Está en la página 1de 7

DETERMINACIN DE COLIFORMES EN UNA MUESTRA DE AGUA

1. Introduccin

El agua como posible agente portador de m.o.s patgenos puede poner en peligro la salud y la vida. Los
grmenes patgenos que con mayor frecuencia se propagan por este medio son los Salmonella typhosa,
Salmonella sp. Shigella sp. y Vibrio cholerae, los cuales pueden causar fiebre tifoidea, fiebre paratifoidea,
disentera y clera, respectivamente. Estos m.o.se encuentran en las heces y en la orina de personas y
animales infectados que al ser eliminados pueden contaminar las aguas que se utilizan para el consumo
humano.

El agua puede ser completamente clara y no presentar ninguna cualidad apreciable al olfato o al paladar
y, sin embargo, puede estar contaminada. Por esta razn es necesario aplicar tcnicas especiales a fin
de poder determinar su calidad microbiolgica sanitaria.

Los exmenes para el agua en el laboratorio comprenden tanto anlisis microbiolgicos como anlisis
fsico qumicos. El anlisis microbiolgico comprende el anlisis cuantitativo o recuento y el anlisis
cualitativo determinacin de la presencia o ausencia de un determinado m.o.

2. Anlisis microbiolgico cuantitativo para agua

El anlisis microbiolgico del agua tiene como objetivo determinar la presencia de m.o. de origen
intestinal, lo que se puede lograr mediante la determinacin de coliformes y de E. coli. Estas bacterias
son habitantes normales del intestino del hombre y de animales y si abundan en una muestra de agua
significa que el agua tiene presencia de contaminacin fecal.

El grupo de m.o. llamados coliformes forman parte de la familia de las Enterobacteriaceas. Son bacilos
Gram negativos aerobios y anaerobios facultativos. Producen cido a partir de la glucosa y otros
carbohidratos. Fermentan la lactosa con produccin de cido y gas a 35C en 48 horas. Este grupo
incluye los gneros: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, y Enterobacter.

E. coli es una bacteria cuyo hbitat es el intestino del hombre y de animales de sangre caliente y debido a
esto se ha utilizado como indicador de contaminacin fecal.

El grupo de coliformes fecales se define como bacilos Gram negativos aerobios anaerobios facultativos,
que fermentan la lactosa, formando cido y gas a 44,5C 0,2C en 24 horas de cultivo. Este grupo
incluye los m.o. que pertenecen pr lo menos a dos gneros: Escherichia y Klebsiella.

3. Determinacin de bacterias coliformes

La concentracin de bacterias coliformes en una muestra de agua se puede determinar a travs de dos
tcnicas: Nmero Ms Probable (NMP) y Filtro Membrana (FM). La tcnica de Nmero Ms Probable es
indicada cuando se espera encontrar o detectar una baja concentracin de coliformes en la muestra.

La tcnica del Nmero Ms Probable contempla la dilucin de la muestra y generalmente se emplean 5


tubos con el medio de cultivo inoculado para cada dilucin. Para poder determinar la concentracin de las
bacterias coliformes se deben realizar como mnimo tres diluciones consecutivas.

La determinacin de las bacterias coliformes ya sea por NMP o por FM considera dos etapas o pruebas:
Prueba presuntiva
Prueba confirmativa

1
Prueba presuntiva

Consiste en determinar la fermentacin de la lactosa con produccion de gas. Para esto se inocula con
muestra de agua un tubo con caldo lactosado o caldo lauril sulfato triptosa y se incuba a 35C por 24-48
horas. Si no hay produccin de gas el resultado es negativo para la presencia de coliformes y el anlisis
termina. Por el contrario, si hay presencia de gas y turbidez se debe confirmar la presencia de coliformes.
Ver Figura 7.1.

Prueba confirmativa

Para confirmar la presencia de m.o del grupo coliformes se realizan dos pruebas, una para confirmar
coliformes totales con caldo bilis verde brillante al 2% y otra para confirmar coliformes fecales utilizando
caldo EC. Si se desea confirmar la presencia de Escheriachia coli se deben realizar pruebas bioqumcas
a aquellos tubos que den positiva la prueba de confirmativa para coliformes fecales. Ver figura 7.2 y 7.3.

4. Procedimiento

4.1. Siembra de la muestra Prueba presuntiva

Previo a la inoculacin, la muestra y diluciones deben ser agitadas 25 veces en 7 segundos en un


arco de 45, con movimientos de arriba hacia abajo para asegurar la homogeneidad de la
muestra. Este procedimiento debe repetirse antes de inocular cada serie de diluciones.
Inocular 5 tubos de caldo lauril sulfato triptosa doble concentracin con 10 mL de la muestra en
cada tubo.
Inocular 5 tubos de caldo lauril sulfato triptosa simple concentracin con 1 mL de la muestra en
cada tubo.
Inocular 5 tubos de caldo lauril sulfato triptosa simple concentracin con 0,1 mL de la muestra en
cada tubo.
Agitar suavemente la gradilla para mezclar la muestra con el medio de cultivo e incubar los tubos
a 35C por 24 a 48 horas.
Observar la formacin de gas en cada tubo a las 24 h la presencia de gas y turbidez es registrada
como prueba positiva. En caso negativo, sin gas ni turbidez, incubar por 24 h ms.
Registrar el nmero de tubos positivos por cada dilucin. Ver Figura 7.1.

4.2. Prueba confirmativa de coliformes totales, fecales, E. coli

Todos los tubos que resulten positivos a las 24 o 48 horas se transfieren a caldo bilis verde brillante al 2%
para confirmar coliformes totales y a caldo EC para confirmar coliformes fecales. Ver Figura 7.2.

a. Prueba Confirmativa de coliformes totales


Transferir un inculo con asa loop a tubos con caldo lactosa verde brillante 2%.
Incubar a 35C por 48 h en estufa de incubacin.
Son positivos de coliformes totales aquellos tubos con formacin de gas y turbidez.

b. Prueba Confirmativa de Coliformes fecales


Transferir un inculo con asa loop a tubos con caldo EC.
Incubar a 44,5C por 24 h en bao de coliformes.
Son positivos de coliformes fecales aquellos tubos con formacin de gas y turbidez.

2
Figura 7.1. Prueba presuntiva para la determinacin de coliformes

Figura 7.2. Prueba confirmativa para la determinacin de coliformes totales y fecales

c. Prueba Confirmativa de E. coli

3
De cada tubo de caldo EC que presente formacin de gas, transferir por estra un inculo a una
placa con agar LEAM (Levine eosina azul de metileno).
Incubar las placas invertidas a 35C por 24 h.
Seleccionar las colonias que presenten centro oscuro con o sin brillo metlico.

d. Pruebas bioqumicas Prueba IMViC

Figura 7.3. Prueba confirmativa para la determinacin de E. coli.

Respuestas del E. coli a la Prueba IMViC

Biotipo1 Biotipo 2
I + -
M + +
Vi - -
C - -

4.3. Clculo y expresin de los resultados

La combinacin de tubos positivos y/o negativos de la pruebas confirmativas es referida a la tabla de


NMP y se expresa como:

NMP de coliformes totales por 100 mL de muestra


NMP de coliformes fecales por 100 mL de muestra

Cuando se utilizan ms de 3 series de diluciones decimales, se considera el resultado de 3 series,


eligiendo la dilucin ms alta que da resultados positivos en los 5 tubos de ensayados y las dos
diluciones siguientes.

4
Si para el clculo del NMP se consideran las tres priemras series (10, 1 y 0,1 mL), el valor expresado en
la Tabla I corresponde al NMP/100 mL

Si en lugar de los volmenes de muestra de 10, 1 y 0,1 mL se consideran 1, 0,1 y 0,01 m, se lee el
resultado de la Tabla II y se multiplica por 10. Si se utilizan alcuotas ms pequeas, multiplicar por 100 o
1000, segn las alcuotas consideradas.

5. Trabajo experimental

5.1. Objetivo

Determinar la concentracin de coliformes totales y fecales en una muestra de agua

5.2. Materiales, medios de cultivo y reactivos

Vrtex
Estufa de incubacin
Pipetas estriles
Asa de siembra tipo loop
Tubos con caldo lauril sulfato triptosa concentracin doble y simple
Agua peptonada tamponada al 0,1%

5.3. Actividades

Cada grupo recibir una muestra de agua a la cual deber determinar la concentracin de coliformes
totales y fecales de acuerdo a la tcnica de tubos mltiples.

Procedimiento

Realizar prueba presuntiva de acuerdo a las indicaciones del punto 4.1


Realizar prueba confirmativa para coliforrmes totales y fecales de acuerdo a lo indicado en el punto 4.2.
Determine los resultados de acuerdo a lo indicado en el punto 4.3.

5
Tabla II. Nmero ms probable de bacterias por 100 g (mL) de muestra analizada empleando cinco tubos
inoculados con 10, 1 y 0,1 g (mL) de muestra.

6
Referencias

Alors, R. (2008).Tcnicas de visualizacin microscpica de microorganismos. Innovacin y


experiencias educativas. ISSN 1988-6047
APHA, AWWA, WEF. (2005). Standard Methods for the examination of water and wastewater. 21 st
ed., Washington.
Castillo, G. (1979). Mtodos para anlisis bacteriolgicos de aguas. Servicio Nacional de Obras
Pblicas, Ministerio de Obras Pblicas, Santiago.
FAO. (1981). Manual de Mtodos de Anlisis Microbiolgicos. Santiago.
Gamazo, C., Lpez-Goi, I. y Daz, R. (2005). Manual prctico de Microbiologa. 3 Ed. Barcelona.
Elsevier Masson.
ISP. (1998). Manual de Tcnicas Microbiolgicas para alimento y agua. Ministerio de Salud.
Santiago.
Merck. (1990). Manual de medios de cultivo. MERCK, Darmstadt.
Leal, H. (1992). Manual de trabajos prcticos de microbiologa. Departamento de Ingeniera
Qumica. Universidad de La Frontera. Temuco.
Ramos, E. (2006). Manual de laboratorio de instrumentacin bsica. Facultad de Bioanlisis.
Universidad de Veracruz. Mxico.
Scheuerman, E., Diez, MC. (1999). Manual de Laboratorio de Microbiologa de Alimentos. 1 Ed.
Temuco. Ediciones Universidad de La Frontera.