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Programa y contenidos.

Prctica 1: Introduccin a la microscopa ptica


Facultad de Ciencias Manejo del microscopio de campo claro

Universidade da Corua Prctica 2: Estudio de bacterias y hongos


A. Tincin y observacin de bacterias (Procariota)
B. Observacin de hongos (Fungi): levaduras y mohos

Prctica 3: Estudio de protozoarios (Protista) y clulas animales


A. Cultivo y observacin de Protozoarios (Protista) dulceacucolas a partir de
infusiones y cultivos.
Prcticas de B. Estudio de la endocitosis y digestin intracelular, osmoregulacin y
quimiotactismo en paramecios.
C. Observacin de clulas animales (Tincin de la mucosa bucal humana).
Laboratorio de
Prctica 4: Estudio de clulas vegetales
A. Observacin de clulas vegetales (epidermis de cebolla).
BIOLOGA B. Estudio de los fenmenos de plasmlisis y turgencia.

CELULAR Prctica 5: Observacin de estructuras subcelulares vegetales


A. Observacin de plastos (cloroplastos, cromoplastos y amiloplastos).
B. Observacin de cristales de oxalato en clulas vegetales.
1 Grado Biologa
Prctica 6: Fraccionamiento celular
A. Determinacin de las velocidades de centrifugacin requeridas para el
fraccionamiento celular
B. Aislamiento y observacin de la fraccin cloroplstica
C. Aislamiento y observacin de la fraccin nuclear y mitocondrial

Alumna/o:
Prctica 7: Estudio de los cromosomas y la mitosis
A. Estudio de la mitosis en tejidos vegetales.
B. Observacin de cromosomas gigantes de Drosophila.

Prctica 8: Tincin y estudio de las clulas sanguneas

Prctica 9: Introduccin a la microscopa electrnica

Cuestiones relativas a las prcticas


Anexo i. Reactivos y disoluciones qumicas empleadas
Julin Yez Snchez (para uso exclusivo del curso) Anexo II
Prctica 1. INTRODUCCIN A LA MICROSCOPA PTICA

B- Un sistema mecnico, constituido por:


El microscopio ptico compuesto emplea la luz visible para crear una imagen
aumentada de la muestra a observar. Est formado por: o SOPORTE: Mantiene la parte ptica. Tiene dos partes: el
pie o base y el brazo.
o PLATINA: Lugar o superficie donde se mantiene la
A- Un sistema ptico, constituido por:
preparacin. Cuenta con mandos coaxiales para el
desplazamiento de la preparacin en el eje XY y con una
o OCULAR: Lente situada cerca del ojo del observador. Ampla o magnifica la imagen escala milimetrada para determinar la posicin de la
captada por el objetivo. preparacin en cada momento
o OBJETIVO: Lente situada cerca de la preparacin. Recoge las interacciones de la luz o CABEZAL: Contiene los sistemas de lentes oculares.
al atravesar el objeto y ampla la imagen (el resultado de dicha interaccin) de Puede ser monocular, binocular,...
sta. Es la lente responsable de la resolucin y por tanto de la calidad del o REVLVER: Contiene los sistemas de lentes objetivos.
microscopio. Permite, al girar, cambiar los objetivos.
o CONDENSADOR: Lente que concentra los rayos luminosos sobre el objeto de la o TORNILLOS DE ENFOQUE: Macromtrico que aproxima
preparacin. el enfoque y micromtrico que consigue un enfoque ms
o DIAFRAGMA o IRIS: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador. Cuanto preciso.
ms cerrado est, mayor contraste. Demasiado cerrado puede provocar
prdida de resolucin.
o FOCO: Dirige los rayos luminosos de una fuente de luz halgena hacia el
condensador.

Tcnicas de observacin microscpica


Existen diferentes tcnicas de observacin microscpica. Las imgenes de un mismo
objeto que podemos observar con un microscopio ptico de luz transmitida que atraviesa la
muestra, pueden ser diferentes dependiendo del modo en que hagamos interaccionar la luz
con el objeto o en algunos casos segn las caractersticas de la luz (microscopa de luz
polarizada, de fluorescencia). As tenemos imgenes de campo claro (A), de contraste de
fases (B), de contraste de interferencia diferencial o DIC (C), campo oscuro (D)
MANEJO DEL MICROSCOPIO PTICO DE CAMPO CLARO e. Enfocar con el tornillo micromtrico. Procurar evitar cambiar al objetivo de 40X
para evitar que ste se manche con el aceite de inmersin.
1. Colocar el objetivo de menor aumento (X4) en posicin de empleo con la platina baja.
f. Una vez finalizada la observacin, colocar el objetivo de menor aumento (x4)
2. Colocar la preparacin sobre la platina sujetndola con las pinzas metlicas. girando el revlver. Retirar la preparacin de la platina.

3. Comenzar siempre la observacin con el objetivo de X4. g. Bajar la platina si fuera necesario y limpiar el objetivo de inmersin empleando
primero papel seco para absorber el exceso de aceite y finalmente con papel
4. Para realizar el enfoque: humedecido en alcohol. Comprobar que el objetivo 40x est perfectamente
limpio.
a. acercar la platina con la preparacin a la lente frontal del objetivo, empleando el
tornillo macromtrico hasta que comience a verse una imagen aunque sea La iluminacin Khler
borrosa. La distancia de trabajo del objetivo de X4 es grande por lo que no
debera empezar a enfocarse con la muestra muy prxima al objetivo. El objeto de la iluminacin Khler consiste en conseguir el mayor poder de resolucin del
microscopio. Con esta tcnica trataremos de optimizar el alineamiento del sistema de
b. cuando se observe algo ntida la muestra, girar el mando micromtrico hasta
obtener un enfoque fino. iluminacin con la va ptica y asegurar que la luz est bien centrada y enfocada sobre la
muestra, evitando la interferencia de posibles rayos refractados. Para ello ajustaremos la
5. Pasar al siguiente objetivo. Si el microscopio es parafocal, la imagen debera estar casi
altura y la apertura del condensador
enfocada y simplemente tendremos que mover un poco el micromtrico para lograr el
enfoque fino. Si al cambiar de objetivos se pierde por completo el foco de la imagen, es Los microscopios ms completos suelen tener dos diafragmas: Un diafragma de campo
preferible volver a enfocar con el objetivo anterior y repetir la operacin desde el paso 3.
situado a nivel de la lmpara y un diafragma de apertura o iris, situado debajo del
6. Toma de coordenadas: los sistemas de coordenadas van asociados a los sistemas de condensador. Si su microscopio no tiene diafragma de campo, el mtodo para optimizar la
arrastre de la platina (escuadra y pinza) y estn dotados de regletas milimetradas en las iluminacin sera,
que los nmeros de las abscisas y ordenadas no son coincidentes para evitar
equivocaciones.
a. enfoque una muestra cualquiera con un objetivo de bajo aumento. Una vez enfocada
Como ejercicio prctico, localice algn punto la muestra no es preciso volver a mover los tornillos de enfoque
de inters de la muestra y determine sus
b. cierre el diafragma de apertura o iris hasta ver sus lmites polidricos
coordenadas con ayuda de las escalas
milimetradas de la platina. Como ejercicio, c. centre el campo del iris con los tornillos del condensador, si los tuviera.

pruebe anotando las coordenadas XY de un d. enfoque el campo del diafragma subiendo o bajando el condensador hasta que vea los
punto concreto de la preparacin. Quite la bordes del iris ntidos. Tanto la muestra como el iris deben estar ambos simultneamente
enfocados.
muestra y, despus de modificar la posicin de la platina, vuelva a colocar la muestra e
intente localizar el punto de observacin ajustando los sistemas de arrastre de la platina a E. abra el iris hasta que su borde llegue al borde del campo de visin y vuelva a ajustar
la altura del condensador si fuera necesario. Esa ser la posicin (altura) correcta del
las coordenadas anotadas anteriormente. condensador.

7. Empleo del objetivo de inmersin: si el sistema de objetivos es parafocal, enfocar En general no es preciso ajustar la posicin del condensador para cada objetivo, pero s el
previamente la muestra con el objetivo de menor aumento (x40) contraste con el diafragma de apertura. El punto de contraste ptimo con la menor prdida

a. Girar el revlver hacia el objetivo de inmersin dejndolo a medio camino entre de resolucin se consigue cerrando el iris hasta el punto en que sea patente una disminucin
ste y el de X40. de la intensidad de la iluminacin del campo de observacin. La intensidad de la iluminacin

b. Colocar una gota de aceite de inmersin en la muestra sobre el campo iluminado. debe ajustarse con el potencimetro de la fuente de luz o con filtros, no con el iris.

c. Terminar de girar suavemente el revlver hasta la posicin del objetivo de


inmersin (X100).

d. Mirando directamente al objetivo, subir la platina lentamente hasta que la lente


toca la gota de aceite y se adosa a ella (en muchos casos no hace falta)
Prctica 2. ESTUDIO DE BACTERIAS Y HONGOS Observacin al microscopio

A. Tincin y observacin de bacterias

Introduccin
El yogur es un producto derivado de la leche; se obtiene inoculando generalmente
Streptococcus thermophilus y Lactobacillus bulgaricus a la leche pasteurizada y
homogeneizada. El cultivo se somete a incubacin durante 2 3 horas a una temperatura de
43-45 C. Streptococcus thermophilus es responsable de la acidificacin de la leche y es una
bacteria homofermentativa, es decir, que produce exclusivamente cido lctico como
producto de desecho resultado de la fermentacin de la glucosa. sta provoca un
incremento de la acidez haciendo que las protenas de la leche precipiten, formando un gel.
La mayor acidez (pH 4-5) tambin evita la proliferacin de otras bacterias potencialmente
patgenas.

Material

Yogur Aguja de siembra o palillo dental


Mechero de alcohol Glicerina
Azul de metileno Portaobjetos
Alcohol Cubreobjetos

Procedimiento
1. Con la aguja de siembra (o palillo) tomar una pequea cantidad de yogur y depositarla en
el portaobjetos. Incorporar una gota de agua, remover para obtener una solucin uniforme y
realizar la extensin.
2. Secar a la llama del mechero.
3. Depositar la preparacin sobre el soporte de tincin y lavar con
agua destilada.
4. Cubrir con alcohol totalmente el frotis y dejar actuar durante unos
segundos a fin de que se disuelva la grasa del yogur. Transcurridos
stos, escurrir el exceso de alcohol y dejar secar al aire.
5. Teir con azul de metileno durante 10 minutos. Lavar con agua
destilada. Dejar secar la extensin al aire.
6. Depositar una gota de glicerina sobre la preparacin y cubrir con
un cubreobjetos. Observar al microscopio.
B. Observacin de hongos (Fungi): levaduras y mohos Observacin al microscopio
Dibujar algunas de las clulas observadas. Describir los resultados

Introduccin
Las levaduras y mohos son hongos cuyo aparato vegetativo est constituido por un micelio
ramificado, sin forma definida, denominado talo. Este micelio da origen a una fructificacin
de forma definida, que no procede de una flor, como la que se observa en otros vegetales.
Estas fructificaciones producen esporas que son diseminadas y originan de nuevo otros
micelios.
Levaduras
Introduccin
La levadura de cerveza, Saccharomyces cerevisiae, utilizado industrialmente en la
fabricacin de cerveza, pan y vino, es un ascomiceto. Esta levadura es considerada el cultivo
ms antiguo realizado por el hombre y constituye el origen de la biotecnologa. Observada a
gran aumento, presenta el aspecto de
elementos ovoides de pocas micras. Cada
uno de los elementos es un hongo formado
por una sola clula. Cuando las condiciones
nutritivas son favorables, la levadura se
reproduce por gemacin (reproduccin
asexual); pero cuando el alimento empieza a
escasear, una clula se convierte, tras una
serie de complicados fenmenos internos, en
un asca que da lugar a 4 u 8 ascosporas
(reproduccin sexual).

Material

Levadura de cerveza Placa Petri


Azul de metileno Portaobjetos y cubreobjetos
Mechero de alcohol Agua destilada

Procedimiento
1. Tomar un poco de levadura y depositarla en la placa Petri, en
la que previamente se habr puesto agua con sacarosa.

2. Tomar unas gotas del cultivo y extenderlas sobre el


portaobjetos. Fijar suavemente a la llama.

3. Teir con azul de metileno durante 15 minutos.

4. Lavar con agua destilada y cubrir con el cubreobjetos.


Mohos
Observacin al microscopio

Introduccin Dibujar algunas de las clulas observadas. Describir los resultados


El tipo de hongos microscpicos denominado mohos se reproduce por esporas, las cuales
son transportadas principalmente por el viento; cuando encuentran un medio adecuado,
germinan y se desarrollan originando un micelio. Rpidamente forman estructuras
reproductoras (esporangiforos) que producen nuevas esporas, cerrndose as el ciclo.
Los Aspergillus y los Penicillium forman los mohos verdes, muy comunes.

El moho del pan es un moho blanco, tras su germinacin, pero se convierte en negruzco
ms tarde y si se le toca deja una especie de polvo negro. Est constituido por un denso
fieltro de filamentos que discurren por la superficie
del pedazo de pan y que constituyen la porcin
vegetativa del hongo. Estos filamentos son tubos
continuos, no habiendo tabicacin. De trecho en
trecho, unas pequeas prolongaciones se hunden
en el pan: son manojos de rizoides. Los pequeos
puntos oscuros son los cuerpos fructferos, o
esporangios, desde donde se liberan las esporas.
Este hongo recibe el nombre de Rhizopus nigricans.

Material

Pan y/o cscaras de frutas Palillos


Agua destilada Portaobjetos y cubreobjetos

Procedimiento
Tomar de un trozo de pan o cscaras de frutas (en los que se haya desarrollado el moho)
una pequea porcin de moho. Colocarlo sobre un portaobjetos con una gota de agua, cubrir
con el cubreobjetos y observar al microscopio.
Prctica 3. ESTUDIO DE PROTOZOARIOS Y CLULAS ANIMALES
Material

A. Observacin de Protozoarios (Protista) dulceacucolas a partir de Placas de cultivo o cristalizador Portaobjetos normales o excavados
infusiones y cultivos Cuentagotas Cubreobjetos
Solucin de metilcelulosa (1,5%) Azul de metileno y rojo neutro

La palabra protozoario significa "pequeo animal". Son llamados as porque muchas


Procedimiento
especies se comportan de manera semejante a animales minsculos. Son organismos
1) Tcnica: infusiones y medios de cultivo
microscpicos, unicelulares eucariticos; hetertrofos, fagtrofos, depredadores o
Para el cultivo primario, se introduce en un recipiente con 250 ml de agua, hojas, hierba o
detritvoros, a veces mixtrofos (parcialmente auttrofos); que viven en ambientes hmedos
materia vegetal. El agua, si es natural de una charca debe hervirse previamente unos 10
o directamente en medios acuticos, ya sean aguas saladas o aguas dulces. Su cuerpo est
minutos, y mejor si lleva algo de paja durante la ebullicin ya que sta liberar nutrientes
formado por una sola clula o por una colonia de clulas
para el crecimiento bacteriano. Si el agua es del grifo, debe dejarse en un recipiente abierto
iguales entre s, es decir, aunque son unicelulares deben
durante un da para que pierda el cloro. La infusin de agua y materia vegetal se deja en un
reconocerse como organismos completos en cuyas
lugar moderadamente iluminado (no directamente al sol) durante unos 7-15 das. A partir de
estructuras se llevan a cabo todas las funciones propias
este cultivo primario (o bien de una charca, un estanque, agua de un florero o del filtro de un
de animales multicelulares. Se reproducen por mitosis.
acuario), puede tomarse algunas muestras de la superficie y del fondo del recipiente y
Cada clula da lugar a dos clulas hijas. A veces pueden
transferirlas a nuevos medios de cultivo (cultivos secundarios). Los medios para los cultivos
intercambiar material gentico. Se clasifican segn su
secundarios, se prepararn dejando al menos dos das en recipientes cubiertos con una tapa
capacidad de movimiento.
a temperatura ambiente (20-21C) y con luz baja o moderada, 250 ml de agua corriente
Los protozoarios son primariamente acuticos y viven en
(hervida y/o desclorada) suplementada con: restos vegetales (A), 12-13 granos de trigo (B) o
el agua dulce o salada, en pequeas lagunas o en los ocanos. Algunos viven en el suelo
de arroz (C), 60 mg de yema de huevo cocida (D), una pizca de leche desnatada en polvo
hmedo arrastrndose en la capa de agua que rodea a cada partcula del suelo. Los
(E), 2g de levadura seca (F), otras (2 pellets o bolitas de pienso para conejos/litro,), o
protozoarios parsitos se pueden encontrar en sangre y lquidos tisulares de plantas.
incluso combinaciones de las anteriores. Diferentes microorganismos se desarrollarn mejor
Algunos protozoarios se impulsan agitando estructuras llamados flagelos o cilios en un
en unos medios de cultivos que en otros. As, para ciliados en general use cualquiera de las
patrn rtmico similar al que produciran muchos minsculos remos.
soluciones descritas; los Paramecium se dan bien en A, D y E; Los Flagelados se cultivan
Aunque lo protozoarios carecen de sistema nervioso, tienen orgnulos conductores, como el
con xito en B y D; Amoeba o Paramecium bursaria, se desarrollan mejor en la C; Stentor se
cuerpo basal y el sistema de neurofibrillas. El cuerpo basal estimula y controla el movimiento
cultiva tanto en la solucin C, como tambin en B y D; Vorticella se cultiva mejor en la
del flagelo o del cilio al cual est unido. Muchos flagelados tienen orgnulos fotosensibles
solucin D; para Blepharisma pruebe con la solucin B o C,
asociados con los orgnulos conductores y locomotores.
Se conocen unas 25.000 especies de protozoarios, de los cuales sobre una treintena son
2) Montaje:
parsitos patgenos de humanos.
Para ralentizar mecnicamente el movimiento de los protozoos pueden usarse mtodos
Pueden clasificarse en cinco grupos segn su forma de locomocin:
fsicos como colocar en el portaobjetos unas 4-5 fibras cortas de algodn antes de depositar
Mastigophora o flagelados: tienen uno o ms flagelos parecidos a ltigos.
la gota de la muestra. Tambin pueden inmovilizarse muchos de ellos sin alterar su forma
Sarcodina: tienen seudpodos. Incluye a las amebas y los radiolarios, que son marinos.
aadiendo una gota de acetato de cobre (3%) o sulfato de cobre (1%). Nosotros aplicaremos
Ciliados: muchos cilios cortos. Incluye a los paramecios.
un mtodo qumico (basado en Stiles & Hawkins, 1947) que utiliza un polmero
Suctoria: Cuando son jvenes presentan cilios, pero luego desarrollan tentculos.
osmticamente neutro, la metilcelulosa.
Sporozoa: parsitos que carecen de estructura locomotora. Se reproducen por divisin
mltiple.
Se realizarn tres muestras. Se toman tres gotas de la infusin con la pipeta (deben tomarse
de la superficie sin revolver mucho) y se coloca cada una de ellas en el centro de un
portaobjetos, al lado de la gota de metilcelulosa (1,5%).

a- A una de las muestras se le coloca directamente un cubreobjetos.


b- A la segunda muestra se le aade una gota de solucin acuosa de rojo neutro
(0,01%-0,001%), que permite una tincin vital, se monta con el cubreobjetos.
c- La tercera muestra se teir con solucin acuosa de azul de metileno (0,05%),
depositando una gota del colorante y montando el cubreobjetos.
Observar las tres muestras al microscopio
Para evitar la desecacin en observaciones largas, puede rodear la gota de la muestra con
un anillo de vaselina depositado con una jeringuilla antes de colocar el cubreobjetos.

Sucesin de protistas. Observe los cultivos (especialmente el primario de restos vegetales y


heno) dos o tres veces por semana durante 2-3 semanas y analice los cambios en la
diversidad y densidad relativa de las especies que encuentre, contabilizando por ejemplo el
numero medio de individuos en un campo visual a bajo o alto aumento.

Observacin al microscopio
Dibujar algunas de las clulas observadas y describir los resultados de las tres
preparaciones realizadas
Qu estructuras aparecen teidas y de qu color? Qu diferencias observa entre las tres
muestras?
B. Estudio de la digestin intracelular, osmoregulacin y
quimiotactismo en paramecios Material

Los paramecios son organismos hetertrofos unicelulares Cultivo de paramecios Solucin de Metilcelulosa (3%)
inicialmente clasificados en el reino Protista. La clasificacin Levadura seca Agua de mar (o solucin de NaCl 3%)
actual los ubica dentro de ciliados que junto a los Dinoflagelados Rojo Congo Jeringuilla y cuentagotas
y los Apicomplexa (Plasmodium, Toxoplasma,) forman el grupo Azul de Metileno 0,1% Portaobjetos y cubreobjetos
eucaritico de los Alveolata. Los paramecios engloban a 14
especies con un tamao comprendido entre 0,3-0,5 micras son
de los protozoos ciliados ms conocidos. Algunas especies (P.
Procedimientos
bursaria, P. chlorelligerum) pueden vivir en simbiosis
Cultivo de paramecios (debe prepararse 1 o 2 semanas antes del experimento)
(mutualismo) con algas verdes unicelulares (zooclorelas) libres
Tome 4-5g de arroz y 5-6 ramas de heno y hirvalas durante 10 minutos en 100ml de agua
en el citoplasma o ancladas a su membrana plasmtica.
corriente. Transfiera a las placas de cultivo y cbralas. Djelas as 3-4 das para que se
Los paramecios, adems de estar rodeados por miles de cilios
desarrolle un rico cultivo bacteriano. Transfiera el medio a botellas e inocule 2-3 gotas de
simples, como caractersticas peculiares destacan la presencia
algunos paramecios procedentes bien de fuentes naturales (canales, acequias o estanques
de dos ncleos: un macroncleo poliploide que controla las
ricos en materia vegetal en degradacin) o de concentrados obtenidos comercialmente. (Ver
funciones metablicas no reproductivas y un microncleo
cultivo alternativo en Anexo I)
diploide implicado en la reproduccin. Suelen reproducirse
asexualmente por fisin binaria o mitosis generando clones. Los
Suspensin de levaduras teidas
macroncleos se dividen por amitosis, sin condensacin de los
Para la suspensin de levaduras teidas, mezcle 10g de levadura seca en 30ml de agua y
cromosomas y sin participacin de fibras del huso. Tambin
0,1gr de rojo Congo y mantenga en ebullicin durante 10 minutos con agitacin. Enfriar y
presentan un proceso particular de sexualidad a travs del
mantener la suspensin refrigerada (tambin podra mantenerse congelada durante tiempo
mecanismo de conjugacin previa a la mitosis, generando
indefinido). El rojo Congo es un colorante cuyo color depende del pH, por tanto acta como
descendencia con nuevas combinaciones gnicas (reproduccin
un indicador de pH.
sexual). Otra caracterstica es la presencia de una zona
forma cida zona de viraje forma bsica
particular de la membrana llamada citostoma por el que captura las partculas orgnicas y Colores del Rojo Congo pH 3.0 a pH 5.2
pH 2zul pH 7
organismos menores (bacterias, algas levaduras) que le sirven de alimento y lo conduce
hacia la regin de membrana en la que ser endocitado. Asimismo la clula presenta otra
1) Montaje para el estudio de la endocitosis y digestin intracelular
regin particular de la membrana donde son exocitados los productos de deshecho llamada
1. Con una jeringuilla delimite una circunferencia de metil-celulosa en un portaobjetos
citoprocto o poro anal. Bajo la membrana presenta unos orgnulos baciliformes
con un dimetro siempre menor que el lado del cubreobjetos que vaya a utilizar. Coloque
denominados tricocistos, situados en hileras y que se disparan tanto para la captura de
una gota del cultivo de paramecios en el centro del anillo.
presas como para la defensa. Tambin es caracterstica la presencia de dos vacuolas
2. Aada una gota de la suspensin de levaduras teidas y cubrir con un cubreobjetos.
contrctiles implicadas en la osmoregulacin. En esta prctica analizaremos la endocitosis y
Enfocar y observar en el microscopio con el objetivo de X40 tan pronto como sea posible
digestin intracelular, la osmoregulacin por vacuolas contrctiles y la descarga de
ya que las primeras endocitosis pueden empezar a tener lugar a los 10 segundos.
tricocistos por quimiotactismo.
Probablemente tenga que ajustar continuamente el enfoque y la iluminacin a lo largo de
proceso de observacin.
Observacin al microscopio 2) Montaje para el estudio del control de la osmoregulacin.
Examine el surco oral y observe la formacin de las vesculas de endocitosis.
Observe el movimiento o ciclosis de las vesculas en el citoplasma y la regin del poro anal. 1. Realice un montaje de una gota del cultivo de paramecios inmovilizados con metilcelulosa
Dibuje el curso y describa los cambios producidos en las vesculas (tamao, coloracin de (o pasta de metilcelulosa al 10%).
las levaduras) a 1, 5, 10, 15, 20 y 30 minutos tras la ingestin. Razonar las posibles causas 2. Aumente el contraste cerrando el diafragma de apertura y observe las vacuolas
de dichos cambios y complete las cuestiones planteadas a continuacin contrctiles alimentadas por un sistema radial de canales y que se vacan rpidamente por
contraccin de las vesculas cuando estn llenas. Anote el nmero o frecuencia de
Cul de los siguientes grficos se ajusta a los cambios de pH observados durante la pulsaciones por minuto.
digestin en la vacuola digestiva? 3 (opcional). Determine si el carcter cido o alcalino del contenido de la vacuola contrctil
aadiendo una gota de rojo fenol. El colorante acta como un indicador, siendo amarillo en
medio cido y rojo/violeta en medio alcalino (ver anexo).
A B
4. Repita la misma operacin para las siguientes preparaciones en las que junto a la gota de
cultivo de paramecios se aade una gota de
a) agua destilada
b) de agua de mar (o de una solucin de 3% NaCl) diluida al 2,5%; 5%; 7,5% y 10%
5. Observe y mida el tamao relativo de las vacuolas contrctiles. Registre tambin la tasa
de pulsacin (n de pulsaciones por unidad de tiempo, segundos o minutos) de las vacuolas
C D
contrctiles para cada una de las condiciones.
6. Represente en una grfica la relacin entre la actividad de las vacuolas contrctiles y la
salinidad del medio (Note que la salinidad real del medio puede verse modificada al realizar
la preparacin).

Observacin al microscopio

Observacin al microscopio
3) Montaje para el estudio de la descarga de tricocistos
Tricocistos de Paramecium al microscopio electrnico
Para observar la descarga de los tricocistos, deposite una gota de azul de metileno 0,1% en
el borde del cubreobjetos de una preparacin de una gota del cultivo de paramecios. Deje
difundir el colorante y observe la reaccin de los paramecios ante la presencia del mismo. A
esta concentracin de colorante (1mg/ml) la tincin ya deja de comportarse como vital o
supravital. Observe a los tricocistos con el objetivo X100 y dibjelos.

Observacin al microscopio

View of the anterior end of Paramecium showing the placement and size of trichocysts (tric)
relative to the cortex and cytoplasmic organelles. Trichocysts docked at the crests of the
surface ridges have carrot shaped bodies surmounted by a spike that is long enough to
penetrate from below the infraciliary lattice all the way to the tip of the ridge. Two trichocysts
(*) have been internally discharged into elongated shafts during fixation. cv, contractile
vacuole. EM taken by R. Allen. Bar = 2m.

When the trichocyst is discharged


its body (tric) suddenly elongates 7
times into a long slender thread. Its
tip (tt) and tip sheath do not change
shape. per, peroxisome; kd,
kinetosomal fibers; il, infraciliary
lattice. EM taken by R. Allen Bar =
0.5m.
C. Observacin de clulas animales (tincin de la mucosa bucal 8. Poner una gota de agua en el centro de la preparacin y cubrir con el cubreobjetos.
humana) 9. A bajo aumentos, localizar las clulas. Observaremos algunas clulas asociadas, otras
dobladas o rotas. Buscar 1 2 que estn completas y bien aplanadas, centrarlas en el
campo y observar a mayor aumento (X40).
Introduccin

Tpico ejemplo de las clulas animales son las


Observacin al microscopio
correspondientes a la mucosa bucal humana,
Con el objetivo de 10X, y despus con el de 40X, dibujar el estado del tejido y de las clulas
las cuales forman parte del epitelio estratificado
y describir los resultados obtenidos.
pavimentoso, que slo est presente en los
vertebrados, y proporciona una proteccin
eficaz contra los agentes mecnicos, qumicos
y la evaporacin. El desgaste de las clulas
superficiales es compensado por la
proliferacin de las clulas basales.

Material

Papel de filtro Palillo dental


Azul de metileno Portaobjetos y cubreobjetos
Goteros Soporte de tincin y cubetas
Mechero de alcohol Frasco lavador

Procedimiento
1. Colocar una pequea gota de agua en un portaobjetos
2. Con el extremo del palillo de dientes, frotar ligeramente la cara interna de la mejilla y
mezclar el material obtenido, con un cuidadoso movimiento de rotacin, con la gota de agua,
hasta que se forme una mezcla homognea.
3. Calentar hasta la desecacin, a la llama del mechero, sin que
llegue a hervir y sin quemar el portaobjetos.
4. Colocar el portaobjetos sobre el soporte de tincin, encima de la
cubeta.
5. Aadir unas gotas de azul de metileno (0,1-1%) sobre la
extensin realizada. Esperar 4 5 minutos.
6. Inclinar el portaobjetos y verter el exceso de colorante en la
cubeta.
7. Lavar la preparacin con agua hasta que no suelte color.
Practica 4. ESTUDIO DE CLULAS VEGETALES
Observacin al microscopio
A. Observacin de clulas vegetales (epidermis de cebolla)
Dibujar y describir los resultados obtenidos.

Introduccin
Las cebollas son bulbos formados por clulas vivas, de las cuales pueden crecer hojas y
races cuando se plantan o se almacenan en un sitio hmedo. Otras clulas de este bulbo
son menos activas y forman una capa que recubre las hojas de la cebolla.

Material

Solucin de Lugol Papel de filtro


Cuchillas de afeitar Pinzas
Portaobjetos y cubreobjetos Bulbos de cebolla

Procedimiento
1. Depositar dos gotas de la solucin yodo-yodurada (reactivo de Lugol) sobre el
portaobjetos. Esta solucin presenta dos funciones principales. Por un lado acta como un
fijador, matando a las clulas sin modificar ni su estructura morfolgica ni su composicin
qumica. Por otro lado, acta como un colorante proporcionndoles a las clulas una cierta
tonalidad amarillenta.

2. Seccionar una cebolla longitudinalmente. Al hacerlo, observaremos una serie de capas


concntricas (alrededor del eje central) que constituyen hojas modificadas con sustancias
nutritivas.

3. Aislar la segunda o tercera hoja a partir del exterior. Con la ayuda de una cuchilla de
afeitar y unas pinzas, separar un fragmento de epidermis no mayor de 1 cm2, es decir, de la
delgada y transparente membrana que tapiza su cara cncava.

4. Depositar el fragmento de epidermis en el reactivo de Lugol, teniendo cuidado de colocar


contra el portaobjetos la parte desgarrada de la epidermis (esta precaucin es importante ya
que permite una mejor visualizacin al microscopio).

5. Cubrir con un cubreobjetos, extraer con papel de filtro el exceso de reactivo de Lugol y
observar al microscopio.
B. Estudio de los fenmenos de plasmlisis y turgencia. la pipeta, de NaCl en el portaobjetos en el borde del cubre y colocar un trozo de papel de
filtro en el extremo opuesto para aspirar (por capilaridad) el tampn fosfato. Repetir la
operacin 1 2 veces. Esta sustitucin de una disolucin por otra se reconoce porque el
Introduccin lquido de la preparacin se aclara.
Las vacuolas juegan un importante papel en el intercambio de agua entre la clula y el 6. Con el objetivo de 10X, y despus con el de 40X, observar y dibujar el estado del tejido y
medio. La clula vegetal se encuentra rodeada de una membrana celulsica rgida, pero de las clulas
permeable al agua y a la mayora de los solutos. La vacuola central est, por el contrario, 7. Sustituir la disolucin de NaCl por agua destilada (medio hipotnico) siguiendo el
limitada por una membrana permeable al agua, pero impermeable a las sales. Si el medio procedimiento indicado en el paso 5. Observar y dibujar el estado del tejido y de las clulas.
que rodea a la clula es hipertnico, la clula perder agua, la vacuola disminuir de
volumen y el protoplasma tender a desprenderse de la membrana celulsica (plasmlisis). Observacin al microscopio
Si la clula se encuentra en una disolucin hipotnica, la diferencia de presin osmtica se
Dibujar y describir el estado del tejido (10X) y el detalle de algunas clulas (X40) en cada
traducir en un flujo de agua hacia la vacuola, cuyo volumen entonces aumentar
uno de los casos (pasos 4, 6 y 7), y explique el fenmeno observado en cada caso teniendo
(turgencia). La presencia de una membrana rgida limitar, sin embargo, esta expansin y la en cuenta las propiedades de la membrana plasmtica
presin intracelular se elevar hasta compensar la diferencia de presin osmtica existente
entre los dos medios.
Las variaciones de volumen observadas en los ejemplos precedentes son la consecuencia
de diferencias de presin osmtica entre las dos fases de la membrana celular.

Material

Bulbos de cebolla Portaobjetos


Tampn fosfato (pH 7.4) Cubreobjetos
Rojo Neutro Pinzas
Cloruro sdico al 6% Cuchillas
Agua destilada Pipetas
Vidrio de reloj Papel de filtro

Procedimiento
1. Colocar una pequea cantidad de tampn fosfato y un par de gotas de solucin acuosa de
Rojo Neutro sobre un portaobjetos (o vidrio de reloj).
2. Tomar un fragmento de la epidermis (de la 2 o 3 escama contadas desde el exterior) de
un bulbo de cebolla. Sumergir inmediatamente (para evitar la desecacin de las clulas) el
fragmento de epidermis en la mezcla de tampn y Rojo Neutro. Dejar sumergido durante 3
4 minutos.
3. Colocar dicho fragmento sobre un portaobjetos, de modo que la superficie que estaba en
contacto con la escama quede hacia arriba. Cubrir con un cubreobjetos.
4. Con el objetivo de 10X, y despus con el de 40X, observar y dibujar el estado del tejido y
de las clulas.
5. Sustituir la solucin tampn por la disolucin de cloruro
sdico (al 6%). Para ello, depositar unas gotas, con ayuda de
Prctica 5. OBSERVACIN DE ESTRUCTURAS SUBCELULARES II. Cromoplastos
VEGETALES
Introduccin
Los cromoplastos son plastos que elaboran sustancias coloreadas o pigmentos. Podemos
A. Observacin de plastos (cloroplastos, cromoplastos y amiloplastos). observarlos examinando ciertas races coloreadas, como las de la zanahoria, ptalos y
epidermis de frutos. Las coloraciones amarillas se deben a dos pigmentos, la carotina y la
xantofila; el rojo es debido al licopeno. Puede suceder que ciertos cloroplastos se conviertan
Los plastos son orgnulos citoplasmticos que se encuentran principalmente en las clulas
en cromoplastos, tal y como sucede en el tomate, que al madurar pasa de verde a rojo.
de los vegetales cloroflicos. Se distinguen tres categoras de acuerdo con su contenido en
pigmentos: CLOROPLASTOS, presentan clorofila, de color verde; CROMOPLASTOS,
Material
contienen pigmentos de diferente coloracin y LEUCOPLASTOS, incoloros y que acumulan Tomate Portaobjetos
sustancias como almidn, lpidos o protenas. Aguja lanceolada Cubreobjetos

Procedimiento
Tomar, con la ayuda de la aguja lanceolada, un fragmento de la parte interna del tomate
(Lycopersicum esculentum), en la regin donde el tejido es compacto. Depositar el
fragmento sobre el portaobjetos y cubrir con un cubreobjetos presionando suavemente.
I. Cloroplastos

Introduccin III. Leucoplastos (Amiloplastos)


Ciertos plastos elaboran una sustancia de color verde: la clorofila. Los cloroplastos pueden Introduccin
tener formas variadas; generalmente son discoidales, pero hay otras formas (en espiral,
Los amiloplastos son plastidios incoloros (sin pigmentos) que almacenan el almidn
arrosariados,...).
generado en los plastos fotosintticamente activos. La relacin que hay entre los granos de
Para la primera observacin detallada de las clulas verdes de una planta viva, vamos a
almidn y los plastos es la siguiente: el plasto se alarga y en l aparece una o varias
emplear una hoja de Polypodium, un helecho muy comn que se encuentra en los muros
vesculas en las cuales nace el germen de un grano de almidn. Esto se pone de manifiesto
(alternativamente tambin pueden emplearse hojas de puerro).
tratando la preparacin con Lugol, que lo colorea de azul oscuro.

Material
Material
Polypodium o puerro Portaobjetos Patata, batata, haba seca, harina Portaobjetos
Cuchilla de afeitar o bistur Cubreobjetos
Solucin de Lugol Cubreobjetos
Agua destilada Pinzas
Procedimiento
Depositar en un portaobjetos una gota de agua destilada y otra de Lugol, y mezclar. Raspar
Procedimiento con una lanceta o con la hoja de un bistur la superficie del interior del tubrculo de una
Con la ayuda de la cuchilla, extraer un fragmento de epidermis del envs de una hoja de patata (Solanum tuberosum) y depositar el extracto en el portaobjetos. Hacer lo mismo con
Polypodium. Colocar la parte inferior hacia arriba en un portaobjetos (en el que previamente la batata (Ipomoea batatas) el grano de juda (Phaseolus vulgaricus) y de trigo (Triticum
habamos depositado una gota de agua destilada) y cubrir con un cubreobjetos. aestivum). Cubrir con un cubreobjetos y observar. El almidn es depositado como
. esferocristales en granos esfricos y ovoides que pueden presentar unas estras de
crecimiento concntricas, alrededor de un punto central denominado hilio (grano de almidn
simple) o de varios (grano de almidn compuesto). Para poder apreciarlo puede ser preciso
cerrar bastante el diafragma de apertura del condensador.
Observaciones al microscopio III. Amiloplastos
Observar con el objetivo de 4X y 10X, y tras seleccionar una zona adecuada dibujar alguna
I. Cloroplastos de las clulas y su contenido con el de 40X. Describir lo observado. Comparar entre los
Dibujar una pequea porcin de tejido con el objetivo de 4X 10X y posteriormente de las granos de almidn de reserva de las diferentes especies. Note si son concntricos o
clulas epiteliales y de los estomas con el de 40X. Describir la estructura de los estomas excntricos, simples o compuestos

II. Cromoplastos
Observar con el objetivo de 4X y 10X, y tras seleccionar una zona adecuada dibujar alguna
de las clulas y su contenido con el objetivo de 40X
B. Localizacin en el citoplasma vegetal de cristales de oxalato
Observacin al microscopio

Introduccin Observar con el objetivo de 4 y 10X, y tras seleccionar una zona adecuada dibujar alguna de
En contraste con los animales, que eliminan al las clulas y su contenido con el de 40X. Describir lo observado.
exterior el exceso de materiales inorgnicos,
las plantas los depositan casi enteramente en
sus tejidos. Estos depsitos inorgnicos en los
vegetales consisten principalmente en sales de
calcio y en anhdridos silcicos. Entre las sales,
la ms frecuente es el oxalato clcico, que se
encuentra en la mayora de las familias
vegetales.
Estos depsitos constituyen cristales de formas variadas: arena cristalina, columnares
(estiloides), paquetes de agujas (rafidios), prismas alargados, cristales empotrados unos en
otros (maclas; si son numerosos y crecen a partir de un centro comn se denominan
drusas)... En la cebolla presentan aspecto prismtico.

Material

Bulbos de cebolla Pinzas


Cuchilla Portaobjetos
Glicerina Cubreobjetos

Procedimiento
Cortar un trozo de aproximadamente 1 cm2 de las hojas exteriores de la cebolla, hojas
coriceas y secas. Depositarlo sobre el portaobjetos que contenga una gota de glicerina.
Cubrir con el cubreobjetos y observar al microscopio.
Prctica 6: FRACCIONAMIENTO CELULAR primera centrifugacin del extracto crudo es a 600g por 10 minutos, tras la cual sedimenta
la fraccin nuclear. Este sedimento o pellet contiene los ncleos. La prxima separacin
se realiza a partir de la fraccin soluble o sobrenadante postnuclear, formado por las
partculas suspendidas en el lquido sobre el sedimento nuclear, la cual es transferida a otro
El fraccionamiento celular es una tcnica usada para investigar la bioqumica y fisiologa de
tubo que se centrfuga a 10000 g durante 30 minutos. El material sedimentado resultante se
orgnulos fuera del ambiente complejo de la clula intacta. El objetivo principal de esta
conoce como fraccin mitocondrial que contiene tanto mitocondrias como microcuerpos.
prctica es aislar los cloroplastos, ncleos y mitocondrias de tejidos vegetales por el mtodo
de fraccionamiento celular.

HOMOGENIZACIN. Para preparar los tejidos para el fraccionamiento celular, primero se Material:
debe suspender en un medio apropiado (una solucin amortiguadora, salina azcar
isotnica). Para mantener la integridad de los orgnulos y enzimas durante el procedimiento Hojas de espinaca y de coliflor Gasa o colador de tela
del fraccionamiento, todas las soluciones y material de vidrio deben mantenerse fras. Una pizca de arena purificada y enfriada Embudos de vidrio
Despus de rebanar las hojas, el tejido est preparado para la homogenizacin, Solucin de maceracin de Manitol Agitador (Vortex, opcional)
procedimiento que rompe los enlaces celulares y libera el contenido celular, sin daar el Solucin tamponadora de Manitol Pipetas y puntas
medio en suspensin. La suspensin de clulas constituyentes se llama homogenizado. Solucin amortiguadora Tris-NaCl Centrfuga/ centrifuga refrigerada
Para los tejidos de plantas, la homogenizacin se debe realizar con un mortero, al cual se le Solucin saturada de ura Tubos de centrfuga 15-ml
aade una pizca de arena como abrasivo. En esta prctica los cloroplastos se aislarn de la 2% Triton X-100 Hielo picado
espinaca y los ncleos y mitocondria se aislarn de la coliflor. Orcena aceto-lctica Pipeta Pasteur
0,01-2% Verde Jano B en tampn Esptula
CENTRIFUGACION DIFERENCIAL. Debido a las diferencias en tamao y densidad, cada
Cuchilla o escalpelo Portaobjetos y cubreobjetos
componente celular est sujeto a una fuerza centrfuga. La fuerza generada por la centrfuga
Mortero y mano (enfriados en hielo) Microscopio
o fuerza centrfuga relativa (RCF) se
expresa en unidades g. La RCF es una
funcin de la velocidad de centrifugacin
en revoluciones por minuto (rpm) y la
distancia (de las partculas) de la muestra
desde el eje de rotacin. El RCF puede
calcularse por la ecuacin:

RCF = (1,119x10-5) x R x S2,

donde R es el radio (en cm) del rotor y S la


velocidad de centrifugacin/rotacin (rpm).

En la centrifugacin diferencial, el
homogenizado es centrifugado en una
centrfuga refrigerada repetidas veces a
altas velocidades, sedimentando
progresivamente pequeas partculas y
estructuras subcelulares. En general, la
A. Determinacin de las velocidades de centrifugacin requeridas B. Aislamiento y observacin de la fraccin cloroplstica
para el fraccionamiento celular
Introduccin

Introduccin Los cloroplastos de las clulas de espinaca se aislarn utilizando el mtodo modificado de
F.R. Whatley y D.I. Arnon (1962). La espinaca se homogeniza por maceracin en una
En la mayor parte de los casos, las centrfugas nos indican y permiten ajustar la velocidad solucin amortiguadora. El homogenizado filtrado es previamente centrifugado a 200 g
del rotor en revoluciones por minuto. Sin embargo, para realizar el fraccionamiento celular durante 1 minuto para obtener el extracto o fraccin cruda, cuyo sobrenadante se
nos interesa conoce el valor de la fuerza centrifuga relativa en unidades g y que pueden centrfuga para sedimentar los cloroplastos.
variar dependiendo de las caractersticas de la centrfuga que usemos.
Los cloroplastos son orgnulos relativamente grandes, por lo tanto, algunos detalles internos
Procedimiento se observan con el microscopio ptico. Tras examinar la morfologa normal de los
cloroplastos de la espinaca, se estudiarn los efectos de dos compuestos orgnicos. Los
1. Con una regla o cinta mtrica mida el radio del rotor (la distancia en centmetros desde el cloroplastos se tratarn con una solucin saturada de urea y una solucin acuosa de Triton
centro del rotor hasta el extremo inferior de un tubo de centrfuga colocado horizontalmente). X-100, que es un detergente fuerte. La urea es utilizada para desnaturalizar protenas,
En el caso de tubos inclinados, R se toma como la distancia desde el eje de rotacin hasta el alguna de las cuales salen de la membrana de los cloroplastos.
margen externo del tubo de centrfuga (rmax). En otras ocasiones se toma como valor del
radio, la media entre el radio mximo (del centro al extremo del tubo, rmax) y el mnimo (del Procedimiento
centro hasta el extremo del brazo rotor, r min).
1. Pese 4 g de hojas frescas de espinaca, a las que se les eliminaron las venas centrales.

2. Corte las hojas en pequeos pedazos y colquelas en un mortero fro (el mortero da
mejores resultados que la licuadora). Aada 15 ml de la solucin amortiguadora de Tris-NaCl
fra, una pizca de arena purificada fra y macere el tejido durante 2 minutos.

3. Filtre la suspensin a travs de varias capas de gasa a un tubo de centrfuga de 15 ml fro.


A. Rotor de ngulo fijo B. Rotor basculante C. Rotor vertical
4. Centrifugue el lquido filtrado a 200 g durante 1 minuto. Verifique antes que los tubos de
2. Calcule las rpm requeridas para cada una de las centrifugaciones para obtener cada una centrfuga estn correctamente balanceados.
de las fracciones celulares a lo largo de esta prctica, usando la frmula
5. Decante el sobrenadante (fraccin cruda) a un tubo fro y centrifugue a 1300 g durante 5
g = (1.119 10-5) x R x S2 minutos.

RCF (g) R= Radio del Rotor (cm) S requerido (rpm) 6. Descarte el sobrenadante y aada usando una probeta 10 ml de la solucin
200 amortiguadora fra de Tris-NaCl al sedimento que qued en el tubo de centrfuga.
600 Resuspenda el pellet con una pipeta Pasteur.
1300
7. Tape el tubo de centrfuga, e invierta el mismo para mezclar su contenido. Mantener la
10000
suspensin de cloroplastos sobre hielo picado.
Observacin microscpica de la fraccin cloroplstica Observacin microscpica de cloroplastos tratados con urea

1. Con una pipeta Pasteur remueva una gota de la suspensin de cloroplastos y lleve a cabo 1. Coloque una pequea gota de la suspensin de cloroplastos en un portaobjetos limpio.
una preparacin en fresco (wet mount). Use una pequea gota de modo que no tenga que Aada una gota de la solucin de urea saturada y coloque un cubreobjetos sin presionar.
ejercer presin sobre el cubreobjetos, daando los cloroplastos.
2. Examine los cloroplastos bajo los objetivos de 40X y de inmersin de aceite durante 5
2. Examine los cloroplastos bajo el objetivo de 40X y luego bajo el objetivo de 100X de minutos. Dibuje los cloroplastos que presenten una morfologa alterada. Qu cambios
inmersin en aceite. Calcule la longitud y anchura media de 5 cloroplastos en micras. morfolgicos ocurren en los cloroplastos?

Medidas x1 x2 x3 x4 x5 Valor En presencia de luz qu sabe de la accin de la urea, explique sus observaciones.
m)
( medio
Largo
Ancho

3. Dibuje la morfologa de algn cloroplasto que muestren detalles internos e identifique sus
estructuras.

Observacin microscpica de cloroplastos tratados con Triton X100


4. Identifique y dibuje los cloroplastos que tengan una morfologa interna poco homognea.
Cul es la forma de un cloroplasto individual? Qu estructuras son visibles en los 1. Prepare un montaje en fresco usando una pequea gota de la suspensin de cloroplastos
cloroplastos? y una gota de solucin de Triton X-100 al 2%.

2. Examine la preparacin bajo el objetivo de 40X y 100X. Comente o ilustre las


observaciones realizadas Qu cambios morfolgicos ocurren en los cloroplastos?

En presencia de luz qu sabe usted de la accin de Triton X-100, explique sus


observaciones.
C. Aislamiento y observacin de las fracciones nuclear y Observacin microscpica de la fraccin nuclear
mitocondrial
1. Con una esptula remueva una pequea cantidad del pellet o sedimento nuclear y
Para la obtencin de la a fraccin nuclear y mitocondrial de las clulas de la coliflor se
aplquelo en un portaobjetos.
utilizar el mtodo descrito por WD Bonner (1967). El tejido se homogeniza en una solucin
amortiguadora de manitol y se filtra a travs de una gasa, el homogenizado es 2. Aada varias gotas de colorante nuclear orcena lactoactica. Tras 15s, coloque un
secuencialmente centrifugado para obtener ambas fracciones. cubreobjetos y elimine el exceso de tinte con papel absorbente usando una leve presin.

Para la observacin de los ncleos se debe realizar una tincin. El colorante a utilizar ser la 3. Examine la preparacin bajo el objetivo de 40X (usando un filtro verde) y el objetivo de
orcena aceto-lctica, el cual tie de rojo la cromatina. Cada nucleolo aparece como un rea inmersin en aceite. Mida los dimetros de los ncleos y complete la tabla,
prominente, redonda y clara.
Medidas x1 x2 x3 x4 x5 Valor
Las mitocondrias se tien con el colorante verde Jano (Janus green B). Despus de la m)
( medio
tincin, la mitocondria se tie con una coloracin azul-verdosa, que es el color del tinte en su Largo
forma oxidada; en su forma reducida, el colorante es incoloro. El verde Jano se mantiene en Ancho
estado oxidado por el sistema de citocromo oxidasa de la mitocondria. El verde Jano se
utiliza tambin como tincin de viabilidad celular, ya que las clulas muertas incorporan el Represente grficamente los ncleos observados e identifique los nucleolos.
colorante pero transcurrido el tiempo no lo transforman a su forma oxidada (incolora)

Procedimiento

1. Tome 20 g de la parte externa de la coliflor con un escalpelo.

2. Coloque el tejido en un mortero fro con 40 ml de medio de maceracin de Manitol


(Mannitol grinding medium) y 5 g de arena purificada. Macere los tejidos por 4 minutos.

3. Filtre la suspensin a travs de 4 capas de gasa hmeda a un tubo de centrfuga. Deje


reposar el tubo por 2 minutos.

4. Decante y transfiera el sobrenadante (fraccin cruda) a un tubo. Centrifugue a 600 g


durante 10 min a 0-4 C.

5. Transfiera el sobrenadante obtenido (fraccin soluble/ postnuclear) a un tubo de


centrfuga fro y coloque el sedimento (fraccin nuclear) en un bao de hielo.

6. Centrifugue la fraccin soluble a 10.000 g durante 30 min a 0-4 C.

7. Descarte el sobrenadante y aada 5 ml del medio de manito (Mannitol assay buffer) fro al
sedimento. Con una esptula remueva el pellet de las paredes del tubo de centrfuga y con
una pipeta Pasteur resuspndalo, obteniendo as la fraccin mitocondrial.
Observacin microscpica de la fraccin mitocondrial

1. Coloque 5 gotas de la suspensin mitocondrial en un tubo pequeo. Aada 5 gotas del


tinte verde Jano (Janus green stain), agite y espere 10 minutos.

2. Coloque una gota de la mezcla en un portaobjetos limpio y observe bajo los objetivos de
40X y 100X.

3. Identifique y dibuje la morfologa de las mitocondrias. Mida el largo y ancho de 5


mitocondrias (x1-x5) y calcule el valor medio de las mediciones.

Medidas x1 x2 x3 x4 x5 Valor
m)
( medio
Largo
Ancho
Prctica 7. ESTUDIO DE LOS CROMOSOMAS Y LA MITOSIS Procedimiento
Para poder observar las distintas fases mitticas conviene utilizar
A. Estudio de la mitosis en tejidos vegetales
un material en crecimiento, en el que hay muchas clulas en
divisin y, probablemente, al hacer la preparacin, podamos
Introduccin sorprender algunas en cada una de las fases de la mitosis. Para
Todas las clulas somticas de un organismo pluricelular provienen de una sola clula, el ello son especialmente indicados los meristemos terminales de las
cigoto, gracias a un proceso divisional llamado mitosis. La funcin de la mitosis es construir races en crecimiento.
una copia exacta de cada cromosoma y distribuir, mediante la divisin de la clula, una 1. Elegir una raz de cebolla de unos 5 a 10 mm. de longitud; cortar
dotacin idntica de cromosomas en cada una de las clulas hijas. por la base con una cuchilla y situarla sobre un portaobjetos.
La clula, durante la mitosis, pasa por diferentes estados o fases mitticas fcilmente
2. Sujetndola por la base con una lanceta, procurar hacer cortes
reconocibles por las transformaciones que tienen lugar durante cada una de ellas.
transversales (rodajas) lo ms finos posibles, a un par de mm. del
La Interfase es el perodo entre dos mitosis
extremo. Recoger 1 2 cortes con la lanceta y situarlos en un
sucesivas. Su duracin es variable dependiendo
portaobjetos.
del organismo y del tipo de clula que se trate. El
ncleo aparece granulado y no es posible distinguir 3. Fijar los cortes durante 10 minutos en Carnoy en un vidrio de

los cromosomas como tales. reloj.

Durante la Profase, los cromosomas se hacen 4. Colocar unas gotas de orcena A (aceto-clorhdrica) sobre los
visibles; en algunos casos se pueden observar las cortes y dejar 10 minutos. El clorhdrico disuelve la lmina
dos cromtides que forman el cromosoma. A celuloso-pctica que une a las clulas, facilitando su dispersin
medida que los cromosomas se condensan, posterior, actuando tambin como lquido de maceracin
empieza a formarse el huso y los centrolos (en 5. Flamear suavemente 2 3 veces sin que el colorante llegue a ebullir. Evitar que las
vegetales no se observan) emigran hacia los polos muestras se sequen.
de la clula. Desaparecen los nucleolos y l
6. Una vez enfriada la preparacin, aadir la orcena B (actica) colocar el cubreobjetos y
membrana nuclear.
hacer el aplastamiento o squash apretando con fuerza el cubre contra el porta con el
En la Metafase, ya desaparecida por completo la
pulgar. Hay que tener cuidado de que la superficie sobre la que se realiza la operacin sea
membrana, los cromosomas se ordenan en la
lisa a fin de no romper la preparacin. Tambin el cubreobjetos puede romperse si el corte
placa ecuatorial.
es demasiado grueso. Conviene colocar papel de filtro entre el cubreobjetos y el dedo para
Durante la Anafase, los cromosomas hermanos empiezan a desplazarse hacia los polos.
no mancharse de colorante (ya que es algo txico).
En la Telofase, en cada polo de la clula se agrupa una dotacin idntica de cromosomas y
empiezan a tomar el aspecto tpico de interfase. La membrana nuclear se vuelve a formar y
se inicia la divisin celular mediante el proceso de citocinesis.

Material

Races de bulbos de cebolla cuentagotas


Cuchilla de afeitar Orcena actica clorhdrica y actica
Pinzas y agujas enmangadas Lquido de Carnoy
Vidrio de reloj Portaobjetos y cubreobjetos
Mechero de alcohol Papel de filtro
Observacin al microscopio B. Observacin de cromosomas gigantes de Drosophila.
Con los objetivos de 4X y 10X buscar las zonas donde las clulas estn bien teidas y en un
slo plano, buscando figuras de mitosis en ellas. Observar con el objetivo de 40X las fases La preparacin muestra los cromosomas gigantes de las glndulas salivales de larvas de

de mitosis y dibujar cada una de ellas. Drosophila. Los cromosomas politnicos se encuentran en numerosos tejidos larvarios
incluidos el cuerpo graso, el intestino medio y posterior, pero los mayores cromosomas los
encontramos en las glndulas salivares de la larva instar 3 que, para adaptarse a su elevada
actividad, aumentan el tamao de sus clulas en lugar de aumentar su nmero. Los
cromosomas politnicos son cromosomas en interfase que han multiplicado sus
cromosomas (1024 cromtidas dispuestas en paralelo por cada cromosoma) tras 10 rondas
de (endo)replicacin. A lo largo de los cromosomas gigantes se alternan bandas oscuras
fuertemente coloreadas y segmentos ms claros, denominados interbandas. Algunas bandas
especficas aparecen hinchadas formando los puffs, lugares de intensa actividad de los
genes.

Las glndulas, extradas y fijadas en actico (45%) son teidas en orcena acetolctica y
aplastadas (mtodo del squash) sobre portaobjetos gelatinizados con cubreobjetos
siliconados. La orcena es un colorante obtenido naturalmente a partir de dos especies de
lquenes (Rocella tinctoria y Lecanora parella) o artificialmente por sntesis qumica.

Observacin al microscopio
Prctica 8. TINCIN Y ESTUDIO DE LAS CLULAS SANGUNEAS Procedimiento
1. Para obtener la muestra de sangre, limpiar la pulpa del dedo con un algodn con alcohol,
Introduccin
dejar evaporar, frotar con un algodn seco y pinchar con una lanceta.
La sangre es un tejido constituido por corpsculos en suspensin en un fluido denominado
plasma. Al microscopio se presenta como un medio homogneo en el que estn esparcidas 2. Depositar la gota de sangre en un lado y en el centro de un portaobjetos. Seguidamente,

las clulas sanguneas. Estas clulas son de dos tipos: glbulos rojos y glbulos blancos. con la ayuda de un portaobjetos de borde

Los glbulos rojos, tambin denominados eritrocitos o hemates, son los ms numerosos y esmerilado, hacer una extensin o frotis de la

son anucleados. Su principal funcin es transportar oxgeno y dixido de carbono por medio sangre. El portaobjetos con el que se hace la

de la hemoglobina que contienen. extensin debe deslizarse bien colocado y lo ms

Los glbulos blancos, o leucocitos, encargados de la defensa del organismo son de dos perfectamente aplicado en su borde contra el

tipos: otro, sobre el cual se hace la extensin. Slo

Granulocitos: presentan granulaciones citoplasmticas y poseen ncleos divididos en pasar una vez de forma continua e

lbulos. Hay tres tipos: ininterrumpida.

- Neutrfilos: son los ms numerosos. Su ncleo es muy lobulado (hasta 3. Secar al aire la extensin o frotis; la desecacin se facilita con un movimiento en forma de
4 5 lbulos). Su citoplasma es plido y finamente granulado. abanico, nunca soplando o con calor.
- Eosinfilos: son menos numerosos que los anteriores. Su citoplasma 4. Depositar los portaobjetos encima del soporte de tinciones. Sobre ellos, dejar caer una
est lleno de gruesos granos eosinfilos y su ncleo es bilobulado. gota de alcohol absoluto (100) y esperar que el alcohol se evapore, con lo que se consigue
- Basfilos: son los ms escasos. Su ncleo es bilobulado, un poco el fijado.
oculto por la gran cantidad de gruesos grnulos basfilos de
5. Depositar unas gotas de Hematoxilina de Mayer que cubran toda la extensin. Evitar la
citoplasma.
desecacin del colorante, aadiendo ms si fuera necesario. Dejar actuar 15-20 minutos.
Agranulocitos: no poseen granulaciones citoplasmticas. Son de dos tipos:
6. Lavar la preparacin con agua corriente. Sin secar la extensin, depositar una gota de
- Linfocitos: son relativamente pequeos. El ncleo ocupa casi toda la
eosina (colorante cido) y dejar actuar durante 1 minuto.
clula, es redondeado y puede presentar una escotadura.
- Monocitos: son ms grandes que los anteriores y menos numerosos. 7. Lavar con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.

Su ncleo es reniforme y su citoplasma posee una dbil basofilia. 8. Deshidratar: pasar la preparacin por baos sucesivos de etanol de 80, 96 y 100,
durante 3 minutos cada bao.
Las plaquetas son fragmentos celulares de megacariocitos y su tamao es mucho menor 9. Aclarar: pasar la preparacin por un bao de xileno durante 5 minutos.
que el de las clulas. Aparecen aisladas o en pequeos grupos. Su funcin se dirige sobre
10. Montar: depositar unas gotas de medio de montaje (resina sinttica Eukitt) sobre un
todo al control de las hemorragias, siendo fundamental su presencia para la formacin del
cubreobjetos y despus apoyar el cubreobjetos sobre el borde de la preparacin dejndolo
cogulo sanguneo.
caer suavemente.

Material
Observacin al microscopio
Portaobjetos esmerilados Agua destilada Analice crticamente el resultado de su preparacin
Lanceta Etanol (80, 96, 100)
Hematoxilina de Mayer Xileno
Eosina Y Cubeta de tincin
Prctica 9. INTRODUCCIN A LA MICROSCOPA ELECTRNICA

Esquema que representa las analogas/diferencias entre el M.O. y el M.E.

Escala comparativa M.O. / M.E.


6) Describa las especificaciones que presentan los objetivos de mayor y menor aumento de
CUESTIONES RELATIVAS A LAS PRCTICAS su microscopio.

Prctica 1.
1) Es lo mismo un microscopio ptico que un estereomicroscopio?

7) Cul es el mximo aumento al que puede observar un objeto con su microscopio?


2)Qu es el lmite de resolucin o distancia de resolucin? De qu factores depende?

8) Calcula el tamao de la clula de la imagen (en micrmetros) tomando la distancia entre


los extremos de la lnea. (2,8 cm).
Queremos colocar una barra de calibracin. Calcula una barra de escala y expresa el valor
de dicha barra.
400X

3) Qu es la apertura numrica de una lente ptica?

2,8 cm

4) Qu significa que los objetivos de un microscopio son parafocales? Qu es la distancia


parfocal y distancia de trabajo de un objetivo?
9) Cul es el tamao real de un objeto (expresado en micras) cuya imagen fotogrfica
tomada con un aumento final de x300 en un fotomicroscopio tiene 3 cm?

5) Identifique las partes del microscopio ptico de campo claro


numeradas en la fotografa.
10. Si las clulas animales tienen un tamao medio de 25 micras, Cuntas clulas caben
en 1 mm.?
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
Prctica 2. Prctica 4.
1) cite las diferencias entre los hongos y el resto de las eucariotas animales y vegetales. 1. Qu es una solucin tamponadora y para qu se utiliza?

2. Qu les ocurrira tericamente a las clulas animales en cada una de las soluciones
empleadas: isotnica, hipertnica e hipotnica? En qu solucin podra producirse la
plasmolisis?

Prctica 3. 3. Las clulas procariotas pueden sufrir lisis de membrana en soluciones hipotnicas?

1. Qu diferencias existen entre los cilios y los flagelos?

2. A qu se le denomina vacuola pulstil o contrctil y cul es su funcin?

Prctica 5.
1. En la naturaleza, la apertura de los ostiolos debido a la turgencia de las clulas oclusivas
depende de factores como la luz, temperatura, humedad ambiental, la concentracin de
CO2, Pero por qu los poros aparecen abiertos en su preparacin?

3. Si se hubieran teido bacterias saprfitas de la mucosa, podra decir si son Gram


positivas o negativas?

2. Por qu se utiliza glicerina como lquido de montaje en la observacin de los depsitos


de sales de oxalato?
Prctica 7.
1. Qu diferencias existen entre la mitosis de clulas animales y vegetales?

Prctica 6.
1. Qu estructuras subcelulares (orgnulos) se encuentran en el la fraccin soluble
postnuclear?

2. Qu estructuras subcelulares (orgnulos) se encuentran en el la fraccin mitocondrial?

2. Si el nmero haploide de cromosomas de un organismo diploide es 36,


Cuntos cromosomas seran visibles en la metafase?

3. Qu estructuras subcelulares (orgnulos) se encuentran en el la fraccin soluble


postmitocondrial?

3. Cuntos cromosomas seran visibles en cada uno de los polos de la Anafase?

4. El verde Jano B adems de teir las mitocondrias, es un colorante usado para analizar la
viabilidad de un cultivo celular. En su forma oxidada presenta coloracin verde-azulada,
mientras que es su forma reducida presenta una apariencia incolora. Al ser este colorante
(como tambin lo son el resto de los colorantes usados en las llamadas tinciones vitales)
txico para las clulas a medida que pasa el tiempo, razona cmo sera la evolucin de la
tincin en un cultivo celular con el tiempo en presencia de este colorante.
4. Qu significado biolgico o ventaja puede representar los cromosomas politnicos?
Prctica 8. Prctica 9.
1. Qu estructuras celulares tien ambos colorantes? 1. Dada la siguiente lista de entidades, determinar qu tipo de microscopa (ptica o
electrnica) sera la ms adecuada para analizarlos: 1) clula animal 2) virus - 3) bacteria
4) protenas 5) mitocondrias 6) vulo 7) neuronas 8) piojo 9) glucgeno 10)
ADN

2. Qu dimensiones (largo x ancho) expresadas en micras y en nanmetros tiene la


bacteria de la microfotografa de microscopa electrnica?
2. Qu agente qumico para la fijacin de las clulas ha utilizado? Cules son las
funciones de un fijador?

3. Cita 4 diferencias entre un microscopio ptico y un microscopio electrnico de transmisin.

3. En qu casos y por qu es necesario deshidratar la muestra tras la tincin? 4. Cul es el fundamento del M.E.T.? Y del M.E.B.?En qu se basa el mayor poder de
resolucin de la microscopa electrnica frente a la microscopa ptica?

5. En la foto se muestra una clula vista al microscopio electrnico de transmisin (20000X).


a) Indicar si la clula de la foto es eucariota o procariota. Justificar la respuesta.
b) Indicar si la clula de la foto es animal o vegetal. Justificar.
4. Por qu es necesario el tratamiento (denominado tambin aclarado porque la muestra se c) Indicar el nombre de las estructuras sealadas.
vuelve ms transparente) con Xileno?
SOLUCIONES COLORANTES

ANEXO I. Reactivos y disoluciones qumicas empleadas - Azul de Metileno


Solucin Stock (1,48%)
Azul de metileno...1.48 g
SOLUCIONES FIJADORAS Etanol 95%. 100 ml
Dejar reposar varios das y filtre antes de almacenar.

- Lquido de Carnoy Para tincin de bacterias o descarga de los tricocistos (Prcticas 2A, 2B, 3B y3C) 0,1%,
1mg/ml, 1:1000
60 ml alcohol absoluto Diluir el volumen deseado de la disolucin madre (1:10) antes de usar, mezclando 5
30 ml cloroformo ml de la solucin con 45 ml de agua destilada.
10 ml cido actico
.Para coloracin vital o supravital, 0,05% (0,5 mg/ml, 1:2000), (Prctica 3A)
Diluir la solucin madre 1:20; p. ej. 5ml en 90 de agua destilada.
SOLUCIONES AMORTIGUADORAS O bien puede hacerla directamente diluyendo 0,05g azul de metileno + 100ml agua
destilada
Para una dilucin mayor (1:10000, 0,01%, 0,1mg/ml), diluir 10mg en 100ml de agua.
- Solucin amortiguadora Tris-NaCl (Tris salino) (0,05M Tris-Cl, 150 mM NaCl, ph 7,6)
- Eosina
Disolver 6.05 g de Tris y 8.76 g NaCl en 800 ml de H2O destilada o desionizada. Solucin Stock de Eosina Y (1%):
Ajuste el pH a 7.6 con 1 M HCl. Eosina Y..10 g
Complete el volumen total hasta 1 L con agua destilada o desionizada Agua destilada..200 ml
La solucin es estable a 4C durante 3 meses. 95% etanol800 ml
Disolver y almacenar a temperatura ambiente.
- Tampn Fosfato 0,1M pH 7,4 (a partir de soluciones stock)
Solucin colorante Eosina Y (0.25%):
Solucin A: 0.2M fosfato sdico dibsico Solucin stock de Eosin Y..250 ml
Na2HPO4*2H20 (MW = 178.05) 35.61 g 80% Etanol750 ml
o Na2HPO4*7H20 (MW = 268.07) 53.65 g cid acetico glacial (concentrado)5 ml
o Na2HPO4*12H20 (MW = 358.14) 71.64 g Disolver y almacenar a temperatura ambiente.
+ ddH20 para hacer 1l
- Hematoxilina de Mayer
Solucin B: 0.2M fosfato sdico monobsico La hematoxilina es un colorante cuyo pigmento es extrado de la corteza del rbol campeche
NaH2PO4*H20 (MW = 138.01) 27.6 g (Haematoxylon campechianum). Este pigmento es la base de numerosas formulaciones que
o NaH2PO4*2H20 (MW = 156.03) 31.21 g varan entre otras cosas en el mordiente (compuesto, generalmente un ion metlicoen este
+ ddH20 para hacer 1l caso, que determina la actividad y/o afinidad del colorante)
Sulfato de aluminio potasio..50 g
pH (25 C) Solucin A (ml) Solucin B (ml) Hematoxilina.1 g
7.0 30.5 19.5 Ioduro sdico.0,2 g
7.2 36.0 14.0 cido actico glacial..20 ml
7.4 40.5 9.5 Agua destiladahasta 1 litro
Disuelva primero el alumbre de potasio en agua destilada. Aada el ioduro y finalmente el
7.6 43.5 6.5
actico. Lleve la disolucin a ebullicin y una vez fra fltrela si fuera necesario.
Complete el volumen hasta 100ml con agua destilada
- Reactivo de Lugol (solucin yodurada de yodo)
La osmolaridad (la concentracin molecular de todas las partculas osmticamente activas)
(Nota: No confundir con la tintura de yodo, que es una solucin alcohlica de yodo)
contenidas en una solucin puede ajustarse bien variando la molaridad de los fosfatos o bien
Para preparar la solucin madre disuelva el yoduro de potasio en 10 ml de agua destilada,
por adicin de sacarosa, glucosa o cloruro de sodio
agregue los 5 g de.yodo, haga una pasta y luego diluya hasta 100 ml con agua destilada.
A pH 7.2:
I2 ...........................................5 g
0.10M = 226 mOs (miliosmoles)
KI ........................................10 g
0.05M = 118 mOs
Agua destilada.....................85 ml
0.075 = 180 mOs
0.15M = 350 mOs
La solucin madre puede durar sin problemas ms de un ao, teniendo la precaucin de
guardarla en frasco oscuro y en refrigerador.
Para las pruebas usar una dilucin al 10% de la solucin madre combinando 1 ml de ste
con 9 ml de agua destilada.
- Orcena actica clorhdrica y actica (para mitosis)
Solucin A (Actica y clorhdrica): - Verde Jano B 0,01-2% en tampn
Orcena ......................................................2 g
cido actico glacial.................................45 ml
OTRAS SOLUCIONES
Agua.........................................................55 ml
cido clorhdrico concentrado....................1 ml
Disolver el polvo de orcena en el cido actico caliente (60). Minimizar la evaporacin o
restituir el volumen de cido actico perdido. Enfriar y aadir el agua. Dejar reposar 48 horas - Solucin lquida (1,5% , 3%) o pasta (10%) de metilcelulosa
y filtrar. Finalmente aadir 1 ml de cido clorhdrico.
- Disolver 1,5g, 3g o 10g de metilcelulosa en polvo en 50 ml de agua hirviendo.
Solucin B (actica): - Retirar y dejar reposar 20-30 minutos.
Orcena...........................................................2 g - Aadir 48,5 ml de agua fra y remover sin hacer burbujas.
cido actico glacial.....................................45 ml
Agua.............................................................55 ml La consistencia a la concentracin de la solucin del 1,5% es semejante a la de la miel o
sirope. La consistencia de la pasta de metilcelulosa es de gelatina.
Disolver el polvo de orcena en el cido actico caliente. Enfriar y aadir el agua. Dejar
reposar 48 horas y filtrar. Sugerencia: preparar 200 ml de la solucin B y despus separar
100 ml de esta para obtener la solucin A al aadir 1 ml de HCl - Medio de maceracin de Manitol (Mannitol grinding medium): 0.3 M D-manitol, 0.02 M
Tampn fosfato (pH 7.2)
- Orcena aceto-lctica o lactoactica 2%
Orcena...........................................................2 g - 109.32 g D-mannitol, 1.64 g KH2PO4 , 4.84 g K2HPO4
cido lctico (85% en dH2O)33ml - 2 litros dH2O, pH 7.2 (ajustar con KOH)
cido actico glacial......................................33 ml - Conservar en el refrigerador
Agua destilada...............................................33 ml

Disolver la orcena. Calentar sin que llegue a ebullicin en un bao de vapor (steam bath) en - Medio de Manitol (Mannitol Assay Buffer) (opcional para resuspender los sedimentos
campana de extraccin de gases y filtrar en caliente. Dejar reposar durante 24 horas nucleares y mitocondriales): 0.3 M manitol, 0.02 M fosfato potsico (pH 7.2), 0.01 M KCl,
protegida de la luz. Almacenar a temperatura ambiente, en un frasco mbar o protegido de la 0.005 M MgCl2.
luz con papel de aluminio.
- 1 litro de medio de maceracin de manitol + 0.76 g KCl, 1.02 g MgCl2-6H2O
- Rojo Neutro (a partir de una disolucin stock) - pH 7.2 (ajustar con KOH)
- Conservar en el refrigerador
Disolucin madre (0,1%, 1mg/ml, 1/1000) (alcohlica o acuosa)

Rojo neutro .0,1gr - Cultivo de Paramecium


Etanol absoluto (o en agua destilada).100ml Hervir 10g de pienso de conejo en 250ml de agua. Dejar 24 horas, remover y colar (solucin
Esta solucin es estable en oscuridad. A partir de esta solucin stock pueden realizarse las de pienso de conejo)
diluciones acuosas cuya estabilidad se ve reducida a algunas horas
Mezclar en las siguientes proporciones,
para la tincin de vacuolas (prctica 4B) - H20 mineral o desclorada400ml
- Diluir un volumen de la solucin madre en proporcin1:5 (e.g. 1ml en 4 ml de agua - Solucin de pienso de conejo..50ml
corriente o en tampn) lo que representa una concentracin final de 0,02% - Cultivo maduro de Paramecios50ml

para coloraciones vitales o supravitales (prctica Protozoarios) Etiquetar y dejar 4-10 das en recipiente abierto a temperatura ambientey en oscuridad para
- disolucin acuosa al 0,01% (0,1mg/ml, 1:10.000), disolver 1ml de la solucin stock que los paramecios se dividan y proliferen. Pasado este tiempo puede utilizarse 25ml de este
en 10 ml (9 ml) de agua destilada. cultivo maduro de Paramecios para un subcultivo posterior si fuera necesario. Utilizar el
- disolucin acuosa al 0,001% (0,01mg/ml, 1/100.000), disolver 1ml de la solucin sobrante
stock en 100 ml (99 ml) de agua destilada
Para concentrar a los Paramecios, centrifugar (en tubos Falcon)el cultivo madurodurante 2
La solucin acuosa puede hacerse tambin en disoluciones tampn o disoluciones salinas minutos a 5000rpm. Descartar el 70% del sobrenadante con una pipeta
(0,45% NaCl). En esos casos, filtrar al final. Este colorante es adems un indicador de pH,
siendo rojo a pH menores de 6,8 y amarillo a pH por encima de 8.0 (ver tabla del anexo II)

- Rojo Fenol (Fenolsulfonftalena) 0,1%


Disuelva 0.1g de rojo fenol en 15ml de sol. de hidrxido de sodio 0.02N y afore a 100ml.
Usado frecuentemente como indicador de pH en medios de cultivo. Es ligeramente
estrognico o estrgeno-mimtico
ANEXO II

Tabla 1. Colorantes que actan como indicadores de pH

Figura 1.
Representacin de la clasificacin de los diferentes grupos de organismos eucariotas