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Cultivos en Monocapa

Las clulas exhiben una variedad de comportamientos sociales, lo que hace que su
multiplicacin sea inhibida cuando establecen contacto entre s, permitiendo la formacin
de una monocapa que cubrir la correspondiente superficie de crecimiento. Las clulas
provenientes de cultivos primarios son las que mejor crecen en sta condicin, dada su
estabilidad gentica y su naturaleza diploide normal.
Los recipientes para el cultivo de clulas estacionarias son cajas de Petri, frascos para el
cultivo de tejido (T-25, T-75), entre otros, que pueden ser de material de plstico o de vidrio
previamente tratado y su desprendimiento para transferirlas a superficies mayores se
realizan con agentes proteolticos como la tripsina.
Cuando se requiere la produccin de ste tipo de cultivo en una escala mayor, se debe
incrementar el rea de la superficie de crecimiento, siendo ideal utilizar botellas en rotacin
(roller). Mediante ste sistema, las clulas pueden crecer en toda la parte interna de la
pared de la botella, usando un aparato que permite la rotacin del roller a una baja
velocidad; de esta forma un roller de 1 litro que requiere 100 ml de medio, confiere una
superficie de crecimiento de 500 cm2.
Otra forma de aumentar el nmero de clulas adherentes por volumen de frasco, es
utilizando microperlas (microportadores), que son compuestos en base a dextranos o a
vidrio, las que flotan cuando se emplean en cultivos con agitacin, lo que le da una mayor
disponibilidad de superficie para el crecimiento celular: con 100 ml de medio de cultivo, se
logra una superficie de 0.24 m2. La relacin superficie-volumen para los rollers es de 0.2-
0.7, mientras que para los microportadores es de 122-153.
Existen otras consideraciones que influyen en la utilizacin de sistemas en monocapa a
pesar de las ventajas que tienen los cultivos en suspensin, entre las que estn la
flexibilidad para desarrollar cultivos primarios o de lneas heteroplodes, la facilidad para la
remocin del medio gastado antes de infectar las clulas y la alta concentracin que se
obtiene del producto, como en el caso del virus de la Fiebre Aftosa.
Cultivos en Suspensin
Las Lneas celulares que provienen de cultivos primarios con requerimiento de anclaje a
superficies, tienen la propiedad de crecer de manera estacionaria o en suspensin despus
de un perodo de adaptacin.
Existe evidencia experimental que los sistemas en suspensin tambin requieren de
matrices que son macromolculas, que sirven de protectores a la superficie celular; stas
macromolculas se encuentran en el suero, el cual contribuye igualmente con el medio de
cultivo, proporcionando un sistema balanceado de nutrientes. Dentro de stas matrices est
el Methocel, esencial para el crecimiento de cultivos en suspensin.
Aunque el cultivo estacionario es ideal cuando se busca la elaboracin de productos
extracelulares, el cultivo en suspensin es deseable cuando los productos son
intracelulares o cuando se presentan problemas con la capacidad de anclaje de un
determinado tipo de clula.
El proceso de cultivo continuo ofrece factores econmicos decisivos (utilizacin de mejores
equipos, reducida manipulacin) cuando se trata de producir cultivos a una mayor escala
de operacin.
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El ciclo de replicacin de los virus es el trmino utilizado para describir el ciclo
de reproduccin de los virus. Este consta generalmente de las siguientes fases: fijacin y
entrada en la clula, eclipse, multiplicacin y liberacin del virus. Los virus son formas
acelulares que no pueden reproducirse por si mismos en el exterior; para ello requieren
introducirse en clulas donde controlarn sus mecanismos reproductivo.
Fijacin o adsorcin
El primer paso en la infeccin viral es la adsorcin a la membrana de la clula susceptible
por medio de la adhesin de ligandos virales (protenas de la capside o glucoprotenas de
las espculas, por ejemplo a receptores superficiales de la clula). La distribucin en el
cuerpo del hospedador de ciertos tipos de receptores celulares explica el tropismo tisular y
de hospedador de los virus. Los tejidos y clulas que carecen de receptores especficos de
virus determinados no son infectados por dichos viriones. La naturaleza de los receptores
es variable y ciertos virus pueden tener ms de un tipo de receptor.
Penetracin
Los virus complejos producen una ruptura en la membrana celular del hospedador en uno
de los puntos de anclaje, gracias a la presencia de
algunas molculas de enzimas hidrolticas entre las protenas de la cpside. A travs de la
rotura, el tubo central inyecta el ADN vrico, quedando la cpside vaca en el exterior de la
[[clula] queso y el cido nucleico libre en el citoplasma. La presencia de cpsidas en la
superficie celular es un buen indicio de que ha sufrido una infeccin vrica.
Otros virus sin envoltura lipdica se introducen en la clula con cpsida y todo, lo cual puede
realizarse de dos maneras:
Por penetracin directa: despus de la fijacin, el virus abre una brecha en la membrana y
se introduce en el citoplasma.
Por endocitosis: la membrana forma una invaginacin en torno al virus, llegando a formar
una vescula que penetra en la clula. Formada la vescula, el virus abre una brecha en la
membrana de la misma con ayuda de algunas enzimas hidrolticas que l mismo transporta,
penetrando as en el citoplasma.
Los virus con envoltura lipdica burlan la barrera de la membrana celular porque su cubierta
lipdica se funde con la membrana, ya que son de la misma naturaleza. Esta fusin de
membranas puede realizarse en dos lugares distintos:
Fusin en la superficie celular: de manera que el virin penetra directamente en el
citoplasma.
Fusin con un lisosoma: se forma una vescula por endocitosis, a la que se une
un lisosoma para digerir la partcula introducida; entonces, la cubierta lipdica del virus se
funde con la membrana del lisosoma y el virin escapa hacia el citoplasma.
Eclipse
Segn la duracin de la fase de eclipse, se suelen distinguir dos modalidades de ciclo
infeccioso de un virus:
Ciclo ordinario: el cido nucleico vrico procede inmediatamente a la transcripcin de su
mensaje gentico en los ARN necesarios para su multiplicacin, y prosigue rpidamente el
ciclo vital. Este tipo de ciclo es el ms extendido en la naturaleza.
Ciclo lisognico: fue descubierto por Andr Lwoff en bacterifagos. El ADN vrico se cierra
por sus extremos generando un ADN circular. Este ADN se inserta en el ADN bacteriano en
un lugar especfico en el que la secuencia de nucletidos bacterianos es semejante alguna
regin del ADN vrico.
La bacteria prosigue sus funciones vitales sin que el virus realice ninguna accin, y cuando
el ADN bacteriano se duplica tambin lo hace el ADN vrico, de manera que
el genoma del virus pasa a las dos bacterias hijas. La multiplicacin bacteriana puede
seguir durante generaciones sin que el virus se manifieste. Pero ante una alteracin de las
condiciones ambientales, el ADN vrico se separa del bacteriano y prosigue entonces las
restantes fases de ciclo infeccioso, produciendo la muerte de la bacteria y nuevos
ejemplares del virus.
Algunos virus que infectan clulas animales siguen tambin el ciclo lisognico, como los
papilomavirus de las verrugas y algunos retrovirus que producen algunos tipos de cncer.
En el caso de los retrovirus, conviene recordar que el cido nucleico
es ARN monocatenario, por lo que la transcriptasa inversa ha de copiar el genoma vrico
en forma de ADN antes de que pueda insertarse en el ADN celular.
Multiplicacin
La multiplicacin del virus consta de la replicacin de su material gentico, de
la transcripcin de su mensaje en una molcula de ARN y de la traduccin del mensaje para
producir protenas vricas, tanto las que formarn parte de la cpsida como las protenas
enzimticas necesarias para el ensamblaje de las piezas del virin y para algunas de las
funciones anteriores. Los ribosomas y la mayor parte de las enzimas que los cidos
nucleicos vricos utilizan en estos procesos son los de la clula infectada.
Los virus con ADN realizan la replicacin del material gentico de la misma manera que las
clulas; en el caso de los virus con ADN monocatenario, previamente a la replicacin se
sintetiza una cadena de ADN complementario para formar la doble hlice.
Los virus con ARN replican el material gentico sin necesidad de pasar por ADN, actuando
cada cadena de ARN como molde para la sntesis de su complementaria.
Los retrovirus constituyen una excepcin a lo dicho anteriormente, ya que su ARN sintetiza
un ADN bicatenario, que ser el que posteriormente realice la sntesis de nuevos
ejemplares de RNA vrico.
Los virus con ADN y los retrovirus sintetizan el ARN a partir de la cadena molde de ADN de
forma similar a como lo hacen las clulas.
Los virus con ARN, excepto los retrovirus, sintetiza en el ARN copiando la cadena molde
de ARN, sin necesidad de pasar por ADN.
Posteriormente a estos procesos, tiene lugar el ensamblaje de las piezas para construir
nuevos viriones. En muchos virus, como el del mosaico del tabaco, el ensamblaje es
automtico y depende de la concentracin salina del medio. En otros virus, en el ensamblaje
intervienen enzimas codificadas en el cido nucleico del virus.
Liberacin de los nuevos virus
Despus de la multiplicacin del virus tiene lugar la salida de los nuevos individuos, que
saldrn con capacidad de infectar nuevas clulas. Las principales modalidades de
liberacin da nombre a nuevas variantes del ciclo vital de los virus:
Infeccin persistente
Los nuevos virus no esperan a la muerte de la clula hospedadora para abandonarla, sino
que van saliendo de la clula al mismo tiempo que se van produciendo, de manera que la
clula puede seguir viva y produciendo nuevas partculas vricas. La liberacin puede
hacerse de dos maneras:
Los virus sin envoltura lipoproteica salen directamente, sin arrastrar ningn resto de la
membrana plasmtica, bien sea abriendo una brecha en la membrana, o bien
aprovechando los mecanismos de exocitosis o salida de sustancias al exterior de la clula.
Los virus con envoltura lipoproteica salen por gemacin, es decir, se rodean de una porcin
de membrana plasmtica que acaba separndose de la clula y constituye la cubierta
lipoproteica del nuevo virus.

La infectividad de los rotavirus se incrementa, y muy probablemente depende,


del tratamiento del virus con tripsina. Este tratamiento proteoltico resulta en el
rompimiento especfico de VP4 (776 aa) en dos polipptidos de menor peso
molecular, llamados VP8 (aa 1-131) y VP5 (aa 247 a 776) (3, 57). El corte de VP4
no afecta la unin a la clula, y mas bien ha sido asociado con la entrada del virus
al citoplasma celular , por penetracin directa (47, 88). El mecanismo por el cual
el corte con tripsina activa la infectividad viral se desconoce an, sin embargo, se
ha propuesto que la penetracin del virus puede ser iniciada por los extremos
recin generados por el corte con tripsina o por un posible cambio
conformacional de VP4 a consecuencia del corte con esta proteasa.