INTRODUCCIN A LA CROMATOGRAFA

FASES CROMATOGRAFICAS Y APLICACIONES

Curso Qumica Analtica Cualitativa

Jorge Yez S

Depto. de Qumica Analtica e Inorgnica

Facultad de Ciencias Qumicas
Universidad de Concepcin
 FASES ESTACIONARIAS Y FASES MVILES EN CROMATOGRAFA
LQUIDA

La fase estacionaria requiere materiales estables que no reaccionen con la fase mvil o
que no sufra un deterioro por el paso o condiciones qumicas de sta.

- resistencia mecnica (presin, flujo, temperatura)

- resistencia qumica (pH, oxidantes)

Para cumplir estas caractersticas se usan materiales relativamente inertes como fase
estacionaria.

La fase estacionaria est constituida generalmente por dos componentes:

- soporte mecnico de llamado relleno

- fase ligada
a) Soporte mecnico de llamado relleno

- Caractersticas importantes del soporte son:

- tamao de grano (generalmente muy pequeo, 5 - 100)

- regularidad de tamao (poca dispersin de tamao),
- tamao de poro (son generalmente porosos)
- regularidad de su forma.

- Soportes ms frecuentes:
Gel de slice o slica g el (SiO2 n H2O)
Almica (Al2O3 n H2O)
Celulosa
Poliestireno con grupos funcionales
- Gel de slice o slica gel (SiO2 n H2O)

Es el ms usado que presenta en su superficie grupos ligantes Si-O-H.

La slice cumple con todas las caractersticas de estabilidad mecnica y qumica.

Generalmente se usan partculas muy pequeas de slice (3 - 100 m de dimetro), las

que se clasifican segn su estructura en:

Partculas Porosas
Partculas Peliculares
Mallas monoltica:
Partculas porosas regulares e irregulares y no porosas o peliculares.
- Almica (Al2O3 n H2O)

- Tambin presenta grupos ligantes del tipo Al-O-H.

- El tipo de cromatografa en que ms se usa este tipo de fase estacionaria (slice y

almina) es en la cromatografa de adsorcin

- Los grupos funcionales hidroxilos (OH-) sirven para establecer uniones dbiles del tipo
dopolo-dipolo, puentes hidrgeno y uniones tipo con los solutos y de esta forma se
produce la adsorcin de molculas sobre la fase estacionaria.

- Celulosa

Se usa como soporte pero es menos frecuente por su menor estabilidad a condiciones
drsticas.

- Poliestireno con grupos funcionales

Grupos carboxlicos, sulfonatos (aninicos) y grupos minos (positivos).

b) Fase ligada

- En la cromatografa de reparto lquido - lquido (separacin por solubilidad) se une

qumicamente una fase lquida a la superficie de las partculas de relleno (slica o
almina).

- En este caso el relleno acta como soporte fsico de la fase lquida que est ligada.

- Esta fase ligada es en escencia la verdadera fase estacionaria que interacciona fsica y
qumicamente con los solutos.

- La fase ligada son grupos qumicos determinados que pueden unirse qumicamente al
soporte segn la ecuacin general:

Ejemplo:

CH3 CH3
-HCl
Si-OH + Cl - Si - R ------------- Si - O - Si - R

CH3 CH3
soporte fase ligada Fase estacionaria ligada
Las fases ligadas se dividen por su grado de polaridad en:

- Polares
- Poco Polares
- Apolares

Tabla 1. Fases ligadas ms comunes en cromatografa lquida

R - Polares R - Apolares comunes

(CH2)3-NH2 (amino) (CH2)17- CH3 (octadecilo)

(CH2)3- CN (ciano) (CH2)7 - CH3 (octilo)
(CH2)3- OCH (OH) CH2OH (diol) (CH2)3- CH3 (Butilo)
(CH2) - CH3 (Etilo)
(CH2)3- C6H11 (hexilo)
(CH2)3- C6H5 (fenilo)
- Cuando la fase estacionaria presenta grupos apolares y la fase mvil es un solvente
polar o poco polar se habla de:

- HPLC en fase reversa o cromatografa en fase reversa (abreviado como RP-HPLC, del
ingls Reverse Phase HPLC).

- Cuando la fase mvil es menos polar que la fase estacionaria se habla de

cromatografa en fase normal.
Fases Mviles ms comunes en Cromatografa lquida

Solventes qumicos con las siguientes caractersticas:

- ser de alta pureza, ya que generalmente las impurezas daan o inactivar sitios activos
de la fase estacionaria

- ser un buen disolvente para los compuestos a separar (para no producir

precipitaciones dentro del sistema)

- no reaccionar con los solutos

- estar libre de gases para no producir volumen muerto por aparicin de burbujas en el
sistema,

y tambin debe poseer caractersticas fsicas y qumicas definidas como:

- polaridad
- pH
- temperatura
- fuerza inica
- propiedades pticas que puedan afectar la
deteccin de los solutos
 Fases Mviles ms usadas:
Solvente (para la almina) Solvente (para la almina)
Fluoroalcanos -0.25 diclorometano 0.42
n-pentano 0.00 tetrahidrofurano 0.45
i-octano 0.01 1,2-dicloroetano 0.49
n-heptano 0.01 2-butanona 0.51
n-decano 0.04 acetona 0.56
ciclohexano 0.04 dioxano 0.56
ciclopentano 0.05 acetato de etilo 0.58
disulfuro de carbono 0.15 acetato de metilo 0.60
tetracloruro de carbono 0.18 1-pentanol 0.61
1-cloropentano 0.26 dimetilsulfxido 0.62
eter isopropilico 0.28 anilina 0.62
cloruro de isopropilo 0.29 nitrometano 0.64
tolueno 0.29 acetonitrilo 0.65
1-cloropropano 0.30 piridina 0.71
clorobenceno 0.30 2-propanol 0.82
benceno 0.32 etanol 0.88
bromoetano 0.37 metanol 0.95
eter dietilico 0.38 1,2-etanodiol 1.11
cloroformo 0.40 acido acetico Largo
1. Mezclas de solventes en F.M.

- Los solventes son usados generalmente en mezcla para conseguir as una fase mvil de
polaridad definida.
Por ejemplo:
Fase mvil constituida por metanol y agua, la polaridad de esta mezcla
aumenta a medida que se incrementa la proporcin de agua y vice versa.

Otras caractersticas como el pH son reguladas utilizando tampones en su composicin

qumica.
- Elucin isocrtica (1 solo solvente)

Si para la elucin de los compuestos separados en una columna o en capa fina se usa un
solo solvente como fase mvil durante toda la elucin.

- Elucin en gradiente

Si la elucin se realiza con una mezcla de solventes y la composicin de la mezcla se

vara durante la elucin, se habla de elucin con gradiente de solventes.

La elucin con gradiente puede ser dinaria (dos solventes), terciaria (tres solventes) y
cuaternaria (cuatro solventes).

La elucin en gradiente se utiliza preferentemente para aumentar la velocidad de

elucin de los compuestos retenidos en la fase estacionaria.
Ejemplo de elusin en gradiente e isocrtica
 Cmo seleccionar el tipo de cromatografa a usar para una separacin

Basarse en las caractersticas fsico-qumicas de los analitos:

- peso molecular
- la solubilidad
- carga inica
- acidez

Con estos datos se debe tambin seleccionar la fase mvil y la fase estacionaria a
utilizar.
 peso molecular < 1000

soluble en solvente org nico soluble en agua

solubles en solventes solubles en solventes de No i nico i nico

apolares y/o poco polares mayor polaridad
C6 - CHCl3 CHCl 3 o CH3OH

Cromatograf a en fase reversa Cromatograf a en fase normal Cromatograf a en fase normal Cromatograf a de intercambio i nico
0
Cromatograf a en fase reversa

fase ligada: C1 - C18 fase ligada: s lice, ciano, amino, diol fase ligada: ciano, amino, diol
 peso molecular > 1000

soluble en solvente org nico soluble en agua

Tama o molecular Tama o molecular No i nico i nico

menor a 30 nm menor a 30 nm

Cromatograf a en fase reversa Cromatograf a de exclusi n molecular Tama o molecular Tama o molecular Cromatograf a de intercambio i nico
menor a 30 nm menor a 30 - 400 nm

fase ligada: C4 - C8 - C18 Cromatograf a en fase reversa Cromatograf a de exclusi n molecular

fase ligada: C4 - C8 - C18

fenilo o poliester
 Configuracin general de un sistema de cromatografa lquida de alta eficiencia
(HPLC)

Los componentes modulares de un cromatgrafo de HPLC son:

Una bomba de alta presin

Recipientes de la fase mvil (uno o ms solventes)

Una unidad de gradiente

Vlvula de inyeccin de la muestra

Un detector que permite identificar la salida de los solutos separados.

Un registrador grfico de las seales del detector

Sistema de Inyeccion Sistema de Separacin Sistema de Deteccin

UV-VIS
Sistema de Columnas
vlvula
Conductividad

Fluorescencia

pre-columna columna Refractomtrico

Probe 9 200 L
Electroqumico
Horno Termostatizado
(optativo) Polarimtrico
autosampler (optativo)

Flowrate: 2 mL/min

Bomba HPLC
(isocrtica)

computador con integrador

Flowrate: 2 mL/min
Sistema de Elucin con software (optativo)
Gradiente (optativo)
Sistema de Presentacin
de Seales y
cuantificacin de datos
Soluciones de
Elucin
(1 ms)
carrier
Ejemplos de distintas columnas utilizadas en HPLC

20 cm
 EJEMPLOS DE SEPARACIONES UTILIZANDO HPLC

1.- Separacin de alcanos lineales mediante cromatografa de reparto

Slo se puede considerar el nmero de carbonos como caracterstica diferenciadora para

una separacin cromatogrfica.

A continuacin se presenta la separacin de alcanos lineales (C5 hasta C17) en una

muestra sinttica.

Condiciones de la separacin cromatogrfica

Cromatografa de reparto en fase reversa (RP-HPLC)

Fase mvil metanol 100% (poco polar)

Fase estacionaria columna cerrada con material de relleno slica gel con fase ligada C18
octadesilo (ODS)
Detector UV-VIS (los alcanos absorben luz en el rango ultravioleta, 215nm)

Mientras ms larga la cadena carbonada del alcano, mayor tiempo permanecer ste en la
fase estacionaria apolar (C18, octadecilo) y su tiempo de retencin ser mayor.
2.- Separacin de fenilalcanos mediante cromatografa de reparto

En sus caractersticas qumicas, los fenilalcanos son prcticamente iguales. La interaccin

con la fase mvil y la fase estacionaria es del mismo tipo y slo se puede considerar el
nmero de carbonos de la cadena unida al fenilo como caracterstica diferenciadora para
una separacin cromatogrfica.

A continuacin se presenta la separacin de los fenil alcanos (fenil-C0 hasta fenil-C5) en

una muestra sinttica.

Condiciones de la separacin cromatogrfica

Cromatografa de reparto en fase reversa (RP-HPLC)

Fase mvil metanol 100% (poco polar)

Fase estacionaria columna cerrada con material de relleno slica gel recubierta por
grupos ligados octadesilo o C18 (ODS)
Detector UV-VIS (todos los compuestos cclicos absorben luz en el rango
ultravioleta, alrededor de 254nm)
Si se quisiera disminuir el tiempo de anlisis y acortar los tiempos de retencin, se podra
disminuir la polaridad de la fase mvil, agregando por ejemplo acetonitrilo
(metanol/acetonitrilo = 50/50%v/v).
3.- Separacin de anilinas (colorantes) mediante cromatografa de adsorcin

En sus caractersticas qumicas, las anilinas (o-, m- y p-nitronanilina) son prcticamente

iguales. La interaccin con la fase mvil y la fase estacionaria es del mismo tipo, pero se
puede considerar la diferencia de la interaccin dipolo-dipolo de los 3 ordenamientos
estructurales de las anilinas y la fase estacionaria como principio para una separacin.
A continuacin se presenta la separacin de las o-, m- y p-nitronanilinas en una muestra
sinttica.

Condiciones : Cromatografa de adsorcin en slica gel

Fase mvil heptano/tetrahidrofurano (87/13%v/v), apolar
Fase estacionaria columna cerrada con material de relleno slica gel
Detector UV-VIS (todos los compuestos cclicos absorben luz en el rango
ultravioleta, alrededor de 254nm).

Interaccin dipolo-dipolo de anilinas y fase estacionaria (slica gel).

Interaccin ptima menor dbil
NO2 NO2

H2N NO2 H2N H2N

OH OH OH OH OH OH
Cromatograma de esta separacin:
4.- Separacin de proteinas de diferente peso molecular (tamao) mediante
permeacin o filtracin en gel

Las proteinas pueden ser separadas en base a su tamao mediante una fase estacionaria
que posee retculos de tamao determinado en donde son incluidas las proteinas durante
su paso por la columna.

A continuacin se presenta la separacin de proteinas ovoalbmina, quimotripsingeno

A, citocromo C y lisozima.

Condiciones de la separacin

Cromatografa de filtracin en gel o exclusin por tamao

Fase mvil buffer fosfato pH 7

Fase estacionaria columna cerrada con material de relleno polieter hidroxilado con
tamao de partcula de 10 m y poros de 130 A (rango de pesos
moleculares a separar 500-80.000 Daltons)
Detector UV-VIS (todos las proteinas absorben luz en el rango ultravioleta,
alrededor de 214nm)
Cromatograma de esta separacin:

Peak de identificacin Peso Molecular

1.- Tiroglobulina 660000
2.- Serino albmina de bovino 67000
3.- B-Lactoglobulina 35000
4.- Mioglobina 17000
5.- Citocromo C 13000
6.- Tetraglicina 216
Columna: PE TSK G2000SW 7,5 mm x 30 cm (x2)
Fase Mvil: NaCl 0.3 M en buffer fosfto 0.1 M, pH 7.0
Velocidad de elusin: 0.5 mL/min.
5.- Separacin de cationes por cromatografa de intercambio inico

Los cationes pueden ser separados en base a su carga y tamao mediante una fase
estacionaria que posee grupos aninicos en los cuales se produce la interaccin de cargas.

A continuacin se presenta la separacin de cationes Li+, Na+, NH4+, K+, Mg++, Sr++, Ba++
en una muestra sinttica.

Condiciones de la separacin

Cromatografa de intercambio inico

Fase mvil cido ftlico 10 mM, tampn tris pH 5 (tris-hidroximetil

aminometano)

Fase estacionaria columna cerrada con resina de intercambio catinico (grupos

sulfonatos)

Detector conductividad elctrica

 Resina de intercambio
catinico (sulfonatos)

Cromatogramas: