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Ingeniera Industrial

ISSN: 1025-9929
fondo_ed@ulima.edu.pe
Universidad de Lima
Per

Quino Favero, Javier; Bernal Portilla, Nora; Ycono Llanos, Juan Carlos
Diseo de un proceso experimental para la produccin de papana liofilizada
Ingeniera Industrial, nm. 26, 2008, pp. 201-229
Universidad de Lima
Lima, Per

Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=337428492011

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Diseo de un proceso experimental para


la produccin de papana liofilizada

Javier Quino Favero, Nora Bernal Portilla, Juan Carlos Ycono Llanos

Ingeniera Industrial n.O 26, 2008, ISSN 1025-9929, pp. 201-229

Resumen: Se describe el diseo de un proceso tecnolgico para la obten-


cin de papana purificada a partir del ltex fresco del fruto verde de Ca-
rica papaya. El ltex fresco del fruto es resuspendido en buffer con agen-
tes protectores de la actividad de la enzima cuya concentracin y condi-
ciones de aplicacin fueron halladas de manera experimental. El extrac-
to es centrifugado para separar la materia insoluble y la solucin clarifi-
cada es sometida a precipitacin con sulfato de amonio para obtener enzi-
ma insoluble. La enzima insolubilizada es resuspendida en agua, desali-
nizada en una unidad de filtracin tangencial y el agua removida por lio-
filizacin. El proceso permite recuperar el 80% de la protena y el 65% de
la actividad original. El producto obtenido es un polvo blanco rpidamen-
te soluble en agua. Todas las etapas pueden ser escaladas para la produc-
cin comercial de papana.

Palabras clave: Papana, proteasa, carica papaya

Experimental Process design for lyophilized papain production

Abstract: A process for papain (cistein papainase) extraction and purifi-


cation from fresh latex obtained from unripped fruits of Carica papaya is
described. Samples of fresh collected latex were suspended in citrate-
phosphate buffer containing reducing agents whose concentration and
application conditions were found experimentally. The extract was cen-
trifugated and the clarified solution subjected to ammonium sulphate
precipitation. The insoluble fraction was resuspended in water, desalted
and concentrated by tangential filtration and, the remaining water re-
moved by liophylization. The process allowed 80% recovery of the initial
protein content and 65% of the original activity, the product obtained can
be described as a white powder very soluble in water. All the steps can be
scaled-up for commercial papain production.
Keywords: Papain, protease, carica papaya.

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Quino, Bernal, Ycono

INTRODUCCIN

Las enzimas son biocatalizadores, agentes de origen biolgico que ace-


leran la velocidad a la cual ocurren las reacciones qumicas al dismi-
nuir los requerimientos de energa de activacin necesaria para dichas
reacciones (Cornish-Bowden, 1995). Las enzimas no se consumen en el
proceso, por lo que una molcula de enzima sigue actuando.
La catlisis enzimtica como se denomina a la accin de las enzi-
mas es eficiente, altamente especfica, puede llevarse a cabo en con-
diciones relativamente suaves como temperatura ambiente y pH
neutro y permite un control muy preciso de la reaccin. Por ello, la
aplicacin de las enzimas a la industria se constituye en uno de los pri-
meros procesos biotecnolgicos de la qumica moderna (Roberts, Tur-
ner et al., 1995).
Las enzimas han encontrado un gran nmero de aplicaciones en la
industria, una de las clases de enzimas con mayor amplitud de aplica-
cin son las proteasas.1 Las proteasas son enzimas que provocan la hi-
drlisis o digestin de otras protenas en fragmentos ms pequeos y
en ciertas condiciones pueden ser usadas para la sntesis de nuevos
compuestos de inters farmacutico (Chaiwut, Kanasawud et al.,
2007). Una de las proteasas cuyo uso se encuentra muy difundido es
la papana, en realidad una mezcla de papana y quimopapana, que
es extrada del ltex de los frutos verdes de la Carica papaya.
Las plantas de Carica papaya tienen tallo recto, de crecimiento r-
pido y sin ramificaciones; de siete a ocho metros de alto y con un tallo
de 20 cm de dimetro. Las hojas son suaves y se encuentran agrupa-
das cerca de la parte superior de la planta. Es nativa de Amrica Cen-
tral y se ha distribuido en los trpicos, donde se cultiva hasta 32 gra-
dos de latitud, tanto hacia el norte como hacia el sur. En algunas zo-
nas tropicales es prcticamente una maleza.
La papana se encuentra en el ltex y se colecta haciendo cortes sa-
gitales en los frutos verdes, este fluye despus de hacer cortes super-
ficiales, para coagularse en la superficie del fruto despus de algunos
minutos, en un proceso similar a lo que ocurre con las heridas (Silva,

1 Medicamentos para facilitar la digestin, manufactura de vacunas, medicacin para el


tratamiento de desplazamiento de discos intervertebrales, soluciones para limpieza de
lentes de contacto, sntesis de pptidos y medicamentos antiinflamatorios, entre otros.

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Diseo de un proceso experimental para la produccin de papana liofilizada

Garcia et al., 1997). El ltex gotea en un recipiente apropiado y es se-


cado al sol o en horno a 55-60 grados. Los mismos frutos son cortados
nuevamente en diferentes lugares en intervalos semanales. Estos fru-
tos son comestibles, por lo que el ltex y el fruto son utilizados. Se han
reportado rendimientos de 20 a 25 kg de papana seca por hectrea
durante el primer ao; 90 a 100 kg durante el segundo; 60 a 90 kg en
el tercero; 30 a 40 kg en el cuarto, y 20 o menos en el quinto (Morton,
1977; Duke y DuCellier, 1993).
El 2006, el Per import casi tres millones de dlares en poco ms
de 334 toneladas de diferentes tipos de enzimas (grfico 1). Por ello,
es de inters el desarrollo de mtodos de extraccin y purificacin
avanzados para producir enzimas que satisfagan la demanda interna
y que puedan a su vez encontrar un mercado externo.

Grfico 1
Importacin de enzimas en el Per en los aos 2003-2006

3.000.000
Peso neto (kg) FOB US$

2.500.000

2.000.000

1.500.000

1.000.000

500.000

2003 2004 2005 2006

Fuente: Datatrade SAC.


Elaboracin propia.

La papana es obtenida del ltex del fruto verde de la Carica papa-


ya. La Carica es un gnero que se origin en Amrica tropical y sub-
tropical, del cual se han descrito unas 40 especies nativas desde Mxi-
co hasta el norte de Argentina. De estas especies la Carica papaya
(papaya) es la ms diseminada en los trpicos del mundo y la fuente
principal de papana.

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Quino, Bernal, Ycono

En la produccin convencional de papana se realiza una serie de


incisiones a los frutos verdes de la papaya, los que empiezan a exudar
el ltex, el que es secado al sol o en hornos, previa mezcla con sulfito
de potasio para evitar la oxidacin; luego, el ltex seco ser pulveri-
zado y vendido como papana cruda. Este proceso deteriora una canti-
dad importante de la enzima presente e introduce muchas impurezas.
A la fecha los principales exportadores de papana cruda son Sri
Lanka, Uganda y Tanzania (Duke, 1983).
El producto de estas exportaciones llega a pases industrializados,
como los Estados Unidos, en donde la papana cruda es sometida a
procesos de purificacin con la finalidad de aumentar su actividad, re-
moverle impurezas, estandarizada y aplicada a procesos industriales.
La papana cruda importada a los Estados Unidos est dentro del ru-
bro productos hortcolas miscelneos, y como puede apreciarse en la
tabla 1 el total mundial se encuentra en aumento.
Cerca del 80% de la cerveza producida en los Estados Unidos es
tratado con papana, la cual digiere los fragmentos de protena que
pueden precipitar, gracias a esta accin la cerveza se mantiene trans-
parente cuando se enfra (Duke y DuCellier, 1993).
Los procesos destinados a la separacin de la papana del ltex, puri-
ficacin, concentracin y estabilizacin aumentan significativamente el
valor de la papana cruda y le permite ingresar a mercados y procesos
productivos ms sofisticados. La tecnologa de purificacin de papana,
an en proceso de optimizacin, le da un alto valor al producto, lo cual
demuestra su gran rentabilidad y atractivo para los inversionistas del
pas. El ltex (papana cruda) es cotizado con un valor promedio apro-
ximado de US$35/kg, mientras que la papana purificada puede llegar
a costar US$160/100 g o ms para las preparaciones muy purificadas.
El precio del kilo de papaya pagado al productor en el ao 2002 fue de
S/.0,292 por kilogramo.2 Se estima que cada fruto produce unos 9 gra-
mos de ltex por kilo (Monti, Basilio et al., 2000), y cada cajn de papa-
ya comercializada podra producir 108 g de ltex.

2 Ministerio de Agricultura del Per. Cuadro 59. Precio promedio pagado al productor
(en chacra) por mes segn principales productos agrcolas y pecuarios. [en lnea] Por-
tal Agrario. <http://www.portalagrario.gob.pe/precios/pppagprod_0212.shtml>. (Consul-
ta: 27 de enero del 2008).

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Tabla 1
Importacin a los Estados Unidos de enzimas derivadas de productos hortcolas

rea/Pases de origen
y commodities importados Enero-diciembre Enero-noviembre
Importes de consumo Valores en miles de dlares Comparaciones

2002 2003 2004 2005 2006 2006 2007 variacin


Partidas arancelarias %

Total mundial Otras enzimas 3507907000 261.463 285.292 336.087 367.293 418.400 384.941 412.546 7,17
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Norteamrica Otras enzimas 3507907000 13.176 13.130 14.334 21.774 28.208 26.072 26.457 1,48
Caribe Otras enzimas 3507907000 0 47 437 51 50 50 50 0,00
Amrica Central Otras enzimas 3507907000 0 0 107 12 0 0 0 -
Amrica del Sur Otras enzimas 3507907000 3.828 3.630 2.471 5.883 5.350 4.978 8.406 68,86
Unin Europea-27 Otras enzimas 3507907000 180.762 187.500 225.125 244.815 277.767 255.148 277.300 8,68
28/01/2011

Europa (otros) Otras enzimas 3507907000 4.155 4.922 2.799 3.843 4.006 3.732 4.133 10,74
Ex Unin Sovitica Otras enzimas 3507907000 465 4.771 6.995 411 2.182 2.176 152 -93,01
Asia este Otras enzimas 3507907000 51.289 62.913 72.747 80.263 89.470 82.578 85.584 3,64
04:36

Medio Oriente Otras enzimas 3507907000 518 739 542 855 641 554 657 18,59
frica subsahariana Otras enzimas 3507907000 1.347 1.214 1.292 1.176 869 846 1.012 19,62
Asia del sur Otras enzimas 3507907000 2.161 2.601 3.357 3.402 3.753 3.406 3.243 -4,79
Asia del sureste Otras enzimas 3507907000 3.105 3.117 5.093 3.396 5.073 4.536 4.322 -4,72
Oceana Otras enzimas 3507907000 637 709 786 1.102 1.032 865 1.229 -42,08
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Fuente: Foreign Agricultural Service, Departamento de Agricultura de Estados Unidos (fecha de consulta: 22 de enero del 2008).

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En nuestro pas la disponibilidad de papaya es abundante. Existen


diversas regiones, como Hunuco, Amazonas, Ucayali, donde las con-
diciones climatolgicas favorecen el cultivo de la papaya. La necesidad
de recoleccin del ltex propicia la demanda de mano de obra, lo que
crea ms fuentes de trabajo para la poblacin.
El empleo de la papaya para la produccin de papana favorece el
ecodesarrollo; es decir, promueve el desarrollo de las regiones, al utili-
zar racionalmente los recursos naturales con estilos tecnolgicos y for-
mas de organizacin que respetan los patrones sociales y culturales.3

2. MATERIAL Y MTODOS

2.1 Obtencin de ltex de Carica papaya

Se obtuvo ltex por incisiones longitudinales realizadas a frutos ver-


des de papaya (vase fotografa). La extraccin se hizo entre las 9 y las
10 de la maana, en plantas de papaya ubicadas en el distrito de San
Borja, en Lima. Las incisiones se realizaron con la ayuda de una esp-
tula plstica. El ltex que emana de las incisiones fue recolectado en
vasos de precipitado previamente lavados con mezcla sulfocrmica y
enjuagados con agua destilada y bidestilada. Las muestras recogidas
de esa manera fueron tapadas con parafilm y almacenadas en fro en
una caja trmica con hielo para su transporte al laboratorio.

2.2 Determinacin de la concentracin de protena

La determinacin del contenido de protena en el ltex se realiz por


el mtodo de Lowry (Stoschek, 1990), utilizando como patrones alb-
mina de suero bovino (BSA Sigma) y papana liofilizada (Sigma). El
buffer alcalino consisti en 48 ml de NaOH 0.1M, conteniendo 2 por
ciento de Na2CO3, 1 ml de tartrato de sodio y potasio al 1% y 1 ml de
CuSO45H2O al 0.5%. A 100 L de muestra se le adicionaron 2000 L
de buffer alcalino y se incub por 10 minutos a temperatura ambien-
te. Luego se adicionaron 200 L de reactivo Folin-Ciocalteu diluido
(Sigma) 1:1, seguido de agitacin inmediata en un vrtex.

3 Organizacin de las Naciones Unidas. Glossary of Environment Statistics, Studies in


Methods. Series F, nm. 67. Nueva York, 1997.

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Diseo de un proceso experimental para la produccin de papana liofilizada

Incisiones en frutos de Carica papaya para obtener ltex

Se prepar una batera de estndares con concentraciones 0.2, 0.4,


0.6, 0.8 y 1.0 mg/ml de BSA o papana. Se sigui el siguiente esquema:

Tabla 2
Protocolo para cuantificar la cantidad de protena

Blanco Muestra/estndar

Agua 100 L
Muestra 100 L
Buffer alcalino 2.000 L 2000 L
Incubar por 10 minutos a temperatura ambiente
Reactivo Folin-Ciocalteau 200 L 200 L
Incubar por 30 minutos a temperatura ambiente y leer absorbancias a 600nm

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2.3 Determinacin de la actividad enzimtica

Para la determinacin de la actividad se utiliz como sustrato de reac-


cin una disolucin 25 mM de benzol-arginil-paranitroanilida (Bap-
na) (Sarath, Zeece et al., 2001), para ello se disolvi 0.1087 g de Bapna
en 10 mL de dimetilsulfxido (DMSO). Las muestras con la enzima ex-
trada fueron resuspendidas en buffer cido 4-morfolinoetanosulfnico
(MES) 0.01 M pH 6.20, que contena cistena o 2-mercaptoetanol
50 mM como agentes reductores incubadas por 10 minutos a 25C an-
tes de iniciar la reaccin por adicin del Bapna 25 mM. La hidrlisis
del Bapna por la accin enzimtica se monitore de manera continua
a 410 nm en un espectrofotmetro Perkin Elmer Lambda 40. Se sigui
el siguiente esquema:

Tabla 3
Protocolo para determinar la actividad enzimtica

Blanco Muestra/estndar

Muestra 100 L
Agua 100 L
Buffer MES 0.01M pH 6.20 1900 L 1900 L
Incubar por 10 minutos a 25C
Bapna 25 mM 100 L 100 L
Leer absorbancia de manera continua a 410 nm y calcular la pendiente en el rango lineal.

La variacin de la absorbancia con respecto al tiempo (dA/dt) per-


mite calcular la tasa de formacin de p-nitroanilida con respecto al
tiempo y determinar las unidades (Cornish-Bowden 1995). El clculo
de pendiente en la regin de linealidad se ejecut con la aplicacin
KinLab de Perkin-Elmer.

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Diseo de un proceso experimental para la produccin de papana liofilizada

La unidad se defini como la cantidad de enzima que libera un mi-


cromol de p-nitroanilida por minuto a 25C a pH 6.20. Cuando la
muestra estuvo diluida se realiz la correccin apropiada segn el fac-
tor de dilucin.

2.4 Determinacin de las condiciones de extraccin

2.4.1 Evaluacin del pH de extraccin

Para la evaluacin del pH de extraccin se realiz una extraccin con


buffer citrato-fosfato a pH 3.00, 4.00, 5.00, 6.00 y 7.00. Para ello se
efectu una dilucin 1:10 de ltex fresco en buffer.
Se tomaron alcuotas y se determin la actividad en el momento de
la extraccin (0h) y a las 24 y 120 horas. Los ensayos se realizaron por
duplicado.

2.4.2 Evaluacin del tiempo de extraccin

Se realiz una dilucin 1:10 (w/w) de ltex en buffer y se le proporcion


agitacin constante mientras la temperatura se mantuvo a 5C o a
temperatura ambiente de 25C.
Se extrajo peridicamente una alcuota de la suspensin, la cual
fue centrifugada a 5.000 g durante 10 minutos en una centrfuga He-
raus Sepatech Biofugue 200.
La actividad fue determinada en el sobrenadante, adicionalmente
se determin la cantidad de protena extrada.

2.4.3 Evaluacin de la concentracin del buffer y agentes


protectores de la actividad

Se ejecut un diseo factorial completo de tres factores en dos niveles


para medir los efectos e interacciones de los componentes, de acuerdo
con el siguiente esquema:

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Tabla 4
Diseo factorial para evaluar los efectos del buffer y
la concentracin de cistena y 2-mercaptoetanol

Experimento Concentracin Concentracin Concentracin mM


molar del buffer mM de cistena de 2-mercaptoetanol

1 0.1 0 0
2 0.1 0 50
3 0.1 50 0
4 0.1 50 50
5 0.2 0 0
6 0.2 0 50
7 0.2 50 0
8 0.2 50 50

Los experimentos se efectuaron por duplicado y la determinacin


de la actividad tambin se realiz por duplicado. Se hizo un anlisis
de varianza (Anova) en la aplicacin Systat. Todos los grficos se ela-
boraron en el programa Sigma Plot y muestran los valores promedio
desviacin estndar.

2.4.4 Precipitacin, desalinizacin y liofilizacin de la enzima

Una vez extrada la enzima en buffer suplementado con agentes re-


ductores (cistena o 2-mercaptoetanol) la enzima fue precipitada por
adicin de sulfato de amonio en cristales al sistema de extraccin has-
ta una saturacin del 45%. El producto obtenido fue concentrado por
centrifugacin durante cinco minutos a 5.000 g y resuspendido en buf-
fer hasta lograr un volumen final de 0.1 veces el volumen inicial del
volumen inicial.
La solucin obtenida se diafiltr contra agua destilada en una uni-
dad de filtracin tangencial minimate, con la finalidad de desalinizar
el producto obtenido. La diafiltracin se llev a cabo a un flujo de 1.5
ml por minuto. La solucin desalinizada fue precongelada a -20C y
liofilizada a -45C y 0.045 mbar de presin durante 6 horas. Se obtu-
vo un polvo de color blanco con bastante volumen.

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3. RESULTADOS

3.1 Ensayos para determinacin de protena

Los grficos obtenidos al medir concentraciones crecientes de pro-


tena contra la absorcin medida muestran linealidad en el rango en-
sayado. La pendiente de las curvas es diferente para el caso de la alb-
mina de suero bovino (BSA) y la papana. La papana proporciona me-
jor linealidad en el ensayo, segn se muestra en el grfico 2:

Grfico 2
Comparacin de las curvas de calibracin con papana y
albmina de suero bovino (BSA)

Determinacin de cantidad de protena por el mtodo de


Lowry: Albmina de suero bovino versus papana

0.8

0.7 BSA
Papana
0.6 BSA Regr
600nm

0.5
Absorbancia

0.4

0.3

0.2

0.1

0.0
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2
[Protena] mg/mL

3.2 Recuperacin de actividad en funcin del pH

Se logr recuperar un mayor nmero de unidades cuando el pH del


buffer de extraccin fue 3.00. Se encontr que a valores de pH ms ba-
jos (condiciones ms cidas) la recuperacin fue mayor (grfico 3).

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3.3 Efectos de la concentracin del buffer

Para todos los tiempos, el buffer citrato-fosfato pH 3.0 de mayor con-


centracin molar produjo un ms unidades recuperadas. Un mayor
tiempo de extraccin tambin produjo mayor recuperacin (vase
grfico 4).

Grfico 3
Recuperacin de unidades de enzima a diferentes pH de extraccin

Extraccin con buffer citrato-fosfato 0.01M 0.1M pH 3, 4, 5, 6 y 7


35
Actividad recuperada en el ltex (U/mL)

30 Buffer 0.02M 0h
Buffer 0.1M 0h
25

20

15

10

2 3 4 5 6 7 8
pH del buffer de extraccin

Grfico 4
Efectos del tiempo de extraccin en la recuperacin de enzima

140 Cantidad de unidades recuperadas por extraccin con buffer


citrato-fosfato 0.01M y 0.1M pH 3.0 segn tiempo
Actividad recuperada en el ltex (U/mL)

120 de extraccin de 0, 24 y 120h

100
Buffer citrato-fosfato 0.02M
Buffer citrato-fosfato 0.1M
80

60

40

20

0
0 24 120

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Diseo de un proceso experimental para la produccin de papana liofilizada

3.4 Experimentos factoriales

Se aplic un anlisis de varianza (Anova) a los resultados obtenidos


del experimento factorial. Se muestran los efectos individuales de la
concentracin de buffer citrato-fosfato pH 3.0, en concentracin 0.1 y
0.2M (grfico 5), la concentracin de cistena 0 y 50mM (grfico 6) y la
concentracin de 2-mercaptoetanol 0 y 50mM (grfico 7). Los efectos
encontrados fueron significativos para las variaciones en la concentra-
cin de buffer (p=0.004) y 2 mercaptoetanol (p=0.013), mas no para las
concentraciones ensayadas de cistena (p=0.438).

Grfico 5 Grfico 6
Efecto de la concentracin molar Efecto de la concentracin
de buffer en la extraccin de cistena (1=0mM y 2=50mM)
de papana (p=0.004) de cistena en la extraccin
de papana (no significativo)

228 222
219
210
205
Actividad

Actividad

201
192
183 188

174
165 171
0.1 0.2 1 2
Buffer Cisterna

Grfico 7
Efecto de la concentracin de 2-mercaptoetanol
(3=0mM y 4=50mM) en la extraccin de papana (p=0.013)

227

207
Actividad

187

167
3 4
ME

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Se encontraron efectos independientes entre la concentracin de


buffer empleado y la concentracin de cistena (grfico 8) o 2 mercap-
toetanol (grfico 9).

Grfico 8
Efectos combinados de la concentracin
del buffer (0.1 y 0.2M) y cistena (0 y 50 mM)

1 2
232.0 232.0

213.5 213.5
Actividad
Actividad

195.0 195.0

176.5 176.5

158.0 158.0
0.1 0.2 0.1 0.2
Buffer Buffer

Grfico 9
Efectos combinados de la concentracin
de buffer (0.1 y 0.2M) y 2-mercaptoetanol

3 4
240 240

220 220
Actividad

Actividad

200 200

180 180

160 160
0.1 0.2 0.1 0.2
Buffer Buffer

214 Ingeniera Industrial n.O 26, 2008


10-industrial 26-QUINO:REVISTA INGENIERIA 28/01/2011 04:36 Pgina 215

Diseo de un proceso experimental para la produccin de papana liofilizada

El grfico 10 muestra que en ausencia de 2-mercaptoetanol (3) la


adicin de cistena (1=0mM; 2= 50mM) produce un efecto negativo que
puede neutralizarse en presencia de 2 mercaptoetanol 50mM.

Grfico 10
Efectos combinados de cistena 0 y 50mM (1 y 2) y
2-mercaptoetanol 0 y 50mM (3 y 4)

3 4
232 232

207 207
Actividad

Actividad

182 182

157 157
1 2 1 2
Cistena Cistena

El grfico 11 muestra los efectos combinados para los tres factores


en los cuatro niveles ensayados (Buffer Citrato-Fosfato 0.1 y 0.2M, cis-
tena 0mM (1) y 50mM (2), 2-mercaptoetanol 0mM (3) y 50mM (4). Se
encontr una interaccin significativa entre los tres factores
(p=0.000).

Grfico 11
Efectos combinados de la concentracin de buffer 0.1 y 0.2M, cistena 0 y
50mM (1,2) y 2-mercaptoetanol 0 y 50mM (3,4)

1,3 1,4
244.0 244.0

222.2 222.2
Actividad

Actividad

200.4 200.4

178.6 178.6

156.8 156.8

135.0 135.0
0.1 0.2 0.1 0.2
Buffer Buffer

Ingeniera Industrial n.O 26, 2008 215


10-industrial 26-QUINO:REVISTA INGENIERIA 28/01/2011 04:36 Pgina 216

Quino, Bernal, Ycono

2,3 2,4
244.0 244.0

222.2 222.2
Actividad

Actividad
200.4 200.4

178.6 178.6

156.8 156.8

135.0 135.0
0.1 0.2 0.1 0.2
Buffer Buffer

3.5 Extraccin de actividad en funcin del tiempo

La curva de recuperacin de actividad y protena versus el tiempo a


baja temperatura (5C) y agitacin constante muestra un comporta-
miento clsico, esto es, pasado un tiempo los valores de actividad en-
zimtica y concentracin de protena muestran una tendencia a un
valor constante (grfico 12). Esto indica que ya no es posible lograr
una mayor extraccin de protena o una mayor recuperacin de la acti-
vidad enzimtica al aumentar los tiempos de extraccin. La extraccin
se realiz bajo agitacin constante, buffer citrato-fosfato 0.2M y pH
3.0. La relacin ltex: buffer de extraccin fue 1:10. Idntica a los ex-
perimentos de los grficos 3 y 4.

Grfico 12
Actividad recuperada frente al tiempo para ltex
de papaya mezclado con buffer bajo agitacin constante a 5 C

Buffer citrato-fosfato 0.2M; pH 3.0; 50mM 2-mercaptoetanol

216 Ingeniera Industrial n.O 26, 2008


10-industrial 26-QUINO:REVISTA INGENIERIA 28/01/2011 04:36 Pgina 217

Diseo de un proceso experimental para la produccin de papana liofilizada

La extraccin a 25 muestra menores niveles de recuperacin de


actividad y prdida de la actividad en el tiempo, que se evidencia por
la disminucin del nmero de unidades recuperadas al transcurrir el
tiempo (grfico 13). Este comportamiento es marcadamente diferente
a los valores estables de actividad cuando el ensayo se realiz a 5C.
La cantidad de protena recuperada al transcurrir el tiempo es muy
similar en ambos casos (grfico 14), en consecuencia la disminucin de
la actividad obedece a la desactivacin de la enzima por la temperatura.
La extraccin con buffer citrato-fosfato 0.2M; pH 3.0; 50mM 2-mer-
captoetanol y temperatura de trabajo a 5C permiti recuperar 400
U/mL de ltex en 50 minutos.

Grfico 13
Actividad recuperada durante extraccin a 5 y 25 C

Recuperacin de actividad versus tiempo de extraccin


a temperatura alta y baja

Extraccin a 25 grados Celsius


Extraccin a 5 grados Celsius
Actividad recuperada U/mL

Buffer citrato-fosfato 0.2M; pH 3.0; 50mM 2-mercaptoetanol

Ingeniera Industrial n.O 26, 2008 217


10-industrial 26-QUINO:REVISTA INGENIERIA 28/01/2011 04:36 Pgina 218

Quino, Bernal, Ycono

Grfico 14
Concentracin de protena extrada a 5 y 25 C

Concentracin de protena extrada en funcin del tiempo de extraccin


a temperatura ambiente y baja temperatura

Buffer citrato-fosfato 0.2M; pH 3.0; 50mM 2-mercaptoetanol

La medicin de la actividad y protena recuperadas permiti calcu-


lar el valor de actividad especfica: el nmero de unidades enzimticas
recuperadas dividido entre la cantidad de protena recuperada (una
medicin de la pureza del producto). Al aumentar el tiempo de extrac-
cin aumenta la cantidad de protena recuperada, lo mismo ocurre con
la actividad pero a un ritmo menor, es por ello que la pureza de pro-
ducto recuperado disminuye (vase grfico 15). Por ello, el tiempo de
extraccin para las condiciones ensayadas se estima entre 40 y 50
minutos.

218 Ingeniera Industrial n.O 26, 2008


10-industrial 26-QUINO:REVISTA INGENIERIA 28/01/2011 04:36 Pgina 219

Diseo de un proceso experimental para la produccin de papana liofilizada

Grfico 15
Actividad especfica versus tiempo
unidades proteasa/mg de protena
Actividad especfica:

Buffer citrato-fosfato 0.2M; pH 3.0; 50mM 2-mercaptoetanol

3.6 Recuperacin de la enzima

El grfico muestra la recuperacin de la enzima despus de la diafil-


tracin (desalinizacin) y la liofilizacin del extracto obtenido con buf-
fer citrato-fosfato 0.2M; pH 3.0; 2-mercaptoetanol 50mM.
El extracto inicial se toma como punto de partida y se le asign un
valor del 100% al valor de actividad medido ms alto. Las actividades
medidas para el diafiltrado y el liofilizado se calculan como porcenta-
jes del mximo inicial.
Los datos muestran promedios y desviaciones estndar, cada punto
representa cuatro mediciones independientes de actividad en un
intervalo de 3 minutos. Tambin se incluye la determinacin de la
cantidad de protena recuperada.
Se logr recobrar el 80% de la protena y se retuvo el 65% de la acti-
vidad inicial. El producto obtenido es un polvo blanco muy soluble en
agua.

Ingeniera Industrial n.O 26, 2008 219


10-industrial 26-QUINO:REVISTA INGENIERIA 28/01/2011 04:36 Pgina 220

Quino, Bernal, Ycono

Grfico 16
Balance de masa para el proceso de extraccin y purificacin de papana

Actividad relativa y cantidad de protena recuperadas


segn etapa de tratamiento

% recuperado de la cantidad inicial de protena


100 100

80 80
Actividad relativa

60 60

40 40

20 % recuperado de la cantidad inicial de protena


20
Actividad relativa

0 0
Extracto obtenido Diafiltrado Liofilizado

El grfico 17 muestra el balance de materia para el proceso disea-


do sobre la base de los resultados experimentales de la purificacin de
papana a partir de ltex de Carica papaya.

Clculos preliminares
a) Buffer de extraccin pH = 3: por 100 mL
39.8 mL de cido ctrico + 10.2 mL de Na2HPO4.12 H2O
39.8 mL x 19.21 g / 1000 mL + 10.2 mL x 71.7 g / 1000 mL

Se agrega 2-mercaptoetanol a 50mM


50x10-3 mol/L x 0.1 L x 78.13 g/mol = 0.39065 g para 100 mL de buff.

Entonces, para preparar 100 mL de buffer se requiere:


0.7646 g de cido ctrico
0.7313 g de Na2HPO4.12 H2O
0.39065 g de 2-mercaptoetanol
Completar con agua.

220 Ingeniera Industrial n.O 26, 2008


10-industrial 26-QUINO:REVISTA INGENIERIA 28/01/2011 04:36 Pgina 221

Diseo de un proceso experimental para la produccin de papana liofilizada

b) Solucin de NH4SO4 al 40%:


Se utiliza 0.243 g/mL

c) Rendimiento en la liofilizacin = 0.5 g de papana purificada / 30


mL de lquido alimentado.
Clculos realizados para el balance de materia en base a los datos
tomados el da 11 de diciembre del 2007.
Base: 8.2856 g de ltex
Buffer de extraccin
masa = 8.2856 x 90/10 = 74.57 g
= 1.009 mL
V = 73.90 mL
Lquido con papana que sale de la centrfuga 1:
masa = 75.314 g
= 1.0112 g/mL
V = 74.4798 mL
Sulfato de amonio aL 40%
masa = 74. 4798 mL x 0.243 g/mL = 18.0986 g
Masa total inicial en la etapa de precipitacin = 75.314 + 18.0986
= 93.4126 g
Masa de lquido residual que sale de la centrfuga 2 = 88.9756 g
Masa de slidos con papana que sale de centrfuga 2 = 4.4369 g
Cantidad de agua para la dilucin = 9 x 4.4369 = 39.9321 g
Lquido inicial de la liofilizacin
Masa total = 4.4369 + 39.9321 = 44.369 g
volumen total = 40 mL
Masa de papana purificada = 0.5 / 30 x 40 = 0.67g
El diagrama muestra un balance de materia expresado en kilogra-
mos para una base de 1 kg de ltex.
El factor de escalamiento fue: 1/8.

Ingeniera Industrial n.O 26, 2008 221


10-industrial 26-QUINO:REVISTA INGENIERIA 28/01/2011 04:36 Pgina 222

Quino, Bernal, Ycono

Grfico 17
Balance de masa en base a los procesos experimentales desarrollados

Extraccin y purificacin de papana a partir del fruto de papaya


balance de material para una base de 1 kilo de ltex

Papaya

Recoleccin de ltex

Ltex
1,0 kg

P-7
Buffer de extraccin
Mezclado 9,0 kg
Agitacin con enfriamiento

P-21 Slidos residuales


0,91 kg
Centrifugado

Lquido con papana

Precipitacin

Sulfato de amonio al 40%


2,18 kg
Lquidos residuales
10,74 kg
Centrifugado

Slido con papana


0,54 kg

Dilucin
Agua
4,82 kg Papana diluida
5,35 kg 4,87 L
Agua con sales residuales
Filtracin

Agua
Papana concentrada
Liofilizacin Agua

Papana purificada liofilizada


0,08 kg

222 Ingeniera Industrial n.O 26, 2008


10-industrial 26-QUINO:REVISTA INGENIERIA 28/01/2011 04:36 Pgina 223

Diseo de un proceso experimental para la produccin de papana liofilizada

Estimacin de costos

Determinacin de P.U

Cantidad Costo (US$) P.U


Ltex, g1 0.05 0.050

Agua bidestilada (l) 20 0.0427 0.85

cido ctrico, g 0.7646 0.0542 0.041


Na2HPO4.12 H2O, g 0.7313 0.0724 0.053
2-mercaptoetanol, g 0.39065 0.101 0.039
Agua bidestilada, l 0.0985 0.85 0.084
Costo buffer de extraccin pH = 3 por 100 mL 0.218
Por kg costo buffer pH = 3 2.180

Agitador magntico
Agitador magntico x hr 21600 400 0.019
Electricidad (kwh) 0.012 0.3 0.004

Incubadora
Incubadora x hr 36000 3000 0.083
Electricidad kwh 1 0.3 0.300

Centrfuga
Centrfuga (x hr) 36000 1500 0.042
Electricidad (kwh) 0.065 0.3 0.020

Solucin de amonio al 40%


Sulfato de amonio 0.872 40.8 35.58
Agua bidestilada 1.308 0.08 0.11
Costo solucin de amonio al 40% 35.69

Filtracin tangencial
Bomba peristltica
Agitador magntico
Equipo 43200 1500 0.035
Electricidad (kwh) 0.0373 0.3 0.011

Liofilizacin
Congelador 43200 6000 0.139
Electricidad (kwh) 0.7 0.3 0.210
Liofilizador 43200 14693 0.340
Electricidad (kwh) 0.7 0.3 0.210

Mano de obra
Investigador, h 4 77.193 19.298
Auxiliar, h 4 56.140 14.035

Ingeniera Industrial n.O 26, 2008 223


10-industrial 26-QUINO:REVISTA INGENIERIA 28/01/2011 04:36 Pgina 224

Quino, Bernal, Ycono

Costos del proceso de purificacin de papana

Mezclado y agitacin con enfriamiento Cantidad P.U Costo (US$)


Ltex, g 1.000 0.05 0.05
Buffer de extraccin, g 9.00 2.18 19.62
Depreciacin del equipo(hr) - agitador 0.83 0.02 0.02
Electricidad (kwh) - agitador 0.83 0.30 0.25
Depreciacin del equipo(hr) - incubadora 0.67 0.08 0.06
Electricidad (kwh) - incubadora 0.67 0.30 0.20
Investigador 1.0 19.30 19.30
Auxiliar 1.0 14.04 14.04
Costo proceso 1 mezclado y agitacin
con enfriamiento ($) 53.52
Cantidad procesada 10.000
Costo unitario proceso 1 mezclado y
agitacin con enfriamiento ($) 5.352
Factor de escalamiento 120.69

Centrifugado
Costo proceso 1 mezclado y agitacin
con enfriamiento ($) 10.00 5.35 53.52
Depreciacin del equipo - centrfuga, h 0.50 0.04 0.02
Electricidad (kwh) - centrfuga, kwh 0.50 0.02 0.01
Investigador, h 0.50 19.30 9.65
Auxiliar, h 0.50 14.04 7.02
Costo proceso 2 centrifugado, US$ 70.22
Slidos residuales, kg 0.91 4.00
Cantidad procesado, kg 9.090
Costo unitario proceso 2 centrifugado, US$ 7.725
Factor de escalamiento 120.69
Costo del proceso, US$ 16.70

Precipitacin
Costo proceso 2 centrifugado, US$ 9.09 7.72 70.22
Sulfato de amonio al 40%, g 2.18 35.69 77.80
Depreciacin del equip - agitador, h 0.17 0.02 0.00
Electricidad (kwh) - agitador, Kwh 0.17 0.00 0.00
Investigador, h 0.2 19.30 3.86
Auxiliar, h 0.2 14.04 2.81
Costo proceso 3 de precipitacin 154.69
Cantidad procesado, kg 11.270
Costo unitario proceso 3 precipitacin 13.726
Factor de escalamiento 120.65
Costo del proceso 84.47

Centrifugado
Costo unitario proceso 3 precipitacin, US$/kg 11.270 13.726 154.69
Depreciacin del equipo (hr) - centrfuga, h 0.083 0.04 0.00
Electricidad centrfuga, Kwh 0.083 0.020 0.00
Investigador, h 0.15 19.30 2.89
Auxiliar, h 0.15 14.04 2.11

224 Ingeniera Industrial n.O 26, 2008


10-industrial 26-QUINO:REVISTA INGENIERIA 28/01/2011 04:36 Pgina 225

Diseo de un proceso experimental para la produccin de papana liofilizada

(continuacin)

Costo proceso 4 centrifugado 159.69


Slidos residuales, kg 10.74
Cantidad procesado, kg 0.54
Costo unitario proceso 4 centrifugado, US$ 295.73
Factor de escalamiento 121.71 US$
Costo del proceso, US$ 5.01 9.27

Dilucin
Costo proceso 4 centrifugado, US$ 0.54 295.73 159.69
Agua de dilucin, l 4.82 0.08 0.41
Depreciacin del equipo - agitador, h 0.25 0.019 0.00
Electricidad - agitador, Kwh 0.25 0.004 0.00
Investigador, h 0.3 19.30 5.79
Auxiliar, h 0.3 14.04 4.21
Costo proceso 5 dilucin 170.10
Cantidad procesado, kg 5.36
Costo unitario proceso 5 dilucin 31.74
Factor de escalamiento 120.70 US$/kg
Costo del proceso, US 10.41 1.94

Filtracin tangencial
Costo proceso 5 dilucin 5.360 31.74 170.10
Agua de desalinizacin 5.360 0.85 4.58
Depreciacin del equipo - filtracin tangencial, h 1.000 0.03 0.03
Electricidad - filtracin tangencial 1.000 0.01 0.01
Investigador, h 1.50 19.30 28.95
Auxiliar, h 1.50 14.04 21.05
Costo proceso 6 filtracin tangencial 224.73
Cantidad procesado, kg 5.360
Costo unitario proceso 6 filtracin tangencial 41.93
Factor de escalamiento 120.81 US$
Costo del proceso, US$ 54.62 10.19

Liofilizacin
Costo proceso 6 filtracin tangencial, US$ 5.360 41.93 224.73
Depreciacin del equipo - precongelador, h 1.00 0.139 0.14
Electricidad - precongelado, Kwh 1.00 0.210 0.21
Depreciacin del equipo - liofilizacin, Kwh 10.00 0.340 3.40
Electricidad (kwh) - liofilizacin 10.00 0.210 2.10
Investigador, h 2.00 19.30 38.60
Auxiliar, h 5.00 14.04 70.18
Costo proceso 7 liofilizacin, US$ 339.35
Papana liofilizada, kg 0.08
Costo unitario proceso 7 liofilizacin, US$ 4241.86

Rendimiento en la liofilizacin 0.0149


Factor de escalamiento 120.81 US$/kg
Costo del proceso de liofilizacin,US$ 114.62 1432.7747

Ingeniera Industrial n.O 26, 2008 225


10-industrial 26-QUINO:REVISTA INGENIERIA 28/01/2011 04:36 Pgina 226

Quino, Bernal, Ycono

4. DISCUSIN

Para cuantificar la cantidad de protena se realiz el ensayo de Lowry.


En este tipo de determinacin se usa con frecuencia la albmina de
suero bovino (BSA) como estndar para realizar una curva de calibra-
cin. Dado que en este tipo de mtodos colorimtricos diferentes pro-
tenas dan como resultado diferentes valores de absorbancia, es mejor
utilizar la protena de inters papana en la construccin de las
curvas de calibracin (Stoschek, 1990). El grfico 2 ilustra estas dife-
rencias importantes en la respuesta, en especial en los lmites altos de
la determinacin.
El ltex colectado al hacer incisiones en los frutos verdes de Carica
papaya se mezcl con buffer fosfato-citrato (Stoll y Blanchard, 1990)
0.02M en una proporcin 1:10 a valores de pH, que comprendieron
desde el pH 3 hasta el pH 7. Para evaluar la actividad recuperada se
tom una alcuota de cada extracto y se llev a pH 6.20 para determi-
nacin de la actividad (segn protocolo descrito en la tabla 3). La m-
xima actividad recuperada se produjo a pH 3.0 a las 0, 24 y 120 horas
de haber realizado la extraccin. El resultado se explica porque la pa-
pana se encuentra inactiva a pH 3.0 y no se produce la autolisis o au-
todigestin de la papana por la propia papana (Greenberg y Winnick,
1940); adicionalmente a este efecto de desactivacin reversible se su-
ma el efecto que los iones fosfato y citrato tienen sobre la papana: fa-
vorecen la activacin aunque esta no se encuentre al pH ptimo (Kim-
mel y Smith, 1954). El grfico tambin indica que perodos ms largos
de extraccin brindan mayor recuperacin de la actividad.
La obtencin de enzimas a partir de extractos vegetales requiere
ambientes reductores (Gegenheimer, 1990), mxime si la enzima de
inters necesita agentes que prevengan la oxidacin (Baines y Bro-
cklehurst, 1979; Monti, Basilio et al., 2000). Por ello, se evaluaron los
efectos de dos agentes reductores comnmente usados en la extraccin
de enzimas (Nitsawang, Hatti-Kaul et al., 2006): cistena y 2-mercap-
toetanol en un diseo factorial de 2 niveles y 3 factores. El tercer fac-
tor fue la concentracin de buffer de extraccin, con una fuerza inica
superior mayor (0.1 y 0.2M) para aumentar la compatibilidad con las
concentraciones de solutos halladas en el ltex (Gegenheimer, 1990).
Se encontraron diferencias significativas que favorecieron al 2-mer-
captoetanol sobre la cistena y tambin al buffer de extraccin 0.2M
sobre la concentracin 0.1M.

226 Ingeniera Industrial n.O 26, 2008


10-industrial 26-QUINO:REVISTA INGENIERIA 28/01/2011 04:36 Pgina 227

Diseo de un proceso experimental para la produccin de papana liofilizada

La aplicacin de cistena, 2 mercaptoetanol o ambos es rutinaria en


la extraccin de las enzimas de clase similar a la papana (cistena
proteasas). Los resultados encontrados bajo las condiciones de extrac-
cin utilizadas indican que la presencia de cistena tiene un efecto ne-
gativo que no es significativo en la recuperacin de la actividad.
Visto que la extraccin no se realiz con agitacin constante se re-
pitieron las condiciones de extraccin con buffer citrato-fosfato 0.2M,
pH 3.0 y 50mM 2-mercaptoetanol y se proporcion agitacin constan-
te a 5C.
La curva de recuperacin de actividad frente al tiempo aumenta de
manera constante y el valor de actividad se estabiliza en el tiempo, lo
mismo sucede con la cantidad medida de protena extrada. Los valo-
res de actividad recuperada (grfico 12) son 4 veces ms altos que lo
logrado en los ensayos iniciales de extraccin. Para el caso de la ex-
traccin a condiciones similares pero a 25C la extraccin de protena
sigue una curva similar, sin embargo, la actividad recuperada es me-
nor y cae con el tiempo: las bajas temperaturas estabilizan la estruc-
tura de las enzimas y permiten una mejor recuperacin (Fido, Clare
Mills et al., 2004).
El extracto fue desalinizado y liofilizado para obtener un polvo de
color blanco soluble en agua.
La integracin de las diversas etapas, segn se describe en el gr-
fico 16, permite obtener 80 g de papana a partir de 1 kg de ltex fres-
co. El estimado de costos indica que la produccin de 1 kg de papana
purificada tendra un costo de US$4.241,86; el gramo de papana puri-
ficada y liofilizada se encuentra en un rango que oscila entre US$10 y
US$60, dependiendo de la pureza de la preparacin y del uso que se le
dar al producto.

5. CONCLUSIONES

Se ha logrado disear un proceso de produccin de papana a par-


tir de ltex fresco de Carica papaya. El proceso tiene cuatro etapas:
extraccin, precipitacin, desalinizacin y liofilizacin.
La extraccin de papana de ltex fresco del fruto verde de Carica
papaya requiere buffer citrato-fosfato pH 3.0, 0.2M, 50mM de
2-mercaptoetanol con relacin 1:10 (ltex:buffer) y agitacin cons-
tante a 5C.

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Quino, Bernal, Ycono

La enzima extrada se precipita con sulfato de amonio a una satu-


racin del 45% y se desaliniza por diafiltracin en un sistema de fil-
tracin tangencial.
Al final de la liofilizacin se recupera el 80% de la protena total y
el 65% de la actividad original.
El producto obtenido es soluble en el agua y puede ser estandari-
zada su comercializacin para aplicaciones en la industria de ali-
mentos.
El proceso descrito permite obtener 80 g de papana por kg de ltex
fresco.
La produccin de 1 kg de papana purificada y liofilizada tiene un
costo estimado de US$4.241,86.

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