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El estrs de la replicacin vincula el cncer estructural y el cncer La inestabilidad cromosmica

Abstracto
La inestabilidad cromosmica estructural y numrica se observan comnmente juntos en tumores
slidos ( Figura 1a-c suplementaria ) 6 . Esta co-ocurrencia puede ser inducida experimentalmente a
travs de la funcin mittica puesto de control defectuoso o fijacin cromosoma para el huso mittico, o
a travs de defectos pre-mitticas que afectan a la estructura cromosmica, tales como la reparacin del
ADN defectuoso y replicacin 6 - 10 . Sin embargo, los mecanismos subyacentes CIN en el cncer siguen
siendo poco claras.
Los cnceres colorrectales pueden clasificarse ampliamente como CIN + / aneuploide o CIN- /
microsatlite inestable 3 . CIN + clulas mostr una mayor frecuencia de errores de segregacin
cromosmica en comparacin con CIN-clulas (mediana = 38% frente a 18%, p = 0,0025, Mann-
Whitney prueba, complementaria Fig. 2a ) [ 11] . Para abordar si los mecanismos mittico o pre-mittico
son responsables de estos errores de segregacin, analizamos las imgenes de alta resolucin de anasas
en un panel de clulas CIN + CRC. La mayora de los errores de segregacin consisti en fragmentos de
cromosomas sin centromeres (acentrales, Figura 1a ) y puentes anafase (54-81%, mediana del
70%, Figura 1a, b ), indicativos de aberraciones cromosmicas estructurales que surgen a travs de
defectos pre-mittico12 . En contraste, slo el 10-43% de los errores de segregacin se estaban quedando
cromosomas con centrmeros (mediana 20%,la Figura 1a, b ), lo que sugiere que la disfuncin mittico
resultante en anexos de cromosomas impropias 6 no puede explicar la mayora de los errores de
segregacin en las clulas CIN + CRC ( complementario Fig. 2b ). Adems, la distorsin cinetocoros de
los cromosomas rezagados (que refleja adjuntos merotelic 6 ) fue raro (0-12%, la mediana del 8% de los
errores de segregacin, complementaria Fig. 2c ). No se observaron diferencias en el tiempo mittico, la
funcin de punto de control mittico, la cohesin de la cromtida hermana o los centrolos
supranumerarios entre las clulas CIN + y CIN-, y los husos multipolar fueron poco frecuentes (0-18%,
mediana del 8%Fig. 2d-i suplementaria . Estos datos sugieren que la disfuncin mittica ocurre a baja
frecuencia en clulas CIN + CRC y que la mayora de los errores de segregacin cromosmica
observados resultan de aberraciones cromosmicas estructurales. Por consiguiente, el 22-71% (mediana
del 36%) de las metafases de clulas CIN presentaban cromosomas estructuralmente anormales,
incluyendo cromosomas acntricos, cromosomas dicntricos y roturas de doble cadena de ADN ( Figura
1b, c y Figura 2j suplementaria ).
A continuacin buscamos una causa putativa para estas alteraciones cromosmicas estructurales. La
activacin de la respuesta de dao del ADN se ha observado en ambos adenomas colorrectales y
carcinomas [ 13 , 14] y se cree que reflejan el estrs de replicacin del ADN [ 13 , 15 , 16] . La induccin
farmacolgica del estrs de replicacin en clulas HCT-116 (CIN-) result en aberraciones
cromosmicas estructurales y errores de segregacin, 82% de los cuales eran puentes o cromosomas
acntricos ( Figura 3a-f suplementaria ). Es importante destacar que tambin se indujeron cambios
cromosmicos numricos ( Figura 3g, h ), lo que demuestra que el estrs de replicacin puede dar como
resultado una inestabilidad cromosmica tanto estructural como numrica 17.
El estrs de la replicacin del ADN da lugar a una serie de fenotipos celulares incluyendo el dao del
ADN en prometafase 10 , 15 , 16 , puentes ultrafinos de ADN anafase (UFB) 16 y cuerpos nucleares positivos
53BP1 en clulas G1 15 , 18 ( Figura 1d y Fig. 3i - m ). Clulas CIN + muestran dao en el ADN
prometaphase elevada (mediana 74% CIN + frente a 34% de clulas CIN- con 3 H2AX focos, Figura
1d, e (p = 0,033, prueba de Mann-Whitney)) en ausencia de un aumento de dao oxidativo del ADN
( Fig complementario 4a - c ). H2AX focos no se limitan a telmeros ( Suplementario Fig. 4d, e). Las
clulas CIN + tambin mostraron ms cuerpos nucleares 53BP1 en clulas G1 ( Figura 1d, f , p = 0,028,
prueba de Mann-Whitney). En consonancia con la hiptesis de que el estrs de replicacin puede
conducir a errores de segregacin cromosmica en CIN + clulas, UFBs se enriquecieron en anaphases
con errores de segregacin en comparacin con anasis sin errores de segregacin ( Figura 1d, g , p =
0,00018, pareado t-test).
Para evaluar directamente la replicacin del ADN, se realizaron ensayos de fibra de ADN para dos
lneas celulares CIN y cuatro CIN +, para medir la progresin de horquillas de replicacin individuales,
el bloqueo de horquillas y la asimetra entre horquillas de replicacin hermanas. Clulas CIN + muestran
tasas de horquilla significativamente ms lentas en relacin con CIN- lneas celulares (0,56-0,83 kb /
min en comparacin con 1/11 a 1/12 kb / min, p <0,05, Figura 1h, i , complementario Fig. 5a, b .
Adems, no haba pruebas De aumento de la horquilla de replicacin de horquilla y la progresin
asimtrica de la horquilla hermana en varias lneas celulares CIN + ( Figura 5c-e suplementaria), En
consonancia con la progresin deteriorada de la horquilla de replicacin. Estos datos indican que el
estrs de replicacin elevado, como se demuestra utilizando marcadores establecidos y medicin directa
de la progresin de la horquilla de replicacin, puede contribuir sustancialmente a la desregulacin
cromosmica en clulas CIN + CRC.
Buscamos una base gentica para el estrs de replicacin elevada y errores de segregacin cromosmica
en clulas CIN +. El examen de los datos de secuenciacin de exome completo en los tumores
colorrectales de The Cancer Genome Atlas (TCGA) [ 19] , y el estado de mutacin de 64 genes en las
lneas celulares de CRC (COSMIC), revel que el nico gen mutado a frecuencias significativamente
ms altas en CIN + TP53 , que tambin est mutado en el 13-33% de los tumores CIN y lneas celulares
( Figura 6a, b ). Se cree que las mutaciones en TP53 son permisivas para CIN en lugar de
causales 20 . Estos datos sugieren que aunque las mutaciones en oncogenes conocidos o supresores de
tumores pueden contribuir al estrs de replicacin en las clulas cancerosas 14 ,21 , es poco probable que
expliquen exclusivamente el estrs de replicacin elevado en clulas CIN + CRC. Por lo tanto, se abord
si las aberraciones genticas adicionales pueden contribuir a CIN.
Hemos planteado la hiptesis de que las regiones de la prdida de nmero de copia somtica consistente
en CIN + CRC podra codificar CIN-supresor de los genes, la prdida de lo que podra contribuir a la
induccin de cromosoma missegregation. Para identificar las regiones de prdida especficas de CIN, se
analizaron datos de hibridacin genmica comparativa (CGH) para una cohorte de 26 tumores
colorrectales aneuploides y 20 lneas celulares CIN +. Cromosoma 18q fue ms frecuentemente sujetos a
copiar prdida nmero, observada en 88% de los tumores aneuploides y 80% de lneas celulares de CIN
+, ( Figura 2a, b y el cuadro complementario 1 ) consistente con los estudios publicados en CRC y otros
tipos de tumores 22 - 24 . Las prdidas de nmero de copias en los tumores CIN + y las lneas celulares
fueron altamente concordantes (p <0,001, prueba exacta de Fisher, Tabla Suplementaria 2). A
continuacin examinamos la secuencia temporal y las consecuencias de la prdida del nmero de copias
18q en los tumores. En una cohorte de 28 adenomas (tumor preinvasivo) con carcinoma en el mismo
espcimen ( Figura 2c ), se observ una prdida de 18q de heterozigosidad (LOH - indicativo de la
prdida del nmero de copias) en 21/28 (75%) carcinomas, 28 (35,7%), lo que implica una prdida de
18q en la transicin adenoma-carcinoma. 18q LOH se asoci significativamente con la aneuploida en
ambos adenomas y carcinomas ( Figura 2d , Suplementario Fig. 6c ].
Para identificar los genes supresores de CIN candidatos codificados dentro de regiones de prdida
recurrente de nmero de copias, se transfectaron clulas HCT-116 con grupos de cuatro ARNsi dirigidos
a los genes ms frecuentemente perdidos, presentes en 1 copias en al menos 30% de lneas celulares
CIN + (94 Genes codificados en el cromosoma 18q, Tabla complementaria 3 ). Despus de 48 horas se
cuantificaron errores de segregacin de anafase ( Figura 7a suplementaria ). Es importante destacar que
este enfoque identificara los defectos mittico y pre-mittico. SiRNA piscinas inducir errores de
segregacin a 3 desviaciones estndar por encima de la frecuencia en el control de clulas
transfectadas se evaluaron en los ensayos de validacin. Todas las secuencias dirigidas a PIGN,
RKHD2 y ZNF516 indujeron errores de segregacin y niveles de mRNA agotados eficientemente
(Figura 7b-d suplementaria . Independiente secuencias de ARNsi independiente de cada uno de los tres
genes tambin indujeron errores de segregacin ( Suplementario Fig. 7e ) y estos genes fueron
priorizados para su posterior anlisis, aunque no podemos excluir una contribucin de otros genes
codificados en 18q a CIN. De la nota, RKHD2 es el nico codificador de la protena del gen situado
entre dos genes implicados en la carcinognesis CRC, DCC y SMAD4 . Se observa la prdida del
nmero de copias de PIGN, RKHD2 o ZNF516 en el 85% de las 20 lneas celulares CIN + y el 84% de
los tumores aneuploides (n = 103) en la cohorte independiente TCGA 19, Con la prdida de los tres genes
en el 70% de las lneas celulares CIN + y el 79% de los tumores aneuploides ( cuadro complementario
4 ). Es importante destacar que la reduccin del nmero de copias se correlacion significativamente con
la reduccin de la expresin de mRNA para los tres genes tanto en el TCGA tumor cohorte y CRC
lneas celulares ( Figura 2e , Suplementario Fig. 8a y la Tabla 5 suplementario ).
Seguidamente se asegur fuera de los objetivos de siRNA efectos contra MAD2 (mittico punto de
control de protenas) y RAD51 (ADN reparacin de protenas), no estaban causando cromosoma
missegregation ( Supplemental Fig. 8b-e ) [ 25] . Dos secuencias de RKHD2 agotaron parcialmente la
protena MAD2, y se excluyeron del anlisis posterior. Adems, la expresin de RKHD2-GFP exgeno
rescat los errores de segregacin inducidos al silenciar la RKHD2 endgena usando un siRNA dirigido
a UTR 3 ', y la expresin de PIGN-GFP resistente a ARNsi y ZNF516-GFP redujeron los errores de
segregacin inducidos por agotamiento de PIGN endgeno o ZNF516 Fig. 8f suplementario ). Silenciar
cada supresor de CIN tambin indujo errores de segregacin en dos lneas celulares CIN-CRC
adicionales, DLD1 y RKO, y en clulas CIN + NCIH508 18q-normales (Figura 9a-c suplementaria . La
induccin de los errores de segregacin fue independiente de la sealizacin oncognica KRAS en
clulas HCT-116, como los errores de segregacin tambin fueron inducidos despus de silenciamiento
del gen supresor de CIN en una lnea celular isognica de tipo salvaje KRAS ( Figura 9d ).
El silenciamiento de genes supresores de CIN en las clulas HCT-116 primariamente inducido
cromosomas acntricos y puentes anafase ( Figura 3a ) en ausencia de defectos mitosis gruesos (datos no
presentados), similar a las observaciones en lneas celulares CIN + CRC con prdida de 18q ( Figura
1b ). Esto sugiri un origen pre-mittico para estos errores de segregacin cromosmica y, en
consecuencia, se observ una mayor frecuencia de cromosomas estructuralmente anormales ( Figura 3a,
b , Figura 10a suplementario ). Para evaluar la no disyuncin del cromosoma, se construyeron lneas
celulares HCT-116 que expresaban de forma estable ARNs de horquilla pequea (shRNAs). ShRNA
mediada silenciamiento de cada gen supresor de CIN aumento de la frecuencia de error de segregacin
( Suplementario Fig. 10b) Y los clones de clulas individuales crecidos a partir de cada lnea celular
mostraron una desviacin intra-colonia significativamente incrementada para los cromosomas 2 y 15
( Figura 3c, y Figura 10c suplementaria ), indicando que el silenciamiento de genes supresores de CIN
induce inestabilidad tanto estructural como numrica.
A continuacin, examin el estrs de replicacin despus de silenciamiento del gen supresor de CIN. Se
observ una elevacin del dao prometafsico del ADN ( Figura 3e ), lo que aument
concomitantemente con el aumento de la frecuencia de error de segregacin ( Figura 10d ), apoyando la
hiptesis de que el dao observado en el ADN refleja una causa y no una consecuencia , De errores de
segregacin. Silenciamiento de cada gen CIN-supresor tambin result en cuerpos 53BP1 elevados en
clulas G1 ( Figura 3F ), que no fueron afectados por la citocinesis-inhibicin, y por lo tanto poco
probable que refleje la citocinesis inducida por dao en los cromosomas 7 , 15 ( complementario Fig. 10e-
g). Silenciando PIGN y ZNF516 tambin aument significativamente la frecuencia de UFB ( Figura
3g ). Consistente con la prdida de genes supresores de CIN que contribuyen al estrs de replicacin en
las clulas CIN +, la co-expresin transitoria de PIGN, RKHD2 y ZNF516 dio lugar a una reduccin
parcial de cuerpos G1 53BP1 en 3 CIN + lneas celulares con 18q prdida ( Supplemental Fig. 11a-
d ). Los ensayos de fibra de ADN revelaron un cambio en la distribucin hacia velocidades reducidas de
horquilla de replicacin al silenciar cada uno de los genes supresores de CIN en clulas HCT-116, con
velocidades de horquilla promedio reducidas despus de silenciar PIGN y ZNF516 ( Figura 3h,
i y Figura 12a, ). Adems, se observ una mayor asimetra hermana horquilla despus de silenciar a cada
uno de los tres genes (Suplementario Fig. 12c ) en consonancia con la degradacin de la progresin
horquilla de replicacin.
Estos datos sugieren que los errores de segregacin resultante de silenciamiento de genes supresores de
CIN son impulsados por el estrs de replicacin. Para probar an ms esta hiptesis, HCT-116 clulas
transfectadas con siRNAs contra CIN-supresor de los genes fueron complementados con nuclesidos,
mostr anteriormente para reducir la replicacin inducida por el dao del ADN [ 5] . Los nuclesidos
redujeron significativamente la induccin de errores de segregacin despus del silenciamiento de PIGN
(62% a 32%), RKHD2 (57% a 36%) y ZNF516 (43% a 34%), mientras que los errores de segregacin
control no fueron afectados ( Figura 4a). A continuacin, se comprob si la suplementacin con
nuclesidos podra atenuar la desregulacin cromosmica en lneas celulares CIN + con prdida de
18q. La suplementacin con nuclesidos redujo significativamente la frecuencia del error de segregacin
en un 45-55% y atenu el dao del ADN prometafsico en un 28-43% en cuatro lneas celulares CIN +
( Figura 4b, c , Figura 13a suplementaria ), indicando la supresin del dao del ADN inducido por la
replicacin y el cromosoma subsiguiente Missegregation. El alcance de la reduccin mediada por
nuclesidos en los errores de segregacin implica que de novoLa generacin de aberraciones
cromosmicas estructurales es responsable de una gran proporcin de eventos de desregulacin
cromosmica en clulas CIN +. Por el contrario, la suplementacin con nuclesidos no afect la
frecuencia del error de segregacin en cuatro lneas celulares CIN o clulas CIN + NCIH508 18q-
normales ( Figura 13b, c ). Nucleoside suplementacin no afect a la proliferacin, la distribucin del
ciclo celular, o los niveles de ATP celular ( Supplemental Fig. 14a-f ) 5 .

En conclusin, nuestros hallazgos implican el estrs de replicacin como un importante factor de inestabilidad
cromosmica en la CRC. Adems de la degradacin de la progresin de la horquilla de replicacin, las clulas CIN
+ presentan dao de ADN asociado al estrs de replicacin y cromosomas estructuralmente anormales que se
mezclan mal durante la mitosis, relacionando la inestabilidad estructural y numrica. El complemento de las
clulas CIN + con nuclesidos redujo tanto el dao al ADN como los errores de segregacin, apoyando un papel
directo para el estrs de replicacin en la conduccin del CIN. Dada la naturaleza compleja del estrs de
replicacin y CIN, es probable que haya mltiples aberraciones genticas que contribuyen a estos fenotipos
dentro de un tumor individual. Aqu, sugerimos un mecanismo gentico putativo que puede contribuir a CIN en
CRC, a travs de la prdida recurrente de una regin en el cromosoma 18q, Codificando tres supresores
nuevamente identificados del estrs de replicacin y de la missegregacin cromosmica. La prdida del
cromosoma 18q en muchos tipos de tumores slidos sugiere la posible contribucin de este locus a CIN en
tumores ms all de CRC. Adems, los informes de estrs de replicacin del ADN a travs de mltiples tipos de
tumores sugieren que el estrs de replicacin puede ser una ruta comn a CIN y la heterogeneidad
intratumoral13 ,26 . Los esfuerzos para dirigir o restringir el estrs de replicacin pueden por lo tanto proporcionar
un enfoque racional para limitar la diversidad de tumores, la evolucin del genoma y la adaptacin.

Materiales y mtodos

Lneas celulares
Las clulas se mantuvieron a 37C con CO _ { 2} al 5% en DMEM con medio L - Glutamina (Gibco) o
RPMI 1640 (clulas Gibco - NCIH747), suplementado con FBS al 10% y 1/10000 unidades de
Penicilina - Estreptomicina (Sigma) . La lnea celular de la CIN se defini como se describe
anteriormente [ 28] .

Tratamientos celulares
Todos los compuestos eran de Sigma. Nocodazol: 50 o 100 ng / ml. Afidicolina: 0,2 \ mu M, 24
h. Monastrol lavado: 100 M, 1 o 16 h, lavado 3 veces en medio fresco antes de 75 minutos de
recuperacin. Blebbistatina: 100 \ mu M, 4 h. Nuclesidos: Se prepararon recientemente adenosina,
citidina, guanosina y uridina para cada experimento, se esterilizaron por filtracin y se usaron a 0,3 30
M. H 2 O 2 : 350 M, 4 h, antes de la recuperacin 16 h.

Propagacin de metafases y preparacin de FISH clonal


Propagacin de la metafase : Las clulas se cosecharon despus de 1 h de tratamiento con 10 mM de
colcemid (Gibco), se hincharon con KCl (0,4%, 37C, 7 min) antes de la fijacin en metanol: cido
actico 3: 1. Las clulas se dejaron caer sobre portaobjetos de vidrio y se envejecieron durante ~ 2
semanas. Se utiliz una sonda centrmero humano (Poseidon) de acuerdo con las instrucciones del
fabricante. PESCADO CLONAL: Se expandieron 500 clulas en colonias de 30-60 clulas sobre placas
de vidrio antes del tratamiento con KCl y fijacin en metanol: cido actico 3: 1. Las lminas se
desnaturalizaron (70 C en citrato de sodio 2X (2XSSC) / formamida al 75%, 2 min, se apagaron en
etanol al 70% enfriado con hielo) y se deshidrataron a travs de una serie de etanol. Se desnaturalizaron
las sondas (CEP2 (D2Z1 Spectrum orange), CEP15 (D15Z1 Spectrum green, sondas Abbott Molecular),
se hibridaron a los portaobjetos (16 h, 37C), despus se lavaron (50% de formamida / 2XSSC y 2XSSC
a 42 C, seguido de lavados 4XSSC y PBS a temperatura ambiente) .Los portaobjetos fueron
deshidratados y montados en Vectashield hardset ms medio de montaje DAPI (H-1500).

Inmunofluorescencia
Las clulas cultivadas en cubreobjetos se fijaron en: 10% Triton X-100, 1 M PIPES, 0,5 M EGTA, 1 M
MgCl 2 , 4% formaldehdo. Anticuerpos primarios de ratn: -tubulina (1: 1000 Sigma T6074), NDC80
(1: 800 Abcam Ab3613), centrina3 (1: 1000 Abcam Ab54531) ciclina A1 (1: 350 Santa Cruz sc-56299),
fosfo-histona H2A. Anticuerpos primarios de conejo: 53BP1 (1: 500 sc - 22760), \ beta - tubulina (1:
1000, Abcam), RPA (1: 500 Millipore 05 - 636) Y anticuerpos anti-centromricos humanos (ACA) (1:
250; Antibodies Incorporated). Anticuerpos secundarios (sondas moleculares utilizadas a 1: 500): Anti-
ratn de cabra conjugado con AlexaFluor 488 ( A11017 ), AF594 de cabra anti-conejo ( A11012 ),
AF647 anti-humano de cabra ( A21445). El ADN se ti con DAPI (Roche) y cubreobjetos montados en
Vectashield (Vector H-1000). La preparacin y la inmunotincin de los pliegues de metafase se realiz
como se describe anteriormente [ 29] . La mayora de las imgenes fueron adquiridas usando un
microscopio Olympus DeltaVision RT (Applied Precision, LLC) equipado con una cmara Coolsnap
HQ. Las pilas de imgenes 3D se adquirieron en pasos de 0,2 m, utilizando un objetivo de inmersin de
aceite Olympus 100x o 60x 1.4NA UPlanSAPO. La deconvolucin de pilas de imgenes y mediciones
cuantitativas se realiz con SoftWorx Explorer (Applied Precision, LLC).

Ensayos de Fibras de ADN


Las clulas se sembraron ( siRNA transfeccin) 48 h antes de la marcacin secuencial de pulso con
CldU y IdU (Sigma Aldrich, cada 30 min cada uno) y la cosecha de ADN para los ensayos de fibra
como se describe anteriormente [ 30] .

Interferencia de ARN
SiRNA transfections se realizaron a 40 nM por reverso de transfeccin con Lipofectamine RNAiMax
(Invitrogen). Vase la Tabla Suplementaria 6 para las secuencias utilizadas. La pantalla se llev a cabo
en placas de 12 pocillos (0,5 x 10 5 HCT-116 clulas / pocillo en cubreobjetos) utilizando siGENOME
SmartPools (Dharmacon) con un pocillo de control por placa (Dharmacon no.2 control). Despus de 48
h las clulas se fijaron y se tieron para -tubulina. 30 anaphases / siRNA pool fueron anotados
manualmente para los errores de segregacin.

Las transfecciones de ADN y la mutagnesis de construccin marcada con GFP


Clulas H2B-mRFP : Las clulas se transfectaron con pH2B-mRFP (regalo de A. Straube) usando
Fugene 6.0 (Promega) y se seleccionaron en 1 mg / ml de G418 antes de la clasificacin por flujo para la
expresin de mRFP. Las clulas se mantuvieron en 500 g / ml de G418. Sntesis de la lnea celular
ShRNA : Las clulas HCT-116 se transfectaron con plsmidos shRNA (Open Biosystems, vase
la Tabla Suplementaria 7 ) usando Fugene 6.0 (Promega) y se seleccionaron en puromicina 0,5 M
durante 2-3 semanas. Se amplificaron 3 colonias por ARNhc, se extrajo ARN y se evalu el
silenciamiento mediante qPCR. Se seleccionaron colonias con silenciamiento eficiente. Las lneas
celulares se mantuvieron en puromicina 0,5 \ mu M. PIGN / RKHD2 / ZNF516-GFP: Para el
experimento de rescate de siRNA en la Figura 8f suplementaria, 1 g (PIGNins-GFP, RKHD2-GFP) o
0,5 g (ZNF516ins-GFP) o bien co-transfectadas con siRNA utilizando Lipofectamine RNAiMax
durante 48 h (RKHD2) o transfectadas 24 h despus de la transfeccin siRNA utilizando Lipofectamine
2000 (Invitrogen) Durante 24 h (PIGN y ZNF516). Para co-transfeccin en lneas celulares CIN +, se
transfectaron 2 g de ADN total usando Lipofectamine LTX Plus (Invitrogen), de acuerdo con las
instrucciones del fabricante. PIGN- y RKHD2-GFP eran de Geneocopoeia, ZNF516-GFP era de
Origene. Mutagnesis insensible a siRNA: Se utiliz el kit de mutagnesis dirigida al sitio Quikchange
XL (Stratagene) para crear tres desajustes de bases en secuencias diana de ARNsi para oligo 3 de PIGN
y oligo 3 de ZNF516 en PIGN-GFP y ZNF516-GFP, respectivamente. La mutagnesis se confirm por
secuenciacin.
Extraccin de ARN y RT-qPCR
El ARN se extrajo utilizando el kit Qiagen RNeasy. La transcripcin inversa se realiz utilizando el kit
de sntesis de cDNA de First strand (Amersham). El qPCR se realiz en placas de 96 pocillos utilizando
sondas / cebadores TaqMan previamente diseados en un sistema ABI 7900HT (Applied
Biosystems). Todas las reacciones se realizaron por duplicado. La cantidad relativa de ARNm se calcul
usando el mtodo de CT comparativo despus de la normalizacin a GAPDH.

Western blot
Los extractos de protena celular se separaron en geles NuPAGE 4-12% Bis-Tris (Invitrogen) y luego se
transfirieron a una membrana de fluoruro de polivinilideno (Millipore). Las membranas se incubaron
con anticuerpos: MAD2 (ratn 1: 1.000 BD-Biosciences 610678), RAD51 (ratn 1: 1.000 Abcam
ab213), GFP (ratn 1: 1000, sc-9996), Turbo-GFP (conejo 1: 1000, Evrogen ) En leche al 5% en
solucin salina tamponada con Tris, y se detect con anticuerpo secundario conjugado con HRP (1:
10.000 Dako) y quimioluminiscencia (ECL, Amersham Biosciences). Se cuantific la carga con anti--
actina conjugada con HRP (1: 100.000, Sigma).

Microscopa de lapso de tiempo


Se cultivaron clulas marcadas con H2B-mRFP en placas de cmara de 8 pocillos (LabTek). Se
adquirieron 14 pilas z de 14 m (7 imgenes) con un objetivo de inmersin de aceite UPlanSAPO
Olympus 40x 1.3 NA cada 3 min durante 6 h usando un microscopio DeltaVision en una cmara
controlada por temperatura y CO 2 . El anlisis se realiz con Softworx Explorer.

Citometra de flujo
ndice mittico : Las clulas se fijaron en etanol al 70% y se tieron con anticuerpo anti-MPM2 de ratn
(3: 500 Millipore 05-368, durante la noche a 4 C) y AF647 de cabra anti-ratn (sondas
Molecular A21463 ) y DAPI. 8-oxo-guanina : clulas ( tratamiento H 2 O 2 ) se fijaron en formaldehdo
al 4%, ADN desnaturalizado en HCl 2 M durante 20 minutos, y se tieron con anti-8-oxoguanina de
ratn (1: 200 Abcam ab62623). Los datos se procesaron utilizando el software FlowJo.

Inmunohistoqumica
Los grnulos de clulas embebidos en parafina ( tratamiento de H 2 O 2 ), se seccionaron a 4 m, se
depilaron en xileno y despus se rehidrataron a travs de series de etanol en agua. La peroxidasa
endgena fue bloqueada (1,6% H 2 O 2 , 10 min), seguido de incubacin con 10% de suero de caballo
normal (30 min). Las secciones se incubaron con anti-8-oxoguanina de ratn (1: 1000, 1 h), se lavaron
3x en PBS, luego se incubaron con anticuerpos anti-ratn de caballo biotinilados (Vector Labs 1: 400,
35 min). Despus del lavado, se aadi sustrato de peroxidasa (DAB) (2 min), se lavaron las placas en
agua y se contracoloraron con hematoxilina. Los portaobjetos se lavaron, se deshidrataron y se montaron
en un soporte de tipo DPX.

Ensayos de proliferacin
Las placas se formaron imgenes utilizando un IncuCyte a largo plazo in situ Sistema de imgenes de
clulas, dentro de una incubadora. Las imgenes de contraste de fase se adquirieron cada 2 h durante 72
h y se determin automticamente la confluencia de la monocapa celular. Se excluyeron los pozos
perifricos y se construyeron curvas de crecimiento. Las tasas de crecimiento se calcularon midiendo el
gradiente de la fase de crecimiento lineal.

Medicin de ATP
Despus de la suplementacin con nuclesidos, las clulas se trataron con el reactivo Cell Titer Glo
(Promega). Las medidas de control se tomaron de pozos con medios nuclesidos. Los niveles de ATP
se normalizaron a la biomasa / pocillo (In Vitro Toxicology kit de ensayo Sulforhodamine B solucin -
Sigma).

Procesamiento de array SNP 6.0


Lneas celulares : Se obtuvieron datos de Affymetrix SNP 6.0 para 20 lneas de CIN + y 9 CIN-
(Wellcome Trust Sanger Institute). Nmero de nmeros enteros se estimaron para cada sonda SNP
utilizando el algoritmo PICNIC [ 31] . TCGA: Los datos de Affymetrix SNP 6.0 se descargaron para 365
muestras de CRC y las relaciones logR y las diferencias allicas se calcularon mediante la Affymetrix
Genotyping Console . Se excluyeron muestras que fallaron en los parmetros de control de calidad de
Affymetrix. Se excluyeron todos los tumores con <60% de ncleos tumorales (basados en estimaciones
patolgicas de secciones adyacentes). Para estimar el nmero de copias, se us el algoritmo
GAP 32. Ploidy se calcul mediante el clculo de la mediana ponderada nmero de copias en todos los
segmentos de nmero de copia, con pesos igual a la longitud del segmento. Los segmentos de nmero de
copias de prdida y ganancia se definieron con relacin al estado de ploida de cada muestra restando la
estimacin de ploida del nmero de copias estimado del segmento.

Puntuacin de complejidad cariotpica


Puntuacin de Complejidad Estructural (SCS) : definida como la suma de todas las regiones
estructuralmente aberrantes. Las regiones de ganancia y prdida intra-cromosmicas se definieron con
relacin al nmero de copias modal del cromosoma, y cada regin se cont como una aberracin
estructural. Para evitar la sobreestimacin, las regiones aberrantes <1 MB fueron excluidos. Puntuacin
numrica de complejidad (NCS): La suma de todas las ganancias y prdidas cromosmicas completas
(los cromosomas con> 75% de los valores del nmero de copias SNP ms altos o ms bajos que la
ploida de la muestra se contaron como ganancias o prdidas cromosmicas completas
respectivamente). Mltiples eventos de nmero de copias que afectan al mismo cromosoma se
puntuaron por separado (por ejemplo, -2 copias = 2 prdidas de cromosomas). NCS y SCS resultados
fueron divididos por 1,5 para las lneas celulares triploides, y por 2 para las lneas celulares tetraploides,
para dar cuenta de la mayor probabilidad de anomalas cariotpicas en los genomas poliploides. ndice
de inestabilidad del genoma ponderado: Como las medidas del ndice de ADN basadas en FACS no
estaban disponibles para los tumores TCGA, y la informacin sobre el estado de MSI no estaba
disponible para un nmero suficiente de tumores, se requera un medio alternativo de clasificacin. El
ndice de inestabilidad del genoma (GII) 33Es el porcentaje de SNPs a travs del genoma presente en un
nmero de copia aberrante, en relacin con la ploida de lnea de base de la muestra. Hemos adaptado el
GII a fin de tener en cuenta la variacin en el tamao de los cromosomas, de modo que los grandes
cromosomas no tienen un mayor efecto sobre la puntuacin de los pequeos cromosomas:% aberrante
SNPs para cada cromosoma se calcul por separado y la media de aberracin a continuacin, . Para
definir un umbral para CIN- frente a CIN +, se calcul el GII ponderado (wGII) para las lneas
celulares. Un umbral de 0,2 distinguido con precisin CIN + de CIN-, como se defini anteriormente
[ 28] . El mismo umbral se aplic entonces a la cohorte TCGA de tumores.

Datos de secuenciacin (TCGA)


Se obtuvieron datos de mutacin somtica de nivel 2 preprocesados de The Cancer Genome Atlas
Research Network 19 para 101 tumores colorrectales para los que tambin se dispona de datos de
nmero de copias de SNP 6.0. Todos los genes con 5 mutaciones somticas fueron excluidos del
anlisis. Los tumores colorrectales se clasificaron como CIN + usando wGII> 0,2. Los datos de
mutacin somtica para las 29 lneas celulares de cncer colorrectal se obtuvieron de la base de datos
COSMIC ( http://cancer.sanger.ac.uk/cancergenome/projects/cosmic/ ). La asociacin del estado CIN
con el estado de mutacin somtica de TP53 , APC , SMAD4 y KRASSe prob con pruebas exactas
unilaterales de Fisher y los valores de p se ajustaron para pruebas mltiples con el mtodo Benjamini &
Hochberg 34

Definicin de las prdidas del nmero de copias somticas en CIN + frente a los tumores CIN-
y lneas celulares
Se obtuvieron tumores aneuploides: BAC array-CGH para 26 muestras de tumor aneuploides, y
segmentado por segmentacin binaria circular (R package DNAcopy ). El algoritmo GISTIC 35 se utiliz
para identificar regiones de ganancia y prdida consistentes, con umbrales de 0,1 / -0,1 para ganancia /
prdida, respectivamente, y un umbral de valor q de 0,25. La neuploida se defini por citometra de
flujo (ndice de ADN> 1,2). Lneas celulares: Las regiones mnimas consistentes de alteracin genmica
a travs de todas las lneas celulares se evaluaron para el nmero de copias de ADN. Cada regin en
cada lnea celular se normaliz a la lnea base ploida de la lnea celular para dar la norma XY se defini
entonces como perdida (nmero de copia <lnea de base de la ploida), o no se perdi (nmero de copia
lnea de base de la ploida) y se estableci en 0. Cada regin se evalu para la ganancia de la misma
manera. Para la prueba de significacin estadstica entre CIN + y CIN- lneas celulares de un d-score
para cada regin perdido se calcul calculando la media de copias normalizado nmero X norma a travs de
CIN + ( media (x norma, C ) ) y CIN- ( significa (X norma , M ) ), lo que explica tanto la amplitud como la
frecuencia de las aberraciones genmicas. A continuacin, se realiz un anlisis de significacin de
microarrays ( siggenes de paquete SAM - R ) con un estadstico t de dos muestras modificado:

re( I ) = ( m e a n ( Xn o r m , C( I ) ) - m e un n ( Xn o r m , M( I ) )S ( i ) + s0
El parmetro s (i) define la desviacin estndar de regin especfica 36 . En contraste con un estadstico t
de dos muestras estndar, SAM incluye un parmetro adicional s 0, Lo que disminuye la influencia de la
alta varianza muestral. Esto se estableci empricamente a 0,5, dando como resultado una ponderacin
equilibrada de frecuencia y amplitud. Para detectar regiones significativas, se permutaron aleatoriamente
(N = 10000) SNP sondas para cada muestra por separado. Para ahorrar tiempo de computacin,
dibujamos aleatoriamente nmeros de copias para cada muestra, estableciendo la probabilidad de un
nmero de copias dado al porcentaje de sondas SNP mostrando este nivel de nmero de copias a travs
del genoma. Para cada regin ensayada, los valores de p se estimaron contando el porcentaje de
permutacin d-puntuaciones mayor o igual que el d-score observado. Para ajustar las pruebas mltiples,
los valores q se calcularon con el valor q del paquete RY los genes con q <0,25 fueron llamados
significativos. Para garantizar la seleccin de los genes de forma coherente alterado a travs de CIN +
lneas celulares, los cambios genmicos no se observa en 50% de las lneas celulares fueron excluidos
de un anlisis posterior. Los genes se mapearon a regiones utilizando el paquete R biomaRt 37 . Todos
los genes presentes en 1 copias en 30% de CIN + lneas celulares, y no ms de 1 CIN-lnea celular,
se seleccionaron para la investigacin funcional.

Muestras de carcinoma en adenoma


Se identificaron 20 tumores de FFPE de archivo que mostraban carcinoma colorrectal adyacente pero
discreto y adenoma. Se utilizaron muestras y registros de acuerdo con la aprobacin de tica de
investigacin del Reino Unido (MREC06 / Q1702 / 99). H & E diapositivas de las muestras fueron
revisadas, las regiones marcadas como normales (si est presente) / adenoma / carcinoma. Y se utiliza
como una gua para tomar tejido de cada regin de diapositivas sin manchas por microdiseccin de
aguja. El ADN se extrajo con digestin estndar de proteinasa K, y se purific (DNeasy kit -
Qiagen). Ploidy anlisis se realiz utilizando automatizado basado en imagen citometra (Fairfield
Imaging, Nottingham, Reino Unido) como se describe anteriormente [ 38 , 39] . Anlisis LOH : matrices
SNP: El Illumina Sentrix Beadarray humano enlace mapeo panel versin IVb se utiliz de acuerdo con
las instrucciones de ensayo de genotipado Goldengate (Illumina, San Diego, EE.UU.). El ADN se
amplific, se fragment y se hibrid al Beadchip, seguido de una sola base de extensin. Beadchips
fueron teidos, secados y escaneados con un lector Beadarray (Illumina, San Diego, EE.UU.). Los datos
de la imagen se visualizaron utilizando Genomestudio (Illumina, San Diego, EE.UU.). Todas las
muestras tenan tasas de llamada por encima de 0,97. Los adenomas y carcinomas fueron marcados
como LOH o no LOH en 18q segn la ausencia o presencia de alelos heterocigticos,
respectivamente. Anlisis de LOH usando microsatlites :Las condiciones de PCR estndar se usaron
con el cebador directo marcado fluorescentemente con HEX o FAM. En cada marcador, LOH se
consider presente cuando un rea de pico en el adenoma o el carcinoma se redujo a 50% del otro alelo,
en relacin con el normal de ADN pareado. Se analizaron hasta 5 microsatlites en 18q21 (D18S46,
D18S1110, D18S35, D18S69 y D18S1407). Todas las PCR se realizaron dos veces y todas las muestras
analizadas con SNP arrays tenido concordante resultados.

Anlisis de la expresin gnica


TCGA: Los datos de expresin de genes personalizados Agilent 244K (G4502A-07-3) se descargaron
para 154 muestras de CRC y se normaliz la punta de impresin con el margen del paquete R. Se
promediaron las sondas duplicadas. Lneas celulares: Los datos de microarrays de Affymetrix HT-
HGU133A para 20 lneas de CIN + y 9 CIN- se obtuvieron del Wellcome Trust Sanger Institute. Los
datos se RMA normalizado con el paquete R- affy. Se utiliz el coeficiente de correlacin de Spearman
para la correlacin del nmero de copias y los datos de expresin.
A) Esquema que ilustra los orgenes pre-mittico y mittico de los errores de segregacin
cromosmica. Paneles de la derecha: imgenes de ejemplo en clulas SW1116 (CIN +) teidas con DAPI
y anticuerpos anti-centromricos (ACA). B) % Errores de segregacin en lneas celulares CIN +
clasificadas en cromosomas retardados, acntricos y puentes anafase. Los puentes se extienden
completamente entre las masas de ADN; Los cromosomas acentricos y rezagados se distinguieron
usando tincin ACA. Los errores de segregacin no clasificables como puentes, cromosomas retardados
o acentrales (<15%) se omitieron para mayor claridad. % Anaphases que muestran errores de
segregacin (n> 100 / lnea celular), y% metafases que muestran aberraciones estructurales (n = 38-84 /
lnea celular) mostradas debajo del grfico. do)Ejemplos de cromosomas estructuralmente anormales
identificados en los cromosomas de metafase se propagan, se hibridan con una sonda de todo
centromero (verde) y se tien con DAPI. D) Ejemplos de fenotipos celulares asociados al estrs de
replicacin en clulas NCIH747 (CIN +) teidas con DAPI y anticuerpos como se indica; (I) focos H2AX en
prometafase; (Ii) cuerpos 53BP1 en clulas G1 (ciclina A1 negativa); (Iii) UFBs anafase, detectadas con
anticuerpos para la protena RPA 27 de unin a ADN monocatenario . E) Prometaphase Dao del ADN en
CIN + frente a CIN-clulas (n> 100 clulas / lnea celular, * p = 0,033). F) % de cuerpos G1 53BP1 en CIN +
frente a clulas CIN- (n> 250 clulas / lnea celular, * p = 0,028). G)Anafasas con UFB. Hola)Se incubaron
secuencialmente 4 lneas celulares CIN + y 2 CIN con 5-clorodesoxiuridina (CldU) y 5-yododesoxiuridina
(IdU) durante 30 minutos cada una. Se realizaron ensayos de fibra de ADN y se evaluaron las velocidades
de replicacin en horquillas de replicacin individuales. Se muestran fibras representativas de cada lnea
celular (h) . I) Distribucin de las tasas de horquillas de repeticin (CldU, n> 300 horquillas en total /
lnea celular a partir de 3 experimentos), con tasas de bifurcacin de replicacin media (CldU, n> 60
tenedores / experimento, media sem de 3 experimentos) (recuadro). Prueba t de dos colas con
respecto a las clulas HCT-116.
Prdida del nmero de copias somticas del cromosoma 18q en CIN + CRC
A) Anlisis GISTIC para la prdida del nmero de copias somticas en 26 tumores colorrectales
aneuploides. Q = 0,25 determina la significancia (lnea negra). B) Prdidas de nmero de copias en 20
lneas celulares CIN + CRC. Se definieron regiones significativas en relacin con 9 lneas celulares CIN,
(Q = 0,25, lnea negra). C) Hematoxilina y muestra de tumor manchada con eosina, que muestra
adenoma con carcinoma adyacente. D) % Ncleos aneuploides, medidos por citometra de imagen de
ADN, en adenomas y carcinomas pareados (n = 20) con / sin 18q LOH (Tukey box plot con outliers
mostrados, test t de dos colas, * p <0.05). E) La correlacin de Spearman entre la expresin de mRNA y
el nmero de copias de ADN para PIGN , RKHD2 y ZNF516En los tumores CIN- (n = 28, puntos
negros) versus CIN + (n = 74, puntos rojos) (TCGA). Los tumores se definieron como CIN + basado en
un ndice de integridad del genoma ponderado> 0,2 (vase Mtodos). Estadstica: prueba de Wilcoxon
Mann-Whitney.
A, b) los genes supresores de CIN se silenciaron en clulas HCT-116 (CIN-) durante 48 h. A) % Errores de
segregacin representados por cromosomas retardados, acntricos y puentes anafase. Otros errores de
segregacin (<15%) son omitidos para mayor claridad . Para la comparacin, los errores de segregacin que
se producen a travs de anexos cromosmicos inadecuados fueron inducidos por monastrol tratamiento
(100 M, 1 h, 75 min de liberacin). % Anaphases mostrando errores de segregacin y% metafases que
muestran 1 cromosoma estructuralmente anormal (n> 100) mostrado debajo del grfico. B) Ejemplos de
cromosomas estructuralmente anormales segn se indica. discos compactos)Las lneas celulares que
expresan de forma estable shRNAs como se indica se sembraron a baja densidad en portaobjetos de vidrio
para permitir la formacin de colonias. Las diapositivas se fijaron y se hibridaron con sondas de ADN para
centrmeros 2 y 15. c) Ejemplo de imgenes de clulas de control y clulas shPIGN. D) % Desviacin del
nmero de copias de centromero modal por colonia (media de dos sondas (CEP2 y CEP15)). Las lneas son
valores medianos, estadstica: prueba de comparacin mltiple de Dunn, p <0,01. Ej. , Se puntuaron las
clulas HCT-116 para fenotipos asociados al estrs de la replicacin despus del silenciamiento del gen
supresor de CIN mediado por siRNA: e) % Prometafases que presentan focos 3 H2AX (media sem, 3
experimentos, n> 100 / experimento); F)% De clulas G1 con 3 cuerpos 53BP1 (media sem, 3
experimentos, n> 150 / experimento); G) Anafasas con UFB (media sem, 3 experimentos, n = 100 /
experimento). Los ensayos estadsticos para, por ejemplo) fueron t-tests de dos colas, * p <0,05, ** p
<0,01. H, i) se realizaron ensayos de fibra de ADN despus de la transfeccin de siRNA como se
indica. Imgenes de fibra representativas para transfecciones de siRNA como se indica como se
muestra (h) . I) Distribucin de las tasas de horquilla de replicacin (n> 200 horquillas en total por
transfeccin de siRNA de 2 experimentos) con tasas de horquilla promedio (n> 70 horquillas / experimento,
media sd de 2 experimentos).

A) Anaphases con errores de segregacin 48 h suplementacin de nuclesidos 24 h despus de la


transfeccin siRNA como se indica (media sem, 3 experimentos, Two-tailed t-test, ** p
<0,01). B) Anafasas con errores de segregacin 48 h suplementacin de nuclesidos en lneas celulares
CIN + como se indica (media sem, 3 experimentos, Dos-tailed test t, ** p <0,01). C) Cambio de pliegue
en el% de prometafases que presentan 3 H2AX focos 48 h de suplementacin de nuclesidos en
lneas celulares CIN + como se indica (n100 clulas por condicin por lnea celular, media sem de 3
experimentos). Los datos no normalizados se muestran en el suplemento 13a .