RESCATE TERAPUTICO DE LA MIOCARDITIS CHAGSICA AGUDA CON

INSUFICIENCIA CARDACA CONGESTIVA EN RATONES ALBINOS NMRI

MEDIANTE EL USO DE NIFURTIMOX Y DIPIRIDAMOL.

Rescue therapy of acute Chagas myocarditis with congestive heart failure in NMRI

albino mice using nifurtimox and dipyridamole

Daniela Yustiz-Aparicio1, Mara Gonzlez-Hernndez1, Greybis Hernndez-Forero1, -

Mara Gudez-Ortiz1, Sonia Santeliz1, 2, Rafael Bonfante-Cabarcas1.

(1) Unidad de Bioqumica, Decanato de Ciencias de la Salud; Universidad

Centroccidental Lisandro Alvarado. Barquisimeto, Lara, Venezuela.

(2) Unidad de Biomedicina, Departamento de Medicina y Ciruga, Decanato de

Ciencias Veterinarias.

Correspondencia: Dr. Rafael Bonfante Cabarcas. Unidad de Bioquimica, Decanato de

Ciencias de la Salud, Universidad Centroccidental Lisandro Alvarado. Av. Libertador

con Andrs Bello, Barquisimeto, Estado Lara, Venezuela. Cdigo Postal: 3001.

Telfono: 58 251 259-1854

e-mail: rcabarca@ucla.edu.ve
Resumen

La enfermedad de Chagas (ECh) constituye un problema de salud a nivel global, por lo que

es necesario el desarrollo de nuevos protocolos teraputicos; recientemente nuestro grupo

demostr que nifurtimox asociado a dipiridamol tiene efectos curativos en ratones con ECh

en fase aguda. En este trabajo estudiamos el efecto de nifurtimox y dipiridamol en ratones

con miocarditis chagsica aguda (MChA) grave con insuficiencia cardiaca congestiva

(ICC). La muestra estuvo constituida por 42 ratones con MChA con ICC, divididos en tres

grupos: Control Chagas (CC; n= 11), Nif-Dip tratados con nifurtimox asociado a

dipiridamol (n=14) y Nif-Dip-ICC tratados con nifurtimox y dipiridamol asociados a

digoxina, furosemida y captopril (n=17); las dosis de nifurtimox y dipiridammol fueron 40

y 30 mg/kg/da, respectivamente, durante 6 semanas. Los ratones fueron sometidos a

valoracin clnica y estudios electrocardiogrficos, hemoparasitolgicos e histopatolgicos.

Los resultados mostraron menor mortalidad en Nif-Dip (28,57%; n=4) comparado con CC

(54,54 %; n=6) y Nif-Dip-ICC (52,9%; n=9). Clnicamente los ratones tratados con

nifurtimox y dipiridamol aumentaron de peso, desapareci la ICC y no presentaron

esplenomegalia. La parasitemia y los parsitos en el miocardio fueron erradicados en los

grupos tratados con nifurtimox y dipiridamol, donde se observ disminucin de la fibrosis,

miocitolisis, infiltrado inflamatorio y de mastocitos comparados con CC. Los trastornos de

la repolarizacin, alargamiento del QRS y QT, incremento de la onda S y la disociacin

auriculo-ventricular fueron revertidos por el tratamiento nifurtimox y dipiridamol; mientras

que el PR alargado, la disminucin de la onda R y trastornos del ritmo permanecieron

inalterados o aumentaron. En conclusin nifurtimox tiene actividad tripanocida,

dipiridamol potencia el efecto de nifurtimox y mejora la funcionalidad cardiaca. La

mortalidad en Nif-Dip-ICC estara relacionada con el efecto txico de digoxina. Los efectos
y la amplia ventana teraputica del dipiridamol deben considerarse en protocolos

teraputicos en la ECh.

Palabras clave: Enfermedad de Chagas, Insuficiencia Cardiaca, Nifurtimox ,

Dipiridamol, Ratones, Tratamiento, Trypanosoma cruzi.

Abstract

Chagas disease (ChD) is a global health problem, so the development of new therapeutic

protocols is necessary; our group recently showed that nifurtimox associated with

dipyridamole has curative effects in mice with ChD in the acute phase. In this paper we

study the effect of nifurtimox and Dipyridamole in mice with acute chagasic myocarditis

(AChM) with severe congestive heart failure (CHF). The sample consisted of 42 mice with

AChM with CHF divided into three groups: Control Chagas (CC; n = 11), Nif-Dip treated

with nifurtimox associated with dipyridamole (n = 14) and Nif-Dip-CHF treated with

nifurtimox and dipyridamole associated with digoxin, furosemide and captopril (n = 17);

nifurtimox and dipyridamole doses were 40 and 30 mg / kg / day, respectively, for 6 weeks.

The mice underwent clinical, electrocardiographic, hemoparasitological and

histopathological assessments. The results showed lower mortality in Nif-Dip (28.57%; n =

4) compared to CC (54.54%; n = 6) and Nif-Dip-CHF (52.9%; n = 9). Clinically nifurtimox

and dipyridamole treated mice gained weight, CHF disappeared and did not have

splenomegaly. Parasitemia and myocardium tissue parasites were eradicated in nifurtimox

and dipyridamole treated groups, where decreased fibrosis, myocytolysis, inflammatory

infiltrate and mast cells were observed as compared with CC. Repolarization disorders,

prolonged QRS and QT, S wave increase and atrioventricular dissociation were reversed by
nifurtimox and dipyridamole treatment; while elongated PR, R wave decrease and rhythm

disorders or remained unchanged or increased. In conclusion nifurtimox has trypanocidal

activity, dipyridamole potentiates nifurtimox effect and improves heart function. Mortality

in Nif-Dip-CHF would be related to the toxic effect of digoxin. Dipyridamole effects and

its wide therapeutic window should be considered in therapeutic protocols dealing with

ChD.

Key words: Chagas disease, Heart failure, Nifurtimox, Dipyridamole, mice, treatment,

Trypanosoma cruzi.
 INTRODUCCIN

La ECh es un problema de salud pblica a nivel global debido a 4 razones fundamentales.

En primer lugar por una alta prevalencia residual del 1,06% en los pases endmicos, lo

cual representa alrededor de 6 millones de personas infectadas por Trypanosoma cruzi

(T.cruzi) en 21 pases de Amrica Latina; donde la transmisin por transfusin sangunea

tiene una prevalencia del 0,93 %, la incidencia de transmisin congnita es del 0,089% y la

incidencia de transmisin vectorial es del 0,005%; asimismo se calcula que la prevalencia

de miocardiopata chagasica en la poblacin general es de 0,21% y en la poblacin

infectada del 20,3% (1). En segundo lugar la globalizacin de la enfermedad producto de

los flujos migratorios de personas infectadas con T. cruzi, desde pases endmicos a pases

desarrollados, reportndose en Europa una prevalencia del 4.2% para la poblacin

inmigrante (2), mientras que en Estados Unidos se encuentran 300.000 inmigrantes

latinoamericanos infectados, de ellos 45.000 son casos con cardiomiopata chagsica (3).

En tercer lugar, la reemergencia de la enfermedad como brotes epidmicos por transmisin

oral en pases endmicos, con alta morbilidad y mortalidad, como ha sido por ejemplo

reportado en Brasil (4), Colombia (5) y Venezuela (6). En cuarto lugar, por el incremento

en la proliferacin de vectores y su migracin hacia latitudes ms nortes del continente

americano, producto del cambio climtico global, lo cual contribuye al ciclo de transmisin

vector-humano en estas reas (7).

Uno de los puntos ms crticos en la infeccin por T. cruzi es la miocarditis

chagasica crnica (MChC), clsicamente se plantea que entre el 30 y 40% (8) de individuos

seropositivos desarrollan esta fase patolgica de la enfermedad, sin embargo nuestro grupo

en un trabajo realizado en el Estado Barinas demostr que el 70,4% de los individuos

seropositivos estudiados tenan signos clnicos, electrocardiogrficos y/o ecocardiogrficos

de MChC, evidenciando adems una mortalidad de 1,73% en individuos seropositivos(9).

Los individuos infectados usualmente evolucionan naturalmente sin intervencin

mdico teraputica hacia una fase indeterminada, sea porque desarrollaron una fase aguda

asintomtica o porque no existen polticas de tratamiento para la enfermedad en la fase

indeterminada. En consecuencia, frecuentemente los pacientes reciben tratamiento cuando

se encuentran en la etapa de miocardiopata dilatada con o sin insuficiencia cardiaca (IC),

generalmente el protocolo teraputico es paliativo de carcter funcional y no de carcter

etiolgico tripanocida. La magnitud de este problema se observa en estudios de prevalencia

de anticuerpos anti-T. cruzi en pacientes con IC, en este sentido nuestro grupo report en un

estudio realizado en la regin centroocidental de Venezuela que el 40,1% de los pacientes

con IC estudiados son seropositivos (10). Este dato implica que un gran porcentaje de las

miocardiopatas dilatadas en nuestra regin son consecuencia de la ECh y sera urgente,

dada la magnitud del problema, establecer medidas teraputicas tempranas para evitar el

desarrollo de esta enfermedad incapacitante.

Por otra parte, en Amrica latina los casos de Chagas agudo sea por transmisin oral

o vectorial han sido asociados a elevados niveles de parasitemia, a una miocarditis aguda

severa con altas tasas de mortalidad y morbilidad (6). El dao cardiaco severo seria reflejo

de la proliferacin y accin patognica del parsito, por lo tanto, sera mandatorio realizar

intervenciones teraputicas agresivas de carcter tripanocida, que permitan disminuir la

carga parasitaria y por ende, disminuir la mortalidad y morbilidad derivadas de la fase

aguda de la enfermedad.

Actualmente los protocolos teraputicos aceptados para la ECh en su fase aguda son

el nifurtimox y benznidazol, donde se obtienen los mejores resultados, sin embargo, los
resultados no son estrictamente satisfactorios, ya que, a pesar de que los exmenes

parasitolgicos tienden a indicar cura parasitolgica, los exmenes serolgicos indican la

persistencia de anticuerpos anti-T. cruzi, lo cual puede ser interpretado como la persistencia

de una infeccin activa latente (11). En Venezuela los estudios de la efectividad del

tratamiento con nifurtimox y benznidazol han sido desalentadores, Carrasco y col. (1999)

demostraron que aun cuando el 100% de los pacientes tratados con benznidazol tenan una

negativizacin de la parasitemia, en el 91% y en el 75% de los casos se pudo demostrar la

presencia de parsitos tisulares, de su genoma o de sus antgenos; asimismo, en el 80 y en

el 75 % de los pacientes persista la serologa positiva, a los 12 meses y 5 aos de

seguimiento, respectivamente (12). Alarcn de Noya y col. (2015) reportaron una

persistencia de la infeccin a los 6 aos de seguimiento en 70% de los pacientes tratados

con nifurtimox o benznidazol, procedentes de microepidemias por transmisin oral que han

ocurrido en la regin centro-norte de Venezuela (6).

Dada la alta morbilidad y mortalidad de los pacientes y los resultados

desalentadores con el uso de los tripanocidas clsicos, resultara til plantear esquemas

teraputicos donde estas drogas sean combinadas con frmacos potencialmente eficaces

desde el punto de vista parasitolgico y fisiopatolgico, de tal manera de incrementar la

eficacia del nifurtimox y el benznidazol, y disminuir sus efectos colaterales (13).

Idealmente, estas drogas deberan tener efecto tripanocida, favorecer la

funcionalidad cardiaca, contrarrestar los fenmenos fisiopatolgicos derivados de la

infeccin como la inflamacin y la generacin de radicales libres (13), estimular el sistema

inmune para compensar la inmunosupresin caracterstica de la ECh (14) y debe

contrarrestar los efectos colaterales de estas drogas (15).

 De acuerdo con esto, podra plantearse al dipiridamol como una droga coadyuvante,

cuyo mecanismo de accin se basa en el incremento de los niveles intracelulares de AMPc

y GMPc por inhibicin de la fosfodiesterasa 5 (en 16) y la elevacin de la adenosina

extracelular por la inhibicin del transportador equilibrado de adenosina y de la enzima

adenosina deaminasa (ref 18?). La elevacin de GMPc y la activacin de los receptores

A2 por adenosina permiten va xido ntrico (NO) inducir vasodilatacin coronaria

mejorando el flujo sanguneo, lo cual es potenciado por las propiedades angiognicas del

dipiridamol (en 16). La elevacin de AMPc ejerce un efecto antiagregante plaquetario por

estimulacin en la produccin de prostaciclinas (PGI2) (en 16). De igual modo, los niveles

elevados de adenosina extracelular inducidos por el dipiridamol mejoran la funcin

cardiaca en pacientes con falla cardiaca (17), puesto que acta sobre los receptores A1 y A3

causando cardioproteccin (18). (16 al ---).

De la misma manera, se ha demostrado que el dipiridamol inhibe la interaccin

entre plaquetas y monocitos, la adhesin de neutrfilos al endotelio vascular, el

reclutamiento de linfocitos y la activacin y liberacin de mediadores proinflamatorios,

favoreciendo un efecto antinflamatorio. El dipiridamol posee una estructura molecular que

le permite ejercer una accin antioxidante de mayor eficacia que el cido ascrbico y el -

tocoferol, de esta manera suprime la formacin de radicales libres, mejorando el estado

redox de clulas sometidas a fenmenos inflamatorios mediados por estas especies

reactivas (en 16).

Recientemente, nuestro grupo demostr que dipiridamol tiene efecto tripanocida in

vitro con una CI50 de 372 M y potencia el efecto de dosis subteraputicas de nifurtimox

permitiendo obtener resultados curativos, en ratones NMRI con Chagas agudo. Dado que la

mayor parte de los pacientes con MChA cursan con IC con una alta tasa de mortalidad,
sera imprescindible plantear protocolos teraputicos para este tipo de pacientes. Por lo

tanto, en el presente trabajo nos planteamos si en los individuos con MChA funcionalmente

con ICC se puede realizar un rescate teraputico con nifurtimox y dipiridamol, que permita

disminuir la mortalidad y las secuelas funcionales cardiacas. En consecuencia, realizamos

un protocolo teraputico donde ratones NMRI infectados con T. cruzi, con 6 semanas de

evolucin y con signos de ICC fueron tratados con nifurtimox 40mg/kg y dipiridamol

30mg/kg, y se les realiz una evaluacin clnica, electrocardiogrfica e histopatolgica a los

fines de evaluar la eficacia del tratamiento.

 MATERIALES Y MTODOS

Muestra. La muestra estuvo constituida por 48 ratones machos, de la cepa NMRI, adultos,

con pesos entre 30-50g, obtenidos del Bioterio Central de la Universidad Centroccidental

Lisandro Alvarado (Barquisimeto, Venezuela), los cuales fueron infectados por va

intraperitoneal con tripomastigotes sangucolas suspendidos en 0,9% de NaCl, a una dosis

de 100 tripomastigotes por gramo de peso corporal. La cepa de T. cruzi utilizada fue del

linaje TcI registrada bajo la denominacin MHOM/VEcepa792/2-92-YBM (19). Los

parsitos utilizados fueron obtenidos de sangre de ratones infectados en fase aguda de la

enfermedad y mantenidas en ciclos vector/ratn susceptible; el vector utilizado fueron

ninfas en estado III de Rhodnius prolixus. A Las 2 semanas de inoculacin, se realiz la

confirmacin de la parasitemia, solo los ratones con parasitemia positiva fueron incluidos

en el estudio.

De un total de 48 ratones infectados, 6 (12,50%) murieron durante las seis semanas

de la evolucin de la infeccin, los 42 ratones restantes con MChA, funcionalmente con

ICC, fueron estudiados electrocardiogrficamente bajo anestesia con Pentobarbital y

Ketamina, , e inmediatamente se subdividieron en tres grupos: CC (n= 11), tratamiento con

nifurtimox asociado a dipiridamol (Nif-Dip; n=14) y nifurtimox-dipiridamol asociado a

frmacos para el tratamiento de IC (Nif-Dip-ICC; n=17). Durante el periodo peri y post

anestsico (0 a 48 horas) el grupo CC tuvo una mortalidad del 45,45 % (n=5), Nif-Dip del

21,42 % (n=3) y Nif-Dip-ICC del 41,17 % (n=7), obteniendo un total de 27 ratones,

quedando conformados los grupos por 6 ,11 y 10 individuos respectivamente. Posterior al

efecto anestsico, se inici a cada grupo experimental el plan teraputico respectivo, por un

total de 6 semanas. Al grupo CC (n=6) no se le administr tratamiento, Nif-Dip recibi

nifurtimox (40mg/kg) asociado a dipiridamol (30mg/Kg) (n=11); el grupo Nif-Dip-ICC

recibi nifurtimox (40mg/Kg), dipiridamol (40mg/Kg) y captopril (5 mg/Kg) (n=10),

adicionalmente se le administr digoxina (8g /Kg) y furosemida (2mg/kg) durante 1

semana. Los ratones fueron identificados, se distribuyeron en jaulas de acero inoxidable

con dimensiones de 29x30x14cm, independientemente del grupo experimental en un

nmero de 5 a 10 individuos por jaula, con libre acceso al agua y al alimento (Perrarina,

Protinal, Venezuela), con ciclos de luz/oscuridad de 12 horas y una temperatura media de

27C.

A las 6 semanas de aplicacin de tratamiento, fueron valorados signos clnicos de

ICC, parasitemia y electrocardiogrficamente, se sacrificaron con exceso de anestesia, y se

les realiz autopsia, se extrajeron muestras de tejidos para estudios histopatolgicos

posteriores.

Biotica. Todos los procedimientos experimentales realizados en esta investigacin se

basaron en los principios establecidos en el manual de biotica y bioseguridad del fondo

nacional para la ciencia y tecnologa, ministerio del poder popular para la ciencia y la

tecnologa de Venezuela (19).

Electrocardiografa. Los estudios electrocardiogrficos se realizaron bajo anestesia con

Pentobarbital Sdico 50 mg/kg y Ketamina 50 mg/kg de peso corporal, va intraperitoneal,

en configuracin bipolar, utilizando 3 electrodos tipo aguja (uno positivo, uno negativo y

uno neutro o de referencia), los cuales se posicionaron en el tejido subcutneo. Se trabaj

con 4 derivaciones: DI donde el electrodo positivo se coloc junto con el de referencia en la

articulacin del hombro izquierdo, mientras que el electrodo negativo se posicion en la

articulacin del hombro derecho; en DII el electrodo positivo se posicion en el apndice

xifoides, el negativo se ubic en la articulacin del hombro derecho y el de referencia en la

articulacin del hombro izquierdo; en DIII tanto el electrodo negativo como el electrodo de
referencia se ubicaron en la articulacin del hombre izquierdo y el electrodo positivo se

mantuvo en el apndice xifoides y en la derivacin AVF el electrodo negativo se posicion

en la lnea media cervical por encima de la fosa supraesternal, mientras que el electrodo

positivo se coloc en el apndice xifoides y el de referencia permanece en la articulacin

del hombro izquierdo.

Los electrodos fueron conectados a un amplificador BioAmp (ADInstruments,

Nueva Zelanda), las seales analgicas fueron convertidas en seales digitales a travs del

sistema Powerlab / 8sp (ADInstruments, Nueva Zelanda), visualizados, registrados y

analizados en un computador personal utilizando el software Chart v4.2.1 (ADInstruments

Nueva Zelanda). La captura de la seal se realiz a una frecuencia de 1.000 eventos/seg y

se filtr a 60 Hz.

Histopatologa. Las muestras de ventrculo derecho y punta cardaca fueron fijadas con

solucin de paraformaldehido al 4% en PBS, pH 7,4 por espacio de 2 horas. Las muestras

de tejido fijadas fueron embebidas sucesivamente en soluciones de sucrosa del 10, 15, 20,

25 y 30% hasta que las muestras migraran al fondo del recipiente; luego fueron guardadas a

-70C hasta su uso. Las muestras fueron descongeladas e incluidas en OCT, congeladas de

nuevo con nitrgeno lquido, cortadas con criostato obteniendo secciones de 5 m, las

cuales fueron colocados en lminas y se tieron con hematoxilina-eosina o azul de

toluidina. Adicionalmente otro grupo de muestras fueron fijadas con formol al 10% en PBS

pH 7,4, incluidas en parafina, cortadas en micrtomos y teidas con hematoxilina-eosina.

Anlisis de Datos. Los datos se expresan como valores absolutos, porcentajes o el

promedio SEM. Se utiliz el test de Student pareado para analizar la significancia de la

diferencia observada en los promedios antes y despus del tratamiento, el test de Student no

pareado para comparar 2 grupos de muestras, mientras que el ANOVA seguido del post-
Test de Tukey se utiliz para analizar la significancia de la diferencia observada en los

promedios entre los diferentes grupos experimentales. Se acept como significativo un

valor de p<0,05. Se utiliz el Software GraphPad Prism 5.0 para el anlisis estadstico.
 RESULTADOS

Durante las siguientes seis semanas de tratamiento se obtuvo la muerte de 1

individuo del grupo CC (16,67 %), 1 individuo de Nif-Dip (9,10 %) y 2 individuos de Nif-

Dip-ICC (20%) , quedando con 5, 10, y 8 individuos en cada grupo respectivamente.

Todos los ratones adquirieron la infeccin, con una parasitemia promedio de 4,19

0,74 x 106 parsitos/ml una semana antes del inicio del protocolo teraputico. En todos los

grupos experimentales tratados no se detectaron parsitos en sangre a partir de la sptima

semana, mientras que en el grupo CC la parasitemia desapareci entre la octava y novena

semana, estando todos los grupos con parasitemia de 0 al momento del sacrificio.

En la Figura 1 observamos parmetros clnicos al final del protocolo experimental.

Podemos constatar que los grupos tratados incrementaron significativamente el peso

corporal; mientras que el peso del bazo y los signos clnicos de ICC disminuyeron

significativamente al ser comparados con el grupo CC.

En las Tablas I y II, y en las Figuras 2 y 3 mostramos los parmetros

electrocardiogrficos cuantitativos y cualitativos antes y despus de instalar el protocolo

teraputico. Los signos electrocardiogrficos que se encontraron alterados en la etapa pre-

tratamiento de la MChA con ICC fueron una disminucin de la frecuencia cardaca,

alteraciones de la conduccin cardaca reflejadas en un incremento en los valores de los

intervalos QRS, QT y QTc, alteraciones en la repolarizacin ventricular caracterizada por

trastornos de la amplitud, direccionalidad del eje y decaimiento de la onda T. Estos signos

tendieron a ser revertidos con el protocolo teraputico, sin embargo, las amplitudes de las

ondas R y S tendieron a disminuir, indicando aspectos funcionales irreversibles (ver Tabla

I). Respecto a los trastornos cualitativos el protocolo teraputico basado en nifurtimox-

dipiridamol tendi a disminuir los trastornos de conduccin (BAV de III grado) y los
trastornos de post-depolarizacin, sin embargo, los trastornos del ritmo tendieron a

aumentar su frecuencia (ver Tabla II).

El anlisis histopatolgico (ver Tabla III) realizado en cortes de ventrculo derecho

se observ un mayor grosor del epicardio y una mayor miocitolisis, con un infiltrado

inflamatorio de carcter difuso en los ratones del grupo CC, mientras que en los ratones del

grupo Nif-Dip se observaron infiltrados inflamatorios focales y un menor grosor del

epicardio; el grado de fibrosis fue similar en ambos grupos. En cortes de la punta cardiaca

se evidenci que la fibrosis, la miocitolisis, el grosor del epicardio y el infiltrado

inflamatorio fueron menores en los ratones tratados con nifurtimox-dipiridamol. En ambos

cortes se demostr la presencia de nidos parasitarios tanto ntegros como rotos en el 60% de

los ratones sin tratamiento, mientras que en los cortes de los ratones tratados con

nifurtimox-dipiridamol no se observaron nidos de amastigotes (ver Figura 4). De la misma

manera en los cortes de la punta cardiaca observamos mastocitos en 60% (n:3) de los

ratones del grupo CC y en 50% (n:2) del grupo Nif-Dip, sin embargo el nmero de

mastocitos por campo fue mayor en el grupo CC (10,60 7,53) que en el grupo Nif-Dip

(1,00 0,82) (ver Figura 5 y Tabla III)

 DISCUSIN

En este trabajo nosotros demostramos que la combinacin del Nifurtimox con el

Dipiridamol es de utilidad teraputica en ratones con MChA con IC, ya que,

comparativamente con los ratones controles no tratados disminuye la mortalidad,

disminuye o erradica clnicamente y parasitolgicamente la infeccin, y revierte los signos

clnicos e histopatolgicos de MChA. Para nuestro conocimiento este es el primer trabajo

realizado en modelos animales para evaluar el rescate teraputico en ratones con MChA

grave.

El efecto tripanocida del tratamiento con nifurtimox fue comprobado en este trabajo

al demostrar la desaparicin de la parasitemia a partir de la segunda semana y la ausencia

de formas amastigotas o nidos parasitarios en los estudios histopatolgicos de ventrculo

derecho y punta cardaca. Estos resultados concuerdan con los reportados por Santeliz y

col. (2016), quienes demostraron que la combinacin nifurtimox (40mg/kg) y dipiridamol

(30 mg/kg) erradica las formas parasitarias hsticas y hemticas en ratones con Chagas

agudo sin ICC (19). El efecto tripanocida podra depender exclusivamente del efecto de

nifurtimox a la dosis de 40mg/kg, esta dosis ha sido reportada como curativa, sin embargo,

diversos estudios realizados en modelos murinos sobre el uso de nifurtimox en el

tratamiento en la ECh han sido controversiales.

Los estudios realizados sobre el efecto de nifurtimox en animales de

experimentacin han utilizado altas dosis de la droga, obteniendo resultados discordantes;

mientras que Bustamante y col. (2014) obtienen 95-100 % de cura con dosis de 100 mg/Kg

en esquemas continuos de 40 das o intermitentes de 13 das en ratones C57BL/6(Ly5.2+)

(20), Wong-Baeza y col. (2015) obtienen una disminucin discreta de la parasitemia con

dosis similares por 50 das en ratones albinos NIH. Esta discordancia observada entre los
trabajos citados y nuestro trabajo puede ser explicada por las cepas de ratones utilizadas

(21), sin embargo, la repuesta al tratamiento con nifurtimox podra depender de la cepa

utilizada, como se desprende del trabajo de Andrade y col. (1985), quienes encontraron que

las cepas tipo I (alta y temprana parasitemia, tropismo por los macrfagos) presentaban alta

suceptibilidad (56 16 % de cura), las cepas tipo II (alta y tarda parasitemia, tropismo por

el msculo cardaco, presentaban de mediana a alta suceptibilidad (52 11 % de cura) y las

cepas tipo III (baja parasitemia y tropismo muscular esqueltico) presentaban baja

suceptibilidad (0.45 0.45 % de cura), a esquemas terapeticos basados en nifurtimox 200

mg/kg por 4 das, seguido de 50 mg/kg por 5 das a la semana por 90 das (22). Por otra

parte, Faundes y col. (2008) encontr disminucin de la parasitemia a dosis de 2.5 y 10

mg/Kg, con supervivencias del 25 y 100 %, respectivamente (23).

No obstante, el efecto tripanocida del dipiridamol debe ser considerado, ya que

recientemente ha sido reportado este efecto en epimastigotes en medio de cultivo axnico

con una DI50 de 372 M. Sin embargo, planteamos que el mayor efecto benfico de

Dipiridamol es de carcter funcional y est relacionado con el mecanismo de accin de la

droga.

La teora microvascular plantea que el desarrollo de la miocarditis chagsica es reflejo del

dao del endotelio en la microcirculacin, con la formacin de trombos plaquetarios y

hemticos, lo cual causa una isquemia difusa en el tejido cardaco (24), que conlleva a

fenmenos de necrosis, remodelamiento cardaco y fibrosis, conduciendo al desarrollo de

una miocardiopata dilatada con ICC (en 24). Dipiridamol al ser un antiagregante

plaquetario evita la formacin de trombos plaquetarios y por ende hemticos; an ms, al

incrementar los niveles de GMPc y adenosina inducen vasodilatacin coronaria mediada

por la produccin de NO, mejorando los fenmenos isqumicos en el miocardio chagsico.

De la misma manera, al incrementar los niveles de adenosina, actuando sobre receptores A1

y A3 tiene un efecto cardioprotector que le permite manejar mejor las demandas

energticas del corazn insuficiente y evitar fenmenos apoptticos tempranos,

respectivamente (18). Por otra parte, ha sido reportado que la adenosina endgena

actuando sobre receptores A2 tiene un efecto antiarrtmico en la isquemia miocrdica

aguda, que efectivamente disminuye la frecuencia de fibrilacin ventricular, evitando de

esta manera las arritmias letales observadas en la miocarditis chagsica (25,26). De la

misma manera, Pelleg y Belardinelli (1993) demostraron que la adenosina actuando sobre

los receptores A1 generan efectos cronotrpico y dromotrpico negativos, reduciendo la

incidencia de arritmias ventriculares inducidas por isquemia-reperfusin en corazones

aislados de ratas (27).

En este orden de ideas, se ha reportado que la administracin oral a largo plazo (1

ao) de dipiridamol mejora el estado fsico y cardaco de pacientes con ICC leve a

moderada, obtenindose mejoras en la fraccin de eyeccin, en el dimetro sistlico

ventricular izquierdo y en el consumo mximo de oxgeno (28). AQU SE PODRIA

COLOCAR LA REF DEL ARG

Recientemente, Ramakers y col. (2011) reportaron que el tratamiento con

dipiridamol incrementa los niveles de IL-10, la cual es considerada una citoquina

antinflamatoria que induce una disminucin tanto del TNF- como de la IL-6 (29). Los

niveles elevados de TNF- e IL-6 han sido asociados con estados avanzados de la ECh y se

correlaciona negativamente con la funcionalidad cardaca; mientras que los niveles

elevados de IL-10 han sido asociados con una recuperacin en la funcin cardaca al

mejorar la fraccin de eyeccin y disminuir los dimetros diastlicos del ventrculo

izquierdo, siendo por lo tanto un factor cardioprotector (14,30). En la ECh han sido
reportados niveles elevados de IL-10 en pacientes con ECh en fase indeterminada,

mientras que en los pacientes que desarrollan MChC estos niveles se encuentran

disminuidos. (31)

Hay evidencia que sugiere que durante el curso de la infeccin por T. cruzi, el

miocardio es expuesto a lesiones inducidas por un estrs oxidativo continuo, a travs de la

produccin de especies reactivas de oxgeno (ROS), que contribuye a la progresin de la

miocardiopata (32). Estas ROS son liberadas de forma sostenida como resultado de

lesiones mitocondriales, especialmente las relacionadas con la inhibicin del complejo I en

la fase aguda, del complejo V en la fase crnica y del complejo III en ambas fases; los

complejos I y III alterados estn relacionados con las generacin de ROS y la disminucin

de la capacidad energtica mitocondrial durante la miocardiopata chagsica (33). La

estructura molecular de dipiridamol le permite aceptar electrones, funcionando de esta

manera como un barredor de radicales libres, siendo su capacidad mayor que el -tocoferol

y el cido ascrbico, permitiendo plantear entonces que el efecto benfico de dipiridamol

observado en este trabajo est relacionado con su capacidad antioxidante (en 16).

En este trabajo, la mortalidad temprana observada en todos los grupos

experimentales puede ser explicada por el deterioro funcional cardiaco producto de la

MChA, el cual fue agravado al someter a los ratones a anestesia general. En estado vigil los

ratones presentan normalmente una frecuencia cardaca alrededor de 580 lpm (34), mientras

que bajo anestesia con Pentobarbital-Ketamina, como es reportado en este trabajo, se

observa una disminucin con valores entre 373 y 382 lpm. Esta bradicardia inducida por la

anestesia disminuye el gasto cardiaco y agrava la IC, aumentando de esta forma el riesgo de

muerte (35), esto pudo evidenciarse en la mortalidad mostrada por el grupo CC. Por el

contrario los ratones tratados con nifurtimox y dipiridamol presentaron la menor

mortalidad, lo cual est relacionado con los efectos reportados para dipiridamol, descritos

anteriormente (ver arriba). Inesperadamente el grupo tratado con nifurtimox, dipiridamol

asociado a frmacos para la IC (digoxina, furosemida y captopril) presentaron el doble de la

mortalidad que el grupo Nif-Dip, esto puede ser explicado considerando que al recibir

frmacos como la digoxina, en un sustrato cardaco vulnerable a las arritmias, se

incrementa el riesgo de que este frmaco induzca arritmias y muerte sbita (36), tal como

ha sido evidenciado en humanos por Madelaire y col. (2016), quienes reportaron que el uso

de digoxina estuvo asociada a el incremento de riesgo de muerte (hazard ratio (HR): 1.19,

95%-CI: 1.15-1.24) en pacientes con IC crnica con ritmo sinusal (37).

Los resultados experimentales obtenidos en este trabajo revelaron que todos los

ratones NMRI con Chagas agudo presentaron trastornos de repolarizacin, los cuales

mejoraron con el esquema teraputico. Alvarado y col. (2012) plantearon que los trastornos

de la repolarizacin son signos caractersticos de la MChA en humanos y en ratones NMRI,

lo cual le da un valor diagnstico en la ECh aguda (38), lo cual es claramente demostrado

en este trabajo. Los trastornos de repolarizacin ventricular han sido asociados a trastornos

isqumicos y de sobrecarga ventricular (39), el nifurtimox al tener un efecto tripanocida

potenciado por dipiridamol permitira erradicar rpidamente la infeccin, lo cual permitira

revertir los fenmenos inflamatorios relacionados con el parasitismo, mejorando as la

funcionalidad cardaca; sin embargo, el efecto coadyuvante de dipiridamol debe ser crucial,

ya que, revertira los fenmenos isqumicos funcionales, causando vasodilatacin coronaria

y mejorando el balance energtico del cardiomiocito, permitiendo restaurar los equilibrios

inicos transmembranas y de esta manera normalizar los fenmenos elctricos

repolarizantes. Coincidente con los trastornos de la repolarizacin, en este trabajo se

observ un incremento en la amplitud de la onda S, lo cual fue revertido con el esquema

teraputico. Pocos trabajos definen el sustrato electrognico de la onda S, sin embargo, se

ha planteado que la onda S en humanos refleja la despolarizacin tarda en la cara

diafragmtica o la despolarizacin de las clulas de Purkinje (40), sin embargo, en ratones

dada la densidad de las corrientes repolarizantes tempranas, se plantea que la onda S

adems de un componente de despolarizacin tiene un componente de repolarizacin (41),

en consecuencia, al mejorar los trastornos de repolarizacin la onda S disminuye de

amplitud, tal y como hemos observado en el presente trabajo.

Por otra parte, la conduccin intraventricular enlentecida reflejada en los valores del

QRS y QT mejor significativamente posterior a la aplicacin del esquema teraputico; sin

embargo, la conduccin auriculoventricular (AV) reflejada en los valores de PR no

present mejora. La mejora en la conduccin intraventricular podra ser reflejo de una

mejora de la inflamacin y de la irrigacin sangunea, en un sustrato morfofuncional

reversible, en tanto que, la irreversibilidad de los trastornos de la conduccin AV

incluyendo arritmias tipo fibrilacin auricular parecen ser reflejo de un dao irreversible

producto de la intensa inflamacin, remodelamiento y fibrosis de las aurculas, lo cual es

observado en la ECh (42).

As mismo, se observ una tendencia a la disminucin del voltaje de las ondas R, lo

que podra ser consecuencia de un dao irreversible de la estructura miocrdica, donde el

miocardio funcional es sustituido por tejido fibrtico (43); o bien ser reflejo de un efecto

netamente farmacolgico, ha sido reportado que el Dipiridamol tiene un efecto inotrpico

negativo mediado por la accin de adenosina sobre los receptores A1 (19).

En los cortes histolgicos de tejido cardaco con MChA la densidad de mastocitos fue

mayor en los ratones del grupo CC que en el grupo Nif-Dip. Los mastocitos son clulas

inflamatorias que aumentan y desencadenan una serie de respuestas a estmulos

inflamatorios e infecciosos produciendo una liberacion de mediadores como histamina,

leucotrienos, proteasas, citoquinas (IL-1, TNF-), entre otras, que participan en la

patognesis de la miocarditis y cardiomiopata dilatada (44). La reduccin en el nmero de

mastocitos en los ratones tratados con nifurtimox y dipiridamol podra estar en relacin con

el mecanismo de accin de este ltimo al incrementar los niveles intracelulares de

adenosina, tal y como ha sido reportado por Ichikawa y col. (1980) quienes demostraron

que el crecimiento del mastocitoma murino es inhibido por la adenosina exgena (45). Por

otra parte, Batle y col. (2007) reportaron una correlacin entre el grado de fibrosis y la

densidad de los mastocitos en corazones de pacientes con miocardiopata dilatada con ICC

(43). En este sentido, Rork y col. (2008) reportaron que la degranulacin de los mastocitos

contribuye a la injuria miocrdica observada en protocolos de isquemia-reperfusin y que la

activacin de los receptores para adenosina (A2A) reduce el rea del infarto disminuyendo

la degranulacin de los mastocitos cardacos (46).

En conclusin en el presente trabajo demostramos que el tratamiento con nifurtimox

(40mg/kg) y dipiridamol (30mg/kg) tiene un efecto benfico en ratones albinos NMRI con

Chagas agudo e ICC. El efecto de nifurtimox estara relacionado con su actividad

tripanocida, mientras que el efecto de dipiridamol estara relacionado con su capacidad de

potenciar el efecto tripanocida de nifurtimox y por su capacidad de revertir los fenmenos

fisiopatolgicos relacionados con la MChA, como por ejemplo la isquemia en la

microvasculatura, la generacin de radicales libres, la inmunomodulacin de la inflamacin

y la sobrecarga de trabajo cardaco. La seguridad y amplia ventana teraputica del

dipiridamol constituyen una valorable ventaja a la hora de su inclusin en protocolos

teraputicos para la ECh.

Agradecimientos

Conflictos de Inters
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 TABLA I
PARMETROS ELECTROCARDIOGRFICOS CUANTITATIVOS
REGISTRADOS EN RATONES CON MIOCARDIOPATA CHAGASICA AGUDA
CON INSUFICIENCIA CARDACA ANTES Y DESPUS DE INSTALAR EL
PROTOCOLO TERAPUTICO.

Grupos Experimentales
Nif-Dip Nif-Dip- ICC
Pre- Pre-
Parmetros Post-Tratamiento Post-Tratamiento
Tratamiento Tratamiento
FC (lpm) 373,40 22,08 431,40 24,35 382,20 39,34 416,10 22,04
PR 57,37 2,87 52,59 3,72 54,70 3,73 58,07 3,94
QRS (ms) 13,83 0,21 11,50 0,74* 14,71 0,69 11,13 0,45*
QT (ms) 101,50 11,54 68,31 12,81* 105,50 11,33 90,01 6,20
QTc (ms) 244,90 22,16 175,00 29,03* 252,30 21,94 230,80 11,50
P (V) 56,77 10,65 65,57 8,02 34,07 12,74 65,96 4,18*
R (V) 680,30 82,25 577,40 83,88 755,10 83,82 631,80 82,50
S (V) -363,90 62,56 -204,20 40,44* -252,10 45,81 -40,10 40,48*
T (V) 218,20 46,28 270,00 41,68 225,60 49,06 255,50 38,40
1 5,19 0,71 7,82 1,07 6,30 0,78 8,41 2,63
1 % 40,63 8,19 79,25 4,21* 47,72 6,91 74,04 6,25*
2 67,16 11,69 104,50 23,29 69,88 6,57 67,94 5,07
2 % 59,70 9,28 23,32 3,76 30,12 6,57 32,06 5,07
D5 73,78 2,33 62,24 4,39* 71,47 3,51 59,78 4,55*
D10 48,69 4,98 30,98 5,46 49,41 4,78 38,56 4,49
D20 39,06 3,80 20,78 3,01* 38,21 3,97 24,22 3,72*
D40 37,27 2,85 17,26 3,16* 33,84 3,38 23,43 3,50*
D60 20,33 3,09 11,64 2,44* 22,69 2,88 14,46 3,04*
Eje QRS 43,80 21,17 46,90 15,85 70,28 12,26 78,86 6,47
Eje P 53,17 18,53 53,38 9,87 15,40 18,69 58,32 12,45
Eje T 68,00 16,83 79,78 5,31* 59,49 17,08 74,61 6,89
FC: frecuencia cardaca; lpm: latidos por minuto. El decaimiento de la onda T fue analizado por una ecuacin de
decaimiento exponencial para dos componentes, obteniendo los valores de las constantes de tiempo 1 y 2 con sus
respectivos porcentajes de contribucin al decaimiento; adicionalmente, se cuantific porcentualmente el decaimiento de
la amplitud de la onda T a los 5, 10,20,40 y 60 ms posteriores al pico de la T. * significa P < 0.05 al comparar los
valores indicados antes y despus del tratamiento a travs de un test de Student pareado.
 TABLA II

PARMETROS ELECTROCARDIOGRFICOS CUALITATIVOS

REGISTRADOS EN RATONES CON MIOCARDIOPATA CHAGASICA AGUDA
CON INSUFICIENCIA CARDACA ANTES Y DESPUS DE INSTALAR
PROTOCOLO TERAPUTICO.

Nif-Dip Nif-Dip-ICC
Pre- Post- Pre- Post-
Parmetros tratamiento tratamiento tratamiento tratamiento

n % n % n % n %

Disociacin AV 5 50 2 20 0 0 2 25

Extrasstoles ventriculares 0 0 3 30 1 12,5 1 12,5

Extrasstole nodal 0 0 5 50 0 0 1 12,5

Fibrilacin Auricular 4 40 3 30 0 0 2 25

BAV: Bloqueo Auriculoventricular BHH: Bloqueo del Has de His.

 TABLA III

ANLISIS HISTOPATOLGICO REALIZADO EN CORTES DE VENTRCULO

DERECHO Y PUNTA CARDIACA EN RATONES CON MIOCARDIOPATA
CHAGASICA AGUDA CON INSUFICIENCIA CARDACA ANTES Y DESPUS
DE INSTALAR PROTOCOLO TERAPUTICO CON NIFURTIMOX-
DIPIRIDAMOL

Control Chagas Nif-Dip

Parmetros
Ventrculo Punta Ventrculo Punta
Derecho Cardaca Derecho Cardaca
Nidos de
6,00 2,47 3,00 1,91 0* 0*
Amastigote

Fibrosis 1,40 0,50 1,75 0,47 1,40 0,50 0,25 0,25*

Miocitolisis 2,00 0,44 1,50 0,28 1,40 0,24 0,25 0,25*

Grosor del
1,80 0,20 1,75 0,25 1,20 0,20 0,75 0,25*
Epicardio
Infiltrado
2,80 0,20 2,00 0,57 1,80 0,37* 0,50 0,28
inflamatorio

Mastocitos -- 10,60 7,53 -- 1 0,82

* significa p < 0.05 al comparar los valores indicados para la misma regin cardiaca, sin y con tratamiento, a
travs de un test de Student no pareado.
 FIGURA 1

Figura 1. Parmetros clnicos en los ratones Control Chagas y de los sometidos a protocolo teraputico. En A se muestra el peso

corporal, donde observamos que los ratones sometidos a protocolo teraputico incrementaron de peso. En B se muestra el peso

indexado del bazo en funcin del peso corporal, observamos que la esplenomegalia disminuy significativamente en los ratones

sometidos a protocolo teraputico. En C se realiz un anlisis clnico sumativo por ratn basado en la presencia (1) o ausencia (0) de

los siguientes signos clnicos: dificultad respiratoria en reposo, cianosis en reposo, dificultad respiratoria bajo anestesia, cianosis bajo

anestesia y piloereccin; se observa que en los ratones sometidos al protocolo teraputico se evidenci una disminucin de los signos

de ICC o infeccin.* significa p < 0.05 al comparar los grupos sometidos a protocolo teraputico en relacin al grupo Control Chagas

utilizando el test de ANOVA seguido del post-test de Tukey.

 FIGURA 2

A B

C D

Figura 2. Alteraciones electrocardiogrficas observadas antes y posterior a la

aplicacin del protocolo terapetico con Nifurtimox-Dipiridamol asociado con

frmacos para la insuficiencia cardaca. Se presenta los registros electrocardiogrficos de

2 individuos que fueron realizados en la derivacin DIII antes de iniciar el tratamiento

(izquierda) o despus del tratamiento (derecha). En el registro A observamos trastornos

isqumicos, caracterizados por inversin de la onda T y un punto J por debajo de la lnea

isoelctrica, los cuales fueron revertidos con el protocolo teraputico con restitucin de la

morfologa y amplitud de la onda T (registro B); adicionalmente, el tratamiento indujo una

recuperacin de la amplitud de la onda P. En el registro C, se observa una disminucin del

voltaje del complejo QRS y de la onda T, esta ltima presenta una meseta prolongada;

posterior al tratamiento (registro D) se observ recuperacin del voltaje del complejo QRS

y de la onda T, la cual recuper prcticamente su morfologa normal. Las barras verticales

indican 400 V, mientras que las barras horizontales indican 100 ms.
 FIGURA 3

A B

C D

Figura 3. Alteraciones electrocardiogrficas observadas antes y posterior a la

aplicacin del protocolo terapetico con Nifurtimox-Dipiridamol. Se presenta los

registros electrocardiogrficos de 2 individuos que fueron realizados en la derivacin DIII

antes de iniciar el tratamiento (izquierda) y despus del tratamiento (derecha). En el registro

A observamos dos ondas P de baja amplitud, una onda R deprimida, una S profunda, un

QRS prolongado y una onda T que presenta un segundo componente prolongado, que no

llega a la lnea isoelctrica; posterior al protocolo teraputico (registro B) se recuperan las

amplitudes de las ondas P y R, se observa una normalizacin del complejo QRS y una

disminucin de la amplitud del segundo componente de la onda T. En el registro C se

observa claramente que el segundo componente de la onda T forma una deflexin superior

compatible con un fenmeno de post-depolarizacin, el cual fue totalmente revertido por el

protocolo teraputico (registro D). Las barras verticales indican 400 V, mientras que las

barras horizontales indican 100 ms.

 FIGURA 4

Figura 4. Caractersticas histopatolgicas de tejido cardiaco de ratones con Chagas

Agudo tratados o no con Nifurtimox y Dipiridamol. Se muestra cortes de tejidos fijados

con paraformaldehido 4%, criopreservados con sucrosa 30%, embebidos en OCT y

coloreados con hematoxilina-eosina. En A vemos un corte representativo del corazn de un

ratn Control Chagas no tratado, donde se puede observar nidos de amastigotes (ver

flecha), un infiltrado difuso mononuclear y miocitolisis (aumento 1000X). En B vemos un

corte representativo del corazn de un ratn chagasico tratado, donde logramos observar

fibras musculares integras con discretas clulas mononucleares, la separacin de las fibras

es un artefacto producto de la tcnica de criopreservacin (aumento 400X).

 FIGURA 5

Figura 5. Expresin de mastocitos en tejido cardiaco de ratones con Chagas Agudo

tratados o no con Nifurtimox y Dipiridamol. Se muestra cortes de tejidos fijados con

paraformaldehido 4%, criopreservados con sucrosa 30%, embebidos en OCT y coloreados

con Azul de Toluidina. En A vemos un corte representativo del corazn de un ratn Control

Chagas no tratado, donde mostramos dos mastocitos en proceso de desgranulacin (ver

flecha, aumento 1000x). En B vemos un corte representativo del corazn de un ratn

chagsico tratado, donde no logramos observar mastocitos. Arriba y a la derecha

mostramos un grfico de barra con los valores promedio del nmero de mastocitos en 10

campos para los grupos Control Chagas (barra blanca) y Nif-Dip (barra negra)