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UNIVERSIDAD NACIONAL "SAN LUIS GONZAGA" DE

ICA FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUMICA

ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE, IDENTIFICACIN


DE METABOLITOS SECUNDARIOS y
CUANTIFICACIN DE POLIFENOLES TOTALES
DEL EXTRACTO ACUOSO LIOFILIZADO DEL .
FRUTO DE Physalis peruviana L. aguaymanto"

TESIS
PARA OPTAR AL TTULO DE:

QUMICO FARMACUTICO
PRESENTADO POR:
Bach. Espinoza Peralta Elizabeth
Bach. Ojeda Pizarro Gianinna Merle
ASESORA
Mg. Q.F Vega Ramos Nelly
ICA-PER
2017
1
DEDICATORIA:

A Dios por darme salud y bendecir cada da de mi vida,


permitindome as llegar a este momento tan especial para m.
A mis queridos padres Cirilo y Alejandra por ser para m un
ejemplo de trabajo, esfuerzo y dedicacin. Gracias por ser los
mejores madre y padre que el divino hacedor me pudo dar, por
encontrar en ustedes dos grandes y mejores amigos, por su
constante apoyo y consejos en todo momento, por el amor y
comprensin que siempre me han brindado, por ensearme a tener
la fortaleza de continuar siempre hacia adelante y ser un ejemplo
de que todo se puede lograr con mucho esfuerzo y dedicacin, por
confiar siempre en m, pero ms que nada gracias por su infinito y
eterno amor.

A mis hermanas y hermano por ser mis motores y guas en cada


momento de mi vida, por estar ah siempre presente para m en
todo momento.

Elizabeth

2
DEDICATORIA:

A Dios por haberme permitido llegar hasta este punto y haberme


dado salud para lograr mis objetivos, adems de su infinita
bondad y amor.

A mi querida madre Marisol por haberme apoyado en todo


momento, por sus consejos, sus valores, por la motivacin
constante que me ha permitido ser una persona de bien, pero ms
que nada, por su eterno amor.

A mi difunto padre Rufino que me dej sus ejemplos de


perseverancia y constancia que lo caracterizan y que me ha
infundado siempre, por el valor mostrado para salir adelante y
por su amor.

Gianinna

3
AGRADECIMIENTOS

Nuestro ms sincero, especial y eterno agradecimiento:

A nuestros Asesores que gracias a su apoyo, paciencia y dedicacin no hubiese sido


posible la culminacin del presente trabajo de investigacin.

A nuestros Padres que con su gran paciencia y amor incondicional nos supieron orientar
hacia el camino de la superacin y el xito.

A la Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica y la Facultad de Farmacia y


Bioqumica por ser nuestra alma mater de nuestra profesin, por la enseanza
impartida para ser buenos profesionales de la salud en estos cinco aos de estudios.

Por ultimo quedamos agradecidos a las personas y amigos que de una u otra manera nos
apoyaron en la presente investigacin

Muchas Gracias.

4
NDICE

Pg.
RESUMEN 7
SUMMARY 8
INTRODUCCiN 9

CAPTULO 1. ASPECTOS GENERALES 12


1.1 BASES TERICAS 12
1.1.1. Physalis peruviana L. "aguaymanto" 12
1.1.2 Clasificacin Sistemtica de la Especie 15
1.1.3 Composicin qumica y usos tradicionales 16
1.2 ANTECEDENTES DE INVESTIGACiN 17

1.3 SISTEMAS DE DEFENSA ANTIOXIDANTE 20


1.4 DETERMINACiN DE CAPACIDAD ANTIOXIDANTE 22
1.4.1 Mtodo del Poder Antioxidante de Reduccin Frrica 22
(FRAP)
1.4.2. Mtodo de inhibicin frente al radical 2,2-Difenil-1- 24
picrilhidraizil (DPPH)
1.4.3. Trolox 25
1.5 CONTENIDO DE POLlFENOlES TOTALES POR El
26
REACTIVO FOLlN-CIOCAl TEU (CPT)
CAPTULO 11. MATERIALES y MTODOS 27
2.1 MATERIALES 27
2.1.1 Material biolgico: 27
2.1.2 Material qumico botnico 27
2.1.3 Material de laboratorio 27
2.1.4 Reactivos 28
2.1.5 Equipos de laboratorio 29

5
2.2 METODOLOGA ANAlTICA 29
2.2.1 Estudio Fitoqumico 30
2.2.2 Obtencin del extracto acuoso liofilizado del fruto de Physalis 32
peruviana L. "aguaymanto".
2.3 INVESTIGACiN CUALITATIVA DE METABOLlTOS 35
SECUNDARIOS y CUANTIFICACiN DE POLlFENOLES
TOTALES.
2.3.1 Screening fitoqumico preliminar 35
2.3.2 Determinacinde Compuestos Fenlicos 38
2.4 METODOLOGA DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN 41
VITRO
2.4.1 Mtodo de inhibicin frente al radical libre 1,1-Difenil-2- 41
picrilhidracilo (DPPH)
2.4.2 Mtodo del Poder Antioxidante de Reduccin Frrico (FRAP) 44
2.5 TECNICA PARA DETERMINARCONTENIDO DE VITAMINA C 45
2.5.1 Anlisis Estadstico 46
CAPTULO 111R.ESULTADOSy DISCUSiN 47
3.1. ESTUDIO FITOQuMICO 47
3.1.1 Porcentajede rendimiento del extracto acuoso liofilizado 47
3.1.2 Screening fitoqumico preliminar 48
3.2 CUANTIFICACiN DE POLlFENOLESTOTALES 49
3.3 EVALUACiN DE CONTENIDO DE VITAMINA C 50
3.4 EVALUACiN DE ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO 51
FRENTE AL RADICAL DPPH
3.5 EVALUACION DEL PODER ANTIOXIDANTE FRENTE AL 54
RADICAL FRAP
DISCUSiN 57
CONCLUSiNES 60
RECOMENDACIONES 61
REFERENCIASBIBLIOGRFICAS 62
ANEXOS 67

6
RESUMEN

Objetivos: Determinar los metabolitos secundarios, el contenido de


polifenoles totales y la actividad antioxidante in vitro del extracto acuoso
liofilizado del fruto de Physalis peruviana L. Aguaymanto".
Diseo: Estudio Descriptivo Aplicativo. Lugar: Facultad de Farmacia y
Bioqumica, Universidad Nacional San Luis Gonzaga.

Material Biolgico: Se utiliz los frutos de aguaymanto, los cuales se


maceraron en una mezcla etanol-agua, proporcin (50:50), para obtener el
extracto acuoso del fruto sometindose a un proceso de liofilizacin, se
determin los principales metabolitos secundarios, el contenido de
polifenoles totales, vitamina C y la actividad antioxidante in vitro frente a los
radicales DPPH y FRAP. Se utiliz la ecuacin de la recta y el coeficiente de
regresin lineal para determinar los valores respectivos. Resultados: S e
determin la presencia de compuestos fenlicos como nico metabolito
secundario. El contenido de polifenoles totales en el extracto acuoso
liofilizado fue: 0,4496 0,032. mgEAG/g y de Vitamina C fue: 0,213 0.008
mg vit C/g de extracto liofilizado respectivamente. La actividad antioxidante
frente al radical DPPH (1,1-Difenil-2-picrilhidracilo) mostr una Cl50 = 0,048
mg/mL; mientras que el TEAC (Capacidad Antioxidante Equivalente a
Trolox)-DPPH fue 1,21 0,01 mol/g de extracto y TEAC-FRAP = 1,01
0,04 mol/g de extracto. Conclusin: E l extracto acuoso liofilizado
present positiva la reaccin con el tricloruro frrico para el ensayo de
compuestos fenlicos, as como una cantidad ponderable de
polifenoles totales y vitamina C, adems de la inhibicin de los radical
DPPH y FRAP mostrando una buena actividad antioxidante.
Palabras clave: P h y s a l is peruviana L., "aguaymanto", antioxidante,
metabolitos secundarios, compuestos fenlicos, DPPH y FRAP.

7
SUMMARY
Objectives: To determine the secondary metabolites, the total polyphenol
content and the in vitro antioxidant activity of the Iyophilized aqueous extract
of Physalis peruviana L. "Aguaymanto" fruit. Design: Application Study
Descriptive Place: Faculty of Pharmacy and Biochemistry, National
University San Luis Gonzaga.
Biological Material: The fruits of aguaymanto were used, which were
macerated in an ethanol-water mixture, proportion (50:50), to obtain the
aqueous extract of the fruit undergoing a Iyophilization process, the main
secondary metabolites were determined Content of total polyphenols,vitamin
e and antioxidant activity against radicals DPPH and FRAP. The equation of
the line and the linear regression coefficient were used to determine the
respective values.
Results: The presence of phenolic compounds as the only secondary
metabolite was determined. The content of total polyphenols in the
Iyophilized aqueous extract was: 0.4496 0.032. mgEAG / 9 and Vitamin e
was: 0.213 0.008 mg vit e / 9 Iyophilized extract respectively. Antioxidant
activity against the DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl)radical showed an
le 50 = 0.048 mg / mL; While TEAC (Antioxidant Capacity Equivalent to
Trolox) -DPPH was 1.21 0.01 umo / 9 extract and TEAe-FRAP = 1.01
0.04 urnol / 9 extract.
Conclusion: The Iyophilized aqueous extract showed positive reaction with
ferric trichloride for the test of phenolic compounds, as well as a ponderable
amount of vitamin e and phenolic content and inhibition of radicals DPPH
and FRAP showing good antioxidant activity.
Key words: Physalis peruviana L., "aguaymanto", antioxidant, secondary
metabolites, phenolic compounds, DPPH and FRAP.

8
INTRODUCCiN

La actividad antioxidante es una estimacin fiable y global de la capacidad

antioxidante de un alimento, adems de ser un parmetro interesante para

valorar la calidad diettica del producto en cuestin. La actividad

antioxidante de los distintos grupos de compuestos depende de la estructura

individual y del nmero de oxidrilos sustituyentes, as como del peso

molecular. 1

La evaluacin de los componentes nutricionales de un producto alimenticio

no es suficiente para entender y evaluar los efectos del mismo en el

organismo. Tambin es necesario considerar una serie de

microcomponentes (fitonutrientes), conocidos previamente como

componentes no-nutricionales o secundarios, los cuales incluyen a los

compuestos antioxidantes. 2

Las sustancias fitoqumicas son productos orgnicos constituyentes de

alimentos de origen vegetal (frutas y hortalizas y alimentos derivados de

ellas), que no son nutrientes y que pueden proporcionar al alimento unas

propiedades fisiolgicas que van ms all de las nutricionales propiamente

dichas. Dentro de este trmino genrico, se incluyen sustancias de diversas

familias qumicas, como son los polifenoles.3

Los metabolitos secundarios de las plantas se encuentran en la mayora de

las frutas, verduras, y ts. Las plantas son la base de toda terapia de

medicina tradicional y en 1992 se descubri el efecto positivo de los

9
antioxidantes en frutas y verduras. Hay un inters creciente por conocer la

capacidad antioxidante de frutas y verduras para usar su potencial como

alimentos nutracuticos o funcionales. 4

El efecto beneficioso de los alimentos vegetales se atribuye principalmente a

sustancias con actividad antioxidante, como los compuestos polifenlicos, el

cido ascrbico (vitamina C), los carotenoides y la vitamina E. Se ha

sugerido que estas sustancias aumentan la defensa antioxidante del

organismo, contra el estrs oxidativo, responsable de diferentes tipos de

dao celular.5

Al no encontrar evidencias de estudios cientficos realizados a la fruta

acuosa liofilizada de la especie Physalis peruviana L. que reporten sobre la

actividad antioxidante y siendo un fruto con uso teraputico como

antiinflamatorio, analgsico, diurtico, anti prosttico, cncer genitourinario,

consideramos importante realizar el presente trabajo de investigacin. 6

Considerando el uso tradicional que se le atribuye, nos planteamos el

siguiente problema de investigacin: Cules son los meta bolitas

secundarios, el contenido de polifenoles totales y la actividad antioxidante

del extracto acuoso liofilizado de los frutos de Physalis peruviana L.

"aguaymanto"?

Para ello nos planteamos el siguiente objetivo general y los

especficos correspondientes:

OBJETIVO GENERAL:

Identificar metabolitos secundarios, cuantificar polifenoles totales y

10
medir la actividad antioxidante in vitro del extracto acuoso liofilizado de los

frutos de Physalis peruviana L. "aguaymanto".

OBJETIVOS ESPECFICOS:

1. Identificar de los metabolitos secundarios mediante el screening

fitoqumico preliminar del extracto acuoso liofilizado de los frutos de

Physalis peruviana L. "aguaymanto".

2. Cuantificar los polifenoles totales y vitamina C presentes en el extracto

acuoso liofilizado de los frutos de Physalis peruviana L. "aguaymanto".

3. Determinar la actividad antioxidante in vitro mediante el mtodo de

captacin del radical DPPH Y FRAP del extracto acuoso liofilizado de los

frutos de Physalis peruviana L. "aguaymanto".

11
CAPITULO I
ASPECTOS GENERALES

1.1 BASES TERICAS

1.1.1 Physalis peruviana L. "Aguayrnanto"

Physalis peruviana L., es una planta originaria de los Andes

Sudamericanos, especficamente de Per, es una planta perenne,

herbcea y semiarbustiva y fuertemente ramificada, con un gran

desarrollo vegetativo, que alcanza normalmente 1 m de altura, pero

en ocasiones llega a medir 1,8m.7,8,9

Raz: Posee una raz amorfa, pivotante, de la que salen races

laterales y fibrosas (la mayora de races se encuentran a unos 10 a

15 cm de profundidad), formando un conjunto de races que puede

tener un radio hasta de O,60m; posee una coloracin amarillo plido

de consistencia suculenta y semileosa en sus primeros estados de

vida monopdica y luego se ramifica srnpdlcamente.10

Tallo: Herbceo cubierto de vellosidades suaves de color

enteramente verde. Antes de completar su crecimiento, desarrollan

las ramas laterales, que luego crecen ms que el tallo principal,

agrandando lateralmente a la planta (este tipo de crecimiento ayuda

en la proteccin del suelo contra la erosin)10.

Hojas: Simples, enteras y acorazonadas, se las considera

cordiformes, dispuestas en forma alterna en la planta, el limbo es

entero y presenta vellosidades que lo hace suave al tacto.10

12
Flor: La corola de la flor es circular (20 mm de dimetro),

hermafrodita solitaria y pedunculada con cinco pequeos picos (figura

1). El cliz de la flor llega a un tamao de 5cm de largo, es acrecente

como un farol colgante y encierran un pequeo fruto que es una baya

de 8 a 20 mm de dimetro. El cliz se mantiene verde hasta madurar

la fruta, luego se vuelve pardo translcido y el fruto se pone amarillo 10.

Figura 1. Flor de Physalis peruviana L.

Fruto: Es una baya carnosa, el color y aroma del fruto vara

segn los ecotipos, encontrndose desde el color verde limn hasta el

amarillo dorado cuando est maduro (figura 2).10

La corteza es ligeramente amarga. La pulpa amarilla y jugosa

es muy agradable por su sabor azucarado, as como la materia

mucilaginosa que rodea las semillas. El dimetro o calibre del fruto es

bastante variable, que va desde 1,25 a 2,30 cm con un promedio de

1,80 cm; los pesos de los frutos varan grandemente de acuerdo a los

ecotipos, desde 1,70 g a 8,10 g con un promedio de 5,30 g. La fruta

contiene muchas semillas. Cuando ha completado la madurez, el cliz

13
y la fruta caen a la tierra juntas (por efecto de la gravedad), el fruto se

desarrolla durante 60 a 80 das10.

Figura 2. Fruto de Physalis peruviana L.

Semillas: Son muy pequeas (desprovistas de hilos

placentarios), ovaladas, achatadas, miden de 1,5 a 3,0 mm de largo,

de ancho un promedio aproximado de 1,0 mm; siendo el nmero muy

variable en cada fruto que van desde 150 a 320 semillas por fruto; la

semilla es de color amarillo grisceo o amarillo parduzco 10.

Figura 3. Desarrollo vegetativo de Physalis peruviana L.

Physalis peruviana L. es conocida tambin en otras regiones

de nuestro pas como capul, bolsa de amor, cereza del Per,

uchuva, a la cual se le ha atribuido muchas propiedades medicinales,

14
siendo caracterizada por ser una excelente fuente de provitamina A,

vitamina C y est considerado dentro del grupo moderado de

actividad antioxidante, de uso con fines teraputicos; pues segn los

expertos ayuda a purificar la sangre, tonifica el nervio ptico y alivia

afecciones bucofarngeas recomendada a la vez para personas con

diabetes de todo tipo, posee propiedades diurticas y se dice que es

utilizada como tranquilizante natural posiblemente por su contenido de

flavonoides.11.12

1.1.2. Clasificacin Sistemtica de la Especie

REINO : PLANTAE

DIVISIN : MAGNOLIOPHYTA

CLASE : MAGNOLIOPSIDA

SUBCLASE : ASTERIDAE

ORDEN : SCROPHULARIALES

FAMILIA : SOLANACEAE

GNERO : Physalis

ESPECIE : Physalis peruviana L.

NOMBRE VULGAR : Aguaymanto

15
1.1.3. Composicin qumica y usos tradicionales.

Composicin Qumica: Numerosas investigaciones reportan

la caracterizacin fisicoqumica de Physalis peruviana L.

"aguaymanto", las cuales coinciden en valores aproximados para

parmetros slidos solubles como Brix, cuyos contenidos van entre

12,5 y 14,3; el porcentaje de acidez expresado como % de cido

ctrico oscila entre 2 y 2,4. En los frutos maduros el pH y el Brix

decrecen, lo que lleva a un aumento de la acidez de un 2,0 a 2,1%.13

Con composicin destacable de nutrientes como vitamina A,

fibra, protena, potasio, fsforo, hierro y zinc14. Despus del agua,

los carbohidratos son los compuestos presentes en mayor proporcin

en la pulpa, vale destacar tambin los azcares, las pectinas y

almidones. Tambin se encuentran varios cidos que le dan el

carcter cido y contribuyen a sus propiedades fisicoquimicas15.

Usos Tradicionales: El fruto de (Physalis peruviana L.)

"aguaymanto", contiene entre otros nutrientes, compuestos bioactivos

como el cido ascrbico, provitamina A, compuestos fenlicos, entre

otras vitaminas que podran proporcionar un efecto fisiolgico

beneficioso en la salud, mayor que el proporcionado por los nutrientes

sencillos que contiene16. El cido ascrbico (presente en el fruto) es

requerido para el crecimiento y reparacin de tejidos en todas las

partes del cuerpo. Adems, es un antioxidante y como tal es un

nutriente que bloquea parte del dao causado por los radicales

libres16.

16
De todas las sustancias, el -caroteno (presente en el

aguaymanto hasta en 1,77 mg/100g) ha sido uno de los ms

estudiados, numerosas investigaciones han mostrado que aquellas

personas que siguen una dieta rica en -caroteno, tiene menos

disposicin a enfermedades cardiovasculares y cncer. El -caroteno

es un importante agente anti-radical libre siendo muy til en el

tratamiento de diferentes tipos de cncer17.

Se le atribuyen propiedades medicinales como antiasmtico,

diurtico, antisptico, sedante, analgsico, fortifica el nervio ptico,

alivia problemas de garganta, elimina parsitos intestinales,

antidiabticos y antioxidantes18.

1.2 ANTECEDENTES DE INVESTIGACIN

En nuestro pas se ha reportado investigaciones tales como:

Rodrguez U. (2007) Mdico cirujano, docente de la

Universidad Csar Vallejo de la escuela de Medicina y colaboradores,

demostraron el efecto de la ingesta de Physalis peruviana L.

(aguaymanto) sobre la glicemia postprandial en adultos jvenes,

donde participaron 26 sujetos voluntarios quienes fueron divididos

aleatoriamenteen dos grupos:

El grupo 1ingiri 25 g de frutos de Physalis peruviana L. y luego

de 40 minutos se le administr una sobrecarga de glucosa, mientras

que al grupo II slo se le administr esta ltima; recolectndose

17
muestras de sangre a los 30, 60, 90 y 120 minutos, despus a ambos

grupos.

Luego de 3 das se intercambiaron los tratamientos. Se

encontr que en el grupo control el promedio de glicemia basal fue

89.2 7.75 mg/dl, a los 30 minutos postprandial 130.6 14.92 mg/dl,

a los 60 minutos 116.2 16.57 mg/dl, a los 90 minutos 106.3 13.65

mg/dl y a los 120 minutos 93.1 10.55 mg/dl. Mientras en el grupo

problema se obtuvo glicemias de 85.9 10.99 mg/dl, 123.6 13.65

mg/dl, 109.1 13.69 mg/dl, 96.8 12.12 mg/dl y 86.3 13.22 mg/dl

respectivamente. A los 90 minutos hubo una diferencia muy

significativa (p < 0.01) Y a los 120 minutos, una diferencia significativa

(p < 0.05) entre los valores de glicemia de ambos grupos. Por lo que

se concluye que la ingesta de Physalis peruviana (aguaymanto)

reduce la glicemia a los 90 y 120 minutos postprandial en adultos

jvenes19.

Quispe A. (2009) de la Sociedad Cientfica de San Fernando,

Facultad de Medicina, Universidad Nacional Mayor de San Marcos.

Lima, Per, Mdico General, Unit de Formation et de Recherche en

Sciences de la Vie, Universit Pierre et Marie Curie - Paris, Francia. y

colaboradores han realizado estudios de la Evaluacin del Efecto

citotxico de Physalis peruviana L. (aguaymanto) en cncer de colon y

leucemia mieloide crnica utilizando de la planta sus hojas y tallos en

forma de extracto etanlico. Physalis peruvana L. es ms citotxico

que el 5-FU, en las lneas colo-205 y K562. Adems, son menos

18
citotxicas en relacin al 5-FU en la lnea 3T3. Estos estudios

confieren credibilidad de sus propiedades antes mencionadas.20

Mlaga R. (2013) Ingeniero en Industrias Alimentarias y.

Profesor principal del Departamento de Tecnologa de Alimentos.

Facultad de Industrias Alimentarias en Universidad Nacional Agraria

La Molina (UNALM) y colaboradores realizaron estudios de Efecto del

Procesamiento de pur de Physalis peruviana L. "aguaymanto",sobre

los compuestos bioactivos y la capacidad antioxidante demostrando

que hay una correlacin lineal entre el porcentaje de retencin (con

respecto a la materia prima), del cido ascrbico y de las capacidades

antioxidantes hidroflica y total, con coeficientes de 98,59% y 99,09%

base sola, respectivamente.

La correlacin lineal de los compuestos fenlicos totales y de

las capacidades antioxidantes hidroflica y total, estuvo determinada

por los coeficientes 99,33% y 99,75% base sola, respectivamente.

Asimismo, la correlacin de los carotenoides totales con la

capacidad antioxidante lipoflica, fue lineal con un coeficiente de

87,29% base sola21.

Datos actuales:

Actualmente, en el Per Physalis peruviana L. "aguaymanto"ha

tenido un gran impacto en exportacin del fruto fresco, en los ltimos

aos se ha incrementadode 6,9 TM en el 2007 a 59,2 TM en el 2011,

principalmentea Estados Unidos (40%) y Alemania (20%).22.23

19
La mayora de las empresas peruanas exportan aguaymanto

deshidratado, los precios para este producto oscilan entre 11 y 13

dlares el kilogramo y el orgnico entre 12.5 y 14 dlares el

kilogramo.24

Basndonos en los estudios antes mencionados y siendo de

gran importancia la investigacin de dicha especie por ser un

producto perecedero se utilizar el proceso de liofilizacin con el fin

de conservar sus condiciones originales de sus frutos y dndole a

este una utilidad de alimento funcional. Debido tambin al incremento

de exportacin que brinda nuestro pas sera de gran utilidad su

respectiva investigacin para la poblacin.

1.3 SISTEMA DE DEFENSA ANTIOXIDANTE:

Un antioxidante es capaz de neutralizar la accin oxidante de

los radicales libres mediante la liberacin de electrones, los cuales

son captados por los radicales libres, cumpliendo una funcin

preventiva en el desarrollo del envejecimiento y de enfermedades

neurodegenerativas, siendo entonces un terminador de cadena

oxidativa. El antioxidante al interactuar con el radical libre le cede un

electrn, debilitando su accin 25.

La actividad antioxidante no puede ser medida directamente,

pero puede determinarse por los efectos del compuesto antioxidante

en un proceso de oxidacin qumica asociada a la actividad

antirradicalaria o estabilizadora de radicales libres; capacidad para

acceder al sitio de reaccin y estabilidad de los productos formados

20
despus del proceso de estabilizacin de radicales libres. Ante los

daos ejercidos por los radicales libres en los seres vivos la

naturaleza da diferentes fuentes de proteccin que nos permite

reparar este dao. La actividad antioxidante de acuerdo a su origen,

pueden clasificarse como endgenos y exgenos (figura 4).26

En los ltimos aos se han adoptado un amplio rango de

ensayos espectrofotomtricos para medir la capacidad antioxidante

de los alimentos, muestras biolgicas y extractos vegetales.

Entre los ensayos de captacin de radicales libres, el mtodo

del DPPH es el ms rpido, simple por otro lado, el ensayo de

decoloracin ABTS+ se puede aplicar a antioxidantes hidroflicas y

lipoflicos.

Figura 4. Clasificacin de antioxidante

21
1.4. DETERMINACIN DE CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

1.4.1 Mtodo del Poder Antioxidante de Reduccin Frrica


(FRAP)27.

Reaccin SET (Transferencia de electrn nica), que se basa en

la reduccin del complejo de la tripiridiltriazina frrica al complejo

ferroso por un antioxidante en medio cido. Esta reaccin produce un

cambio de color que es monitorizado mediante medicin de la

absorbancia a 593 nm durante 4 minutos, segn el mtodo original,

aunque este tiempo fue posteriormente ampliado hasta 30 minutos, ya

que a los 4 minutos muchos compuestos todava no haban acabado

de reaccionar.

Los resultados se expresan en equivalente Trolox (mol Trolox/g

o mol Trolox/L), tras elaborar una curva de calibracin de este

compuesto, un anlogo hidrosoluble de la vitamina E muy utilizado en

la expresin de resultados de capacidad antioxidante. El esquema

(figura 5) nos muestra la reaccin que tiene lugar en este mtodo de

medida de la capacidad antioxidante.

22
23
1.4.2 Mtodo de inhibicin frente al radical libre 2,2-
28
Difenil-1- picrilhidraizil (DPPH)

El mtodo del DPPH se basa en la reduccin del radical DPPH'

por los antioxidantes de la muestra. El radical es estable y tiene una

coloracin prpura que se pierde progresivamente cuando se aade

la muestra conteniendo sustancias antioxidantes. La decoloracin del

radical se determina a una de 515 nm hasta alcanzar el equilibrio.

Entre las ventajas de usar este mtodo, se tiene que el ensayo DPPH

es un mtodo rpido, sencillo y que no requiere de un equipamiento

sofisticado (figura 6). La desventaja que tiene este mtodo es que

slo puede disolverse en medio orgnico y en algunos casos la

interpretacin resulta complicada, ya que algunos antioxidantes

pueden causar interferencias si poseen un espectro de absorcin

similar al DPPH.

Figura 6. Reduccin del radical libre 2,2-difenil-1-picrilhidrazilBrands &

Williams, 1995)

24
1.4.3 Trolox.

Antioxidante como la vitamina E y se utiliza en aplicaciones

biolgicas o bioqumicas para reducir el estrs oxidativo o dao

celular. El compuesto cido 6-hidroxi-2,5,7,8-tetrametilcromo-2-

carboxlico, Trolox, es un anlogo soluble en agua de la vitamina E,

que se puede comparar con varios antioxidantes comerciales. Las

reacciones entre el Trolox y varios radicales libres oxidantes

incluyendo los radicales peroxi y varios radicales hidroxilo se

examinaron mediante el uso de la tcnica de pulso-radilisis,

demostrando que el Trolox puede someterse a reacciones rpidas de

transferencia de electrones, as como los procesos de transferencia

de hidrgeno; el radical fenoxilo resultante demuestra ser

relativamente estable, en comn con el radical fenoxi derivado de la

vitamina E. Los resultados evidencian que el Trolox (figura 7) (radical

fenoxilo) se repara fcilmente por el ascorbato y ciertos tioles, pero no

por urato, NADH o galato de propilo. Las pruebas evidencian que el

Trolox repara protenas que se han oxidado por radicales libres.29

Figura 7. Molcula del Trolox

25
1.5 CONTENIDO DE POLlFENOLES TOTALES POR EL

REACTIVO DE FOLlN-CIOCAL TEU (CPT) 30

El mtodo de Folin-Ciocalteu (F-C) es comnmente utilizado en

el rea de agroqumica e industrias alimentarias, por su simplicidad,

por la disponibilidad comercial del reactivo y por ser un procedimiento

ya estandarizado. El reactivo de F-C utiliza un mecanismo de reaccin

de oxidacin/reduccin,que no es especfico para fenoles. De hecho,

el mtodo de F-C, mide la capacidad para reducir el reactivo de cido

fosfomolibdico/fosfotngsticoa un complejo azul que es monitoreado

espectrofotomtricamente, donde el molibdeno es reducido en el

complejo y se da la reaccin de transferencia de electrones entre el

Mo (VI) y el reductor. El mtodo implica la oxidacin de fenoles en

solucin alcalina por el heteropolianin molibdotungstofosfrico

amarillo y la medicin colorimtrica de molibdotungstofosfrico azul

resultante.

Este complejo azul tiene su mxima absorcin dependiendo de

su composicinfenlica, adems del pH de las soluciones

implicadas, a continuacin, se representa la reaccin del

reactivo de FC en presencia de un antioxidante.

26
CAPITULO II

MATERIALES Y MTODOS

2.1 MATERIALES

2.1.1 Material biolgico:

Frutos de la especie Physalis peruviana L.

"aguaymanto.

2.1.2 Material Qumico botnico:

Extracto acuoso liofilizado de Physalis peruviana L.

"aguaymanto" .

2.1.3 Material de laboratorio:

Aro de soporte

Celdas de cuarzo

Desecador

Embudos

Esptulas de metal

Fiolas

Gradillas

Luna de reloj

Matraces Erlenmeyer

Micro pipetas

27
Pinzas metlicas

Pipetas Pro

pipeta Porta

embudo

Probetas

Soporte universal

Tubos de ensayo

Tubos eppendorff

Varillas

Vasos de precipitacin

2.1.4 Reactivos:

DPPH (sigma)

TPTZ (sigma)

Reactivo de Liebermann-Burchard

Cloruro frrico (Merck)

Reactivo de Shinoda

Hidrxido de sodio (Merck)

cido clorhdrico (Merck)

Hidrxido de amonio (Merck)

Reactivo de Dragendorff

28
Reactivo de Mayer

Metanol (Fisher)

Etanol (Fisher)

Cloroformo (Merck)

Tricloruro Frrico (JT Baker )

2.1.5 Equipos de laboratorio:

- Estufa

- Balanza Analtica BOECO Germany

- Espectrofotmetro nico 2100 UV-Vis.

- Evaporador rotatorio BUCHI

- Plancha calefactora VELP SCIENTIFICA

- Liofilizador Freeze Dryers

- Centrifugadora VELP SCIENTIFICA

2.2 METODOLOGIAANALTICA

Las diversas pruebas se ejecutaron desde agosto de 2014

hasta diciembre del 2015. El ensayo de la actividad antioxidante,

identificacin de metabolitos secundarios y cuantificacin de

polifenoles totales del extracto acuoso de Physalis peruviana L.

"aguaymanto", se realiz en el laboratorio de Qumica General de la

29
Facultad de Farmacia y Bioqumica de la Universidad Nacional "San

Luis Gonzaga" de Ica.

2.2.1 ESTUDIO FITOQUMICO.

Recoleccin y seleccin.

Los frutos maduros de Physalis peruviana L. "aguaymanto",

fueron recolectados en el distrito de Coracora en la provincia de

Parinacochas del departamento de Ayacucho-Per; en junio del 2014

a una altitud de 3178 m.s.n.m31.

Posteriormente 3000 9 de frutos en buen estado fueron

colocados y trasladados en bolsas de papel craft y transportados al

laboratorio de Qumica General de la Facultad de Farmacia y

Bioqumica de la Universidad Nacional San Luis Gonzaga de Ica.

(Figura 8)

Figura 8. Frutos selectos de Physalis peruviana "aguaymanto".

30
,
Clasificacin Taxonmica de la especie vegetal.

La muestra vegetal fue determinada botnicamente en el

Museo de Historia Natural, de la Universidad Nacional Mayor de San

Marcos, Lima- Per (Anexo 1)

Anlisis Organolptico

Se realiz el anlisis del sabor, olor, color del cliz y fruto y de la

textura de las muestras de Physalis peruvana L. "aguaymanto".

Lavado

El lavado se realiz por inmersin del fruto en agua potable, se

retir cuidadosamente el cliz que cubre a dicho fruto y se elimin

todo material extrao que pudo estar adherido.

Licuado

Con este proceso se transform la materia prima de su estado

slido a un estado pastoso o a una masa semilquida. Para ello se

sumergi los frutos en una solucin de etanol al 96% yagua

destilada, proporcin (1:1) utilizamos una licuadora marca ster para

obtener nuestro producto (Anexo 2).

31
2.2.2 Obtencin del extracto acuoso liofilizado del fruto
de Physalis peruviana L. "aguaymanto".
Maceracin
700 g del material licuado, masa semilquida, fue puesto en

maceracin con una mezcla hidroetanlica proporcin (50:50),

en cantidad suficiente, en frasco mbar, a temperatura

ambiente, protegido de la luz durante 8 das con agitacin peridica,

al cabo de este tiempo se realiz el filtrado con tela tocuyo con

poros de 4,9 - 4,8 micras y posterior desecado por 48 horas a 40C

en un horno con aire circulante en el Laboratorio de Qumica General

de la Facultad de Farmacia de la UNSLG (Anexo 2).

Seguido de esto fueron llevados a centrifugacin una

cantidad de 250 mI. (Anexo 3)

Liofilizado y almacenado

La cantidad del sobrenadante de la centrifugacin de Physalis

peruvana L. "aguaymanto" se coloc en ocho frascos de plstico de

aproximadamente 100 mL cada uno y luego se coloc en bandejas de acero

inoxidable y se congel a -60 "C durante 72 horas, condiciones que

permiten obtener una apariencia opaca y rgida antes de la

liofilizacin. Las bandejas con el producto congelado se acondicionaron

en la cmara de liofilizacin del equipo y se liofilizaron por 96 horas a

presin inferior a 200Hg. (Anexo 4)

33
El equipo utilizado fue un liofilizador marca Freeze Dryers ,

modelo FD 5512.

Posteriormente retiramos nuestros envases y lo almacenamos

respectivamente (Figura 9)

Figura 9. Proceso de Liofilizacin de Physalis peruviana "aguaymanto

33
Fluxograma de operaciones para obtener liofilizado de Physalis

peruviana "aguaymanto" (Figura 1O).

Seleccin-clasificacin

Lavado

Licuado

Macerado

Filtrado

Desecado

Centrifugado

Liofilizado

Almacenado

34
2.3 INVESTIGACIN CUALITATIVA DE METABOLITOS

SECUNDARIOS Y CUANTIFICACIN DE POLIFENOLES TOTALES

En el extracto acuoso liofilizado, se realiz la marcha

fitoqumica, se procedi a realizar las reacciones de precipitacin o

coloracin para los principales metabolitos secundarios, mediante las

tcnicas de Lock de Ugaz32, con los reactivos especficos; en los

resultados se indicar la presencia o ausencia del metabolito.

La marcha fitoqumica se realiz en el Laboratorio de Qumica

General de la Facultad de Farmacia y Bioqumica de la Universidad

Nacional "San Luis Gonzaga" de lea - Per.

2.3.1 Screening fitoqumico preliminar

a) Determinacin de saponinas

Prueba de espuma:

La proporcin de saponinas se mide de acuerdo a la altura de

la espuma. Se someti a una agitacin vigorosa durante 30

segundos a una muestra de solucin acuosa.

Interpretacin: La presencia de la saponina se manifestar

por la formacin de una espuma persistente durante 5 min.

35
b) Determinacin de Flavonoides

Reaccin de Shinoda:

En un tubo de ensayo colocamos 5 mg de la muestra y le

aadimos 3 gotas del cido clorhdrico concentrado y limaduras

de magnesio metlico.

Interpretacin: S i se observa un intenso burbujeo y coloracin

rojo o naranja, de color intenso luego de 10 minutos indica la

presencia de flavonoides.

c) Determinacin de Compuestos Fenlicos:

Reaccin con Cloruro Frrico (FeCI3):

A 5mg de muestra se le agreg 5 gotas del reactivo.

Interpretacin: Instantneamente la solucin debe tomar un

color verde oscuro casi negro, lo que indica la presencia de

compuestos fenlicos.

d) Determinacin de Alcaloides

Reacciones de Dragendorff, Mayer y Wagner:

A 5 mg de la muestra se le adicion 5 gotas del reactivo

respectivo y 1 mL de HClcc.

Interpretacin: se debe observar la aparicin de un

precipitado de color anaranjado, marrn y blanquecino

respectivamente que confirma la presencia de alcaloides.

36
e) Determinacin de Triterpenos y/o Esteroides

Reaccin de Lieberman-Burchard:

A 5 mg de la muestra se adicion 5 gotas del reactivo.

Interpretacin: si se observa que la muestra se torna de un

color azul, se confirma la presencia del metabolito.

f) Determinacin de Taninos

Reaccin de la Gelatina

A 5 mg de la muestra se le agregar 5 gotas del reactivo de la

gelatina al 0,1 %.

Interpretacin: e n un principio si se observa una sustancia

en forma de nube en la solucin y luego queda en el fondo

un precipitado color blanco, confirma la presencia de taninos.

g) Determinacin de Quinonas

Reaccin de Borntrger

A 5 mg de la muestra se le adicionar 5 gotas del reactivo.

Interpretacin: s i se observa la formacin de un

precipitado pardo negruzco, confirma la presencia del

metabolito.

h) Determinacin de los grupos Aminos Libres

Reaccin de la Ninhidrina

A 5 mg de la muestra se adicionar 5 gotas del reactivo si se

observa que la muestra se torna de un color azul, este indica la

presencia del metabolito.

37
2.3.2 Determinacin De Compuestos Fenlicos

Se utiliz el mtodo de Folin-Ciocalteu descrito por Garca et al.

(2012), para la determinacin de Compuestos Fenlicos presentes en

el extracto acuoso liofilizado de los frutos.

El Reactivo Folin-Ciocalteu es una mezcla de cido

fosfotngstico H3PW 12O10 y cido fosfomolbdico H3PMo12O14. Se

produce una reaccin xido-reduccin entre el reactivo de Folin-

Ciocalteu (se reduce) y los polifenoles (se oxidan), dando origen a

xidos de coloracin azul (xidos de wolframio y molibdeno), los

cuales exhiben una amplia absorcin de luz, con un mximo a 765

nm. Se utiliz tambin carbonato de sodio (Na2C03) al 20% y una

solucin stock de cido glico 400 ug/mL.

Procedimiento:

a) Preparacin de los reactivos:

Reactivo de Folin Ciocalteu (FC): Diluir 1/8 del

reactivo original en agua destilada para la reaccin.

Carbonato de sodio (Na2C03) al 20%: Se tom 4g

de carbonato de sodio y se diluy en 20 mL de agua destilada.

Solucin stock de cido glico (AG) 400 ug/mL: Se tom

4mg de cido glico y se diluy en 10 mL de agua destilada.

b) Preparacin del estndar de polifenoles: cido glico 100


ug/mL

Se tom 2 mL de la solucin de cido glico (400 ug/mL) y se diluy

en 8 mL de agua destilada, para obtener la concentracin de

38
cido glico de 100 ug/mL. Luego se procedi a seguir los pasos de la

tabla 1.

Tabla 01.- Preparacin del estndar de cido glico.

Acido glico Agua


Volumen final cido glico
Tubo (100 ug/mL) destilada
uL (ug/mL)
uL uL
1 100 900 1000 10

2 300 700 1000 30

3 500 500 1000 50


c
) 4 750 250 1000 75
R
Fuente: Datos de los autores

c) Reacciones

Reaccin para el cido glico:

- Se tom 300 uL de cada uno de los tubos de ensayo (1,2,3 y 4)

que contenan el estndar de cido glico obtenido en el paso

anterior, con la ayuda de la micropipeta se coloc de forma ordenada

en 4 tubos de ensayos rotulados.

- Luego a los 4 tubos que contenan los 300 uL del estndar se

adicion 450 uL del reactivo de FOLlN diluido y se dej reposar

en oscuridad por 5 minutos.

- Se le adicion 450 uL de carbonato de sodio a cada uno de los

4 tubos de ensayo y finalmente se le adicion 1800 uL de agua

destilada y se llev a reposar en un ambiente oscuro por 30 minutos,

para despus de ese tiempo ser llevado al espectrofotmetro a una

longitudde onda de 765 nm.

39
Tabla 02. Batera de reaccin final del estndar de polifenoles

Reactivo Na2CO3 Agua


AG AG
Tubo de Folin 20% destilada
uL (g/mL)
(L) (L) (L)
0 - 450 450 2100 0
1 300 450 450 1800 1
2 300 450 450 1800 3
3 300 450 450 1800 5
4 300 450 450 1800 7,5

Fuente: Datos de los autores. AG. cido glico

d) Preparacin de la muestra:

Solucin madre del extracto acuoso liofilizado de los frutos:

Se pes 50,0 mg del extracto acuoso liofilizado de Physalis

peruviana. "aguaymanto". Se diluy en 5 mL de agua destilada.

Dilucin de la muestra madre del extracto acuoso liofilizado

de los frutos:

Se tom 1 mL de la solucin madre diluida en agua destilada y se le

agreg 2 mL de agua destilada. (Factor de Dilucin =3)

Luego se procedi a realizar las reacciones:

-Se tom 300 ul, de la muestra diluida y se coloc en 4 tubos de

ensayo respectivamente.

-Luego se adicion 450 uL del reactivo de Folin a cada uno de los

tubos de ensayo, se dej reposar en oscuridad por 5 minutos.

-Se adicion 450 uL de carbonato de sodio a cada tubo de ensayo, y

finalmente se le adicion 1800 uL de agua destilada.

40
-Se dej reposar 30 minutos en oscuridad, para ser llevado al

espectrofotmetro para leerlo a una longitud de onda de 765 nm.

2.4 METODOLOGA DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO.

2.4.1 Mtodo de inhibicin frente al radical libre 1,1-

Difenil-2- picrilhidracilo (DPPH) con modificaciones28 .

El mtodo empleado en este trabajo es el propuesto por Brand

Williams et al, 1995; con algunas modificaciones. Dicho radical tiene

un electrn desapareado y presenta un color violeta el cual cambia a

amarillo plido en presencia de una sustancia antioxidante, por

diferencia de absorbancia se determina el porcentaje de captacin de

radical libre DPPH, sta reaccin se midi con la ayuda de un

espectrofotmetro UV/VIS.

La actividad antioxidante mediante el mtodo del DPPH se

encuentra expresado como leso (g de extracto etanlico / mL), este

valor corresponde a la concentracin del extracto que reduce en un

50% la absorbancia de una solucin metanlica de DPPH a 517 nm

con una absorbancia inicial de 0,600.

Se us como estndar el reactivo TROLOX (6-hidroxi-2, 5, 7,8-

tetramethylchroman-2carboxilicacid) como antioxidante comparador y

para obtener la capacidad antioxidante equivalente a TROLOX.

41
Preparacin de las soluciones:

a) Preparacin del radical DPPH:

Se prepar una solucin a 0,1 mM de DPPH, pesando 2.2 mg

de DPPH, en un matraz aforado previamente tarado y se disolvi en

100 mL de etanol, luego se llev a comprobar que la absorbancia a

517 nm est ente 0,6 y 0.7. El matraz aforado se cubri con papel de

aluminio para la proteccin frente a la luz.

b) Preparacin del Trolox:

Se prepar una solucin stock de 1 mM, para ello se pes 2.4

mg cido 6-hidroxi-2, 5, 7,8-tetrametilcromo-2-carboxlico 97%

(Trolox), se disolvi en 1000 uL de etanol y se le agreg 9000 uL de

agua destilada.

c) Reaccin del Trolox para establecer la curva de calibracin:

De la solucin preparada de Trolox se prepararon 5 diluciones

en tubos de ensayo por triplicado segn el diagrama1, para ello se

hizo reaccionar 300 uL de trolox y 2700 uL de DPPH. Se mantuvo en

la oscuridad por 30 minutos a temperatura ambiente, para despus

realizar la lectura en un espectrofotmetro UVNIS a 517 nm.

42
Dilucin 1: 0,125 mM 1 mL de Solucin 0.25 mM + 1 mL de agua
destilada.

Dilucin 2: 0,0625 mM 1 mL de Solucin 1+ 1 mL de agua destilada.

Dilucin 3: 0,0325 mM 1 mL de Solucin 2+ 1 mL de agua destilada.

Dilucin 4: 0,015 mM 1 mL de Solucin 3+ 1 mL de agua destilada.

Dilucin 5: 0,0078 mM 1 mL de Solucin 4+ 1 mL de agua destilada.

Diagrama 1. Dilucin del estndar de Trolox.

Tabla 03. Concentraciones finales del estndar de Trolox en la

Reaccin.

Volumen Volumen
Trolox
TUBO trolox (mM) de trolox de DPPH
M
uL uL
1 0.125 300 2700 12.5
2 0.0625 300 2700 6.25
3 0.03125 300 2700 3.125
4 0.015625 300 2700 1.56
5 0.0078125 300 2700 0.78
Fuente: Datos de los autores.

d) Reaccin de la muestra: Determinacin de la CI50:

Extracto acuoso liofilizado de frutos:

Se pes 6 mg de extracto acuoso liofilizado de Physalis peruviana L.

"aguaymanto" y se diluy en 1O mL de metanol (600 ug/mL).

43
1 mL de solucin madre + 9 ml de agua destilada. (60 ug/mL) = solucin B
1mL de solucin B + 1 mL 1mL de solucin C + 1 mL 1mL de solucin D + 1 mL
de agua destilada de agua destilada de agua destilada

SOL C SOL. D SOL. E SOL F


30 ug/mL 15 7.5 3.75
ug/mL ug/mL ug/mL

Figura 11. Batera de muestra de Physalis Peruviana L.

e) Reaccin de la muestra para determinar la

concentracin inhibitoria media:

De las soluciones preparada de la muestra se tom de cada una

300 uL y se hicieron reaccionar con 2700 uL de DPPH. Se mantuvo

en la oscuridad por 30 minutos a temperatura ambiente, para despus

realizar la lectura en un espectrofotmetroUV/VIS a 517 nm.

2.4.2 Mtodo del Poder Antioxidante de Reduccin


Frrica (FRAP):

Se seguir el procedimiento descrito por Benzie y Strain (1999)

con ligeras modificaciones.

Para iniciar el anlisis se prepar el reactivo de trabajo, que

consiste en una mezcla de tampn acetato 300 mM (pH=3,6), TPTZ

10 mM en HCL 40 mM y tricloruro frrico (FeCL3. 6 H20) 20 mM

en una proporcin 10:1:1 (v.v.v), una vez preparado se aadir 3 mL

de este reactivo en una cubeta y se medir la absorbancia a 593 nm.

44
Posteriormente se agregaron 100 uL de una de las diluciones

del extracto acuoso de Physalis peruviana L. y se agit en un vortex

durante 30 segundos.

Despus de 6 minutos de incubacin a temperatura ambiente

se realiz la lectura de absorbancia nuevamente a 593 nm, al que se

rest el valor del blanco.

Se procedi de la misma forma para todas las diluciones y las

muestras se realizan por triplicado.

Los resultados se expresaron en relacin al TROLOX. Para ello

se realiz una curva de calibracin en un intervalo de concentraciones

de 1.56 a 12.5 mM y se procedi igual que la muestra. Todos los

puntos de la curva se realizaron por triplicado. Para la comparacin de

los resultados se extrapola los valores de la muestra en la curva

estndar para expresar la actividad antioxidante en relacin a los mM

de TROLOX.

2.5 TECNICA PARA DETERMINAR CONTENIDO DE VITAMINA C

Contenido de cido ascrbico: El contenido de cido

ascrbico fue determinado de acuerdo al mtodo descrito por Lung et

al, con modlcaclones33. Se tom 62,3 mg de extracto acuoso

liofilizado de Physalis peruviana L. y luego se combin con 2 mL de

cido meta fosfrico al 1% por 45 minutos a temperatura ambiente; al

cabo de ese tiempo se filtr. Se tom 100 JJLde la solucin anterior y

se le agreg 900IJL de una solucin de 2,6- dicloroindofenol (cuya

absorbancia estaba entre 0,30 y 0,35 para asegurar que la lectura de

45
la muestra se encuentre dentro del rango de las de los estndares),

luego de 1 minuto se midi la absorbancia a 515 nm. El contenido de

cido ascrbico se determin a partir de la recta de regresin

obtenida con el cido ascrbico estndar en las concentraciones de

1-8 g/mLcomo concentracin final en tubo. Todos los ensayos

se realizaron por triplicado.

2.5.1 ANALlSIS ESTADSTICO

Los datos obtenidos fueron obtenidos como media desviacin

estndar (SEM). Para determinar las CI50 se utiliz el mtodo de los

mnimos cuadrados mediante la regresin lineal.34 Se us el programa

Excel 2013 versin para Windows.

46
CAPTULO III

RESULTADOS Y DISCUSIN

3.1 ESTUDIO FITOQUMICO


3.1.1 PORCENTAJE DE RENDIMIENTO DEL EXTRACTO ACUOSO

LIOFILIZADO DE Physalis peruviana L. AGUAYMANTO

El porcentaje de rendimiento del extracto acuoso liofilizado (% EAL)

fue de 21.42%. Este resultado fue obtenido de la siguiente manera:

Peso final del extracto acuoso liofilizado


%EAL= X 100
Peso inicial de la muestra fresca

150 g
%EAL= X 100
700 g

%EAL frutos = 21,42 %

47
3.1.2 SCREENING FITOQUIMICO PRELIMINAR DEL EXTRACTO
ACUOSO LIOFILIZADO DEL FRUTO DE Physalis Peruviana
L. "Aguaymanto.

48
3.2 CUANTIFICACIN DE POLlFENOLES TOTALES PRESENTES EN
EL EXTRACTO ACUOSO LIOFILIZADO DEL FRUTO DE Physalis
peruviana L. "Aguaymanto".

Desarrollo de la curva de calibracin con el cido glico:


0.800
0.700
Absorbancia 765 nm

0.600
0.500
0.400
0.300 y = 0.0709x + 0.2104
0.200 R = 0.9998
0.100
0.000
0 1 2 3 4 5 6 7 8
Concentracin de Acido glico (ug/mL)

Figura 12. Curva de calibracin del cido glico (AG)

Tabla 05. Determinacin del contenido de polifenoles totales en


el extracto acuoso liofilizado de Physalis peruviana L.

Ecuacin de la recta del estndar cido glico: y = 0,0709X+0.2104


Peso de muestra 50 mg
Absorbancia de la muestra 0.31 0.325 0.315

Factor de dilucin (FD) 3 3 3

ug EAG 1.404 1.616 1.4753

ug EAG X FD 4.2143 4.8490 4.425

(ug EAG X FD)/1000 0.00421 0.00484 0.00442

mg de extracto /mL 10 10 10

mgEAG /g extracto 0,42143 0,48490 0,4425

mgEAG/g extracto 0,4496 0,032

Frmula: [[[[ABS-0,2104/0,0709] x FD] / 1000 ] / 10mg/mL] X 1000

49
1.3 EVALUACIN DE CONTENIDO DE VITAMINA C DEL EXTRACTO
ACUOSO LIOFILIZADO DEI FRUTO DE Physalis peruviana
L. "Aguaymanto".

Tabla 06. Lecturas de las diferentes concentraciones de vitamina C


a 515 nm.

TUBO Vitamina C (ug/mL) ABS *

1 8.333 0.005 0.0001

2 4.167 0.411 0.001

3 2.083 0.662 0.001

4 1.042 0.801 0.003

blanco 0 0.843 0.003

Promedio de tres determinaciones consecutivas


Fuente: Datos de autores

1
0.9
y = -0.1046x + 0.8712
0.8 R = 0.9937
0.7
0.6
ABS 515 nm

0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
-0.10.000 2.000 4.000 6.000 8.000 10.000
CONCENTRACIN DE VITAMINA C (ug/mL)

Figura N 13. Curva estndar de la Vitamina C para establecer


linealidad

50
Tabla 07. Determinacin del contenido de vitamina C por
espectrofotometra

ABS 515 nm 0,706 0,71 0,705

ug equivalente a
1,57 1,63 1,56
vitamina C

FD 30 30 30

ug equivalentes a
47,09 48 47
vitamina C/mL

mg equivalentes a
0,0471 0,0495 0,0461
vitamina C/mL

mg de extracto
223,2 223,2 223,2
acuoso/mL

mg de vitamina C/g de
extracto acuoso 0,213 0,008
liofilizado

3.4.1 EVALUACiN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO


FRI=NTE AL RADICAL DPPH DEL EXTRACTO
ACUOSO LIOFILIZADO DEL FRUTO DE Physalis
peruviana L. "Aguaymanto.

El extracto acuoso liofilizado de Physalis peruviana L.

"Aguaymanto" se determin mediante el ensayo de captacin del

radical DPPH segn Brand y Williams.

51
Tabla 08. Determinacin de la CI50 del trolox mediante la
tcnica de captacin del radical DPPH

M ABS

12.5 0.051

6.25 0.162

Trolox
3.125 0.462

1.56 0.551

0.78 0.613

0 0.674

0.8

0.7
y = -0.0517x + 0.6276
0.6 R = 0.9134
absorbancia 517 nm

0.5

0.4

0.3
CI 50 = 5,69 uM
0.2

0.1

0
0 2 4 6 8 10 12 14
-0.1
Concentracin uM trolox

Figura N 14. Curva estndar del trolox para establecer linealidad

52
Tabla 09. Actividad antioxidante del extracto acuoso de
aguaymanto: Mtodo DPPH

ug/mL de extracto acuoso liofilizado ABS


de aguaymanto

60 0.248

30 0.435

15 0.55

7.5 0.605

3.75 0.636

0.00 0.674

0.8

0.7

0.6
Absorbancia 517 nm

0.5 y = -0.007x + 0.661


R = 0.9959
0.4

0.3

0.2

0.1

0
0 10 20 30 40 50 60 70
Concentracin (ug/mL)

Figura N 15. Determinacin de la CI50 del extracto acuoso


liofilizado del fruto de Physalis peruviana L. Aguaymanto.

53
Mediante el mtodo de regresin lineal se determin una CISO

equivalente a 46,28 g/mL para el extracto acuoso liofilizado de

aguaymanto y una capacidad equivalente al trolox de 1,21 0,01

umol/ g extracto por el mtodo del DPPH.

3.5 EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE FRENTE


AL RADICAL FRAP DEL EXTRACTO ACUOSO LIOFILIZADO
DEL FRUTO DE Physalis peruviana L. "Aguaymanto".

Tabla 10. Lecturas del estndar de trolox a 593 nm en la reaccin con el


reactivo FRAP.
TROLOX uM ABS
Tubo 1 12.5 0.719
Tubo 2 6.25 0.426
Tubo 3 3.125 0.28
Tubo 4 1.5625 0.166
Control 0 0.105

FRAP-trolox
0.8
0.7
Absorbancia 594 nm

0.6
0.5
0.4
0.3 y = 0.0495x + 0.1072
R = 0.9966
0.2
0.1
0
0 2 4 6 8 10 12 14
trolox M

Figura N 16. Curva estndar del trolox vs FRAP

54
En la determinacin de la capacidad antioxidante equivalente a Trolox
por el mtodo del FRAP se obtuvo un valor de 1,52 0,04 umol
trolox/g extracto acuoso liofilizado.

Tabla 11. Lecturas de la muestra a 593 nm en la reaccin con el reactivo FRAP


ABSORBANCIA
0.192 0.199 0.19
MUESTRA
umol /L
equivalente a 1.329 1.395 1.311
trolox
FD 6 6 6
umol /L
equivalente a 7.98 8.37 7.86
trolox
extracto (mg/mL) 5.32 5.32 5.32
umol trolox/g
1.500 1.574 1.479
extracto
umol TROLOX/g
1.52 0.0498
extracto

Figura N 17. Correlacin entre el contenido de vitamina C y la


actividad antioxidante frente al DPPH Y FRAP

El coeficiente de correlacin (R2) entre contenido de vitamina e del

extracto acuoso liofilizado del fruto de Physa/is peruviana L.

"Aguaymanto" y la reaccin con el reactivo DPPH es 0.9964 y para el

FRAP (R2) es 0.5398.

55
Figura N 18. Correlacin entre el contenido de polifenoles totales y la
actividad antioxidante frente al DPPH Y FRAP

El coeficiente de correlacin (R2) entre contenido polifenoles totales del extracto

acuoso liofilizado del fruto de Physalis peruviana L. 'aguaymanto" y la reaccin con

el reactivo DPPH es 0.9330 y para el FRAP (R2) es 0.8212.

56
DISCUSIN

El extracto liofilizado de Physalis peruviana L. se comporta como

un extracto de naturaleza polar y present una promisoria actividad

antioxidante en las metodologas evaluadas y un mediano contenido de

vitamina C y polifenoles totales. Sin embargo, se hicieron correlaciones

entre las diferentes pruebas para discutir los resultados y tener una idea

del mecanismo de accin de los antioxidantes presentes en las muestras

analizadas.

Durante las diferentes pruebas realizadas se encontr que el

contenido de fenoles estuvo en un rango entre 0,4496 0,032

mgEAG/g de muestra, estos resultados obtenidos en el presente trabajo,

no superan a especies nativas reconocidas como la tara y el camu camu

(29,5 0,11; 11,7 0,05 mgEAG/g extracto), respectivamente, as como

la Uncaria tomentosa (ua de gato), Smallanthus sonchifolius (yacn),

Lepidium meyenii (maca), Krameria triandra (ratania) y Physallis

peruviana (aguaymanto) como extracto etanlico no liofilizado segn lo

reportado por Doroteo et al., (2012).

Un buen antioxidante, para su correcta evaluacin debe cumplir

con muchos requisitos como: alta solubilidad en el medio, correcta

orientacin para interactuar con los radicales libres, proteger los lpidos

oxidables, ser un buen reductor y funcionar con alta reactividad, tener

57
efectividad a diferentes pH. Sin embargo, ninguna tcnica de medicin de

la actividad antioxidante satisface las condiciones anteriores, y para tener

una idea del mecanismo de accin de los antioxidantes se deben

establecer correlaciones entre el contenido de vitamina C, polifenoles

totales y los diversos ensayos antioxidantes. Las medidas de los valores

TEAC por la tcnica DPPH son mayores en comparacin al FRAP, esto

se debe a la labilidad del reactivo DPPH, una estructura completamente

plana que reacciona fcilmente con reductores mediante un mecanismo

SET y(o) HAT, lo anterior se refleja en la poca correlacin entre los

valores TEAC de FRAP+ vs. Vitamina C (R2= 0,5398) y

FRAP+ vs. Polifenoles totales (R2= 0,8212).

La concentracin de vitamina C contra la actividad antioxidante,

expresada como TEAC para el ensayo DPPH tienen una correlacin de

99,6 %. Mientras que la regresin lineal entre FRAP y vitamina C

describe en 53,9 % el fenmeno oxidativo y se expresan muy bien como

agentes reductores que reaccionan fundamentalmente mediante un

mecanismo de transferencia de electrones SET. Los valores TEAC por el

ensayo DPPH tienen una alta correlacin, por lo tanto, la tcnica del

DPPH describe mejor el mecanismo oxidativo, que result ms

significativo estadsticamente en el ensayo del DPPH (p< 0,05).

El extracto obtenido a partir del fruto de aguaymanto Physalis

peruviana L presenta como nicos marcadores antioxidante a la

58
vitamina C y los polifenoles totales. El ensayo FRAP est basado en la

habilidad de los compuestos fenlicos para reducir Fe3+ a Fe2+. En

presencia de 2,4,6-tripiridil-s-triazina, la reduccin se encuentra

acompaada de la formacin de un complejo coloreado de Fe 2+. Los

valores de la actividad antioxidante FRAP se encontraron 1,10 0,04

umol/g extracto. Adems, el coeficiente de correlacin es ms alto en la

relacin vitamina C en los dos mtodos antioxidantes evaluados por lo

que se sugiere que la vitamina C presente en el extracto acuoso

liofilizado de aguaymanto generan una respuesta un poco mayor ante la

tcnica de DPPH que para FRAP. Esta misma conclusin se puede

obtener al evaluar la pendiente de la relacin FRAP/DPPH. Se ha

indicado que ambas tcnicas, DPPH y FRAP, son adecuadas para medir

la actividad antioxidante de frutas y hortalizas y que los antioxidantes

contenidos en este tipo de materiales tienen diferente reactividad frente a

los dos mtodos. Aunque ambas tcnicas, DPPH y FRAP basan su

mtodo en reacciones de tipo redox, con potencial redox similares, las

diferencias en las respuestas ante las dos tcnicas pueden radicar en el

pH de trabajo, en DPPH se trabaja a pH neutro en tanto que en FRAP se

trabaja a pH 3,6 por lo que se disminuye el potencial de ionizacin

involucrado en la transferencia de electrones, con lo que se incrementa el

potencial redox y finalmente se cambia el mecanismo de reaccin

dominante. Adems, el mecanismo de reaccin en FRAP es por

transferencia de electrones en tanto que en DPPH es tanto por

transferencia de electrones como por transferencia de tomos de H.

59
CONCLUSIONES

1. Se identific a los compuestos fenlicos y Vitamina C, como nicos

marcadores en el screening fitoqumico del extracto acuoso liofilizado

de Physalis peruviana L. aguaymanto.

2.- El contenido de compuestos fenlicos fue 0,4496 0,032 mgEAG/g y

de vitamina C fue 0,213 0,008 mg vitamina C/ g extracto.

3.- La actividad antioxidante frente al radical DPPH tuvo una CI50

Fruto =0,048 mg/ml; mientras que el TEAC-DPPH fue 1,21 0,01 y TEAC-

FRAP result 1,01 0,04 umol/g. La actividad antioxidante del extracto

acuoso liofilizado lo relaciona con su contenido de vitamina C, adems

de presentar un probable mecanismo por reacciones de tipo HAT

(transferencia de protones) y SET (transferencia de electrones).

60
RECOMENDACIONES
1. Considerando que las sustancias naturales presentes en el

extracto acuoso liofilizado analizado pueden ser responsables del efecto

antioxidante, es preciso continuar el estudio de aislamiento y purificacin

de cada uno de los componentes para poder ser formulados en un futuro

como posibles frmacos de actividad antioxidante.

2. Una vez obtenido el producto deshidrocongelado se recomienda

utilizar un empaque al vaco para prolongar su periodo de vida til e

impedir la rehidratacin del producto deshidrocongelado y prdida de

vitamina C por oxidacin.

3. Para la realizacin de estos mtodos de actividad antioxidante, se

debe trabajar en un ambiente cerrado y con escasa luz, ya que los

reactivos que se utilizan en estas pruebas son muy fotosensibles y

pueden tener resultados negativos.

61
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66
ANEXOS

67
68
ANEXO 2

OBTENCIN DEL EXTRACTO ACUOSO LIOFILIZADO DE


PHYSALIS PERUVIANA AGUAYMANTO.

SELECCIN-
1
RECOLECCIN

2 LICUADO 3 MACERADO

4 FILTRADO 5 DESECADO

69
ANEXO 3

CENTRIFUGADO

70
LIOFILIZADO

71
ANEXO 4

DETERMINACION DE FLAVONOIDES

72
DETEMRINACION DE COMPUESTOS FENOLICOS

73
ANEXO 5

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO

ENSAYO DEL DPPH

PREPARACIN DEL DPPH Y TROLOX

PREPARACIN DE LA MUESTRA

74
RECOLECCION DE LA MUESTRA CON EL DPPH. LECTURA EN
EL
ESPECTROFOTOMETRO

75
ANEXO 6

EVALUACIN DE LA ACTIVIDAD ANTIOXIDANTE IN VITRO

ENSAYO DEL FRAP

PREPARACIN DEL FRAP Y TROLOX

PREPARACIN DE LA MUESTRA

76
RECOLECCION DE LA MUESTRA CON EL DPPH.
LECTURA EN EL ESPECTROFOTOMETRO

77
ANEXO 7

Ensayo para la determinacin de Vitamina C.

78