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INTRODUCCION

La cromatografa, es la tcnica de anlisis qumico utilizada para separar sustancias puras


de mezclas complejas.

Actualmente cromatografa es el nombre que se le da a un grupo de tcnicas utilizadas en


la determinacin de la identidad de sustancias, en la separacin de componentes de las
mezclas y en la purificacin de compuestos. Esta tcnica es muy efectiva y por lo tanto se
utiliza tanto a nivel de investigacin como a nivel industrial.

Este mtodo puede variar de tcnica en tcnica, pero siempre se basa en el mismo
principio: Todos los sistemas de cromatografa contienen una fase estacionaria y una fase
mvil.

Se clasifican en:

Cromatografa plana.- La fase estacionaria se sita sobre una placa plana o sobre un
papel. Las principales tcnicas son:
Cromatografa en papel.
Cromatografa en capa fina
Cromatografa en columna. La fase estacionaria se sita dentro de una columna. Segn el
fluido empleado como fase mvil se distinguen:
Cromatografa de lquidos.
Cromatografa de gases .
Cromatografa de fluidos supercrticos.
La cromatografa de gases.- es til para gases o para compuestos relativamente voltiles,
lo que incluye a numerosos compuestos orgnicos.
Dentro de la cromatografa lquida destaca la cromatografa lquida de alta resolucin.
OBJETIVOS

Conocer la cromatografa como una tcnica de separacin de mezclas de


sustancias, sus caractersticas y sus factores que en ella intervienen,
Estudiar la incidencia del coeficiente de reparto entre la fase mvil y la fase
estacionaria.
Analizar la influencia del solvente en la separacin cromatografa.
Dar a conocer como obtuvimos los colores naturales de las sustancias.
Observar distintas reacciones ya que los disolventes tiene diferentes acciones.
DESARROLLO DEL TEMA.
Qu es la Cromatografa?

Es la tcnica para separar componentes de una mezcla, y su posterior anlisis, basadas en


que las distintas sustancias que forman los componentes de una mezcla se dejan arrastrar
a diferentes velocidades sobre un soporte. El soporte puede ser papel, un gas, otro
lquido, etc. Es un mtodo fsico de separacin de componentes.

Para qu se utiliza la Cromatografa?

La cromatografa se utiliza para lograr la separacin de los componentes de una mezcla


como para medir la proporcin de cada elemento en la mezcla.

FASES DE LA CROMATOGRAFA:

LA FASE ESTACIONARIA.- Consiste en partculas, generalmente slidas, pequeas y con


una superficie microporosa, de forma que presenta un amplio desarrollo
superficial. Puede estar empaquetada en forma de columna o extendida en forma
de capa. En ocasiones es necesario un tratamiento qumico de la fase estacionaria
para conseguir unas partculas de tamao y poro adecuados.

FASE LIGADA.-Una fase estacionaria que est unida de forma covalente a las partculas
de soporte o a la pared interior de la columna. (Lugar donde se produce la
separacin).

FASE MVIL.- Fluido que se filtra a travs o a lo largo del lecho estacionario, en una
direccin definida. Puede ser un lquido (Cromatografa Lquida), un gas
(Cromatografa de Gases) o un fluido supercrtico (Cromatografa con Fluido
Supercrtico). En la cromatografa de gases se uede usar la expresin Gas Portador
para la fase mvil. En la cromatografa de elucin se usa tambin para la fase mvil
la expresin Eluyente.

FLUIR.- Proceso en el que la fase mvil se desplaza a lo largo de la fase estacionaria


transportando los componentes a separar. El proceso de elucin se puede detener
mientras todos los componentes de la muestra estn an en el lecho
cromatogrfico, o continuarse hasta que lo hayan abandonado. Nota: Se prefiere
el trmino "Eluir" a "Desarrollar", trmino usado en nomenclaturas anteriores de
cromatografa plana.
EFLUENTE.- La fase mvil que abandona la columna.

MUESTRA.- Mezcla consistente en cierto nmero de componentes, cuya separacin se


pretende en el lecho cromatogrfico al ser arrastrados o eluidos por la fase mvil.
Componentes de la Muestra. Los constituyentes qumicamente puros de la
muestra. Pueden no ser retenidos por la fase estacionaria (es decir, no
retardados), retenidos parcialmente (es decir, eluidos a tiempos diferentes) o
retenidos permanentemente. Se aceptan tambin los trminos Eluito y Analito
para un componente de la muestra.

SOLUTO.- termino que se refiere a los componentes de la muestra en la


cromatografa de reparto.

DISOLVENTE.- termino que en ocasiones se refiere a la fase estacionaria liquida en la


cromatografa de reparto.

Nota: en la cromatografa liquida, el trmino disolvente se ha usado a menudo para la


fase mvil. Este uso no se recomienda.

ZONA.- Regin del lecho cromatogrfico donde se localizan uno o ms componentes


de la muestra. Se puede usar para ello tambin el termino banda.

CROMATGRAMA.- Una grfica u otro tipo de presentacin de la respuesta de un


detector, la concentracin de un analito en el efluente u otra magnitud usada
como medida de la concentracin en el efluente, frente al volumen de efluente o
al tiempo. En la cromatografa plana, "cromatgrama" puede referirse al papel o
capa con las zonas separadas.

CROMATOGRAFIAR.- separar por cromatografa.

CROMATGRAFO.- El instrumento empleado para realizar una separacin


cromatogrfica.
TIPOS DE CROMATOGRAFA

Existen diferentes criterios de clasificacin de la cromatografa:

Por la naturaleza de sus fases:


Cromatografa lquido - lquido
Cromatografa gas - lquido
Cromatografa lquido -. slido
Cromatografa gas - slido

Atendiendo al proceso qumico-fsico que va a protagonizar el proceso de


separacin:
Siendo este el criterio ms coherente de clasificacin:


Cromatografa de Adsorcin (lquido - slido o cromatografa de fases
normales).
Cromatografa de Reparto (o lquido - lquido), se basa en las
caractersticas de solubilidad relativa de los solutos entre la fase
mvil y una fase estacionaria de un lquido no polar. La fase lquida
se impregna a un soporte inerte de slice o, en el caso de
cromatografa de fase invertida, se une qumicamente.
Cromatografa de Intercambio inico.
Cromatografa de Exclusin.
Con base en la naturaleza del soporte en el que se aloja la fase estacionaria:
Cromatografa plana:
Cromatografa en papel
Cromatografa en capa fina (TLC)
Cromatografa en columna:
Cromatografa de gases (GC)
Cromatografa lquida (LC), pueden ser:

- cromatografa lquido lquido.

- cromatografa slido lquido.


CLASIFICACION DE LAS TECNICAS CROMATOGRAFICAS:

1. DE ACUERDO CON LA FORMA DEL LECHO CROMATOGRFICO:


CROMATOGRAFIA PLANA:

Se realiza sobre papel u otro material slido. Suele llamarse en capa fina o en capa delgada
porque la fase estacionaria recubre un soporte plano y rgido.

CROMATOGRAFIA EN PAPEL:

La cromatografa en papel es una tcnica ampliamente utilizada en el


laboratorio debido a su bajo costo y la rapidez del anlisis.

Se realiza colocando el pimento sobre una hoja de papel de filtro y


posteriormente este se coloca en un disolvente (generalmente un
disolvente fcil de vaporar).

El resultado del anlisis ser una separacin de colores donde se puede


identificar los componentes de la sustancia en caso de que esto no ocurra
deben utilizarse tcnicas de revelado.

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA.

La tcnica es similar a la cromatografa en papel, a excepcin que en este caso el anlisis se


realizara en una placa de plstico, aluminio o vidrio cubierta de una capa de sustancia absorbente
como almina o gel de slice.
CROMATOGRAFIA EN COLUMNA.

La cromatografa en columna es quizs el mtodo ms general utilizado para la separacin, a la vez


que para la purificacin, de diferentes compuestos orgnicos que se encuentren en estado slido
o liquido.

Tcnica de separacin en la que el lecho estacionario esta contenido dentro de un tubo.

Las partculas de fase estacionaria solida, o de soporte recubierto con una fase estacionaria liquida
pueden llenar por completo el tubo (columna empaquetadora) o estar concentradas sobre o a lo
largo de su pared interna, dejando una ruta abierta, no restringida, para el paso de la fase mvil
por el centro del tubo (columna tubular abierta).
2. DE ACUERDO CON EL ESTADO FSICO DE LAS FASES:
CROMATOGRAFIA DE GASES.

Para esta tcnica se utiliza un cromatgrafo de gases el cual volatiliza e inyecta los gases dentro
de una columna.

La fase mvil est formada por gas inerte.

Existen dos tipos; de gas solido y gas liquido.


CROMATOGRAFIA LIQUIDA.

En la cromatografa lquida, la fase mvil es un lquido que fluye a travs de una columna que
contiene a la fase fija. La separacin cromatografa en HPLC es el resultado de las
interacciones especficas entre las molculas de la muestra en ambas fases, mvil y
estacionaria.

A diferencia de la cromatografa de gases, la cromatografa de lquidos de alto rendimiento, no


est limitada por la volatilidad o la estabilidad trmica de la muestra.

Cromatografa lquida de alta presin o de alta eficacia (cuando se emplean partculas de fase
estacionaria muy pequeas y una presin de entrada relativamente alta).
3. De acuerdo con el mecanismo de separacin:

CROMATOGRAFIA DE ADSORCION.

(Atencin: es adsorcin, no absorcin).

La separacin se basa principalmente en la diferente afinidad en trminos de adsorcin de


los componentes de la muestra sobre la superficie de un slido activo.

La fuerza con que es adsorbido un componente depende de las interacciones (tipo y


magnitud) existentes entre, o bien, el componente y la fase estacionaria, o el componente
y la fase mvil, es decir de la polaridad de los componentes, de la actividad del absorbente
(fase estacionaria) y de la polaridad de la fase mvil.

La cromatografa de adsorcin, es una tcnica particularmente til para separar


compuestos de polaridad baja o media. La separacin de compuestos muy polares
mediante cromatografa de adsorcin requiere, debido a la gran retencin que ofrecen, la
utilizacin de adsorbentes muy poco activos, o bien, tratamientos qumicos previos a fin
de reducir su polaridad.
CROMATOGRAFIA DE REPARTO.

Donde la separacin se basa en las diferentes solubilidades de los componentes que conforman la
mezcla en las distintas fases estacionarias, y mviles, que en este caso, son ambas lquidas.
Cuando la fase estacionaria es menos polar que la fase mvil, esta se llamar cromatografa en
fase inversa.

Ejemplos: en cromatografa plana, la F.E. es el agua o disolvente asociados a la celulosa (papel) o al


soporte slido que forma la capa fina; en columna, como F.E. se usan tierra de diatomeas, gel de
slice, celulosa en polvo.

CROMATOGRAFIA DE INTERCAMBIO IONICO.

La fase estacionaria es un slido que tiene anclados distintos grupos funcionales fijos ionizables,
cuyas cargas se encuentran contrabalanceadas por distintos iones mviles que pueden ser
intercambiados por los iones presentes en la fase mvil.
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION.

Tambin se llama de exclusin molecular. Estrictamente, se basa en diferencias de tamao, forma


o carga entre las molculas de los distintos componentes de la muestra, pero lo ms habitual es
aprovechar las diferencias de forma y tamao. En este caso, se la llama tambin cromatografa de
exclusin por tamao, de filtracin en gel, de permeacin en gel o de tamiz molecular.

Esquema de la separacin de molculas de distinto tamao durante una cromatografa de


exclusin.

Ejemplos: para la separacin de protenas y polisacridos se usan como F.E. polmeros lineales
entrecruzados (es decir, que forman enlaces transversales). Los ms comunes son dextranos
(marca comercial: Sephadex), agarosa (Sepharosa y Biogel A) y poliacrilamida (Biogel P). Estos
materiales, en forma de pequeas esferas, se expanden o hinchan al sumergirlos en disoluciones
acuosas, generando un retculo o matriz tridimensional, con poros de tamao definido.

Aplicaciones:

Para la purificacin de una protena (al igual que otras tcnicas cromatografas).
Se puede establecer una correlacin entre el tamao molecular y la movilidad en la
columna de exclusin, por lo que esta tcnica se emplea para determinar masas
moleculares.
Para eliminar sustancias de pequeo tamao molecular de una muestra proteica (ejemplo,
las sales inorgnicas en un desalado de la muestra, eliminacin del exceso de reactivos
tras tratar una protena en el laboratorio, eliminacin de inhibidores enzimticos). El
resultado es similar a una dilisis, pero ms rpido.
CROMATOGRAFIA DE AFINIDAD.

Variedad particular de cromatografa en la que la separacin se basa en la especificidad biolgica


singular de interaccin entre un componente de la muestra y otra molcula unida a la F.E.; los
ejemplos ms comunes son las interacciones enzima-sustrato, antgeno-anticuerpo y ligando-
receptor.

F.E.: un soporte inerte (micro esferas de vidrio o plstico, gel de agarosa) al que se une
covalentemente el ligando de afinidad. Ejemplos de este ligando: sustrato, inhibidor o cofactor de
una enzima, anticuerpo, antgeno, heptano, sustancia transportada, hormona, oligosacridos,
lectinas (protenas con afinidad por oligosacridos).
CROMATOGRAFIA BIDIMENCIONAL.

Es una variante de considerable poder de separacin, ya que se emplean dos diferentes solventes
aplicados secuencialmente para desplazar un solo compuesto.

La gota del compuesto (generalmente un aminocido o un pptido) se revela como una mancha
en papel. Y el material revelador es usualmente ninhidrina o permanganato de potasio.

4. Mtodos de anlisis:

CROMATOGRAFIA DE ELUCION:

Procedimiento en el que la fase mvil pasa de forma continua a travs o a lo largo del lecho
cromatogrfico y la muestra se suministra al sistema de forma discreta, como una pequea
cantidad en un tiempo breve. Esta tcnica presenta la desventaja de que los componentes con
retenciones muy altas puedan no ser observados.
CROMATOGRAFIA FRONTAL:

Procedimiento en el que la muestra ( liquida o


gaseosa) se alimenta de forma continua al lecho
cromatografico. No se utiliza ninguna fase mvil
adicional. Se utiliza la diferencia de afinidad del
adsorbente por cada una de las sustancias a
preparar. Se utiliza una pequea columna, que se
satura sucesivamente por cada una de las
sustancias a separar, emergiendo de ella el primer
componente puro hasta que la columna se satura
del segundo componente, momento en el que
empezara a emerger este mezclado con el
primero. El anlisis frontal tiene su principal
aplicacin como tcnica preparativa en la
purificacin de sustancias.

CROMATOGRAFIA POR DESPLAZAMIENTO:

Procedimiento en el cual la fase mvil contiene un


compuesto (el desplazante) que es retenido ms
fuertemente que el resto de los componentes de la
muestra analizada. La muestra se alimenta en forma
discreta, como una pequea cantidad en un
intervalo breve. Este mtodo se utiliza tanto para
separaciones analticas como preparativas, siendo
muy utilizada en cromatografa de cambio inico.
Etapas en la realizacin de una cromatografa.
CROMATOGRAFA EN COLUMNA:
1.- Preparacin del soporte y fase estacionaria.
1.1.- Equilibrado de la columna.
2.- Aplicacin de la muestra.
3.- Elucin:
a) Lavado de componentes no retenidos.
b) Liberacin, desplazamiento o elucin propiamente dicha de los componentes retenidos.
4.- Recoleccin de fracciones o anlisis del efluente en continuo.
5.- Anlisis, cuantificacin o revelado.
6.- Regeneracin de la fase estacionaria.

CROMATOGRAFA PLANA (PAPEL O CAPA FINA):


1.- Preparacin del soporte y fase estacionaria.

2.- Aplicacin de la muestra.


Secado.
3.- Desarrollo de la cromatografa.
4.- Secado de la placa.
5.- Revelado y cuantificacin en su caso.
RECOGIDA DEL EFLUENTE:
El efluente de una columna se suele recoger en forma de pequeas porciones o fracciones,
comnmente con la ayuda de un dispositivo mecnico llamado colector de fracciones.

Esquema de un colector de fracciones. En cada tubo cae un nmero determinado de gotas o un


cierto volumen. A continuacin el soporte gira, de modo que el tubo siguiente queda colocado
bajo la salida del efluente. Las gotas se detectan mediante una clula fotoelctrica; cada gota
interrumpe el haz de luz y as se cuenta.
PAPEL DE LA CROMATOGRAFA COMO MTODO ANALTICO DE REFERENCIA EN EL
LABORATORIO

INTRODUCCION

La cromatografa es una tcnica analtica muy especfica en la que una mezcla de componentes es
separada aprovechando la reparticin diferencial de los mismos entre dos fases: una mvil y otra
estacionaria. La fase mvil puede ser un gas o un lquido, mientras que la fase estacionaria, est
constituida por un slido o un lquido (unido a una base slida). Tras su separacin, los distintos
analitos se pueden identificar mediante un revelado en el caso de la cromatografa en capa fina o
bien mediante un detector acoplado a la salida de los sistemas cromatogrfico lquidos o gaseosos.
CROMATOGRAFA DE LABORATORIO

El trmino cromatografa se identifica, aunque no etimolgicamente con el procedimiento en el


que una disolucin de sustancia puede separarse por paso en una direccin determinada sobre un
sistema que contiene un slido orgnico o inorgnico insolubles, de mayor o menor grado de
divisin, obtenindose como resultado la retencin de los componentes de la mezcla a diferentes
distancias del punto de partida. El mecanismo bsico es la particin de los componentes mviles
entre dos fases lquidas y la formacin de uniones lbiles sobre la superficie del adsorbente. Si en
ltima instancia se producen retenciones debidas &lo a fuerzas fsicas superficiales, el proceso se
denomina adsorcin cromatografa. Prcticamente existe una combinacin de los dos
fenmenos y se clasifican segn el predominio del uno sobre el otro. Existe un tercer tipo llamado
de intercambio inico que solo citaremos brevemente. Un cuadro resumen de los tipos de
procesos que estn implicados en la cromatografa en general se resume a continuacin situando
debidamente la cromatografa de capa fina (T. L. C.) adecuadamente.
FASES DEL PROCESO CROMATOGRFICO

1. Preparacin de la fase estacionaria


2. Introduccin de la muestra vehiculada por una fase mvil
3. Paso a travs de una fase estacionaria donde se producen las interacciones que ms tarde
llevarn a su separacin
4. Elucin (segn en qu tcnica)
5. Lectura de los resultados para obtener el cromatograma.
MECANISMOS IMPLICADOS:

1. Adsorcin
2. Reparto
3. Intercambio inico
4. Exclusin molecular
5. Afinidad

APLICACIONES DE LA
CROMATOGRAFIA

A. Tecnologa de alimentos y Productos


Naturales.- Puede realizarse la caracterizacin de Aceites Esenciales y Aromas, los cuales son
empleados en la elaboracin de saborizantes, aromatizantes, licores, perfumes, artculos de
aseo, y como materias primas para productos farmacuticos.

B. Control Ambiental.- Dentro de los contaminantes posibles de ser estudiados estn: los
hidrocarburos aromticos, BTEX, pesticidas rgano-clorados y rgano-fosforados en muestras
de aguas superficiales, subterrneas, suelos y lodos.

C. Qumica Forense.- Es posible la aplicacin de la cromatografa de gases y la espectrometra de


masas en la deteccin y cuantificacin de analitos de inters en la qumica forense. Por
ejemplo la determinacin, cuantificacin de alcohol en sangre, anlisis de licores, entre otros.

CAMPOS DE APLICACIN DE LA CROMATOGRAFIA

Asesoramiento en el desarrollo de
mtodos cromatogrfico.
Sntesis de nuevos solventes para la
extraccin selectiva de contaminantes
orgnicos
Implementacin de mtodos analticos
para determinar compuestos orgnicos
de inters ambiental en distintas
muestras de aguas, sedimentos y lodos
Determinacin de compuestos de
inters farmacolgico en tejidos de
origen animal
Imparticin de cursos Servicios
analticos, para la investigacin y al desarrollo, en el mbito del anlisis radio-qumico
ambiental (URAIS: Unidad Radioqumica Ambiental y Sanitaria)
Anlisis de parmetros radioactivos segn la Normativa 98/83/EC, relativa a los requisitos
sanitarios de la calidad de las aguas para el consumo humano
Anlisis de diferentes istopos radioactivos en productos alimenticios de acuerdo con la
normativa en vigor.

LA CROMATOGRAFIA COMO ANALISIS CUANTITATIVO EN EL LABORATORIO

Un anlisis cromatogrfico puede dar una amplia informacin cualitativa si se escoge el sistema de
deteccin adecuado para determinar y evaluar los analitos separados, as si se utiliza un detector
que permita obtener un espectro de cada compuesto separado y a su vez contenga una base de
datos que pueda realizar su comparacin con una biblioteca de espectros se podra, de una forma
muy precisa, establecer la identidad de los componentes de una muestra, de hecho esto se logra
fcilmente con cromatografas que contienen sistema de deteccin como el Infrarrojo (IR), el de
Resonancia Magntica Nuclear (RMN) o el espectrmetro de Masas (MS). Sin embargo, estos
sistemas son muy costosos, es por ello que la mayora de los laboratorios cuentan con
cromatografas con sistemas de deteccin sencillos como el detector de ionizacin a la llama
(siglas en ingls, FID) o el detector de conductividad trmica (siglas en ingls (TCD) en el caso de
cromatografa de gases o detectores de absorbancia o ndice de refraccin para los casos de
cromatografa de lquidos. La nica informacin cualitativa que pueden ofrecer estos sistemas es
el tiempo de retencin del analitos, el cual, solo puede ser usada controlando bien las condiciones
cromatogrficas como: flujo, temperatura, tipo de fase estacionaria en el caso de gases o
composicin qumica de la fase mvil adems de las otras variables mencionadas anteriormente
para el caso de cromatografa de liquida, adems de que se debe tener conocimiento de los
posibles compuestos de la muestra y una amplia variedad de patrones para realizar
comparaciones. Sin embargo, se puede dar el caso que dos compuestos tengan el mismo tiempo
de retencin, lo que imposibilita su identificacin. Por supuesto que, a partir de cromatograma
obtenidos con diferentes fases mviles (para cromatografa liquida) y estacionarias y a diversas
temperaturas de elusin (para cromatografa gaseosa), se puede obtener datos adicionales.
CONCLUSIONES.

Se observo en esta prctica que por medio de la cromatografa es posible


identificar de que sustancias est compuesta una mezcla.

Como la polaridad de los solventes utilizados para la cromatografa determinan el


resultado mostrndonos sus diferentes compuestos.

Se puede observar como las diferentes caractersticas de la mezcla pueden tener


diferentes manchas como resultado.

Como ciertos factores se puede restar en distintas prcticas.


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Lawrence, A., Kaplan, y Pesce, J. 1986. Quimica clinica: Tcnicas de laboratorio,


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Educacion, Madrid. (2002).

Ruben Dario Cortez. Tcnicas de separacin, cromatografa. Seccin de La Red


Latinoamericana de Qumica. Barquisimeto Lara.

Linda Amrica Serrano Falcon. Apuntes qumica cromatografa [En lnea] Sitio de
estudiantes y docentes universitarios Copyright 1999-2001
<http://www.lafacu.com/apuntes/quimica/cromatografia/default/.htm.>