad de las esporas para
sobrevivir al tratamiento trmico y el efecto de las condiciones ambientales en
su subsiguiente crecimiento en alimentos. La resistencia trmica y la duracin
de la fase de germinacin despus del tratamiento trmico son dos parmetros
importantes para estimar la seguridad de los alimentos (Laurent et al, 1999).
Se ha reportado que las esporas Bacillus cereus son capaces de resistir una
temperatura de 95C (Byrne et al, 2006; Anonymous, 2000). Adems se ha
visto que las condiciones del medio como pH, naturaleza de los acidulantes y
temperatura, tambin se relacionan con la resistencia al calor de las esporas
(Laurent et al, 1999).

La termorresistencia de las esporas bacterianas se ve muy influenciada por


factores ambientales durante: (1) la esporulacin; (2) el tratamiento trmico y
(3) la recuperacin. Adems, cuanto mayor sea el nmero inicial de esporas,

26
mayor ser el tiempo necesario para llevar a cabo su destruccin (Hersom y
Hulland 1980).

27
3. JUSTIFICACIN

Los alimentos pueden ser un vehculo de transmisin de microorganismos


patgenos y por tanto tienen gran trascendencia en la salud de los
consumidores. La adquisicin de enfermedades por el consumo de alimentos
contaminados con microorganismos como L. monocytogenes y B. cereus ha
hecho que cada vez ms pases reconozcan la necesidad de someter estos
productos a ciertas pruebas o estudios enfocados a evaluar su inocuidad y su
calidad. Actualmente se conocen muchas tcnicas para el control e inhibicin
de microorganismos con el fin de preservar los alimentos, una de stas es la
adicin de sustancias de origen natural que le provean al alimento calidad
microbiolgica y al mismo tiempo permitan sustituir los aditivos qumicos.
Igualmente el tratamiento trmico ha sido uno de los mtodos ms
comnmente utilizados para la conservacin de los alimentos, especialmente
en conservas. Por lo anterior, en el presente estudio se quiso evaluar la
actividad antimicrobiana del extracto de Minthostachys mollis sobre L.
monocytogenes y B. cereus y determinar el tiempo y temperatura necesarios
para inactivar stos microorganismos mediante curvas de inactivacin tanto en
medio de cultivo como directamente en el alimento, en este caso una conserva.

28
4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

Evaluar el efecto de la inactivacin trmica y el aceite esencial de M. mollis


sobre cepas de Bacillus cereus y Listeria monocytogenes.

4.2 Objetivos especficos

Determinar el tiempo que requieren las cepas de Listeria


monocytogenes y Bacillus cereus para llegar a la fase estacionaria,
mediante curvas de crecimiento.

Evaluar la termorresistencia de las cepas, mediante la elaboracin de


curvas de muerte trmica en caldo BHI y en conserva a base de tomate.

Obtener el aceite esencial de la planta, mediante una tcnica de


hidrodestilacin.

Establecer el efecto bacteriosttico o bactericida del aceite esencial


obtenido de Minthostachys mollis, sobre Listeria monocytogenes y
Bacillus cereus en conservas a base de tomate.

Combinar la inactivacin trmica y el aceite esencial sobre las cepas a


evaluar para realizar la prueba en conservas.

29
5. MATERIALES Y MTODOS

5.1. Obtencin de cepas

Se trabaj con las cepas 146, 142, y 196 de Listeria monocytogenes aisladas
previamente de productos crnicos y la cepa de Bacillus cereus que se obtuvo
de una coleccin del cepario de la Pontificia Universidad Javeriana (Correa,
2004).

5.2 Elaboracin del banco de clulas primario (BCP)

Las cepas de L. monocytogenes se recuperaron en agar Oxford. Para su


posterior criopreservacin fue necesario tomar una parte de este cultivo,
inocularla en 36 mL de caldo BHI adicionado con 0.5% de glucosa y llevar a
incubacin durante 24 horas a 37C, 130 rpm. Finalizado este tiempo, se le
adicion al cultivo 4 mL de glicerol estril y se distribuy en tubos eppendorf
cada uno conteniendo un volumen de 1 mL (Molina et al, 2005). Los tubos
fueron almacenados a 70C durante todo el estudio. Por otra parte la cepa
de B. cereus se recuper en agar Bacillus cereus y se procedi de la misma
forma para su criopreservacin sustituyendo la glucosa al 0.5% por almidn al
1% , para su posterior almacenamiento.

Durante los 6 meses del estudio se realizaron pruebas de pureza a las cepas
utilizadas; esto se hizo mediante tinciones de Gram.

5.3 Curvas de crecimiento

Se realizaron curvas de crecimiento para cada una de las 3 cepas de L.


monocytogenes por triplicado. Para esto se descongel un vial de cada cepa y
se inocul en 20 mL caldo BHI adicionado de 0.5% de glucosa (preinculo),
despus se incub a 37C con agitacin de 130 rpm durante toda la noche.
Posteriormente se adicionaron los 20 mL de cultivo crecido en 200 mL del

30
mismo caldo para iniciar la curva de crecimiento, en el transcurso de este
tiempo se tomaron muestras del inculo, las dos primeras horas cada 15
minutos y despus de estas dos horas cada 30 minutos, este procedimiento
seguido de la medicin por duplicado de la absorbancia del inculo a 620 nm,
utilizando caldo BHI estril con glucosa al 0.5% como blanco, al finalizar las 12
horas, se observ que el cultivo alcanz la fase estacionaria (Romn, 2004.,
Rojas, 2007).

Para B. cereus la cintica de crecimiento se obtuvo como se describe a


continuacin: las curvas se llevaron a cabo durante 24 horas, bajo agitacin
130 rpm y una temperatura de 30C. Para esto fue necesario descongelar las
cepas, inocularlas en 20 ml de caldo BHI con almidn al 1% y dejar en
incubacin durante toda la noche, posteriormente se transfiri el cultivo a 200
mL de caldo BHI con almidn al 1%, se tomaron muestras y se hizo lectura de
absorbancia y recuento en placa, (Delgado et al, 2003). Adicionalmente se
realiz un modelo matemtico de la cintica de crecimiento de B. cereus en
Combase predictor, para identificar las fases de crecimiento del
microorganismo bajo condiciones estndar (caldo tripticasa de soya, pH 7,
temperatura de 30 C, Aw de 0.997).

Durante la realizacin de las curvas de crecimiento se hicieron diluciones


seriadas en agua peptonada al 0.1 % y se sembraron en profundidad las
diluciones 10-7 y 10-8 en agar TSAYE y TS para L. monocytogenes y B. cereus
respectivamente, para luego hacer recuentos.

31
5.4 Evaluacin de la termorresistencia

5.4.1 Elaboracin de curvas de inactivacin trmica

Para realizar las curvas de inactivacin trmica de B. cereus fue necesario


descongelar los viales y colocarlos a crecer durante 18 horas en caldo BHI con
almidn al 1% para que el cultivo alcanzara la fase estacionaria (Romn, 2004).
Posteriormente, se sirvieron tubos con 10 mL de cultivo para someterlos a las
temperaturas a evaluar (55C, 60C y 70C) durante 1, 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30 y
60 minutos. De cada tiempo se realizaron diluciones seriadas de 10-1 a 10-10
en agua peptonada al 0.1% para hacer recuentos en profundidad en agar TS
por duplicado. Cada curva se realiz por triplicado para cada temperatura.
(Molina et al, 2006)

Por otra parte, las curvas de L. monocytogenes se realizaron de la misma


forma pero evaluando temperaturas de 52, 55 y 57C y, tiempos de 1, 2, 5, 10,
15, 20, 30 y 60 minutos. Los recuentos se realizaron de la misma manera que
con las curvas de B.cereus, reemplazando el agar TS por TSAYE.

5.4.2 Elaboracin de la salsa y evaluacin de termorresistencia en salsa.

Para la elaboracin de la salsa sobre la cual se evalu la termorresistencia se


pesaron diferentes cantidades de los ingredientes a utilizar (tomate, cebolla,
ajo, aceite, sal, salsa de tomate y azcar) hasta obtener el sabor, color y
contextura deseada. Se obtuvieron 11 conservas con caractersticas distintas y
se realiz una seleccin de una de ellas con base en las caractersticas
organolpticas requeridas y al mismo tiempo teniendo en cuenta las opiniones
de las personas del laboratorio de microbiologa de alimentos de la Universidad
Javeriana, acerca de sabor, color, etc. Despus de seleccionar la salsa, se
llev a esterilizacin y se sirvieron 200 mL en frascos de vidrio; para despus
inocular 20 mL del cultivo crecido previamente durante 12 y 24 horas para
L.monocytogenes y B.cereus respectivamente. Luego, se procedi a evaluar

32
las mismas temperaturas usadas durante la elaboracin de las curvas ya
mencionadas. Igualmente se realizaron diluciones seriadas en agua peptonada
de cada tiempo y recuentos en agar TS para B. cereus y TSAYE para L.
monocytogenes. Para esto fue necesario pesar 10 g de salsa e inocularlos en
90 mL de agua peptonada para seguir haciendo las diluciones (Carrascal y col.
2003)

5.5 Obtencin de la planta

Las plantas de M. mollis se recolectaron en el jardn botnico de la Universidad


Nacional, Bogot, Colombia. Este procedimiento de recoleccin se realiz en
compaa de un asesor experto en la obtencin de Minthostachys mollis.

5.5.1 Obtencin del aceite esencial de Minthostachys mollis

De una misma poblacin de individuos de M. mollis propagados bajo


condiciones controladas, se tomaron muestras frescas (500 g) de la parte
area de plantas en el mismo estado de desarrollo (vegetativo, floracin o
fructificacin), se sometieron a hidrodestilacin por 2 horas. La fraccin de
aceite esencial extrada se recolect en un vial, para congelarlo a -10 C y
centrifugarlo a 12000 rpm durante 10 min, con el fin de separar la fase acuosa
de la oleosa, y se almacenaron a 4 C para los anlisis posteriores (Chica-
Balaguera et al, 2006., Tepe et al, 2005).

5.6 Evaluacin de la actividad antimicrobiana.

5.6.1 Mtodo difusin en agar con disco para bacterias

5.6.1.1. Preparacin del inculo

Para la obtencin del inculo de L. monocytogenes se realiz un pool con las


cepas 146, 142 y 196, las cuales se adicionaron en 200 mL de caldo BHI con

33
glucosa al 0.5% y se llevaron a incubacin durante 12 horas a 37C, 130 rpm.
En el caso de B. cereus, se inocul en 200 mL de caldo BHI adicionado con
almidn al 1% y se llev a incubacin durante 18 horas a 30C, 130rpm.

Transcurrido el tiempo de incubacin para cada microorganismo, se ajust la


concentracin del inculo haciendo diluciones con caldo BHI adicionado de
0.5% de glucosa o 1% de almidn para L. monocytogenes y B. cereus
respectivamente, y se midi su absorbancia con el espectrofotmetro
GENESYS, hasta obtener un valor de 0.25 equivalente a concentracin de 108
clulas/ mL (Molina et al, 2005). A partir de este inculo se realiz una siembra
masiva en cajas de Petri; para L. monocytogenes se utiliz agar para antibitico
adicionado de sangre al 5% y extracto de levadura al 0.5% (comunicacin
personal Gallegos, 2006) y para B. cereus agar para antibitico. Las placas de
Petri se utilizaron de la siguiente forma: se realizaron 5 rplicas donde una caja
contena el disco impregnado con el aceite esencial puro, otra caja el disco con
el control positivo (ampicilina o vancomicina para Listeria monocytogenes y
Bacillus cereus respectivamente) y la ltima caja el control negativo que en
este caso se utiliz un disco estril. Los discos utilizados se cortaron de papel
Whatman No 3 (6mm) y se esterilizaron previamente (Bauer-Kirby, 1966;
NCCLS, 2003).

5.7. Anlisis estadstico

Se realiz una comparacin de medias para establecer si exista diferencia


estadsticamente significativa entre las diferentes temperaturas utilizadas para
cada una de las cepas de inactivacin trmica, usando el programa SAS-9 para
Windows.

34
6. RESULTADOS Y DISCUSIN

6.1 Prueba de pureza y viabilidad de los bancos de clulas.

Los resultados de pureza y viabilidad de las cepas evaluadas, se muestran en


las tablas 1 y 2 respectivamente.

Tabla 1. Pruebas de pureza

FECHA DE PRUEBA

14 de 20 de 17 de 10 de 22 de 8 de
Enero de Febrero Marzo de Abril de Mayo de Junio de
2007 de 2007 2007 2007 2007 2007
CEPA COLORACIN DE GRAM
L. Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo
monocytogenes pequeo pequeo pequeo pequeo pequeo pequeo
cdigo 146 positivo positivo positivo positivo positivo positivo
L. Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo
monocytogenes pequeo pequeo pequeo pequeo pequeo pequeo
cdigo 142 positivo positivo positivo positivo positivo positivo
L. Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo
monocytogenes pequeo pequeo pequeo pequeo pequeo pequeo
cdigo 196 positivo positivo positivo positivo positivo positivo
Bacillus cereus Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo Bacilo
positivo positivo positivo positivo positivo positivo
esporula- esporula- esporula-
do do do

Tabla 2. Pruebas de viabilidad de los BCP.


CEPA Fecha de prueba : 14 de Enero de
2007
Recuento (UFC/mL)
Listeria monocytogenes cdigo 146 30x108
Listeria monocytogenes cdigo 142 17x108
Listeria monocytogenes cdigo 196 21x108
Bacillus cereus 12x109

35
Figura 4. Fotografa de coloracin de Gram de L. monocytogenes.
Fuente: Autores

Figura 5. Fotografa de la coloracin de Gram de B.cereus.


Fuente: Autores

En la tabla 1 se muestran los resultados de las pruebas de pureza realizadas


durante el estudio, en las cuales se obtuvieron las morfologas que se muestran
en la figura 4, coincidiendo con lo reportado por Bell et al, 2000 para Listeria
monocytogenes, que corresponden a bacilos Gram positivos en algunos casos
en forma de Y o V. En el caso de la morfologa de B. cereus (figura 5), se
observaron bacilos Gram positivos esporulados, coincidiendo con lo reportado
por Delgado et al, 2004. Lo anterior demuestra que el mtodo de preservacin

36
utilizado en este caso, criopreservacin con glicerol, fue favorable ya que es un
mtodo que protege a las bacterias durante el almacenamiento en congelacin
(Lynn, 2004). El glicerol acta a nivel de membrana celular limitando el efecto
de la deshidratacin celular, disminuyendo el punto de congelacin de lquidos
biolgicos intra y extracelulares y promoviendo la vitrificacin en lugar de la
formacin de cristales de hielo intracelulares (Rojas, 2007).

Con relacin a L. monocytogenes, podra decirse tambin que su tolerancia al


fro se relaciona con la lipoprotena OppA, pues sta media el transporte de
ologopptidos dentro de la pared celular, involucrndose en la crioproteccin
por medio de la acumulacin de osmolitos como la glicina betana (Borezee et
al, 2000). Se ha reportado que L. monocytogenes acumula glicina betana para
adaptarse a bajas temperaturas (Molina et al, 2006).

Un banco de clulas es un cultivo microbiano puro, homogneo; almacenado


bajo condiciones que aseguran su estabilidad gentica (Meza, 2004), evita la
alteracin de las caractersticas bioqumicas, secuencia nucleotdica,
estabilidad plasmtica, reconocimiento inmunolgico, actividad biolgica,
caractersticas morfolgicas, retarda la muerte de los microorganismos,
previene la contaminacin y mantiene la viabilidad de los microorganismos
(Monroy et al, 2002). De acuerdo a lo anterior, se evidenci que las cepas de
L. monocytogenes y B. cereus conservaron sus caractersticas y mantuvieron
estabilidad, pues durante todo el estudio hubo poblaciones de 108 UFC/mL y
109 UFC/mL para L. monocytogenes y B. cereus respectivamente (tabla 2).

6.2 Cintica de crecimiento de L. monocytogenes y B. cereus.

Con la realizacin de las curvas de crecimiento de las 3 cepas de L.


monocytogenes en estudio, se evidenci que todas alcanzaron la fase
estacionaria en 12 horas (Fig. 6), lo cual corresponde con lo mencionado por
Aldana, 2000 y Robinson et al, 2001. En este estudio se pretenda conseguir la
fase estacionaria ya que se ha reportado que es el momento en el cual los

37
microorganismos adquieren mayor resistencia; adems en esta fase se han
encontrado ciclos de divisin reductiva, incremento en la estabilidad del ARN y
en la resistencia a condiciones de estrs en bacterias patgenas (Arraz et al,
2002). Segn Robinson et al, 2001, las clulas en fase exponencial son
generalmente ms frgiles y susceptibles a la injuria que en la fase
estacionaria.

L. monocytogenes en fase estacionaria aumenta la expresin del gen prfA, el


cual proporciona un mecanismo por el que las clulas pueden responder a
condiciones adversas de crecimiento. Tambin se sabe que las clulas
contienen varios blancos para la accin trmica, pero ha sido propuesto por
Miller et al, 2006, que la resistencia basal de calor de estos microorganismos
podra ser debida a la estabilidad intrnseca de macromolculas, o sea
ribosomas, cidos nucleicos, enzimas y protenas dentro de la clula y la
membrana (Rojas, 2007).

38
C u rva crecim ien to Listeria mon ocytogenes
C ep a 142 curva 2

0,8
Abs a 620 nm

0,6
0,4
0,2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Tie m po (hora s)

C u rv a c re c im ie n to L is te ria m o n o cy to ge n e s
C epa 196

1
0,8
Abs 620 nm

0,6
0,4
0,2
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
T ie m p o (h o ra s)

C urva crecimiento Listeria monocytogenes


C epa 146

0,6
Abs 620 nm

0,4

0,2

0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Tie m po (hora s)

Figura 6. Curvas de crecimiento de Listeria monocytogenes

39
Por otra parte, B. cereus alcanz su fase estacionaria en un tiempo de 18 horas
como se puede observar en la figura 7. Al comparar los datos obtenidos en el
programa Combase predictor, donde B. cereus en condiciones ideales
alcanza la fase estacionaria en 12 horas, los resultados obtenidos en esta
investigacin difieren por la siguiente razn: el medio utilizado en el programa
es caldo tripticasa de soya, mientras que en este estudio se utiliz caldo BHI
suplementado con almidn, lo que podra explicar el alargamiento de la fase
logartmica; B. cereus posee amilasas que son activadas en presencia de
almidn, y como sucedi en este estudio, la cepa inici una segunda fase (fase
de diauxia), una vez terminado el consumo de glucosa en el medio, pues en
este caso tena dos sustratos alternativos (Fernndez, 1999). Es posible que si
en esta investigacin no se hubiera adicionado almidn al medio, la fase
estacionaria se hubiera obtenido en 12 horas. La razn por la que se adicion
almidn, fue simular las condiciones de las conservas donde se usan
almidones modificados que mantienen la estabilidad reolgica del producto,
pues este microorganismo causa deterioro en las conservas (Hersom y
Hulland, 1980) el cual se evidencia por la aparicin de vetas blancas y acidez
en el producto (Rees y Bettison, 1994).

Cabe resaltar que en estudios para evaluar actividad antimicrobiana o


temperaturas altas, se trabaja con las cepas en fase estacionaria ya que stas
corresponden a condiciones adversas y como ya se mencion, los
microorganismos son ms resistentes durante la fase estacionaria (Robinson et
al, 2001).

40
Curva de crecimiento Bacillus cereus

0,6
0,5
Abs 620 nm

0,4
0,3
0,2
0,1
0
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26
Tiempo (horas)

Figura 7. Curva de crecimiento de B. cereus

6.3 Elaboracin de la conserva

En la figura 8 se muestran los componentes, cantidades y apariencia de la


salsa escogida. Como se mencion en la metodologa, se prepararon
conservas con diferentes cantidades de ingredientes y se seleccion la que
cumpliera con las caractersticas requeridas como viscosidad, olor, sabor,
color, etc. para una conserva a base de tomate. La valoracin de la calidad
sensorial puede servir para determinar los efectos del tratamiento trmico sobre
los alimentos, o sobre su aceptabilidad (gustan-no gustan). Por ejemplo, el
sabor se valora mediante el sentido del gusto (dulce, salado, amargo, cido) y
del olfato (compuestos voltiles), y suele ser valorado en la boca a la
temperatura en que el alimento (o bebida) es consumido normalmente. La
textura puede ser valorada visualmente, por ejemplo la viscosidad mediante el
tacto (Rees y Bettison, 1994). Otros requerimientos para salsa de tomate por
ejemplo, son: su aspecto debe ser completamente homogneo; su color rojo
uniforme, no deber presentar partes decoloradas o ennegrecimiento, su olor y

41
sabor deben ser propios del producto (Quintero, 2003). Con base en esto, se
seleccion la salsa nmero 10 y se descartaron las otras 10 obtenidas (anexo
3).

Ingrediente Cantidad
Tomate 150 g
Azcar 1g
Cebolla 5g
Ajo 0.5 g
Color 0.2 g
Agua 20 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 4g
Sal 0.1 g

Figura 8. Salsa seleccionada a base de tomate.

42
6.4 Evaluacin de la termorresistencia de L. monocytogenes y B. cereus
(en caldo BHI y sobre alimento)

6.4.1 Inactivacin trmica de L. monocytogenes

Al analizar los datos obtenidos en las curvas de inactivacin trmica (figura 9)


se puede observar que durante la evaluacin en las diferentes temperaturas, la
cepa mostr una mayor termorresistencia cuando se someti a la temperatura
en caldo BHI adicionado de 0.5% de glucosa, que lo obtenido en la evaluacin
directamente sobre el alimento (conserva a base de tomate). Aunque podra
esperarse una mayor termorresistencia en la conserva debido a su
composicin, viscosidad, Aw que al ser menor induce una mayor
termorresistencia (Hersom y Hulland, 1980); no fue as probablemente porque
esta resistencia por parte de la clula pudo verse afectada por el pH del medio,
pues el alimento evaluado posea un pH cido (5.0) y se ha demostrado que la
mayora de microorganismos generalmente presentan su resistencia mxima a
pH neutro, disminuyendo su termorresistencia a medida que el pH aumenta o
disminuye (Hersom y Hulland, 1980); en este caso se pudo dar una mayor
destruccin de los microorganismos debido a la acidez del medio. Se ha
demostrado que el comportamiento de L. monocytogenes en los alimentos,
depende de la interaccin de los efectos de temperatura, pH, tipo de
acidulante, contenido de sal, Aw, as como tipos y concentraciones de aditivos
presentes (Ryser, 1999), y en este estudio se present la interaccin de 3
factores: temperatura, pH y concentracin de NaCl.

Es importante sealar, que en los 2 medios evaluados (medio de cultivo y


conserva) la transferencia de calor es igual, es decir, la viscosidad del fluido no
afecta la transferencia de calor porque en los 2 casos se da por conveccin;
con lo cual se puede afirmar que el pH del medio afect en gran medida la
resistencia celular al calor.

43
Otros factores que probablemente pudieron afectar la termorresistencia en la
conserva, fueron las sustancias antimicrobianas presentes en algunos de los
componentes de la salsa como son la cebolla, el ajo y la sal, pues se ha
reportado que estas sustancias poseen un efecto antimicrobiano. Se sabe que
existen diversos productos de origen botnico los cuales poseen una actividad
antimicrobiana como el ajo, organo, mostaza, canela, albahaca, tomillo,
pimienta, mejorana, chile, achiota, cebolla, cilantro, t, limn y naranja
(Barboza et al, 2004).

Por ejemplo el ajo es comnmente utilizado como saborizante y condimento en


los alimentos. El ajo (Allium savitum), pertenece a la familia de las lilceas
junto con la cebolla, el puerro y el tulipn. Es probablemente el alimento con
potencial antimicrobiano mas consumido. Las propiedades medicinales del ajo
han sido estudiadas desde hace ya varios siglos. Sin embargo, es hasta los
aos cuarentas, que aparecen evidencias cientficas de sus propiedades
antimicrobianas; Cavallito y Bailey en 1944, fueron los primeros en aislar el
componente antimicrobiano del ajo a partir de bulbos frescos y lo identificaron
como alicina o cido dialitiosulfnico, el cual es el responsable del olor
caracterstico del ajo y la cebolla. Se ha estudiado que en concentraciones de
1:85,000, tiene actividad bactericida frente a microorganismos Gram positivos y
Gram negativos (Hernndez, 2003). Adicionalmente, la presencia de sal en el
alimento tambin pudo haber afectado la resistencia de las clulas al calor;
pues estudios realizados por Lynn y col en 1991 en carne de cerdo,
demostraron que el aumento en las concentraciones de NaCl (1-3%), result en
una disminucin en la inactivacin trmica de L. monocytogenes a una
temperatura de 60C.

Otro factor que pudo verse implicado fue la tasa de calentamiento. Las tasas
de calentamiento rpidas o lentas, influyen en el grado de destruccin de L.
monocytogenes. En estudios realizados sobre muestras de cerdo molido
inoculado, se observ que un calentamiento lento (1.3C/min) permiti que una

44
mayor concentracin de L. monocytogenes sobreviviera, que en un
calentamiento rpido (Doyle, 2001).

Curvas de inactivacin trmica a 52, 55 y 57 C


en caldo BHI L. monocytogenes

10
9
8
7
Log UFC/mL

6
5
4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

52C 55 C 57C Tiempo ( minutos)

Curvas inactivacin trmica a 52, 55 y 57 C


en salsa L. monocytogenes

11
10
9
8
Log UFC /mL

7
6
5
4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

Tiempo (minutos)
52C 55C 57C

Figura 9. Curvas de inactivacin trmica de L. monocytogenes a 52, 55 y 57


C en caldo BHI y salsa.

45
En cuanto a los valores D encontrados para L. monocytogenes en caldo BHI
(tabla 3) se observa que hubo una disminucin de stos a medida que la
temperatura aument, lo cual puede indicar que el proceso de inactivacin tuvo
los resultados esperados ya que con una mayor temperatura de exposicin
como lo es 57C se observa un mayor efecto sobre la viabilidad de la cepa y
por lo tanto se ver inhibido su crecimiento en un menor tiempo, esto puede
compararse con el anlisis estadstico que muestra una diferencia
estadsticamente significativa entre los valores de la temperaturas de 55 y 57
(tablas 4 y 5). De lo anterior, se podra concluir que el tratamiento con el que
ms rpido se destruye un ciclo logartmico en la poblacin de L.
monocytogenes corresponde a 57C durante 3.3 minutos.

Con respecto a los valores D obtenidos en la salsa tambin se observ una


disminucin para 57C, lo que indica que a mayor temperatura sea sometida la
conserva menos tiempo de exposicin necesita, sin embargo se observ que el
tiempo de exposicin necesario para inactivar un ciclo logartmico a las
diferentes temperaturas no vara sustancialmente, lo que podra apoyarse con
el anlisis estadstico, pues se observa que no hubo una diferencia
estadsticamente significativa en el tratamiento con las tres temperaturas
(tablas 6 y 7), por lo cual en una industria de alimentos es suficiente un
tratamiento trmico que trabaje con 52C durante 60 minutos, para erradicar la
contaminacin por L. monocytogenes.
Esto ratifica que la transferencia de calor se da por conveccin de calor en la
salsa y en el caldo sin obstculos.

Tabla 3. Valores D para L. monocytogenes en caldo BHI y conserva

D52 (minutos) D55 (minutos) D57 (minutos)


Cepa CALDO SALSA CALDO SALSA CALDO SALSA
L.monocytogenes 15 5 6.6 5 3.3 2

46
Tablas 4 y 5. Comparacin de medias por temperaturas en caldo BHI (L.
monocytogenes).

Alfa 0.05
Grados de libertad 78
Error de la media 7.543851
Valor critico de t 1.99085
Mnima diferencia significativa 1.4882

Agrupacin t Media N Tem


A 7.9107 27 57
AB 7.1070 27 52
B 5.7937 27 55
Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes.

Tablas 6 y 7. Comparacin de medias por temperaturas en salsa (L.


monocytogenes).

Alfa 0.05
Grados de libertad 78
Error de la media 7.632015
Valor critico de t 1.99085
Mnima diferencia significativa 1.4969

Agrupacin t Media N Tem


A 7.2811 27 57
A 7.2374 27 52
A 7.1581 27 55
Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes.

6.4.2 Inactivacin trmica de Bacillus cereus

De acuerdo con los resultados obtenidos en las curvas de inactivacin trmica


(figura 10) y los valores D (tabla 8) de B. cereus, se observ que en las curvas
de inactivacin en caldo BHI y en la conserva a base de tomate no hubo una
diferencia considerable en la reduccin de las unidades logartmicas, en cuanto
a los valores D presentados en caldo son iguales en las tres temperaturas
evaluadas (55, 60 y 70 C), lo mismo ocurri en los valores D en la conserva;
claro esta que hay que tener en cuenta que al analizar los datos obtenidos
estadsticamente se encontr que hubo diferencia estadsticamente significativa

47
en el caldo BHI entre 55C y las otras dos temperaturas (60 y 70C), esta
diferencia se podra explicar porque los datos para los valores D son tomados
manualmente lo que podra tener un mayor porcentaje de error, por lo cual en
el presente estudio se tuvo en cuenta el resultado obtenido mediante el anlisis
estadstico donde se confirma que es mejor un tratamiento a 60 o 70C, para
una industria de alimentos es de mayor utilidad aplicar 60C porque representa
menor costo. Otro punto clave para discutir estos resultados es que el
tratamiento trmico para B. cereus segn reportes, tiene una mayor efectividad
durante el desarrollo de las esporas porque aumenta la termorresistencia de los
microorganismos. Se han avanzado una serie de teoras en torno a la
diferencia entre las clulas vegetativas y las esporas. Una de esas teoras es
la que implica el papel del cido dipicolnico (DPA). Se ha descrito que la
termorresistencia de la espora se debe a que una gran porcin de su contenido
acuoso se encuentra en forma no disponible para participar en la coagulacin
de la protena celular. La termorresistencia aumenta de forma gradual a
medida que la concentracin de agua del entorno disminuye (deshidratacin
del protoplasto de la espora). La gran resistencia de ciertas esporas en medios
acuosos exige que la cubierta esporular tenga una permeabilidad acuosa muy
baja, lo que es difcil por la permeabilidad de los materiales orgnicos, se ha
demostrado que existen diferencias en termorresistencia asociados al tamao
de la molcula que ejerce el pH cido (Martnez, 2007). (Herson y Hulland,
1980). Adems existen factores en el medio que afectan la resistencia trmica
de las esporas, como el pH, la naturaleza de los acidulantes, la temperatura y
la concentracin de NaCI (Laurent et al, 1999).

En contraste, se ha encontrado que la resistencia al calor por las esporas de


muchas especies incrementa cuando son sometidas al calentamiento en
presencia de soluciones con altas concentraciones de azcar y sal (Mazas, et
al, 1999).

Si bien se observ una mayor termorresistencia por parte de B. cereus en la


conserva, esto pudo ser por la exposicin a factores diferentes al calor, como a

48
etanol o cido, lo que puede resultar en un incremento de la termotolerancia.
Igualmente, se ha reportado que en una gran variedad de bacterias, la
respuesta al choque trmico incluye el aumento de una serie de protenas del
choque trmico (HSPs). Estudios realizados por Derr et al, 1999 con B.
subtilis, concluyeron que los genes inducidos por calor son divididos en cuatro
clases diferentes segn sus mecanismos regulatorios; los genes de la clase II
son inducidos por estrs trmico y otras condiciones como sal o etanol.
Tambin se ha visto que la repuesta al choque trmico de las clulas de B.
subtilis preexpuestas a calor suave, producen esporas ms estables al calor
(Periago et al, 2002), esta preexposicin al calor puede corresponder a la
temperatura de incubacin utilizada en el presente estudio antes de la
exposicin a las diferentes temperaturas de evaluacin. Durante el desarrollo
de las esporas aumenta la termorresistencia de los microorganismos y por lo
tanto puede ser mas difcil su destruccin, por esta razn se puede decir que B.
cereus tuvo valores D constantes en las diferentes temperaturas evaluadas 55,
60 y 70 C, pues estas temperaturas no son suficientes para la destruccin de
las esporas, se ha reportado que la temperatura ptima para inactivar las
esporas es aproximadamente 90, 95 y 100 C, (Byrne et al, 2006) y que el
tratamiento trmico mnimo para productos procesados (90 -95 C por 6 10
minutos) usualmente no es suficiente para inactivar a todas las esporas
(Fernndez et al, 2002). En el caso de este estudio no se utilizaron estas
temperaturas tan altas, porque se pensaba combinar el efecto de la
temperatura con el agente antimicrobiano (aceite de M. mollis) y adems las
temperaturas altas hacen que se pierdan ms fcil los componentes por
volatilizacin. Asimismo se observa en la figura 7 que las concentraciones de
clulas iniciales vegetativas son altas, por lo cual se ve un decrecimiento ms
rpido del minuto 1 al 5, lo que explica los bajos valores D en estos primeros
minutos. Por otra parte, despus del minuto 5 se observa una tendencia ms
constante lo que puede hacer pensar que la cepa empieza a esporular en este
momento. Adems, debido a la naturaleza logartmica de la curva de muerte
trmica, cuanto mayor sea el nmero de esporas mayor ser el tiempo
necesario para llevar a cabo su destruccin (Hersom y Hulland, 1980) por esta

49
razn se evaluaron tiempos largos. Por todo lo anterior era recomendable la
evaluacin de la termorresistencia de B. cereus directamente sobre las esporas
sin la presencia de clulas vegetativas para dar una aproximacin mas cercana
a la temperatura ptima de inactivacin.

Curvas de inactivacin trmica a 55, 60 y 70 C


en caldo BHI B.cereus

10
9
8
7
Log UFC/mL

6
5
4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

55 C 60 C 70 C Tiempo (minutos)

Curvas de inactivacin trmica a 55, 60 y 70 C


en SALSA B.cereus
8
7
6
Log UFC/mL

5
4
3
2
1
0
0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65

55C 60C 70C Tiempo (minutos)

Figura 10. Curvas de inactivacin trmica de B. cereus a 55, 60 y 70 C en


caldo BHI y salsa.

50
Tabla 8. Valores D para B. cereus en caldo BHI y conserva

D55 (minutos) D60 (minutos) D70 (minutos)


Cepa CALDO SALSA CALDO SALSA CALDO SALSA
B. cereus 0.98 1 0.98 1 0.98 1

Tablas 9 y 10. Comparacin de medias por temperaturas en caldo BHI (B.


cereus).

Alfa 0.05
Grados de libertad 78
Error de la media 3.464374
Valor critico de t 1.99085
Mnima diferencia significativa 0.975

Agrupacin t Media N Tem


A 5.3978 27 55
B 3.6600 27 60
B 3.5100 27 70
Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes.

Tablas 11 y 12. Comparacin de medias por temperaturas en la conserva (B.


cereus).

Alfa 0.05
Grados de libertad 78
Error de la media 3.464374
Valor critico de t 1.99085
Mnima diferencia significativa 1.0085

Agrupacin t Media N Tem


A 3.8026 27 55
A 3.3100 27 60
A 3.2244 27 70
Las medias con la misma letra no son significativamente diferentes.

51
6.6 Extraccin del aceite esencial de Minthostachys mollis y evaluacin
de la actividad antimicrobiana.

En la tabla 13 se muestra la cantidad de aceite esencial obtenido a partir de las


plantas de M. mollis recolectadas.

Tabla 13. Volumen de aceite esencial obtenido

Cantidad de planta sometida a Cantidad de aceite esencial obtenida


hidrodestilacin
500 g 0.5 mL

Los aceites esenciales son tradicionalmente obtenidos por destilacin con


vapor o por hidrodestilacin. Estos procesos son realizados a temperaturas
muy altas y pueden conducir a la degradacin de los compuestos termolbiles,
resultando la formacin de compuestos indeseables y desagradables. Adems
que pueden tener una composicin heterognea. Aceites de superior calidad,
libres de productos degradados por hidrlisis y degradacin trmica; pueden
ser aislados usando dixido de carbono supercrtico (SC-CO2) como solvente
(Bocevska y Sovov, 2007). Debido a que la extraccin con dixido de
carbono supercrtico puede ser llevado a cabo a bajas temperaturas (cerca de
313 K), se preservan las propiedades y composicin original del aceite (Zizovic
et al, 2005). La extraccin del aceite esencial de M. mollis en el presente
estudio, se realiz por medio de hidrodestilacin y se obtuvo una baja cantidad
a partir de la planta (Tabla 13), posiblemente porque como se mencion
anteriormente, esta tcnica se hace a temperaturas muy altas y la volatilizacin
de los componentes del aceite se hace mucho ms fcil. Lo anterior hizo que
la evaluacin de la actividad antimicrobiana fuera limitada y dependiera de la
cantidad de aceite obtenida.

En las tablas 14 y 15 se muestran los datos obtenidos de la actividad


antimicrobiana del aceite esencial

52
Tabla 14. Actividad antimicrobiana del aceite esencial (zona inhibicin en mm)

Tamao del halo (mm)


Microorganismo Rplica Rplica Rplica Rplica Rplica
1 2 3 4 5
Listeria Aceite 0 0 0 0 0
monocytogenes esencial puro
Control 15 18 14 16.3 15
positivo
(ampicilina)
Control 0 0 0 0 0
negativo
(disco estril)
Bacillus cereus Aceite 0 0 0 0 0
esencial puro
Control 36 36 28 32 31
positivo
(vancomicina)
Control 0 0 0 0 0
negativo
(disco estril)

Tamao del halo: Dimetro halo + disco dimetro disco (0.6mm)

Tabla 15. Susceptibilidad de las cepas evaluadas con el aceite esencial de M.


mollis

Disco Listeria monocytogenes Bacillus cereus


Aceite esencial puro R R
Control positivo S S
Control negativo R R

S: Cuando la CMI del antimicrobiano para una bacteria se puede conseguir in vivo a dosis teraputicas.

R: Cuando el microorganismo no es inhibido por las concentraciones que normalmente se pueden obtener
en el sito de infeccin.

I: Cuando las bacterias no se inhiben a concentraciones normales, pero pueden inhibirse a


concentraciones mas altas sin resultar txicas.

Para evidenciar la actividad antimicrobiana del aceite esencial de M. mollis, fue


necesario utilizar un mtodo de difusin en agar con el aceite esencial de la

53
planta, el cual se mostr inactivo y no tuvo inhibicin como se demuestra (tabla
14) pues no hubo presencia de halos en ninguna de las cepas analizadas,
mostrando la resistencia de estos microorganismos al aceite con la
concentracin utilizada para L. monocytogenes y B. cereus (tabla 15).

El presente estudio no tena como objetivo determinar la composicin del aceite


esencial de M. mollis, por tanto se tomaron como base datos obtenidos en
estudios anteriores acerca de los principales componentes presentes. Alkire et
al, 1993, reportaron que el aceite contiene principalmente mentona, pulegona,
-pineno, entre otros (anexo 2). Otros estudios acerca de la composicin
qumica, encontraron que el aceite contiene carvona, pulegona, mentona,
isomentona, -pineno and limoneno, en cantidades relativas que varan de
9.3% a 65% (Chica et al, 2006). Sin embargo Chica et al, 2006, encontr 3
compuestos adicionales en proporciones significativas: carvacrol, acetato de
carvacril y trans--cariofileno. De stos, el carvacrol ha sido muy estudiado por
su potencial actividad antimicrobiana y antifngica frente a distintos
microorganismos. La inhibicin del crecimiento de muchos patgenos por el
carvacrol, ha sido reportada en varios artculos, sin embargo no se ha definido
el mecanismo de accin de ste. Usando B. cereus, un esporoformador
patgeno en alimentos, como organismo modelo, se ha demostrado que la
exposicin de las clulas vegetativas a concentraciones de carvacrol mayores
a 1 mM, conduce a una extensin de la fase de latencia, una tasa baja de
crecimiento mximo especfico y una densidad final de poblacin baja.
Tambin se ha visto que a concentraciones por encima de 1 mM, la viabilidad
de B. cereus decrece exponencialmente. Al mismo tiempo hay un incremento
en la fluidez de la membrana y salida de protones e iones potasio, conduciendo
a una disminucin en el gradiente de pH a travs de la membrana
citoplasmtica, un colapso en el potencial de membrana e inhibicin de la
sntesis de ATP. Finalmente estos eventos, son seguidos por la muerte celular
(Ultee et al, 2002).
Por otra parte, tambin se ha reportado la actividad del carvacrol frente a L.
monocytogenes. Gill y Holley, 2006 encontraron que es capaz de inhibir la

54
actividad ATPasa en la membrana celular. Tambin se ha encontrado que este
tipo de agentes pueden inhibir la generacin de adenosina trifosfato de
dextrosa y afectar la membrana y que concentraciones de carvacrol de 5 a 10
mM tienen actividad bactericida frente a L. monocytogenes (Gill y Holley, 2006).

Por lo anterior, posiblemente la ausencia de actividad antimicrobiana pudo ser


porque en el aceite esencial obtenido en el presente estudio, no contena
carvacrol dentro de sus componentes, siendo este el componente con mayor
actividad antimicrobiana reportado. Es probable que lo anterior se haya dado
porque la composicin qumica del aceite obtenido de la planta puede variar
segn las condiciones de crecimiento, geogrficas, geolgicas, climticas y
estacinales de la planta, por lo tanto sus caractersticas o propiedades
antimicrobianas pueden tambin variar (Chica et al, 2006). Posiblemente la
composicin del aceite obtenido por Chica et al 2006 fue diferente al obtenido
en el presente estudio, pues la recoleccin de la planta se llev a cabo en
diferentes lugares.

Se ha reportado que las bacterias Gram negativas son menos resistentes a la


accin de los aceites que las Gram positivas como resultado de las cadenas
alifticas como sustituyentes en los anillos fenlicos de los componentes del
aceite (Chica et al, 2006).

Adems se ha reportado que L. monocytogenes es la menos sensible entre un


nmero de bacterias evaluadas (Kalemba y Kunicka 2003). La variabilidad de
la actividad antimicrobiana de los aceites esenciales hacia diferentes
microorganismos se puede atribuir a las diferencias cualitativas y cuantitativas
en componentes de aceites individuales, mientras que algunos aceites
esenciales estimulan el crecimiento de algunos microorganismos, otros son
capaces de inhibirlos (Demo et al, 2005). Las caractersticas letales tambin
dependen de los componentes del aceite esencial, y puede depender del
nmero de las clulas del inculo. Algunos productos qumicos, como por
ejemplo la pulegona, han expresado una mayor inhibicin en el crecimiento de

55
Erwinia amylovora en concentraciones ms bajas (103 UFC/ml), otros
compuestos como la -pinona en 107 UFC/ml. y para otros componentes no
se ha encontrado. (Kalemba y Kunicka, 2004).

Otra de las posibles razones por las que no se obtuvo un efecto antimicrobiano
del aceite esencial, fue porque el mtodo utilizado para evaluar la actividad no
fue el mejor; pues se ha reportado que el mtodo de difusin en agar es
inadecuado para aceites esenciales, sus componentes voltiles se pueden
evaporar con el solvente de dispersin durante el tiempo de incubacin,
mientras que sus componentes mas solubles no se difunden bien en el agar.
No obstante, es la tcnica ms comn para evaluar actividad antibacteriana y
antifngica de aceites esenciales porque es mas fcil llevarla a cabo y requiere
solo pequeas cantidades del aceite esencial (Kalemba and Kunicka 2003).

Debido a la difcil tarea que es la recoleccin de la planta, pues es una especie


que nicamente florece en verano (Ojeda, 2004), el aceite esencial no se
consider rentable para su posible uso en preservacin de alimentos, ya que
Colombia es un pas donde no se presentan estaciones y por lo tanto no hay
periodos largos de luz para favorecer la constante floracin de la planta. Por
esta razn se dificult una segunda recoleccin de sta para evaluar
nuevamente la actividad antimicrobiana, debido a las siguientes razones: los
cambios climticos que se presentaron en el momento de la recoleccin
afectaron la floracin de la planta en Cqueza, Cundinamarca, donde se hizo
una expedicin en bsqueda del material vegetal, pues es un lugar donde
comnmente florece; por otro lado se intent la bsqueda en una plaza de
mercado donde se conoce como organo de monte, sin embargo tampoco fue
posible debido a la misma razn del clima; por ltimo, despus de conseguir la
planta en un cultivo de la Universidad Nacional, se tuvo en refrigeracin
durante un tiempo de 2 das, en el cual probablemente se pudieron perder
algunos componentes.

56
Adicionalmente, el uso de aceites esenciales en el sector alimenticio es a
menudo limitado debido a que las dosis antimicrobianas eficaces pueden
exceder niveles aceptables (Kalemba y Kunicka, 2004).

Se ha reportado en literatura que los compuestos qumicos encontrados en el


aceite esencial de esta planta tales como los fenoles isomricos como el
carvacrol y el timol pueden tener caractersticas antimicrobianas similares, el
bajo pH de estas molculas es mas disociado e hidrofbico posiblemente
conduciendo a una mejor unin a las reas hidrofbicas de las protenas
(Michiels et al, 2007) y la bicapa lipdica de la membrana citoplasmtica que
causan la prdida de integridad y la salida del material celular tal como iones,
ATP y cidos nucleicos (Nostro et al, 2007),

Por otra parte el mentol es un es un agente antifngico y antimicrobiano y ha


2+
sido encontrado para interactuar a nivel clular con el Ca citoslico,
probablemente por una liberacin de calcio almacenado intracelularmente y
bloqueando el canal de calcio (Mucciarelli et al, 2001).

De los compuestos encontrados se reporta que la mentona es un inhibidor del


crecimiento mientras que la pulegona es metabolizada por una mono-
oxigenasa microsomal heptica para una serie de hepatotoxinas que causan
cncer en el hgado y esta involucrado en muchos casos reportados de
intoxicacin en humanos y animales. Adems la pulegona es considerado uno
de los ms poderosos aleloqumicos y ha sido demostrado que puede ser dos
veces mas txico que el cianuro de hidrgeno (HCN). (Mucciarelli et al, 2001).
Los efectos de los compuestos alelopticos en la respiracin mitocrondrial
pueden ser importantes en el mecanismo de accin por el cual se controla el
crecimiento de maleza. (Mucciarelli et al, 2001).

Por ltimo, si bien los extractos obtenidos a partir de M. mollis han resultado
eficientes frente a fitopatgenos, en este caso no tienen una actividad

57
antimicrobiana que ameriten seguir con su investigacin para uso en industria
de alimentos.

7. RECOMENDACIONES

En el caso de B. cereus se debe trabajar con esporas y no con formas


vegetativas, para obtener datos ms homogneos.

Al trabajar con el aceite esencial de M. mollis, es necesario que todas las


plantas se encuentren en el mismo estadio del ciclo de vida para
asegurar resultados mas confiables en los compuestos obtenidos;
igualmente se recomienda no dejar pasar ms de un da despus de la
recoleccin del material vegetal para hacer la extraccin del aceite.

58
8. CONCLUSIONES

o De acuerdo con los datos obtenidos en las curvas de crecimiento, se


observ que L. monocytogenes alcanz la fase estacionaria en un
tiempo de 12 horas y B. cereus en un tiempo de 18 horas.

o No hubo diferencias en cuanto a la reduccin logartmica de clulas de


L.monocytogenes en las temperaturas de 52, 55 y 57 C, pero si se
presentaron valores D mayores en caldo que en salsa.

o B. cereus mostr valores D mayores en salsa que en caldo, pero no se


obtuvieron diferencias considerables en cuanto a la reduccin
logartmica en las temperaturas de 55, 60 y 70 C .

o M. mollis no present inhibicin sobre las cepas de L.monocytogenes y


de alimentos.

o Estadsticamente no se encontr diferencia entre las temperaturas


utilizadas para inactivar a B. cereus en la salsa, posiblemente por
condiciones de pH y estructura de la espora.

59
9. REFERENCIAS

ACERO CORAL, G. Y M.D. RIVE. 1989. Medicina indgena, Cacha-


Chimborazo. Ediciones Abya Yala.

ADAMS M.R, MOSS. 1997. Microbiologa de los alimentos. Editorial


Acribia S.A. Pg 176.

AKGUL, A. AND KIVANC, M. 1988. Inhibitory effect of six Turkish thyme-


like spices on some common food-borne bacteria. Die Nahrung 32(2):
pg 201-203.

ALDANA, L., SARASSA,S. 2000. Efecto de desinfectantes y


antimicrobianos naturales frente a cepas de Listeria monocytogenes.
Microbiologa Industrial. Pontificia Universidad Javeriana.

ALIAGA, T.J. Y W. FELDEHEIM. 1985. Hemmung der Keimbildung bei


gelagerten Kartofflen durch das terische l der sdamerikanischen
Muapflanze (Minthostachys spp.). Ernhrung/Nutrition 9 (4): 254-256

ALKIRE, B.H., A. O. TUCKER, M.J.MACIARELLO. 1994. Tipo,


Minthostachys mollis (Lamiaceae): an Ecuadorian Mint. Economic
Botany. 48: 60-64.

AMODIO- COCCHIERI,R., CIRILLO, T., VILLANI, F. AND MOSCHETTI,


G. (1998). The occurrence of Bacillus cereus in fast foods. International
Journal of Food Sciences and Nutrition 49, 4; Health & Medical Complete
pg. 303

ANNOUS, B.A., BECKER, L.A., BAYLES, D.O., LABEDA, D.P.,


WILKINSON, B.J., 1997. Critical role of anteiso-C15:0 fatty acid in the

60
growth of Listeria monocytogenes at low temperatures. Appl. Environ.
Microbiol. 63 (10), pg 38873894.

ANONYMOUS, 2000. Kinetics of Microbial Inactivation for Alternative


Food Processing Technologies. Overarching Principles: Kinetics and
Pathogens of Concern for All Technologies, US Food and Drug
Administration Centre for Food Safety and Applied Nutrition.

BELL, R.G., DE LACY, K.M., (1984). Influence of NaCl, NaNO and 2


oxygen on the germination and growth of Bacillus licheniformis, a
spoilage organism of chub-packed luncheon meat. J. Appl. Bacteriol. 57,
523530.

BELL, C., KYRIAKIDES,A. 2000. Listeria una aproximacin prctica al


microorganismo y su control en los alimentos. Editorial Acribia S.A. Pg
1

BELTRN, L. Y S. CEDILLO. 1994. Determinacin de la actividad


antihistamnica del aceite esencial de Minthostachys mollis Griseb. In
vitro. Revista de la facultad de Farmacia de Venezuela 30(13): 13-16.

BOCEVSKA, M., SOVOV, H. 2007. Supercritical CO2 extraction of


essential oil from yarrow. J. of Supercritical Fluids 40 (2007) 360367.

BOREZEE,E., PELLEGRINI,E., BERCHE,P. 2000. OppA of Listeria


monocytogenes, an Ologopeptide-Binding Protein Required for Bacterial
Growth at Low Temperature and Involved in Intracellular Survival.
Infection and Immunity. 68: 7068-7077.

BYRNE, B. DUNNE, G. BOLTON, D. 2006. Thermal inactivation of


Bacillus cereus and Clostridium perfringens vegetative cells and spores
in pork luncheon roll. Food Microbiology 23 pg 803808

61
CANTN, A., LULL, C., PRIMO,J., MIRANDA,M., PRIMO-YFERA,E.
(2001). Isolation, structural assignment and insecticidal activity of (-)-
(1S,2R,3R,4S)-1,2-epoxy-1-methyl-4-(1-methylethyl)-cyclohex-3-yl
acetate, a natural product from Minthostachys tomentosa. Tetrahedron:
Asymmetr,y p 677683

CARRASCAL, A.K.2003. Manual de Laboratorio de Microbiologa de


Alimentos. Editorial Ceja.

CHANG ST, CHEN PF AND CHANG SC (2001). Antibacterial activity of


leaf essential oils and their constituents from Cinnamomum
osmophloeum. Journal of Ethnopharmacology 77, 123127.

CHICA BALAGUERA, N., MELGAREJO, L., SNCHEZ, J.,


CARRASCAL, A. (2006). Actividad antimicrobiana del aceite esencial
de Minthostachys mollis (Lamiaceae).

CLAUS, D AND BERKELEY RCW. (1986). Genus Bacillus. In Bergeys


Manual of Systematic Bacteriology. Vol 2. pp 1105-1119

CONNER, D. E. (1993). Naturally occurring compounds. In P. Davidson


& A. L. Branen (Eds.), Antimicrobials in foods (pp. 441468). New York:
Marcel Dekker, Inc...

CORREA, C., FONSECA, J. (2004). Prevalencia de Listeria


monocytogenes en expendios de pollo procesado en la zona
suroccidental de Bogot, D.C. Microbiologa Industrial. Pontificia
Universidad Javeriana. Facultad de Ciencias Bsicas.

62
DELGADO., B., FERNNDEZ, A., PERIAGO, P. 2003. Effect of thymol
and cymene on Bacillus cereus vegetative cells evaluated through the
use of frequency distributions. Food Microbiology, p 327334

DIDRY, N., DUBREUIL, L., AND PINKAS, M. 1993. Activit


antimicrobienne du thymol, du carvacrol et de laldhyde cinnamique
seuls ou associs (Antibacterial activity of thymol, carvacrol, and
cinnalmaldehyde singly or in combinations). Pharmazie, 48, 301308.

DOYLE, M. 2001. Virulence characteristics of Listeria monocytogenes,


FRI brief. 1-13.

ELGAYYAR M, DRAUGHON FA, GOLDEN DA AND MOUNT JR (2001)


Antimicrobial activity of essential oils from plants against selected
pathogenic and saprophytic microorganisms. Journal of Food Protection
64, 10191024.

FERNNDEZ, J.M (1999). La Microbiologa como ciencia, aspectos


histricos y comentarios de actualidad. Departamento de biologa y
gentica, Universidad de Salamanca.

FERNNDEZ, A., COLLADO, J., CUNHA, L.M., OCIO, M.J.,


MARTINEZ, A. 2002. Empirical model building based on Weibull
distribution to describe the joint effect of pH and temperature on the
thermal resistance of Bacillus cereus in vegetable substrate.
International Journal of Food Microbiology 77, 147 153

GANDHI, M AND CHIKINDAS. M. 2007. Listeria: A foodborne pathogen


that knows how to survive. International Journal of Food Microbiology.
Vol 113 pag 115

63
GILL, A., HOLLEY, R. 2006. Inhibition of membrane bound ATPases of
Escherichia coli and Listeria monocytogenes by plant oil aromatics.
International Journal of Food Microbiology 111 170174

GONZLES, Y., LPEZ, M., MAZAS, M., GONZLES, J AND


BERNARDO, A. (1995). The effect of recovery conditions on the
apparent heat resistance of Bacillus cereus spores and growth of the
organism in boiled rice. J. Appl. Bacteriol. 78, 548-554.

HERSOM, A.C., HULLAND, E.D. 1980. Conservas alimenticias,


procesado trmico y microbiologa. Editorial Acribia S.A, Zaragoza,
Espaa.

ICMSF. 2000. Microorganismos de los alimentos. Su significado y


mtodos de enumeracin. Editorial Acribia S.A. 2 Edicin. Pg. 48.

IMAI H, OSAWA K, YASUDA H, HAMASHIMA H, ARAI T AND


SASATSU M (2001). Inhibition by the essential oils of peppermint and
spearmint of the growth of pathogenic bacteria. Microbios 106, Suppl. 1,
3139.

JAMES, S. EVANS. J. 2006. Predicting the reduction in microbes on the


surface of foods during surface pasteurisationthe _BUGDEATH_
Project. Journal of Food Engineering 76 :16

KALEMBA, D., KUNICKA, A. (2003). Antibacterial and Antifungal


Properties of Essential Oils. Current Medicinal Chemistry. Poland, 10
pg 813-829

64
KARAPINAR, M., AND AKTUNG, S. E. (1987). Inhibition of foodborne
pathogens by thymol, eugenol, menthol and anethole. International
Journal of Food Microbiology, 4, pg161166.

YAMAZAKI, K., TATSUHIKO, Y., KAWAI, Y., INOUE, N. (2003).


Enhancement of antilisterial activity of essential oil constituents by nisin
and diglycerol fatty acid ester.

KOTIRANTA., A. LOUNATMAA., K., MARKUS HAAPASALO., M. 2000.


Epidemiology and pathogenesis of Bacillus cereus infections. Microbes
and Infection, 2 pg 189198.

LAURENT, Y., ARINO, S., ROSSO, L. (1999). A quantitative approach


for studying the effect of heat treatment conditions on resistance and
recovery of Bacillus cereus spores. International Journal of Food
Microbiology 48 (1999) 149157.

LIS-BALCHIN M, DEANS SG, EAGLESHAM E. 1998. Relationship


between bioactivity and chemical composition of commercial essential
oils. Flavour Frag J;13: pg 98-104.

LYNN, C. SOFOS., J. SCHMIDT., G. 1991. effects of meat curing


ingredients on thermal destruction of Listeria monocytogenes in ground
pork. 54:408-412.

MARINO M, BERSANI C AND COMI G (2001). Impedance


measurements to study the antimicrobial activity of essential oils from
Lamiaceae and Compositae. International Journal of Food Microbiology
67, 187195.

65
MAZAS, M. MARTNEZ. S. LPEZ. M. ALVAREZ, A. MARTIN, R.
1999. Thermal inactivation of Bacillus cereus spores affected by the
solutes used to control water activity of the heating medium. International
Journal of Food Microbiology 53 : 6167

McCABE-SELLERS., B AND BEATTIE. 2004. Food Safety: Emerging


Trends in Foodborne Illness Surveillance and Prevention. Journal of the
American Dietetic Association. 104 page 1708-1717.

MEAD, P.S., SLUTSKER, L., DIETZ, V., MCCAIG, L.F., BRESEE, J.S.,
SHAPIRO, C., GRIFFIN, P.M., TAUXE, R.V., 1999. Food-related illness
and death in the United States. Emerg. Infect. Dis. 5 (5), 607625.

MICHIELS., J. MISSOTTEN., J. FREMAUT., D. DE SMET., S.


DIERICK., N. 2007. In vitro doseresponse of carvacrol, thymol, eugenol
and trans-cinnamaldehyde and interaction of combinations for the
antimicrobial activity against the pig gut flora. Livestock Science 109
:157160

MILLER. F., BRANDO, T. TEIXEIRA., P. SILVA., C. 2006.Recovery of


heat-injured Listeria innocua. International Journal of Food Microbiology
112 pg 261265

MUCCIAARELLI., M. CAMUSSO., W. BERTEA., C. BOSSI., S.


MAFFEI.,M. 2001. Effect of (+)-pulegone and other oil components of
Mentha x piperita on cucu,ber respiration. Phytochemistry 57: 91-98.

MURPHY COWAN, M. 1999. Plants Products as Antimicrobial Agents.


Oxford, Ohio, p 564-582.

66
NOSTRO., A. SUDANO., A. BISIGNANO., G . MARINO., A.
CANNATELLI., M. PIZZIMENTI., F. CIONI.,P. PROCOPIO., F. AND
BLANCO, A. 2007. Effects of oregano, carvacrol and thymol on
Staphylococcus aureus and Staphylococcus epidermidis biofilms.
Journal of Medical Microbiology 56, 519523.

OMER EA, KHATTAB ME, IBRAHIM ME. 1998. First cultivation trial of
Perilla frutescens L. in Egypt. Flavour Fragr J;13:221-5.

OUSSALAH, M., CAILLET, E., SAUCIER, L., LACROIX, M. 2005.


Inhibitory effects of selected plant essential oils on the growth of four
pathogenic bacteria: E. coli O157:H7, Salmonella typhimurium,
Staphylococcus aureus and Listeria monocytogenes. Canad, p 414-
420

PERIAGO, P., SCHAIK,W., ABEE, T., WOUTERS, J. 2002.


Identification of Proteins Involved in the Heat Stress Response of
Bacillus cereus ATCC 14579. Applied and environmental microbiology,
Vol. 68, No. 7 , p. 34863495

PFEIFFER, J., KESSLER, H.G., (1994). Effect of relative humidity of hot


air on the heat resistance of Bacillus cereus spores. J. Appl.Bacteriol. 77,
121128.

PIYASENA, P. LIOU., S. MCKELLAR., R. 1998. Predictive modelling of


inactivation of Listeria spp. in bovine milk during high-temperature short-
time pasteurization. International Journal of Food Microbiology 39 pg
167173

67
PLAZL. I., LAKNER., M. KOLOINI, T. 2006. Modeling of temperature
distributions in canned tomato based dip during industrial pasteurization.
Journal of Food Engineering 75 : 400406

POL, I.E., SMID, E.J. 1999. Combined action of nisin and carvacrol on
Bacillus cereus y Listeria monocytogenes. Institue, Wageningen, The
Netherlands. Letters in Applied Microbiology, p 166-170

QUINTERO, M. 2003. Evaluacin microbiolgica, fsica y aceptabilidad


de la pasta y salsa de tomate elaboradas con tomate larga vida.
Microbiologa Industrial. Pontificia Universidad Javeriana

RAMAN, K.V. Y R.H. BOOTH. 1987. Control of potato tuber moth


Phthotimaea peculella (Zeller) in rustic potato stores Tropical Science
27(3): 175-194.

RAHMAN., M. GUISAN. N. AL-RUZEIKI., M. .2004. D- and Z-values of


microflora in tuna mince during moist- and dry-heating. Lebensm.-Wiss.
u.-Technol. 37 : 9398

REES., J. BETTISON., J. 1994. Proceso trmico y envasado de los


alimentos. Editorial Acribia. S.A. Zaragoza. Espaa.

RINCN, K., ARTEAGA, L., ENCISO, M. 2002. Contribucin al estudio


fitoqumico y de la actividad inmunomoduladora del extracto etanlico de
la corteza de Curatella americana. VII Congreso nacional de
fotoqumica, mayo de 2002. Pg 30.

ROBINSON, T., OLOSIMBO, A., KALOTI, A., OCIO, M., BARANYI, J.,
MACKEY, B. 2001. The effect of inoculum size on the lag phase of

68
Listeria monocytogenes. International Journal of Food Microbiology
702001.163173

ROMN, M., TIRADO, S. 2004. Evaluacin de la formacin de


biopelculas de cepas de Listeria monocytogenes y Pseudomonas sp. en
empaques utilizados en la industria de alimentos. Microbiologa
Industrial. Pontificia Universidad Javeriana

ROJAS, C. 2007. Evaluacin de cuatro desinfectantes sobre Listeria


monocytogenes aisladas de productos crnicos crudos de una planta de
procesados en Bogot. Microbiologa Industrial. Pontificia Universidad
Javeriana

ROZIER, J., CARLIER, V., (1997). Dangers microbiens, Service


dhygie`ne et Industries des denrees alimentaires, Ecole Nationale
Veterinaire de Maisons-Alfort.

RYSER., E y MARTH., E. 1999. Listeria, listeriosis and food safety. 2a


edicin. Ed Marcel dekker, Inc. New York. Estados unidos.

SELBY, T. BERZINS A., GERRARD, D. CORVALAN, C., GRANT, A,


LINTON., R. 2006. Microbial heat resistance of Listeria monocytogenes
and the impact on ready-to-eat meat quality after post-package
pasteurization. Meat Science 74 Pag 425434.

SIELAFF, H. 2000. Tecnologa de la fabricacin de conservas. Editorial


Acribia S.A; Zaragoza, Espaa.

TORRES, F. 2006. impacto de los pulsos elctricos de alta intensidad y


tratamiento trmico sobre la calidad y seguridad de productos derivados
de jugo de naranja. IATA-CSIC valencia Espaa.

69
TORRES, K., POUTOU, R., CARRASCAL, A., SIERRA, S., MERCADO,
M. 2004. Validacin de PCR para deteccin de Listeria monocytogenes
en carnes crudas de carne, res y pollo. Bogot, Colombia, p 414-427.

ULTEE, A., BENNIK, M., MOEZELAAR, R. (2002). The Phenolic


Hydroxyl Group of Carvacrol Is Essential for Action against the Food-
Borne Pathogen Bacillus cereus. Applied and environmental
microbiology, p. 15611568

WALLACE, J. 2004. Symposium on Plants as animal foods: a case of


catch 22? Antimicrobial properties of plant secondary metabolites.

WALTON, NJ., BROWN, DE. 1999. Chemical from plants. Perspectives


on plant secondary products. Imperial College Press.

WHITE, A. 1985. Herbs of Ecuador. Ediciones Libri Mundi, Quito,


Ecuador.

WIJNANDS., L. DUFRENNE., J. ZWIETERING., F. LEUSDEN V. 2006.


Spores from mesophilic Bacillus cereus strains germinate better and
grow faster in simulated gastro-intestinal conditions than spores from
psychrotrophic strains. International Journal of Food Microbiology; 112
pg 120128.

ZIZOVIC,I., STAMENIC, M., ORLOVIC, A., SKALA, D. 2005.


Supercritical carbon dioxide essential oil extraction of Lamiaceae family
species: Mathematical modelling on the micro-scale and process
optimization. Chemical Engineering Science 60 (2005) 6747 6756

70
Recursos electrnicos

BARBOZA-CORONA, J.E., VSQUEZ-ACOSTA, H., SALCEDO-


HERNNDEZ, R., BAUTISTA-JUSTO, M. 2004. [en lnea]: Probiticos y
conservadores naturales en alimentos. Acta universitaria, septiembre-
diciembre, ao/vol. 14, nmero 003 pp. 32-38
<http://redalyc.uaemex.mx/redalyc/pdf/416/41614304.pdf> [Consulta 24
de junio de 2007].

Coopgerminal. (2007). [en lnea]: Las plantas. Alimentacin biolgica


<http://www.coopgerminal.org/alimenta3.htm> [Consulta 13 de dic.
2006].

GROVE. R. (2005) Notes On Making Cola Appendix [en lnea]:


<http://sparror.cubecinema.com/.../chemistry/colap.htm> [Consulta 13 de
Enero 2006].

OJEDA, M.S. 2004. Proyecto Frutihortcola, tecnologas para el


desarrollo sustentable regional. Avances en la domesticacin de la
peperina (Minthostachys mollis (Kunth.) Griseb.), una especie aromtica
de la Argentina [en lnea]:
http://www.inta.gov.ar/manfredi/info/boletines/extension/frutales/lf_bole99
.pdf [Consulta 24 de junio de 2007].

OLSEN SJ, MACKINNON LC, GOULDING JS, BEAN NH, SLUTSKER L.


Surveillance for Foodborne Disease OutbreaksUnited States 1993-
1997. MMWR Morb Mortal Wkly Rep. 2000;49:1-62. Available at:
http://www.cdc.gov/mmwr/preview/mmwrhtml/ss4901a1. htm. Accessed
February 20, 2004.

PALTRINIERI, G., FIGUEROLA, F. Depsito de documentos de la FAO


(1993) [en lnea]: Manual prctico sobre procesamiento de frutas y

71
hortalizas a pequea escala en Per <
http://www.fao.org/docrep/x5063S/x5063S03.htm> [Consulta 14 de junio
de 2007].

PANALIMENTOS OPS/OMS (Argentina, 2007) [en lnea]: Enfermedades


transmitidas por alimentos. Para conocer mejor las ETA.
http://www.panalimentos.org/panalimentos/educacion/educacion1.asp?id
=67 . >[Consulta 13 de dic. 2006].

PEREZ., E. AGUILAR., P. SALVATELA., R. RIBETTO., A. CASTRO., A.


Asociacin argentina de microbiologa (Argentina) [en lnea]: vigilancia
de las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA): su importancia
en la caracterizacin de riesgos. <
www.aam.org.ar/actividades/T_ETA.pdf > [Consulta 13 de dic. 2006]

Secretaria de salud. (Bogot, Colombia ) [en lnea]: CUANDO


CONSUMA ALIMENTOS, NO CONSUMA RIESGOS
<http://www.saludcapital.gov.co/secsalud/seguridad/alimentos.html
>[Consulta 13 de dic. 2006].

VEGA., R. Comunidad Andina. (Bogot, Colombia, 2004) [en lnea]:


"Estrategias e instrumentos para mejorar la seguridad alimentaria en los
pases de la Comunidad Andina: Calidad e inocuidad de alimentos.
<http://www.comunidadandina.org/rural/doc_seguridad/cia.pdf>
[Consulta 13 de dic. 2006].

PELAYO., M. Tratamientos trmicos alternativos [En lnea].


<http://www.consumaseguridad.com/web/es/investigacion/2007/05/04/27
523.php> PELAYO. , M. FUNDACIN EROSKI. (Madrid, Espaa, 2007)
[Consulta 13 diciembre 2006].

72
ANEXO 1

Composicin del aceite esencial de M. mollis determinada por Chica, et al


2006.

No pico Compuestos Tr (min) IK DB-1 Cantidad


relativa (%)
1 -cimoneno 15.42 1015 0.6
2 -terpineno 16.58 1052 0.3
3 Linalool 17.61 1085 0.8
4 Acetato de octan-3-ilo 18.31 1108 0.3
5 Mentona 19.20 1138 12.2
6 Isomentona 19.46 1147 0.5
7 Mentol 19.69 1154 1.7
8 Pulegona 21.61 1219 15.9
9 trans-pulegol 21.91 1230 0.7
10 Acetato de mentilo 22.86 1264 1.2
11 Timol 22.97 1268 1.4
12 Carvacrol 23.26 1278 16.2
13 Trans-acetato de piperitilo* 24.51 1323 0.9
14 Acetato de timilo 24.62 1327 1.4
15 xido de piperitenona 24.86 1336 0.6
16 -elemeno 24.95 1340 0.3
17 Acetato de carvacrilo 25.16 1348 30.6
18 Acetato de geranilo 25.48 1360 1.0
19 trans--cariofileno 27.24 1427 7.6
20 -humuleno 28.06 1460 1.3
21 Biciclosesquifelandreno 28.69 1485 1.5
22 Biciclogermacreno 29.06 1500 2.4
Fuente: Chica, et al 2006.

73
ANEXO 2

Composicin del aceite esencial de M. mollis determinada por Alkire et al,


1993.

Componente Porcentaje (%)


-pineno 0.41 0.08
Sabineno 0.19 0.04
Limoneno 0.88 0.28
(E)--ocimeno 1.20 0.81
Isomentona 4.11 0.84
Acetato de isomentil 1.95 0.58
Neomentol 29.34 3.94
Mentol 20.55 3.33
Pulegona 0.80 0.30
Piperitona 8.96 1.65
-pineno 0.50 0.07
Mirceno 0.06 0
(Z)--ocimeno 0.71 0.11
Mentona 24.00 5.23
Acetato de neomentil 2.72 0.41
Acetato de mentil 0.09 0.02
-carofileno 2.55 0.99
-humuleno 0.37 0.23
Siginificado S.D (N 3-4)
Fuente: Alkire, et al 1993.

74
ANEXO 3

Formulacin de las diferentes salsas obtenidas.

Salsa nmero 1

Ingrediente Cantidad
Tomate 50 g
Cebolla 6.3 g
Ajo 0.8 g
Color 0.3 g
Agua 100 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 3.5 g
Sal 0.3g

Salsa nmero 2

Ingrediente Cantidad
Tomate 100.9 g
Cebolla 5.3 g
Ajo 0.8 g
Color 0.3 g
Agua 50 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 6.7 g
Sal 0.3 g

Salsa nmero 3

Ingrediente Cantidad
Tomate 100.5 g
Cebolla 5.1 g
Ajo 0.5 g
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 5.1 g
Sal 0.3g

75
Salsa nmero 4

Ingrediente Cantidad
Tomate 112.3 g
Cebolla 5.1 g
Ajo 0.5 g
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Sal 0.3g

Salsa nmero 5

Ingrediente Cantidad
Tomate 100.8 g
Azcar 3g
Cebolla 3g
Ajo 0.5 g
Color 0.1 g
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 6.9 g
Sal 0.3g

Salsa nmero 6

Ingrediente Cantidad
Tomate 100 g
Azcar 4g
Cebolla 3.2 g
Ajo 0.5 g
Color 0.1 g
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 7.3 g
Sal 0.3g

Salsa nmero 7

Ingrediente Cantidad
Tomate 70 g
Azcar 3g
Cebolla 2g
Ajo 0.2 g
Color 0.1 g

76
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 10 g
Sal 0.3g

Salsa nmero 8

Ingrediente Cantidad
Tomate 150 g
Azcar 4g
Cebolla 2.5 g
Ajo 0.2 g
Color 0.1 g
Agua 30 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 7g
Sal 0.3g

Salsa nmero 9

Ingrediente Cantidad
Tomate 100 g
Azcar 1g
Cebolla 3g
Ajo 0.4 g
Color 0.1 g
Agua 20 mL
Aceite 2 mL
Salsa de tomate 9g
Sal 0.3 g

Salsa nmero 11

Ingrediente Cantidad
Tomate 150 g
Cebolla 5g
Ajo 0.5 g
Agua 10 mL
Aceite 2 mL
Sal 0.3 g

77
ANEXO 10

COMPARACION DE MEDIAS POR TEMPERATURAS EN CALDO BHI PARA


B.cereus
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 126
----------------------------------------------------------------------------------------
Obs TEM TIM REP LOG
----------------------------------------------------------------------------------------
1 55 0 1 8.87
2 55 1 1 7.00
3 55 2 1 7.00
4 55 5 1 5.30
5 55 10 1 5.00
6 55 15 1 4.00
7 55 20 1 4.00
8 55 30 1 3.47
9 55 60 1 2.00
10 55 0 2 8.87
11 55 1 2 7.00
12 55 2 2 7.00
13 55 5 2 5.30

14 55 10 2 5.00
15 55 15 2 4.00
16 55 20 2 4.00
17 55 30 2 3.47
18 55 60 2 2.00
19 55 0 3 8.87
20 55 1 3 7.30
21 55 2 3 7.00
22 55 5 3 6.47
23 55 10 3 6.17
24 55 15 3 5.69
25 55 20 3 5.36
26 55 30 3 3.60
27 55 60 3 2.00
28 60 0 1 6.95
29 60 1 1 7.00
30 60 2 1 4.47
31 60 5 1 2.00
32 60 10 1 2.47
33 60 15 1 2.30
34 60 20 1 2.76
35 60 30 1 2.00
36 60 60 1 2.30
37 60 0 2 6.95
38 60 1 2 5.20
39 60 2 2 4.00
40 60 5 2 3.66
41 60 10 2 3.27
42 60 15 2 2.90
43 60 20 2 2.47
44 60 30 2 2.72
45 60 60 2 2.17
46 60 0 3 6.95
47 60 1 3 6.49
48 60 2 3 4.60
49 60 5 3 3.23
50 60 10 3 2.84
51 60 15 3 2.17
52 60 20 3 2.00
----------------------------------------------------------------------------------------

78
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 127
----------------------------------------------------------------------------------------
Obs TEM TIM REP LOG

53 60 30 3 2.95
54 60 60 3 2.00
55 70 0 1 6.23
56 70 1 1 5.90
57 70 2 1 4.30
58 70 5 1 3.69
59 70 10 1 3.39
60 70 15 1 2.30
61 70 20 1 2.07
62 70 30 1 1.90
63 70 60 1 1.47
64 70 0 2 6.23
65 70 1 2 5.00
66 70 2 2 4.60
67 70 5 2 3.77
68 70 10 2 3.14
69 70 15 2 3.00
70 70 20 2 2.83
71 70 30 2 2.82
72 70 60 2 2.00
73 70 0 3 6.23
74 70 1 3 5.30
75 70 2 3 4.30
76 70 5 3 3.00
77 70 10 3 3.30
78 70 15 3 3.00
79 70 20 3 3.00
80 70 30 3 1.00
81 70 60 3 1.00

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 128
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure
Class Level Information

Class Levels Values

TEM 3 55 60 70
TIM 9 0 1 2 5 10 15 20 30 60

Number of observations 81

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

The SAS System 22:14 Wednesday, October


13, 2007 129
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure

Dependent Variable: LOG

Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr

> F
Model 2 59.4546889 29.7273444 9.18
0.0003

79
Error 78 252.5620667 3.2379752

Corrected Total 80 312.0167556


----------------------------------------------------------------------------------------

R-Square Coeff Var Root MSE LOG Mean

0.190550 42.95360 1.799437 4.189259

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr


> F

TEM 2 59.45468889 29.72734444 9.18


0.0003

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr


> F

TEM 2 59.45468889 29.72734444 9.18


0.0003
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 130
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure

t Tests (LSD) for LOG


----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

80
ANEXO 11

COMPARACION DE MEDIAS POR TEMPERATURAS EN SALSA PARA


B.cereus
----------------------------------------------------------------------------------------
--------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
----------------------------------------------------------------------------------------

13, 2007 131 Obs TEM TIM REP LOG


----------------------------------------------------------------------------------------
1 55 0 1 6.39
2 55 1 1 5.00
3 55 2 1 4.07
4 55 5 1 3.60
5 55 10 1 3.20
6 55 15 1 2.47
7 55 20 1 2.30
8 55 30 1 1.00
9 55 60 1 0.00
10 55 0 2 6.39
11 55 1 2 5.00
12 55 2 2 4.32
13 55 5 2 3.60
14 55 10 2 3.20
15 55 15 2 2.60
16 55 20 2 2.47
17 55 30 2 1.00
18 55 60 2 0.00
19 55 0 3 6.39
20 55 1 3 5.30
21 55 2 3 5.07
22 55 5 3 4.04
23 55 10 3 3.23
24 55 15 3 2.95
25 55 20 3 2.47
26 55 30 3 1.00
27 55 60 3 0.00
28 60 0 1 6.77
29 60 1 1 5.77
30 60 2 1 5.49
31 60 5 1 3.90
32 60 10 1 3.60
33 60 15 1 2.11
34 60 20 1 1.69
35 60 30 1 1.30
36 60 60 1 0.00
37 60 0 2 6.77
38 60 1 2 5.30
39 60 2 2 4.95
40 60 5 2 3.77
41 60 10 2 3.60
42 60 15 2 3.30
43 60 20 2 1.60
44 60 30 2 1.47
45 60 60 2 0.00
46 60 0 3 6.77
47 60 1 3 4.60
48 60 2 3 3.90
49 60 5 3 3.60
50 60 10 3 3.60
51 60 15 3 2.14
52 60 20 3 1.77
----------------------------------------------------------------------------------------

81
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 132
----------------------------------------------------------------------------------------
Obs TEM TIM REP LOG

53 60 30 3 1.60
54 60 60 3 0.00
55 70 0 1 6.23
56 70 1 1 6.07
57 70 2 1 5.30
58 70 5 1 4.69
59 70 10 1 4.39
60 70 15 1 3.78
61 70 20 1 3.60
62 70 30 1 2.07
63 70 60 1 2.00
64 70 0 2 6.23
65 70 1 2 5.00
66 70 2 2 4.60
67 70 5 2 3.77
68 70 10 2 3.47
69 70 15 2 3.00
70 70 20 2 2.83
71 70 30 2 1.30
72 70 60 2 1.00
73 70 0 3 6.23
74 70 1 3 5.30
75 70 2 3 4.30
76 70 5 3 3.95
77 70 10 3 3.85
78 70 15 3 3.60
79 70 20 3 2.77
80 70 30 3 2.34
81 70 60 3 1.00
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 133
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure

Class Level Information


Class Levels Values

TEM 3 55 60 70

TIM 9 0 1 2 5 10 15 20 30 60

Number of observations 81
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 134
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure

Dependent Variable: LOG

Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr
> F

Model 2 5.2580025 2.6290012 0.76


0.4716

Error 78 270.2211852 3.4643742

Corrected Total 80 275.4791877

82
R-Square Coeff Var Root MSE LOG Mean

0.019087 54.01789 1.861283 3.445679

---------------------------------------------------------------------------------------

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr


> F

TEM 2 5.25800247 2.62900123 0.76


0.4716

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr


> F

TEM 2 5.25800247 2.62900123 0.76


0.4716

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

The SAS System 22:14 Wednesday, October


13, 2007 135
The GLM Procedure

t Tests (LSD) for LOG

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.

83
ANEXO 12

COMPARACION DE MEDIAS POR TEMPERATURAS EN BHI PARA


L.monocytogenes
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 07:11 Thursday, October
14, 2007 1
----------------------------------------------------------------------------------------
Obs TEM TIM REP LOG
1 52 0 1 8.47
2 52 1 1 8.30
3 52 2 1 8.00
4 52 5 1 7.47
5 52 10 1 8.00
6 52 15 1 7.47
7 52 20 1 7.00
8 52 30 1 6.77
9 52 60 1 0.00
10 52 0 2 8.47
11 52 1 2 8.36
12 52 2 2 8.30
13 52 5 2 8.60
14 52 10 2 8.00
15 52 15 2 7.60
16 52 20 2 7.04
17 52 30 2 6.00
18 52 60 2 0.00
19 52 0 3 8.47
20 52 1 3 8.36
21 52 2 3 8.00
22 52 5 3 8.50
23 52 10 3 8.00
24 52 15 3 7.47
25 52 20 3 7.00
26 52 30 3 6.77
27 52 60 3 5.47
28 55 0 1 9.10
29 55 1 1 9.39
30 55 2 1 8.72
31 55 5 1 7.47
32 55 10 1 6.00
33 55 15 1 0.00
34 55 20 1 0.00
35 55 30 1 0.00
36 55 60 1 0.00
37 55 0 2 9.10
38 55 1 2 9.30
39 55 2 2 8.90
40 55 5 2 7.60
41 55 10 2 6.69
42 55 15 2 5.60
43 55 20 2 5.00
44 55 30 2 0.00
45 55 60 2 0.00
46 55 0 3 9.10
47 55 1 3 9.00
48 55 2 3 8.47
49 55 5 3 8.32
50 55 10 3 7.69
51 55 15 3 7.60
52 55 20 3 7.38
----------------------------------------------------------------------------------------

84
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 07:11 Thursday, October
14, 2007 2
----------------------------------------------------------------------------------------
Obs TEM TIM REP LOG
----------------------------------------------------------------------------------------
53 55 30 3 6.00
54 55 60 3 0.00
55 57 0 1 9.84
56 57 1 1 9.00
57 57 2 1 9.00
58 57 5 1 8.69
59 57 10 1 8.00
60 57 15 1 8.32
61 57 20 1 7.49
62 57 30 1 6.00
63 57 60 1 6.00
64 57 0 2 9.84
65 57 1 2 9.69
66 57 2 2 9.69
67 57 5 2 9.47
68 57 10 2 8.77
69 57 15 2 8.60
70 57 20 2 7.20
71 57 30 2 6.00
72 57 60 2 6.00
73 57 0 3 9.84
74 57 1 3 9.30
75 57 2 3 8.95
76 57 5 3 8.60
77 57 10 3 8.30
78 57 15 3 8.23
79 57 20 3 6.77
80 57 30 3 6.00
81 57 60 3 0.00

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 07:11 Thursday, October
14, 2007 3
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure

Class Level Information

Class Levels Values


TEM 3 52 55 57

TIM 9 0 1 2 5 10 15 20 30 60

Number of observations 81

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

The SAS System 07:11 Thursday, October


14, 2007 4
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure

Dependent Variable: LOG

Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr
> F

Model 2 61.6736691 30.8368346 4.09


0.0205

Error 78 588.4203778 7.5438510

85
Corrected Total 80 650.0940469

----------------------------------------------------------------------------------------

R-Square Coeff Var Root MSE LOG Mean

0.094869 39.59267 2.746607 6.937160

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr


> F

TEM 2 61.67366914 30.83683457 4.09


0.0205

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr


> F

TEM 2 61.67366914 30.83683457 4.09


0.0205
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

The SAS System 07:11 Thursday, October


14, 2007 5

The GLM Procedure


t Tests (LSD) for LOG

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.

86
ANEXO 13

COMPARACION DE MEDIAS POR TEMPERATURAS EN SALSA PARA


L.monocytogenes
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

The SAS System 22:14 Wednesday, October


13, 2007 131
----------------------------------------------------------------------------------------
Obs TEM TIM REP LOG
----------------------------------------------------------------------------------------
1 55 0 1 6.39
2 55 1 1 5.00
3 55 2 1 4.07
4 55 5 1 3.60
5 55 10 1 3.20
6 55 15 1 2.47
7 55 20 1 2.30
8 55 30 1 1.00
9 55 60 1 0.00
10 55 0 2 6.39
11 55 1 2 5.00
12 55 2 2 4.32
13 55 5 2 3.60
14 55 10 2 3.20
15 55 15 2 2.60
16 55 20 2 2.47
17 55 30 2 1.00
18 55 60 2 0.00
19 55 0 3 6.39
20 55 1 3 5.30
21 55 2 3 5.07
22 55 5 3 4.04
23 55 10 3 3.23
24 55 15 3 2.95
25 55 20 3 2.47
26 55 30 3 1.00
27 55 60 3 0.00
28 60 0 1 6.77
29 60 1 1 5.77
30 60 2 1 5.49
31 60 5 1 3.90
32 60 10 1 3.60
33 60 15 1 2.11
34 60 20 1 1.69
35 60 30 1 1.30
36 60 60 1 0.00
37 60 0 2 6.77
38 60 1 2 5.30
39 60 2 2 4.95
40 60 5 2 3.77
41 60 10 2 3.60
42 60 15 2 3.30
43 60 20 2 1.60
44 60 30 2 1.47
45 60 60 2 0.00
46 60 0 3 6.77
47 60 1 3 4.60
48 60 2 3 3.90
49 60 5 3 3.60
50 60 10 3 3.60
51 60 15 3 2.14
52 60 20 3 1.77
----------------------------------------------------------------------------------------

87
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 132
----------------------------------------------------------------------------------------
Obs TEM TIM REP LOG
----------------------------------------------------------------------------------------
53 60 30 3 1.60
54 60 60 3 0.00
55 70 0 1 6.23
56 70 1 1 6.07
57 70 2 1 5.30
58 70 5 1 4.69
59 70 10 1 4.39
60 70 15 1 3.78
61 70 20 1 3.60
62 70 30 1 2.07
63 70 60 1 2.00
64 70 0 2 6.23
65 70 1 2 5.00
66 70 2 2 4.60
67 70 5 2 3.77
68 70 10 2 3.47
69 70 15 2 3.00
70 70 20 2 2.83
71 70 30 2 1.30
72 70 60 2 1.00
73 70 0 3 6.23
74 70 1 3 5.30
75 70 2 3 4.30
76 70 5 3 3.95
77 70 10 3 3.85
78 70 15 3 3.60
79 70 20 3 2.77
80 70 30 3 2.34
81 70 60 3 1.00
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------
The SAS System 22:14 Wednesday, October
13, 2007 133
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure

Class Level Information


Class Levels Values

TEM 3 55 60 70

TIM 9 0 1 2 5 10 15 20 30 60

Number of observations 81
----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

The SAS System 22:14 Wednesday, October


13, 2007 134
----------------------------------------------------------------------------------------
The GLM Procedure
Dependent Variable: LOG

Sum of
Source DF Squares Mean Square F Value Pr
> F

Model 2 5.2580025 2.6290012 0.76


0.4716

Error 78 270.2211852 3.4643742

Corrected Total 80 275.4791877

88
----------------------------------------------------------------------------------------
R-Square Coeff Var Root MSE LOG Mean

0.019087 54.01789 1.861283 3.445679

Source DF Type I SS Mean Square F Value Pr


> F

TEM 2 5.25800247 2.62900123 0.76


0.4716

Source DF Type III SS Mean Square F Value Pr


> F

TEM 2 5.25800247 2.62900123 0.76


0.4716

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

The SAS System 22:14 Wednesday, October


13, 2007 135
The GLM Procedure

t Tests (LSD) for LOG


----------------------------------------------------------------------------------------
----------------------------------------------------------------------------------------

NOTE: This test controls the Type I comparisonwise error rate, not the experimentwise
error rate.

89
ANEXO 8

MEDIOS DE CULTIVO

Composicin del Agar Oxford

Polipeptona 20.0
Extracto de levadura 3.0
Almidn 1.0
Cloruro sdico 5.0
Citrato frrico amoniacal 0.5
Esculina 1.0
Cloruro de litio 15
Agar bacteriolgico 13

Composicin caldo BHI

Extracto de cerebro 12.5


Extracto de corazn 5.0
Proteosa peptona 10
Cloruro sdico 5.0
Fosfato disdico 2.5
D (+) Glucosa 2.0

90