INMOVILIZACIN DE

ENZIMAS

Prof. J.M.Snchez-Montero
Grupo de Biotransformaciones
Departamento de Qumica Orgnica y Farmacutica. Fac. Farmacia
 INMOVILIZACIN DE ENZIMAS

DEFINICIN:
CONFINAMIENTO FSICO DE UNA ENZIMA O CLULA EN
UNA DETERMINADA REGIN DEL ESPACIO, DE MANERA
QUE SU ACTIVIDAD CATALITICA SE RETENGA, Y PUEDA
SER REUTILIZADA.
1971, 1er Enzyme Engineering Conference, Henniker, New
Hampshire, USA.

POSTERIOR SIMPLIFICACIN DEL TRMINO:

BIOCATALIZADORES INMOVILIZADOS
ENZIMAS, CLULAS ENTERAS U ORGNULOS CELULARES
(O BIEN COMBINACIONES DE ELLOS) QUE SE ENCUENTRAN
EN UN ESTADO TAL QUE SE PERMITE SU REUTILIZACIN

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PARA UNIFICAR CRITERIOS A LA HORA DE
CARACTERIZAR UN CATALIZADOR INMOVILIZADO, EL
WORKING PARTY ON APPLIED BIOCATALYSIS,
ENCUADRADO DENTRO DE LA FEDERACIN EUROPEA DE
BIOTECNOLOGA DEFINI UNAS LNEAS MAESTRAS
(GUIDELINES) CON OBJETO DE RESPONDER A PREGUNTAS
TIPO:

QU CANTIDAD DE ENZIMA LIBRE SE NECESITA PARA

PREPARAR UN BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO ACTIVO?

QU PARMETROS GOBIERNAN UNA REACCIN

BIOCATA LIZA DA ?
QUE RENDIMIENTO COMPARADO PRESENTA UNA
REACCION BIOCATALIZADA POR ENZIMAS O CLULAS
LIBRES FRENTE A SISTEMAS INMOVILIZADOS?
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REQUISITOS MNIMOS PARA PODER CARACTERIZAR UN
BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO
90.- DESCRIPCIN GENERAL.

90.1.- ESQUEMA DE REACCIN

90.2.- ENZIMA Y MICROORGANISMO
90.3.- TIPO DE SOPORTE
90.4.- MTODO EMPLEADO PARA LA INMOVILIZACIN

91.- PREPARACIN DEL CATALIZADOR INMOVILIZADO.

91.1.- MTODO DE INMOVILIZACIN, CONDICIONES DE

REACCIN.
91.2.- RENDIMIENTO POR PESO SECO, ACTIVIDAD DEL
SOBRENADANTE.

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92.- CARACTERIZACION FISICO- QUIMICA.

9 2.1.-FORMA DEL BIOCATALIZADOR

9 2.2.-DIMETRO MEDIO DE PARTCULA HMEDA
9 2.3.-CAPACIDAD DE HINCHAMIENTO
9 2.4.-COMPORTAMIENTO EN COLUMNAS
(COMPRESIBILIDAD)
9 2.5.-ABRASIN EN REACTORES AGITADOS
9 2.5.-ABRASIN EN REACTORES DE LECHO
FLUIDIZADO.

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93.-CINETICA DEL BIOCATALIZADOR INMOVILIZADO.

93. 1.-ESTUDIO DE LA VARIACIN DE LA VELOCIDAD INICIAL

DE REACCIN FRENTE A LA VARIACIN DE LAS
CONCENTRACIONES DE ENZIMA Y DE SUSTRATO.
93.2.- EFECTO DEL TIPO DE BUFFER Y DEL pH.
93.3.- LIMITACIONES DIFUSIONALES EN EL SISTEMA (EFECTO
DEL TAMAO DE PARTCULA Y LA CARGA ENZIMTICA)
93.4.- GRADO DE CONVERSIN FRENTE A TIEMPO DE
RESIDENCIA.
93.5.- ESTABILIDAD DEL BIOCATALIZADOR EN EL
ALMACENAMIENTO (VELOCIDAD INICIAL RESIDUAL TRAS EL
ALMACENAMIENTO A DIFERENTES TIEMPOS EN DIFERENTES
CONDICIONES.)
93.6.- ESTABILIDAD OPERACIONAL (VELOCIDAD INICIAL
RESIDUAL DESPUS DE DIFERENTES CICLOS CATALTICOS)..
OBJETIVO: MAYOR REPRODUCIBILIDAD
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 VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIN
9PUNTO DE VISTA BIOQUMICO

9VENTAJAS:

91.- Disminucin de problemas de autolisis (proteasas) o de

agregacin, al estar limitados los movimientos rotacionales y
translacionales.
92.- Se ralentizan los cambios conformacionales, por lo que se
pueden estudiar las relaciones estructura-funcin.
93.- Se pueden simular reacciones in vivo.
94.- Se pueden simular sistemas estructuralmente asimtricos (ej.
estudios de membranas).
95.- En sistemas entrecruzados, se pueden fijar interacciones con
fosfolpidos, polisacridos... para simular orgnulos celulares.
96.- La unin multipuntual a soportes deformables permite
estudiar la deformacin de protenas globulares.
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VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIN

9PUNTO DE VISTA BIOQUMICO

9DESVENTAJAS:

91.- Generalmente, se disminuye la actividad enzimtica al

inmovilizar.
92.- Si la preparacin enzimtica no es homognea, se dificulta la
interpretacin de los datos.
93.- A veces, se pueden originar contactos protena-protena
indeseados.

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 VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIN
9PUNTO DE VISTA APLICADO

9VENTAJAS:

91.- Se produce un gran aumento de la estabilidad de la enzima o

clula inmovilizada.
92.- Se aumenta de gran manera la productividad enzimtica por
la capacidad de reutilizacin.
93.- Se aumenta la facilidad de recuperacin y purificacin de los
productos.
94.- Se puede elegir entre una gran variedad de diseos
ingenieriles
95.- Se aumenta la facilidad de operacin y control del proceso,
al trabajar en condiciones ms suaves.

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 VENTAJAS E INCONVENIENTES DE LA INMOVILIZACIN

9PUNTO DE VISTA APLICADO

9DESVENTAJAS:

91.- Generalmente, se disminuye la actividad enzimtica.

92.- Se aumentan los problemas difusionales.
93.- Se aumenta el costo del proceso.
94.- El intervalo de pH de trabajo puede ser distinto al del
biocatalizador nativo.

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MTODOS DE INMOVILIZACIN:

Existen varias metodologas.

1.- RETENCIN QUMICA

1.1.- Enlaces covalentes
1.2.- Enlaces no covalentes. Adsorcin.
1.3.- Reticulado (cross-linking)

2.- RETENCIN FSICA = ATRAPAMIENTO

2.1.- Atrapamiento en matrices.
2.1.1.- En geles o polmeros.
2.1.2.- Micelas reversas.
2.2.- Atrapamiento en membranas.
2.2.1.- En fibras huecas.
2.2.2.- En reactores de membrana.

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1.- RETENCIN QUMICA
1.1.- Enlaces covalentes
1.2.- Enlaces no covalentes. Adsorcin.
1.3.- Reticulado (cross-linking)

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2.- RETENCIN FSICA = ATRAPAMIENTO
2.1.- Atrapamiento en matrices.
2.1.1.- En geles o polmeros.
2.1.2.- Micelas reversas.
2.2.- Atrapamiento en membranas.
2.2.1.- En fibras huecas.
2.2.2.- En reactores de membrana.

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 Mtodos qumicos Mtodos fsicos

E E
E
E
E E
E E E
E
Enlace covalente E E
Entrecruzamiento Adsorcin
Atrapamiento en
Intramolecular (no covalente) Atrapamiento en
gel polimrico
fibras
E+ E+
E E
E - - - - E
E
E Adsorcin
Microencapsulacin Atrapamiento en
E inica
E liposomas
Entrecruzamiento E
Intramolecular E
E E E E
E
Copolimerizacin de la Atrapamiento en
enzima modificada con un E
lminas de un
monmero insaturado en polmero
un gel 3D semipermeable Atrapamiento en
fibras huecas

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ELECCIN DEL MTODO DE INMOVILIZACIN:
C O M P AR A C I N D E LO S M TO D O S

IN C L U S I N U N I N
M T O D O AT R AP A M IEN T O R ET IC U L AD O AD SO R C I N
M E M B R AN AS C O VAL EN T E

PR EP AR A C I N IN T ER M ED IA D IF C IL IN T ER M ED IA SEN C IL L A D IF C IL

F U ER Z A D E L A U N I N D B IL M ED IA D EB IL -M ED IA M ED IA F U ER T E

AC T IV ID AD
M ED IA-AL T A B AJ A B AJ A M ED IA-AL T A AL T A
EN Z IM T IC A

R EG EN ER AC I N
PO SIB L E IM PO S IB L E IM PO S IB L E PO SIB L E D IF C IL
D EL SO PO R T E

C O ST E M ED IO -AL T O M ED IO M ED IO B AJO AL T O

EST AB IL ID AD M ED IA AL T A AL T A B AJ A AL T A

VAL ID EZ G EN ER AL G EN ER AL L IM IT AD A G EN ER AL L IM IT AD A

R ES IST EN C IA A
SI SI SI NO NO
C O N T AM IN A C I N

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 REQUISITOS LGICOS MNIMOS
9La enzima o clula debe ser estable en las condiciones experimentales empleadas.
9Si se emplean agentes entrecruzantes, stos no deben afectar al centro activo. Si pudieran interferir
con ste, se debe utilizar un agente entrecruzante lo ms grande posible.
9Si es posible, se debera proteger el centro activo:
9si existen grupos -SH, stos deben hacerse reaccionar con cistena o glutation, para reactivarse
posteriormente tras la inmovilizacin.
9se puede realizar la inmovilizacin en presencia de concentraciones saturantes de sustrato.
9El proceso de lavado no debe afectar negativamente a la enzima.
9Coherencia con la posterior biotransformacin.
9si soporte = polianin, la conversin de un sustrato aninico ser muy difcil (repulsin)
9enzima atrapada en un gel: si el sustrato presenta un alto peso molecular, el resultado ser
malo.
9Gran importancia de las propiedades mecnicas (estabilidad del soporte, forma fsica del mismo)
9El soporte debe presentar una alta superficie especfica, para minimizar los problemas de
transferencia de materia.
9 El soporte debe conferir al derivado inmovilizado una buena resistencia a la contaminacin
microbiana.
9El soporte debe permitir que se inmovilice una alta cantidad de biocatalizador (alto "loading").
9El soporte debe ser comercialmente accesible:
9bajo precio
9buena disponibilidad

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