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METODOLOGIA EN BIOQUIMICA CLINICA

CROMATOGRAFIA Y
ELECTROFORESIS
DR. LUIS MIGUEL CANSECO AVILA

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Historia de la Cromatografa
Cromatografa.

1892 Reed: Columna en tubos de kaoln


separacin.

1906 Tswett: Invent la cromatografa en


columna
l ((mezcla
l d
de pigmentos).
i t )

1938 Reichstein:
R i h t i cromatografa
t f lquida
l id o fluida.
fl id

1938 Izmailov
I il y Schraiber:
S h ib capa fina
fi ded
alumina (vidrio).

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1947 Boyd,
Boyd Tompkins
Tompkins, Spedding,
Spedding Rieman,
Rieman y
otros: Cromatografa de intercambio inico.

1952 James y Martin: Desarrollaron de la


cromatografa de gas.

1956 Sober y Peterson: primeras celulosas


para intercambio
i t bi inico.
i i

1956 Lathe
L th y Ruthvan:
R th almidn
l id ((estimacin
ti i
PM).

1959 Porath y Flodin: dextrn.

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CROMATOGRAFIA

Griego chroma y graphein que significan


respectivamente "color"
color y "escribir")
escribir ).

Conjunto de tcnicas separacin de


los componentes de una mezcla y su
posterior deteccin.

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CROMATOGRAFIA

Muy variadas
ffase mvil:
il fluido
fl id (gas,
( l id o fluido
lquido fl id
supercrtico) que arrastra a la muestra a travs
de una fase estacionaria
estacionaria.
Fase estacionaria: slido o un lquido fijado en
un slido
slido.

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CROMATOGRAFIA

Las sustancias q que ppermanecen ms


tiempo lbres en la fase mvil avanzan ms
rpidamente con el fluir de la misma y las
que quedan ms unidas a la fase
estacionaria o retenidas avanzan menos y
por tanto tardarn ms en salir o fluir.
fl ir

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Tipos de cromatografa

La cromatografa puede clasificarse de


acuerdo al tipo
p de equilibrio
q involucrado,,
mismo que es gobernado por el tipo de
fase estacionaria utilizada.
(1)adsorcin
(2) particin
ti i
(3) intercambio inico
(4) exclusin
l i
(5) afinidad

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Cromatografa de adsorcin

fase estacionaria slido en el que los


componentes de la muestra son adsorbidos.
adsorbidos

cromatografa lquido-slido
lq ido slido

cromatografa gas-slido

cromatografa de capa fina

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Cromatografa de particin
La fase estacionaria de la cromatografa de
particin es un lquido soportado en un slido
inerte.

cromatografa de particin lquido-lquido.

cromatografa de particin gas-lquido.

cromatografa en papel

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Cromatografa de intercambio inico

Cromatografa de exclusin

C
Cromatografa
t f de
d afinidad
fi id d

Anlisis de Protenas
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COMPONENTES.-

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-Cromatografa en el anlisis de
Protenas: Purificacin
Segn la matriz escogida:

Carga
Hidrofobicidad
Tamao
Capacidad de unirse a grupos qumicos
p
particulares.

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Cromatografa de intercambio inico

La separacin en la cromatografa de intercambio inico


depende la adsorcin reversible de molculas de soluto
cargadas a una resina con grupos inicos de carga opuesta.
cargadas, opuesta

se basa en las diferencias en signo y magnitud de la carga


elctrica neta de las protenas a un valor de pH determinado.
determinado

Carga de La Matriz Y Protenas:

pH del solvente
fuerza inica (proporcional a la concentracin de
iones)

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I t
Intercambiadores
bi d catinicos
ti i
La matriz carga negativa

Intercambiadores aninicos
La matriz carga positiva

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ELUSION :

Carga Inica del Solvente

Su pH

PUNTO ISOELCTRICO

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C
Cromatografa
t f dde exclusin
l i por ttamao

Separarse molculas solvatadas


de acuerdo a su tamao y
habilidad a penetrar fase
estacionaria.

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C
Cromatografa
t f dde exclusin
l i por ttamao

Matriz: Poliestireno entrecruzado con


poros de tamaos determinados
determinados.

Protenas de mayor tamao migran a lo


largo de la columna ms deprisa que las de
pequeo tamao.

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Cromatografa de afinidad

Utiliza interacciones altamente


especficas entre un tipo de
molculas
l l d soluto
de l t y una segunda d
molcula unida covalentemente
(inmovilizada) a la fase estacionaria.

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Interacciones biolgicas tpicas

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La matriz.

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ELECTROFORESIS
PROTEINAS.- De que depende la carga?

Forma

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Electroforesis en Geles de
Poliacrilamida (PAGE).
Preparacin del soporte.

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Preparacin

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PAGE en condiciones no
desnaturalizantes
MIGRACION
FORMA
CARGA
Tamao

FUNCION
Actividad enzimtica
Capacidad
p de unin de anticuerpos
p
Unin a receptores

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PAGE en condiciones
desnaturalizantes
No forma, no carga,
T
Tamao

SDS
REDUCTORES : DTT
DTT, B
Beta-Mercapto
t M t

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Electroforesis bidimensional.
bidimensional

Carga
T
Tamao

PI

DOS DE LOS PARAMETROS

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Electroenfoque

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Electroforesis de cidos nucleicos

TAMAO
CARGA ?
FORMA

Mtodo habitual para separar,


separar identificar y
purificar molculas o fragmentos de DNA y
RNA.
RNA

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NATURALEZA DE LOS GELES

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Factores q
que afectan a la movilidad
electrofortica del DNA.
Voltaje
T
Tamao del
d l Poro
P
Forma

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TAMAO

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FORMA

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