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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTBAL DE

HUAMANGA

FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD

INSTITUTO DE INVESTIGACIN E INNOVACIN

PROYECTO DE INVESTIGACIN

Efecto genotxico del extracto hidroalcohlico y aceite esencial de


las hojas de Satureja brevicalyx Epling wayra mua en ratones,
Ayacucho 2017

Responsable: Dr. Q.F. Edwin Carlos ENCISO ROCA


Miembro: Mg. Q.F. Enrique Javier AGUILAR FELICES

Colaboradores: Mg. Q.F. Pablo Williams COMN VENTURA


Est. Sandrn Deysi CUADROS LAGOS (20120104)

AYACUCHO PER

2017
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN CRISTBAL DE HUAMANGA

Facultad de Ciencias de la salud

Instituto de Investigacin e innovacin

PROYECTO DE INVESTIGACIN

1. GENERALIDADES:
1.1. Ttulo
Efecto genotxico del extracto hidroalcohlicos y aceite esencial de las hojas
de Satureja brevicalyx Epling wayra mua en ratones, Ayacucho 2017

1.2. Responsable, miembros y colaboradores

Responsable
Dr. Q.F. EDWIN C. ENCISO ROCA
Profesor Asociado a Dedicacin Exclusiva, adscrito al Departamento Acadmico
de Medicina Humana.
Miembro:
Mg. Q.F. ENRIQUE J. AGUILAR FELICES
Profesor Asociado a Dedicacin Exclusiva, adscrito al Departamento Acadmico
de Medicina Humana

Colaboradores:
Mg. Q.F. Pablo Williams Comn Ventura
Est. Sandrn Deysi CUADROS LAGOS (20120104)
1.3. Resumen

El presente trabajo de investigacin pretende caracterizar los componentes


qumicos del extracto hidroalcohlico y aceite esencial de las hojas de Satureja
brevicalyx wayra mua y evaluar el efecto genotxico en ratones por recuento
de microncleos.

1.4. Tipo de investigacin

Bsico

Nivel:

Experimental

2
1.5. Cronograma de actividades detallado por trimestre

Dr. Edwin Carlos Enciso Roca

4
ACTIVIDAD 1 Trim. 2 Trim. 3 Trim.
Trim.

Revisin Bibliogrfica
X X X X
Responsable:

Recoleccin de las plantas y secado. X X

Caracterizacin Del extracto


X X
hidroalcohlico.

Estandarizacin del mtodo y


evaluacin de la genotoxicidad del X
extracto hidroalcohlico.

Anlisis Estadstico X

Redaccin del Informe final X

Mg. Enrique Javier Aguilar Felices

3
4
ACTIVIDAD 1 Trim. 2 Trim. 3 Trim.
Trim.

Revisin Bibliogrfica X X X X

Obtencin del extracto hidroalcohlico y


X X
aceite esencial.

Caracterizacin del aceite esencial. X X

Anlisis Estadstico X

Redaccin del Informe final X

1.5.1 fecha de inicio: enero de 2017

1.5.2 Fecha de trmino: diciembre de 2017


1.6. Recursos disponibles:
Recursos Humanos:
03 Qumicos Farmacuticos
01 Estudiante
Recursos de laboratorio:

Material biolgico.
1 kg de hojas de Satureja brevicalyx wayra mua
60 ratones de 25 a 30 g de peso corporal, adquiridos del Instituto Nacional de
Salud, ubicado en el distrito de Chorrillos de la ciudad de Lima.

Recursos de laboratorio:
Microscopio
Balanza Analtica
Centrfuga
Bao mara
Tubos de Ensayo
Matraces Erlenmeyer de 250 ml.
Pipetas de 2, 5 y 10 ml.
Vasos de precipitado de 250 ml.
Fiolas de 25, 50 y 100 ml.
Reactivos

4
Etanol absoluto
Ciclofosfamida
Colorante Giemsa
1.7. Presupuesto:
Reactivos : 2500.00
Equipos : 3000.00
Materiales de laboratorio: 1000.00
Animal de laboratorio 1000.00
Materiales de escritorio : 500.00
S/. 8000.00
1.8. Financiamiento:
Investigacin auspiciada por la Universidad Nacional de San Cristbal de
Huamanga.

2. PLAN DE INVESTIGACIN

2.1. Problema:
Tendrn efecto genotxico el extracto hidroalcohlico y aceite esencial de las
hojas de Satureja brevicalyx wayra mua en ratones?

2.2. Objetivos:
2.2.1 Objetivo general.
Evaluar el efecto genotxico del extracto hidroalcohlico y del aceite esencial
de las hojas de Satureja brevicalyx wayra mua en ratones.
2.2.2. Objetivos especficos.

Caracterizar los metabolitos secundarios presentes en el extracto


hidroalcohlico y el aceite esencial de las hojas de Satureja brevicalyx wayra
mua.
Evaluar el efecto genotxico del extracto hidroalcohlico de las hojas de
Satureja brevicalyx wayra mua en ratones.
Evaluar el efecto genotxico del aceite esencial de las hojas Satureja
brevicalyx wayra mua en ratones.

2.3 MARCO TERICO

5
2.3.1 Antecedentes

Segn informaciones etnobotnicas y etnofarmacolgicas es usada para resolver


problemas gastrointestinales y para la correccin de desrdenes menstruales. Es
digestivo, carminativo, contra la gastritis, flatulencia y antiespasmdica. Tambin
es usado como analgsico soasando las hojas en caso de dolores musculares y
tortcolis. 1,2
En trabajos realizados sobre ltex de las plantas antiverrucosas de Euphorbia
peplus L. leche leche y Ficus carica L. higo se demostr que presentan
efecto genotxico in vitro sobre el ADN genmico de linfocitos humanos.3
Al comparar la genotoxicidad in vitro de las plantas medicinales Euphorbia
peplus L. leche leche, Ficus carica higo, Caesalpinea spinosa (Molina Kuntze
tara y Eucaliptus globulus Labil eucalipto frente al ADN genmico de
Staphylococus aureus, Candida albicans, Leishmania Sp y linfocito humano se
demostr que existe diferencias en la genotoxicidad in vitro de las plantas
medicinales frente al ADN genmico de las especies estudiadas.4

2.3.2 Ubicacin taxonmica de Satureja brevicalix

Segn el sistema de clasificacin de A. Cronquist (1981) 1,5 la especie se ubica


en la siguiente categora taxonmica:
DIVISIN : Magnoliophyta
CLASE : Magnoliopsida
Sub- CLASE : Asteridae
ORDEN : Limiales
FAMILIA : Lamiaceae
GNERO : Satureja
ESPECIE : Satureja brevicalyx Epling
Nombre comn: urqu mua, wayra mua, sacha mua, mua, "inca
mua".6,7

2.3.3 Descripcin botnica


Es de porte arbustiva perennifolio, erguido de 1.0-1.5 m de altura, aromtica y
pubescente. Hojas muy pequeas, espatuladas, ssiles, verticiladas y
opuestas, de margen entero. Flores blancas, solitarias, axilares, tetrmeras,
bilabiadas; cliz gamospalo; corola gamoptala; androceo con estambres
didnamos; gineceo con ovario spero, estilo apical y estigma simple. Florece
en primavera y verano. 6,7
2.3.4 Biodiversidad del gnero Satureja

El gnero Satureja cuenta con unas 200 especies en el mundo, todas estas
especies son de regiones templadas y tropicales de ambos hemisferios de la
Tierra. En el Per se han identificado unas 26 especies, de las cuales 20 son
endmicas. La Satureja brevicalyx es una especie endmica de las regiones alto
andinas sureas del Per.1,2

2.3.5 Distribucin geogrfica

La S. brevicalyx crece en la parte sur andina del Per (Ayacucho, Apurmac,


Cuzco y Puno), entre las altitudes de 3300 3800 msnm, es de predileccin por
laderas de suelos areno-arcillosos y pedregosos. 1,2

2.3.6 Investigaciones fitoqumicas

6
El extracto hidroalcohlico evidencia los siguientes metabolitos: resinas,
azcares reductores, catequinas, lactonas sesquiterpnicas, triterpenos,
esteroides, soponinas, taninos, flavonoides y aceite esencial.7,8

2.3.7 Investigaciones farmacolgicas

Soto (1999),8 determin la actividad antiinflamatoria y analgsica del extracto


hidroalcohlico de S. brevicalyx en 400 mg/kg de peso, aproximando tal actividad
a la del cido acetilsaliclico y estando por debajo del ketorolaco.
Diez (2002),9 determin la actividad antiespasmdica sobre el intestino aislado
de cobayo de una infusin acuosa al 5% de hojas y sumidades floridas de S.
brevicalyx, mostrando una ligera accin antiespasmdica frente a la N-
butilbromuro de hioscina.
Palomino (2005),10 concluye que el extracto acuoso liofilizado de las hojas de S.
brevicalyx posee capacidad de captacin de radicales libres, en relacin a la
vitamina C. Adems no existe diferencia estadsticamente significativa en los
niveles de lipoperoxidacin, glutatin y protenas hepticas, utilizados como
medida de estrs oxidativo.

2.3.8 Test de Microncleos

Los microncleos (MN) son corpsculos citoplasmticos esfricos, detectados en


interfase, ms pequeos y con las mismas caractersticas morfolgicas que el
ncleo celular; se originan por prdida de fragmentos cromosmicos o
cromosomas enteros durante la divisin nuclear y tienen valor en el diagnstico
de genotoxicidad. El test de microncleos registra slo las clulas binucleadas
por bloqueo de la citocinesis con citochalasina B (CBMN), descartando el conteo
de mononucleadas, trinucleadas, tetranucleadas, etc. Este artificio permite
determinar qu clulas han estado expuestas al mutgeno o sustancia a probar
y han pasado recientemente primera divisin.11
En comparacin con el test de microncleos, el anlisis de aberraciones
cromosmicas en metafases proporciona ms detalle del dao, 10 sin embargo
la complejidad del anlisis cromosmico requiere de personal entrenado y mayor
tiempo para el diagnstico.13 Por otra parte, el anlisis de microncleos provee
mayor validez estadstica ya que se registra miles de clulas binucleadas,
mientras que las metafases se cuentan por cientos o menos.
La prueba de microncleos est validada internacionalmente como bioensayo
para evaluar genotoxicidad de sustancias, exposiciones agudas y crnicas, y es
una de las ms usadas para identificar agentes cancergenos.14
La iniciativa internacional The International Collaborative Project on Micronucleus
Frequency in Human Populations (HUMN), busca uniformizar el test de
microncleos; all se comparan resultados y se recopilan datos de frecuencias y
variaciones de diferentes laboratorios en todo el mundo para establecer un
protocolo estndar.15

2.4 Hiptesis
El extracto hidroalcohlico y aceite esencial de las hojas de Satureja brevicalix
wayra mua no presentan efecto genotxico en ratones.

7
2.5 Variables e indicadores
2.5.1 Variable independiente
Extracto hidroalcohlico y aceite esencial de las hojas de Satureja brevicalyx
wayra mua
Indicadores:
Dosis
100 mg/kg p.c.
250 mg/kg p.c.
500 mg/kg p.c.

2.5.2 Variable dependiente


Efecto genotxico
Indicadores:

Porcentaje de microncleos por campo

2.6 Diseo metodolgico

2.6.1 Poblacin

Planta Satureja brevicalix wayra mua recolectadas en el distrito de


Huamaguilla, provincia de Huamanga, departamento de Ayacucho, ubicado a
2740 m.s.n.m.

2.6.2 Muestra

1 kg de hojas secas de Satureja brevicalix wayra mua


2.6.3 Unidad de anlisis
60 ratones de ambos sexos de 25 a 30 g de peso corporal seleccionados
aleatoriamente, mantenidos en un ambiente y una alimentacin balanceada y
agua de forma ad libitum, obtenido en el bioterio del Instituto Nacional de Salud
Lima.

2.6.4 Procedimientos para la recoleccin de datos


Recoleccin de la muestra:
El procedimiento para la recoleccin, clasificacin de las muestras se realizarn
de acuerdo a los procedimientos de recoleccin y conservacin dadas por (Villar
del Fresno, 1999).16
Se seleccionar las hojas que no estn daadas ni maltratadas, luego se
proceder a secarlos y guardarlos, para luego ser trasladados a los laboratorios
de Farmacia y Bioqumica de la Universidad Nacional de San Cristbal de
Huamanga.

Preparacin del extracto hidroalcohlico y caracterizacin del aceite


esencial

8
Para el extracto se procede a la seleccin de las planta perfectamente secas a
temperatura ambiente bajo sombra con buena ventilacin durante 10 das
aproximadamente, previa limpieza de las mismas cuidando extenderlas para
evitar su descomposicin para ser molidas y luego maceradas. Para lo cual se
utiliza 500 g del material vegetal el cual es vertido en una botella color mbar
con 2,5 L de alcohol etlico al 80%, luego se procede a filtrar con un sistema de
vaco a 45C para luego concentrar en el rotavapor y finalmente se seca en una
estufa a 40C.17,18

Evaluacin del efecto genotxico (Test de microncleos)

Mtodo de la OECD para los ensayos de genotoxicidad (OECD, 1997) 19

Se realizar el ensayo de microncleos en ratones de 25 a 30 g de peso


corporal Se formarn cinco grupo de cuatro animales cada uno, cada grupo
deber estar formado por macho y hembras en la misma proporcin.

Se deben aclimatar durante 7 das antes y durante el ensayo los 14 das de


ensayo experimental, deben recibir alimento de la misma composicin y agua
ad libitum, a una temperatura de 20 4 C, un periodo de luz oscuridad de 12
horas. Distribucin de los grupo experimentales para el ensayo de microncleos
en sangre de ratn.

Grupos Tratamiento Dosis

1 Solucin salina 0,9% 10 ml/kg

2 Ciclofosfamida 40 mg/kg

3 Extracto hidroalcohlico/aceite esncial 100 mg/kg

4 Extracto hidroalcohlico/aceite esencial 250 mg/kg

5 Extracto hidroalcohlico/aceite esencial 500 mg/kg

9
Se utilizar ciclofosfamida a una dosis nica de 40 mg/kg, se diluye en solucin
salina al 0,9%, la solucin debe ser administrada inmediatamente despus de
ser resuspendido.20

Los tratamientos sern dados dos veces al da durante 48 horas, para luego
proceder a eutanizar con pentobarbital 100 mg/kg, este tiempo de estudio est
basado en la cintica de maduracin de los eritrocitos en ratones. 21

El procedimiento empleado para la obtencin de las preparaciones de sangre


perifrica fue utilizado de acuerdo a la metodologa propuesta Schmid et al.,
1976.22 Se tomar pequeas muestra de sangre perifrica, debiendo realizar
frotis de sangre (2 a 4 aplicadas por individuo), secado en horas de los mismos
para luego ser teidos con colorante Giemsa al 1% (previo filtrado de los
mismos). Se contara aproximadamente 1000 eritrocitos por individuo, en
campos oculares a 400 aumentos a fin de observar la frecuencia de
microncleos en eritrocitos maduros o inmaduros

Los datos sern expuestos en porcentaje de microncleos.

Diseo de investigacin

Se emplear el diseo de posprueba y grupo control.23

Ge X O

Gb - O

Gc X O

Ge : Grupo experimental

Gb : Grupo blanco

Gc : Grupo control

2.6.5 Anlisis estadstico


Los datos obtenidos sern analizados usando el paquete estadstico SPSS
(versin 19.0) para PC. Estos se presentan como valores medios (X)+/- error
estndar (EE). Las diferencias significativas de los grupos que reciben
tratamiento se determinar con el anlisis de varianza (ANOVA).

10
2.7 Referencias Bibliogrficas

1. Brako L, Zarucchi J. Catalogue of the Flowering Plants and Gymnosperms of


Per. Missouri Botanical Garden. Missouri; 1993.
2. Mostacero LJ, Meja CF, Gamarra TO. Taxonoma de las fanergamas tiles del
Per. Edit. Normas Legales. Trujillo; 2002.
3. Pillaca Untiveros L. Efecto genotxico in vitro del ltex de plantas medicinales
antiverrucosas Euphorbia peplus L. leche leche y Ficus carica L. higo,
Tesis. UNSCH; 2013.
4. Gutirrez Medina ME. Comparacin de la genotoxicidad in vitro de Euphorbia
peplus L. leche leche y Ficus carica L. higo, Caesalpinea spinosa (Molina)
Kuntze tara y Eucaliptus globulus Labil eucalipto, Tesis. UNSCH, Ayacucho
2014.
5. Cronquist A. An integrated system of classification of flowering plants. Edit.
Columbia University Press. New York; 1981.
6. Chumacero A, Iparraguirre D, Riofro O, Salas E. Gnero Satureja (Lamiaceae)
en la etnomedicina andina. Facultad de Biologa, Universidad Nacional Mayor
de San Marcos. Lima; 2003.
7. Carhuapoma YM. Plantas Medicinales Aromticas Nativas de la Provincia de
Huamanga y sus Perspectivas Econmicas. UNSCH, Ayacucho; 2002.
8. Soto VM. Estudio fitoqumico y determinacin de la actividad analgsica en
diferentes extractos de la Satuteja brevicalyx Epl wayra mua. UNSCH,
Ayacucho; 1999.
9. Diez MJ. Efecto antiespasmdico de la wayra mua Satureja brevicalyx Epl
sobre intestino aislado de cobayo. UNSCH, Ayacucho; 2002.
10. Palomino PR. Efecto antioxidante del extracto acuoso liofilizado de las hojas de
Satureja brevicalyx Epl wayra mua. UNSCH, Ayacucho; 2005.
11. Castillo E, Guevara-Fujita M, Fujita R. Optimizacin del test de microncleos
en linfocitos cultivados usando una metodologa de gradiente y frotis. Rev.
peru. biol. 2011; 18(2): 261 - 263
12. Clouston H.J. Lymphocyte culture. In: Rooney D.E. (ed) Human Cytogenetics:
Constitutional Analysis A Practical Approach 3rd ed. chap. 2, 2001. pp. 3354.
Oxford: Oxford University Press.
13. Wolstenholme J. & J. Burn. The application of cytogenetic investigations to
clinical practice. In: Rooney D.E. (ed) Human Cytogenetics: Constitutional
Analysis A Practical Approach 3rd ed. 2001 Pp 129-174.
14. Murli H. Screening Assay for Chromosomal Aberrrations in CHO Cells with
Argentyn 23. Final Report en Covance 24742-0-437 SC 2003 Natural
Immunogenics Corporation. Covance Laboratories Inc. 9200 Virginia, USA 08
April 2003 pp 1-15
15. Fenech M. Cytokinesis-block micronucleus cytome assay. Nature Protocols.
2007;2 (5): 1084-1104.
16. Villar del Fresno.1999.Farmacognosia General. Primera edicin. Editorial
sntesis. Madrid Espaa.

11
17. Aguilar E. Estudio de los flavonoides aislados de las hojas de Smallanthus
sonchifolius (yacn) y determinacin de su actividad antioxidante e
inmunomoduladora. Tesis de Maestra. UNMSM. 2007: 11-40.
18. Miranda M, Cuellar A. Manual de prcticas de laboratorio: Farmacognosia y
Productos Naturales. La Habana - Cuba: Editorial Instituto de Farmacia y
Alimentos Universidad de la Habana. 2000: 23-33.
19. OECD. Organization for economic co-operation and development. Guideline
for testing of chemicals. Mammalian Erythrocyte Micronucleus Test, 1997( pag
1-10)
20. Arencibia DF, Gutirrez A, Gmez R, Pardo B, Curveco D, Garca H.
Evaluacin genotxica del extracto del fruto de la palma real (Rosytonea regia),
mediante ensayos de microncleos en mdula sea de ratn. Revista Cubana
de Farmacia. 2009; 43 (2):8-9
21. Hayashi, M., Tice, R.R., MacGregor, J.T., Anderson, D., Blakey, D.H., Kirsch-
Volders, M., Oleson, Jr. F.B.., Pacchierotti, F., Romagna, F., Shimada, H.,
Sutou, S. and Vannier, B. In Vivo Rodent Erythrocyte Micronucleus Assay.
Mutation Res., 312, 293-304. Stokes WS, Schechtman (1994).
22. Schmid W. The micronucleus tets for cytogenetic analysis. Chemical mutagens
New York Test: Ed. A. Hollaender Plenun. 1976:31-53
23. Hernndez R, Fernndez C. Baptista P. metodologa de la investigacin. 4a Ed.
Editorial McGraw Gill Interamerica. Mxico 2008.

12
ANEXOS

13
ANEXO 1
Matriz de Consistencia
TITULO:Efecto genotxico del extracto hidroalcohlico y aceite esencial de las hojas de Satureja brevicalyx Epling wayra mua en ratones, Ayacucho 2017

Responsable: Dr. Edwin Carlos ENCISO ROCA

PROBLEMA OBJETIVOS HIPTESIS VARIABLES METODOLOGA

Problema Objetivos Hiptesis: Variables e Indicadores: 1. Tipo de investigacin: Bsico


Objetivo General:
Tendrn efecto El extracto Var. Independiente:
genotxico el hidroalcohlico y
2. Nivel de investigacin: Experimental
Evaluar el efecto genotxico del
extracto extracto hidroalcohlico y aceite aceite esencial de las Extracto hidroalcohlico
hidroalcohlico y esencial de las hojas de Satureja hojas de Satureja y aceite esencial de las3. Diseo Metodolgico
aceite esencial brevicalix wayra mua en ratones. brevicalyx wayra hojas de Satureja Poblacin: Planta Satureja brevicalyx wayra
de las hojas de Objetivos especficos: mua no presentan brevicalix wayra mua mua recolectadas en el distrito de
Satureja efecto genotxico en Indicadores: Huamanguilla, provincia de Huamanga,
brevicalyx wayra Caracterizar los metabolitos ratones. departamento de Ayacucho, ubicado a 2740
mua en secundarios presentes en el extracto m.s.n.m.
ratones? hidroalcohlico y el aceite esencial de Dosis 100 mg/kg p.c.,
250 mg/kg p.c. y 500
Muestra: 2 kg de hojas secas de Satureja
las hojas de Satureja brevicalyx
wayra mua. mg/kg p.c. brevicalyx wayra mua
Muestreo: por conveniencia.
Evaluar el efecto genotxico del Unidad de anlisis: ratones de ambos sexos de
extracto hidroalcohlico de las hojas Var. dependiente: 25 a 30 g de peso corporal adquiridos del INS.
de Satureja brevicalix wayra mua
Efecto genotxico
Evaluacin del efecto genotxico (Test de
en ratones.
microncleos), mtodo de la OECD para los
Evaluar el efecto genotxico del Indicadores : ensayos de genotoxicidad (OECD, 1997)
aceite esencial de las hojas de Diseo de investigacin: diseo de posprueba y
Satureja brevicalix wayra mua en Porcentaje de grupo control.
ratones. microncleos por campo
Anlisis estadstico: Las diferencias significativas
de los grupos que reciben tratamiento se
determinar con el anlisis de rianza (ANOVA).

14