TINCIN CON ANTICUERPOS FLUORESCENTES

La microscopia de inmunofluorescencia es una tcnica inmunohistoqumica

que consiste en conjugar colorantes fluorescentes (isotiocianato de
fluorescena, rodamina B de lisamina o cido 1-dimetilaminonaftalen-5-
sulfnico) con anticuerpos o antgenos, exponiendo despus este
conjugado a los anticuerpos o antgenos correspondientes en cortes de
tejidos, frotis de microorganismos o de clulas, o cultivo de tejidos en capa
nica. Cuando la reaccin es positiva y se expone a la luz ultravioleta se
producir fluorescencia observable bajo el microscopio de
inmunofluorescencia

MICROSCOPIO DE INMUNOFLUORESCENCIA

Consta de una fuente de luz (lmpara de mercurio o halgena) la cual debe

emitir la mayor cantidad de luz ultravioleta , el microscopio y un sistema de
filtros, el de excitacin o seleccin de luz ubicado entre la fuente de luz y el
preparado, tiene por objeto permitir el paso de ondas de luz con longitud
que caiga en el rango azul con el fin que el preparado sea alcanzado
exclusivamente por la luz azul y produzca emisin de luz fluorescente. Es
segundo filtro es el de calor y est ubicado entre la fuente de luz y el filtro
de excitacin en los microscopios de luz transmitida y entre la fuente de luz
y el espejo dicrmico en los microscopios de luz incidente. El tercer tipo de
filtro es de barrera, colocado antes del ocular para prevenir daos retinianos
que podran ser causados por rayos ultravioleta que escapan el espejo
dicrmico.

La luz de una fuente de longitud de onda mltiple se mueve a travs de un

filtro excitador que solo permite que pase la radiacin excitada de la
longitud de onda deseada. Esta radiacin es reflejada por el filtro
dicromtico y enfocada por la lente del objetivo sobre la muestra, las
molculas fluorescentes de la muestra se excitan y emiten luz (por
fluorescencia) de una longitud de onda especfica y mayor. Esta luz es
enfocada por el objetivo y la mayor parte pasa a travs del filtro dicromtico
y no se refleja. Un filtro de barrera final bloquea toda la luz residual con la
frecuencia de la radiacin de excitacin.

Clases de tcnicas utilizadas para la preparacin de las muestras

DIRECTA : Es una tcnica que consiste en demostrar la presencia de un

antgeno mediante reaccin directa con un anticuerpo especfico marcado
con colorante fluorescente. El anticuerpo es obtenido a travs de la
inoculacin del microorganismo productor del antgeno en un modelo
animal.

INDIRECTA : Es una tcnica de doble capa en donde se aplica el

anticuerpo sin marcar directamente sobre el sustrato de tejido y se visualiza
por tratamiento con un suero anti-inmunoglobulina conjugado con
fluorocromo.

El proceso consta de dos etapas: en la primera se fijan sobre un

portaobjetos los antgenos que constituyen el substrato conocido especfico
(clulas que contiene virus, T. gondii, T. pallidum, etc.) sobre l se coloca
el suero de quien se sospecha la presencia de anticuerpos especficos, si
la reaccin es positiva se dar formacin de complejo antgeno-anticuerpo
no visible ya que el anticuerpo no estaba marcado.

En la segunda etapa se debe obtener una anti-inmunoglobulina humana

marcada, que reaccionar con el anticuerpo del complejo producido en la
primera etapa. La anti-inmunoglobulina se obtiene as: de una mezcla de
varios sueros de personas normales, se precipitan las globulinas
(anticuerpo), estn globulinas son inoculadas a un organismos (conejos,
cabras), el organismo producir antiglobulinas humanas que se marcan con
fluorescena o cualquier otro de los colorantes. Este anticuerpo marcado se
unir al anticuerpo humano no marcado de la primera etapa que en esta
momento se puede considerar como un antgeno, dando reaccin positiva
de fluorescencia solamente si en la primera etapa se produjo unin entre el
antgeno fija en la placa y el anticuerpo presente en el suero humano que
estamos evaluando.

La tcnica indirecta tiene ventajas: la inmunofluorescencia es ms brillante

que la deteccin directa debido a que varias anti-inmunoglobulinas
fluorescentes se pueden unir a cada una de las molculas de Antgeno-
anticuerpo presentes en la primera capa, adems dado que el proceso de
conjugacin es largo, se ahorra tiempo cuando se estudian varios sueros
para la determinacin de anticuerpo ya que slo es necesario prepara un
nico reactivo marcado : la anti-inmunoglobulina.

SANDWICH : Este es un procedimiento de doble capa diseado para

visualizar anticuerpos especficos. El nombre de la determinacin deriva de
la observacin que el antgeno se ubica entre el anticuerpo presente en el
sustrato de la clula y el agregado como segunda capa.

PREPARACIN DE LA MUESTRA

A. Mtodos de conjugacin : Es posible conjugar las protenas en el suero

completo o en fracciones de suero luego de concentrar los anticuerpos.

Se debe aadir al suero un amortiguador de carbonato-bicarbonato para

mantener condiciones ptimas de pH (9.0), se agita en bao de hielo
aadiendo fluorocromo en un perodo de 15 minutos, se debe permitir una
agitacin toda la noche ya que la conjugacin es del orden del 100% en 24
horas.

B. Purificacin del conjugado : Se logra mediante eliminacin por dilisis

de las sales amortiguadoras y los elementos utilizados como solventes del
fluorocromo (acetona). Se utiliza extraccin con carbn o filtracin en
columna de sephadex para eliminar las sustancias fluorescentes Que. no
reaccionaron lo cual puede ocasionar tincin inespecfica.
C. Concentracin del Anticuerpo : Se logra mediante tratamiento con
sales de amonio saturado. El almacenamiento es el solucin salina
amortiguada con fosfato a pH 7.1.

D. Preparacin de anticuerpos : Se obtienen mediante inmunizacin en

animales, la globulina humana se aplica en 2 o 3 inyecciones a intervalos
de 3-4 semanas, la respuesta de anticuerpos se mide mediante mtodos
serolgicos y el suero se recoge 7-10 das luego de la ltima inyeccin.

E. Manejo de cortes y tejidos : Los frotis y cortes montados que no se

estudien de inmediato se pueden proteger por sumersin en carbowax y
almacenamiento a -20C. Los cortes liofilizados protegidos con resina de
poliester se pueden conservar varios meses en un desecador a 0C sin que
pierda sus antgenos.

Es preferible trabajar con cortes fijados ya que.la tincin

inmunofluorescente en cortes sin fijar se acompaa de difusin o prdida
del antgeno adems se reduce la autoinmunofluorescencia tisular
(vesculas y partculas).

Se deben usar fijadores que no alteren la estructura antgeno-

anticuerpo, el ms empleado es alcohol etlico al 95% entre 4-30C, alcohol
metlico, acetona o formol. Para bacterias es muy til la fijacin mediante
calor. La inclusin en parafina de los tejidos es muy usado y puede lograr
una localizacin ms precisa y una tincin ms viva que con cortes

FLUOROCROMOS

Se deben utilizar colorantes que formen uniones con las protenas pero sin
afectar los grupos de combinacin especfica del anticuerpo. La reaccin
de unin ocurre entre los grupos amino y carboxilo de la protena y los
grupos tiocianato o cloruro de sulfonilo de los colorantes. El fenmeno de
fijacin disminuye la fluorescencia de los fluorocromos de tal manera que
los conjugados solo muestran de 15-30% de la fluorescencia del colorante
libre.

El pH afecta la fluorescencia y por esta razn se debe trabajar a pH estable

y adecuado dependiendo del colorante : fluorescena (pH 8), rodamina (pH
7), DANS (pH 1.6-14).

El colorante fluorescente es una molcula que absorbe luz en una longitud

de onda, lo que excita los electrones y los lleva a un nivel energtico mayor
y al volver a su nivel energtico inicial emite luz en una segunda longitud
de onda. El isocianato de fluorescena y el DANS muestran una
fluorescencia verde manzana bajo la luz ultravioleta y la rodamina
anarajando brillante.

Cuando el lapso de tiempo entre la absorcion de la luz activamente y la

emision de la nueva luz es mayor de 1/10000 segundos el fenomeno se
define como fosforescencia, pero cuando el fenomeno es menor de
1/10000 segundos se define como fluorescencia.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS

VENTAJAS

- Se pueden obtener resultados rpidos.

-No es necesario realizar cultivos.

-Se puede identificar microorganismos especficos en un grupo mixto.

-Determina la identidad de un organismo muerto.

DESVENTAJAS

-Costos en reactivo y equipo

-Debe ser realizado por personal muy especializado.

-Los resultados no son 100% especficos (como toda tcnica serolgica)

BIBLIOGRAFIA

1. file:///F:/minmuflures.html