Biol. Cel. Sistema de endomembranas. Maestría en Biología Experimental.

Prof. Leticia Bucio Ortiz

TÉCNICA WESTERN BLOT INTRODUCCIÓN Una parte importante en la investigación es la purificación e identificación de diferentes moléculas biológicas, cómo las proteínas. Las cuales deben de encontrarse libres de contaminantes si se han de caracterizar adecuadamente. La primera etapa es el aislamiento de las proteínas, habitualmente las proteínas son liberadas de las células. El método de elección depende del tejido de procedencia, así como la localización de las proteínas en la célula. Si la proteína se localiza en el citosol, su liberación sólo requiere la apertura de la célula por ruptura (lisis), es el método más sencillo y suave de efectuar. Ya separada la proteína de su entorno natural, debe de controlarse todas las fases del proceso de purificación. Existen diferentes métodos de purificación como por ejemplo la cromatografía de intercambio iónico, la cromatografía sobre papel, la cromatografía de afinidad, la cromatografía de resolución elevada (HPLC), la electroforesis, etc. El Western Blot es un método para identificar proteínas en una mezcla compleja de proteínas, transfiriendo las proteínas separadas mediante el peso molecular, de un medio gelificado a una membrana de nitrocelulosa de unión de las proteínas para su análisis. MATERIAL Y MÉTODOS. Extracción de proteína
Para realizar electroforesis 1 Cámara de electroforesis: Tubos ependorf de 2 ml y 600 µ l Centrífuga a 13000 rpm durante 10 min a 4ºC 1 Fuente de poder 1 Juego de micropipetas con puntas 1 Baño María 95 oC. Hielo 1 Jeringa Hamilton de 50 µ l Cámara multipozos o gradilla para ependorff Tubos eppendorf de 1000, 600, 200 µ l. Para realizar el Western Blot Determinación de proteínas 1 Cámara de transferencia: 2 placas de plástico. 2 Cajas de plástico para contener la membrana de transferencia 8.5 X 5.5. cm 4-5 Cajas de plástico para contener los geles, lavar membrana, contener agua y soluciones. 1 Fuente de poder Para realizar 2 geles: 1 Agitador de placas. 2 Viales con agitador magnético. Regla y lápiz 1 Parrilla con agitación. Hielo Guantes Papel filtro Watman no. 3 2 juegos de vidrios limpios. 2 peines Membrana de Nitrocelulosa 1 Juego de micropipetas con puntas Tubos para centrífuga de 50 y 10 ml, Costar

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TBS 2. Leticia Bucio Ortiz SOLUCIONES Extracción de Proteínas BUFFER DE LISIS Para 25 ml.197 g NaCl 120 mM 0.4 g Agua desionizada 50 ml SDS al 10 % SDS 10 g Agua desionizada 100 ml almacenar a temperatura ambiente Persulfato de Amonio al 10% Persulfato de amonio 1g Agua dest.8 (0.05 % 0. 8 .Biol.8 ml SDS al 10 % 1.42 g de Tris-HCl (20 mM) 8 g de NaCl (137 mM) Western Blot TBS-Tween 20 0.4 ml β -mercaptoetanol 0.0 y agregar NaF 100 mM 0.6 ml del de 1.8 con HCl almacenar a 4º C (preparar sólo lo necesario o guardar por 10 días a 4ºC) Preparación de las muestras de proteínas Tris-HCl pH=6.6 g Bis-acrilamida 0.5 M) 0.105 g NaVO3 200µ M 0. 10 ml Buffer para muestras 4X Preparación del Gel Solución 1.3 Metanol absoluto.5 M glicerol 0.03 g Glicina 14.4 g Metanol 200 ml SDS 0. Prof.0 ml Electroforesis Buffer de corrida 1X 10 X .5 M tris-HCl pH 8.8 Tris-base 18. Maestría en Biología Experimental.8 con HCl almacenar a 4º C Solución 0.44 g 14. TRIS-HCl 50 mM 0.006 g Finalmente por 1 ml de buffer agregar 80 µ l de cocktail anti-proteasas (1 pastilla en 2 ml de agua) Solución Acrilamida-Bis Acrilamida 14.4 ml Agua desionizada 4.5 % 0.0 ml Tween 20 en 1000 ml de TBS.2 ml Almacenar a T° ambiente.8 Tris-base 6g Agua desionizadas 100 ml Ajustar a pH 6.6 ml del de 20% Azul de bromofenol 0.125 µ l y aforar Ajustar pH 8.4 g SDS 1 g 10 g Agua desionizada 1 L 1L Transferencia Buffer de transferencia Tris-base 03.5 g Aforar a 1 litro H2O ajustar a pH= 8. Cel. Sistema de endomembranas. Tris Base 3 g 30 g Glicina 1.1753 g IGEPAL 0.05% 1.5 g Agua desionizada 100 ml Ajustar a pH 8.5 M tris-HCl pH 6. 2 .

1% 0. Se requiere conocer en qué volumen de homogenado celular se tiene 50 µ g de proteínas.. Las células se lavarán con PBS y se resuspenderán en 250 µ l de buffer de lisis con inhibidores de proteasas y se incubarán en hielo por 15 min. Prof.Cuantificación de proteínas por el método de Bradford o el utilizado en cada laboratorio. 3. Posteriormente se cambiará el medio por uno libre de SFB por 3-24 horas. agitar suavemente. Se sembrarán 2. Leticia Bucio Ortiz Ajustar el pH a 7.) y tiempo de exposición. factores de crecimiento. Sistema de endomembranas. Cel.Biol.5 x 106 células en cajas de Petri de 6 cm2 con medio Williams-completo. 3 .Extracción de Proteínas 1. c) En un vial colocar los reactivos para hacer el gel de corrida. el cual se centrifugará a 13000 rpm durante 10 min a 4ºC. acetaldegìdo.6 Aforar a 1 litro Albúmina 0. IV.4 g de albúmina en 40 ml de TBS-Tween 20 DISEÑO EXPERIMENTAL Leche al 5 % 2 g de leche descremadaen 40 ml de TBSTween 20 I. a) Limpiar cuidadosamente los vidrios para hacer los geles. etc. dejar reposar 10-15 min para gelificación completa. pasado este tiempo se retirará el medio y se remplazará con medio sin SFB junto con el reactivo para el tratamiento elegido (etanol. II.-Condiciones de cultivo y tratamiento de las células. III.. Después de este tiempo se lavaran las células con PBS. 1. 2. b) Considerar las cantidades indicadas en la siguiente tabla para la preparación de 2 geles. Maestría en Biología Experimental. tener cuidado al poner el persulfato casi inmediatamente vaciar la solución ya que se inicia la gelificación en algunos minutos.Preparación del Gel. dejándolas estabilizar por 24 horas. las células se cosecharan raspándolas y haciendo un homogenado celular. Después.. 2. Recuperar el sobrenadante y tomar una alícuota para cuantificar la concentración de proteína total por el método de Bradford.

Maestría en Biología Experimental. Cargar la muestra. 2. VI.M.50 0.02 2.33 10 µ l 50 10 50 10 15 % 2.-Preparación de las Proteínas. 4 .. a 95oC por 5 min. 1.05 1. Hacer lo mismo con 8-10 µ l del estándar de P. Hervir en B.8 ml SDS 10 % Archilamida-Bis TEMED Persulfato de amonio µ l Volumen total ml ml ml Tris-HCl 0.Electroforesis 1.1 3. Cel. dejar reposar de 10-15 min. con jeringa de 50 µ l. 3. quitar los peines a cada uno.5 M pH 8.M. V. con 20 µ l de buffer de muestra. preparar en otro vial la solución para el gel concentrador (cuidado al agregar el persulfato. Leticia Bucio Ortiz d) Posteriormente. 4. Reactivos Agua desionizada ml De Corrida 10 % 4. y lavarla con agua caliente en cada toma de muestra. se recomienda hacer una corrida previa a 200 volts. Sistema de endomembranas. con mucho cuidado para mantener los carriles de los pozos.8 ml SDS 10 µ l % Archilamida-Bis µ l TEMED e) Una vez que está listo el gel.Biol. Agregar el volumen de la proteína equivalente a 50 µ g .1 5 10 Concentrador Agua desionizada ml 3. antes de agregar las muestras de proteínas para correr la electroforesis. Considerar además la muestra del estándar de proteínas que llevará 10 µ l. Prof. Colocar en cada eppendorf de 200 µ l (tantos según las muestras que se tengan) 10 µ l de buffer de muestra. 5. durante 30 min. ya que gelificará casi inmediatamente) y colocar el peine.25 50 650 10 µ Persulfato de amonio µ l Volumen total ml l 25 5 Tris-HCl 1.34 2. Una ves hechos los geles.5 0.5 M pH 6. Elaboración del gel de corrida y gel concentrador .

Colocar los geles en la cámara de electroforesis y llenar con el Buffer de Corrida en el interior y exterior de los geles. 4. VII. Prof. cuidando que no se mezclen. 5 . además cortar 4 papeles filtro (Watman No.5 cm. 3.Bloqueo. cortar la membrana de nitrocelulosa a la medida del gel aprox. 5. En lo que corre la electroforesis. 3. Serrar 5. Una vez terminada la transferencia. Llenar la cámara con buffer de transferencia y el depósito blanco con agua. durante 15-60 min. sacar la membrana con la cara transferida hacia arriba y bloquearla con 1520 ml de leche al 5% en TBS-Tween 20. Colocar todos los componentes en la unidad de transferencia. Correr la electroforesis a 200 volts durante 60 min. Activar la membrana de nitrocelulosa sumergiéndola en metanol absoluto por 30 seg. sacar la membrana con la cara transferida hacia arriba y bloquearla con 15-20 ml de leche al 5% . 3) del mismo tamaño. Terminada la transferencia. en agitación constánte. Cel. Una vez cerrada la placa de plástico. cuidar de lavarla cada que se coloque una nueva muestra.Biol. despegar el gel de los cristales. Hacerlo utilizando guantes. cortar el gel de concentración y con mucho cuidado sumergirlo en el buffer de transferencia. colocarla en la cámara de transferencia. 6. Sistema de endomembranas. Cargar cada una de las muestras en los carriles del gel. Terminado el tiempo de la electroforesis. para ello se coloca la cámara en una tina con hielo) o toda la noche a 30 volts. dentro del refrigerador y con agitación constante del buffer de transferencia. para ello utilizando la jerina Hamilton. agregarles sólo buffer de muestra. Poner la transferencia a 110 V durante 60 min. 7. 8. 2. lavados y colocación de los anticuerpos: 1. Lavar la membrana con solución de TBS-Twen 20 y se puede dejar la membrana en esta solución hasta el día siguiente para continuar.-Transferencia: 1. de la siguiente manera: negro/fibra/2 papel filtro/gel/membrana/2 papel filtro/ fibra/blanco Las fibras y el papel filtro se mojan en el buffer de transferencia. a 4° C. lavar la 4. membrana con agua desionizada y después colocarla en el buffer de transferencia. Maestría en Biología Experimental..5 X 5.. VIII. Leticia Bucio Ortiz 2. Si quedan carriles sin muestra. 8. 9. antes de acomodarlos.

Pasado este tiempo lavar con TBS-Tween 20 la membrana. exponer más o menos tiempo.0 X. en 12 ml de la solución de albúmina en TBS-Tween 20 (para dos membranas). 6 . Lavar: 2 veces con TBS-Tween 20. Dependiendo de la intensidad de las bandas. por 2 h. Poner a la membrana 2 ml de sustrato luminiscente (Kit SuperSignal® West Pico Substrate). durante1 h o toda la noche en agitación. por 15 min.057 g en 1 L de agua desionizada. 3 Cuantificar por análisis densitométrico. 5. Cruz. generalmente diluída (1:200 o 1:500 o 1:1000) según se indique.Biol. 2 ó 3 veces para eliminar el exceso de leche. IX. Maestría en Biología Experimental. se “estripea” la membrana (se lava de las proteínas adheridas) y se repiten los puntos del 3 al 7 del paso VIII. Actina goat polyclonal Anticuerpo Secundario Goat anti-rabbit. Cel.Revelado 1 Realizarlo en cuarto obscuro. Lavar 2 veces 10 min con TBS-Tween 20 y 1 vez por 5 min con TBS-solo. Sta. Sistema de endomembranas. manejando la membrana con pinzas. 3. Poner 3 µ l del anticuerpo secundario. Nota: considerar siempre en que está hecho el anticuerpo primario para usar correctamente el anticuerpo secundario. en 30 ml de la solución de albúmina en TBS-Tween 20 por 1 h. Nota: Para normalizar la cantidad de proteína de las bandas.. 7. Poner el anticuerpo primario policlonal o monoclonal de la proteína que se desea visualizar. Cruz Mouse anti-goat 6. Prof..0. Lavar la membrana con Tris-Base pH= 2. cambiando la soluciòn cada 30 min. pero utilizando como anticuerpo primario a la Actina y como anticuerpo secundario Solución de estripeado Tris-Base 50 mM pH=2. 2 Revelar y fijar la película. 6. Anticuerpo Primario policlonal de conejo. Sta.“Estripeado”. Colocar la membrana en la placa reveladora cubierta con plástico y exponerla a una película Kodak por 30 seg. Leticia Bucio Ortiz 2. 4.

Maestría en Biología Experimental.Biol. Leticia Bucio Ortiz 7 . Prof. Sistema de endomembranas. Cel.

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