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UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN AGUSTN

DE AREQUIPA
FACULTAD DE INGENIERA DE PROCESOS
ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA QUMICA

AUTORES:
Dr. Ing. Ral Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana Bedregal

DATOS DEL ALUMNO


Nombre del alumno ................................

Grupo. Turno Calificacin.

AREQUIPA-PER-2017
UNIVERSIDAD NACIONAL DE SAN
AGUSTN DE AREQUIPA

FACULTAD DE INGENIERA DE PROCESOS


ESCUELA PROFESIONAL DE INGENIERA QUMICA

AUTORES:
Dr. Ing. Ral Omar Gallegos Jara
Ing. Marcia Juana Quequezana
Bedregal

AREQUIPA-PER-2017

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PROLOGO

El Campo de la Microbiologa en toda su magnitud es indispensable para el


desarrollo de las ciencias de la salud humana y animal, para el desarrollo de la agricultura
y para el ilimitado campo de los bioprocesos.

Los microorganismos han demostrado ser un enorme potencial para la


elaboracin de infinidad de productos tiles al hombre, en la generacin de procesos
productivos con menor contaminacin del medio ambiente y con consumos de energa
muchos menores.

Los microorganismos son objetos de manipulaciones genticas para que puedan


producir sustancias diversas de gran necesidad. Estos microorganismos pueden generar
Enzimas que a su vez son empleados como biocatalizadores para los nuevos
bioprocesos.

El conocimiento de la microbiologa se hace imperioso para su aplicacin a


diversas disciplinas del saber humano. La presente Gua de Prctica de Mi9crobiologia
Industrial se ha desarrollado con el objeto de poner al interesado en el conocimiento
sistematizado sobre las tcnicas bsicas del manejo de Microorganismos en laboratorio
para estudiantes de Ingeniera Qumica.

Los Autores

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NDICE

PROLOGO
NDICE
Pgs.
RECOMENDACIONES GENERALES ................................................................................................... 6
PRCTICA 1 : BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA ..................................................................... 7
PRCTICA 2 : RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y CIANOBACTERIAS
IN VIVO, COLORACION VITAL ...................................................................... 12
PRCTICA 3 : PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO: COLORACIONES:
SIMPLE Y DIFERENCIAL, TINCION Y MORFOLOGIA DE
HONGOS .................................................................................................................... 17
PRCTICA 4 : EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO, ACONDICIONAMIENTO
Y ESTERILIZACIN ............................................................................................ 31
PRCTICA 5 : MEDIOS DE CULTIVO ........................................................................................ 36
PRCTICA 6 : SIEMBRA DE MICROORGANISMOS ............................................................... 48
PRCTICA 7 : CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE
COLONIAS........................................................................................................ 57
PRCTICA 8 : CURVA DE CRECIMIENTO ............................................................................... 62
PRCTICA 9 : CONTEO DIRECTO DE CLULAS MICROBIANAS .................................. 67
PRCTICA 10 : AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MTODO DE DILUCIN EN
PLACA.......................................................................................................................... 70
PRCTICA 11 : OBTENCIN DE CIDO ALGNICO A PARTIR DEL ALGA Lessonia 70
PRCTICA 12 : AISLAMIENTO Y SELECCIN DE MICROORGANISMOS DE
INTERS INDUSTRIAL......................................................................................... 70
PRCTICA 13 : AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL rhizobium..................................................... 81
PRCTICA 14 : ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS ............ 83
PRCTICA 15 : MTODO PARA LA DETERMINACIN DE BACTERIAS
COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y escherichia coli POR LA
TCNICA DE DILUCIONES EN TUBO MLTIPLE (NMERO MS
PROBABLE O NMP) ............................................................................................... 86

FRMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS USADOS EN LAS DIFERENTES


PRCTICAS ................................................................................................................................ 88
BIBLIOGRAFA .........................................................................................................................102

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Recomendaciones Generales

1. La hora de entrada tendr 10 minutos de tolerancia, despus de este tiempo, no


se permitir al acceso al laboratorio
2. Al entrar al laboratorio, el alumno deber ponerse la bata y abotonarla
completamente, slo podr quitrsela al salir de ste.
3. Las mesas debern estar siempre limpias y desocupadas, las mochilas debern
ser colocadas en los cajones de las mesas de trabajo.
4. No comer ni fumar en el laboratorio, no introducirse ningn objeto a la boca.
5. Recogerse el pelo para efectuar el trabajo de laboratorio.
6. Limpiar y desinfectar el rea de trabajo antes y despus de usarla.
7. No pasear entre las mesas del laboratorio, el trabajo deber efectuarse sentado y
en su equipo de trabajo.
8. Hablar slo lo necesario con los compaeros.
9. Das antes de iniciar la prctica lea cuidadosamente que es lo que se va a realizar,
si no entiende pregunte al profesor.
10. Si hay necesidad de llevar material biolgico para la realizacin de la prctica, es
necesario conseguirlo de lo contrario la prctica se suspender para todo el
equipo.
11. El asa utilizada para el cultivo de microorganismos deber esterilizarse en la
flama del mechero, antes y despus de su uso.
12. Informe al profesor de cualquier accidente que ocurra.
13. En caso de derramar material que contenga microorganismos, cbralo con fenol
o benzal y deje actuar diez minutos y de aviso al profesor.
14. Todo el material que se va a incubar o desechar, debe colocarse en el sitio
indicado por el profesor.
15. Etiquete todo el material que va a incubar con los siguientes datos: equipo,
grupo, fecha, nombre del material e iniciales del nombre del alumno.
16. Despus de la incubacin es necesario la esterilizacin del material para eliminar
microorganismos que pudieran hacernos dao a nuestra salud.
17. Lvese las manos con agua y jabn antes de salir del laboratorio.
18. Es obligacin de cada equipo entregar todo el material limpio.

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PRCTICA
BIOSEGURIDAD; MICROSCOPIA

I. OBJETIVOS

Aprender las normas bsicas de bioseguridad en el laboratorio


Identificar peligros y riesgos existentes en el laboratorio.
Valorar la importancia de la bioseguridad en el laboratorio
Identificar cada una de las partes del microscopio ptico, conocer su funcin y el cuidado de cada
uno de ellas.
Dominar el mecanismo de iluminacin, la observacin de una muestra con todos los objetivos.

II. MARCO TEORICO

2.1 BIOSEGURIDAD
La bioseguridad es el conjunto de medidas preventivas de sentido comn que tienen la finalidad de
proteger la salud, la integridad fsica, la seguridad de las personas en un ambiente determinado, frente a
diferentes riesgos biolgicos fsicos, psicolgicos y mecnicos.

2.1.1 PRINCIPIOS BASICOS DE LA BIOSEGURIDAD


Universalidad: se deben seguir las normas de bioseguridad rutinariamente en todas las situaciones que
puedan dar origen a accidentes, estando o no previsto el contacto con sangre o cualquier otro fluido
corporal. Estas precauciones deben ser seguidas en todo momento mientras se est dentro del laboratorio
Precauciones estndar: comprende las medidas a tomar para evitar la contaminacin de una persona,
evitando la exposicin directa a sangre y otros fluidos orgnicos potencialmente contaminantes, por
ejemplo mediante el uso de barreras, es decir mediante la utilizacin de materiales adecuados que se
interpongan al contacto de los mismos. La utilizacin de barreras por ejemplo guantes no evitan los
accidentes de exposicin a estos fluidos, pero disminuyen las consecuencias de dicho accidente

2.1.2 PRECAUCIONES ESTANDAR


- Barreras de proteccin
- Lavado de manos
- Desinfeccin y esterilizacin.
- Manejo de objetos punzo cortantes.
- Manejo y eliminacin de desechos
- Ventilacin e iluminacin adecuadas
- Limpieza y desinfeccin de ambientes

2.1.3 VAS DE CONTAMINACIN


1. La boca
Comer, beber y fumar en el laboratorio.
Realizar transferencias con pipetas sin utilizar ningn tipo de proteccin.

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2. La piel
Cortaduras o rasguos.
Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos o utensilios contaminados
(lpices, bolgrafos, etc.).

3. Los ojos
Salpicaduras de materiales infecciosos.
Transferencia indirecta de microorganismos a travs de los dedos contaminados.

4. Los pulmones
Inhalacin de microorganismos transportados por el aire (aerosoles).

2.1.4 BARRERAS DE PROTECCION


- Lavado de manos (antes y despus)
- Guantes
- Mascarilla o barbijo
- Mandil
- Gorro

2.1.5 NORMAS DE BIOSEGURIDAD


Entrar al laboratorio en forma ordenada, dejar las carteras, libros y otros objetos personales en el
lugar que se les indique para tal fin.
Llevar puesto el mandil de laboratorio en todo momento, que debe permanecer completamente
cerrado.
Limpiar y descontaminar las superficies de trabajo, antes de comenzar y al finalizar la sesin
prctica.
Lavar las manos con agua y jabn:
antes de realizar las actividades programadas
antes de salir del laboratorio
despus de usar materiales contaminantes.
Recoger el cabello largo.
Evitar desplazamientos innecesarios, movimientos bruscos. Hablar slo lo indispensable.
No comer, beber, fumar.
Conocer el manejo de todos los equipos y reactivos a emplear antes de iniciar las actividades
indicadas en la prctica. Si usted tiene alguna duda, dirjase al profesor.
Usar mascarillas para casos indicados

2.2 MICROSCOPIA
El microscopio permite la observacin de estructuras muy pequeas que no pueden ser vistas a
simple vista. El poder de resolucin de un microscopio est en relacin inversa a la longitud de onda
de la luz usada.

2.2.1.- PARTES DEL MICROSCOPIO COMPUESTO

1. Parte mecnica:
- Pie
- Columna (pilar, charnela y brazo)
- Tubo: Revlver
- Tornillo macromtrico o sistema de movimiento rpido
- Tornillo micromtrico o sistema de movimiento lento
- Platina: Pinzas sujetadoras de lminas y mandos coaxiales

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- Subplatina: Pieza que asciende y desciende condensador, anillo porta filtros, diafragma
iris y soporte para el espejo

2. Parte ptica del Microscopio:


- Oculares: lentes situados donde va del ojo del observador
- Objetivos: lentes situados en el lado de la muestra
Los objetivos traen impresas las siguientes caractersticas:
o Magnificacin: Ej. x 25
o Apertura numrica (A.N.): Ej. 0,45
o Cualidades de la lente: Ej. Plan cuando se refiere a un objetivo Planacromtico
o Longitud del tubo: Ej. 160 mm
o Correccin de espesor de laminilla Ej. 0,17 mm
o Aparato de iluminacin. comprende: Espejo, Condensador, Diafragma

2.2.2.- USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO


1. El M.O. debe agarrarse siempre del brazo, nunca del tubo o platina porque deteriora el
tornillo micromtrico.
2. Disponer el M.O. en una mesa horizontal y a una altura conveniente para observar sin fatiga
Verificar que los oculares estn limpios y en posicin correcta.
3. Cuando se observe preparaciones fijas, puede inclinar el tubo del M.O. para una mejor
comodidad si se trata de Microscopios que no posean el sistema inclinado. Si se observan
preparaciones frescas oin vivo debe mantenerse la platina horizontal.
4. Verificar que los objetivos en el revlver estn en orden progresivo de aumento.
5. Coloque el objetivo de menor aumento en el eje ptico girando el revlver hasta que haga
clik.
6. Suba el condensador hasta que la lente superior este muy cerca de la platina y abra el
diafragma totalmente.
7. Si el Microscopio tiene luz incorporada, encender el interruptor y si tiene espejo orientarlo
hacia la ventana mejor iluminada o al fluorescente ms cercano.
8. Observe por el ocular la iluminacin del campo y trate de lograr la mxima luminosidad
moviendo el espejo; luego, si es necesario baje ligeramente el condensador.
9. Colocar en la platina el preparado a estudiar, cuidando que la laminilla cubreobjetos quede
hacia arriba, la etiqueta hacia la derecha del observador y que el preparado se encuentre entre
el condensador y el objetivo; es decir, atravesado por los rayos de luz. Este desplazamiento
se logra utilizando los mandos coaxiales.
10. Para iniciar la observacin, emplee siempre el objetivo de menor aumento (panormico
10X) y procure que la distancia objeto-objetivo sea la mnima (5 mm.), esto se logra bajando
el tubo con el tomillo macromtrico y observando por un lado del Microscopio el descenso
del mismo. Luego, observe por el ocular y simultneamente suba al tubo con el tomillo
macromtrico hasta enfocar el elemento en estudio, de inmediato utilice el tomillo
micromtrico para dar nitidez a la imagen. Finalmente recorra la lmina con la ayuda de los
mandos coaxiales para su observacin integral, siempre utilizando el tomillo micromtrico
para no perder la nitidez.
Cuando se trate de Microscopios en donde la platina asciende al utilizar el tomillo
macromtrico, la distancia objeto-objetivo debe ser de 1 a 1,5 cm.
11. Regular el diafragma iris hasta obtener las mejores condiciones de contraste.
12. El elemento que desee observar a mas aumento coloque en el centro del campo y cambie
de objetivo girando el sistema de revlver, teniendo cuidado de girar el objetivo del siguiente
aumento (45X) y NO el de inmersin. Ponga ntida la imagen nicamente con el tomillo
micromtrico.
Es importante tener en cuenta que para cambiar de un aumento a otro no debe manipularse
con el tomillo macromtrico porque corre el riesgo de romper la lmina o la lente frontal
del objetivo.
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13. Para observar las estructuras con objetivo de inmersin, coloque el elemento seleccionado
en el centro del campo y gire un poco el objetivo, de manera tal, que quede libre ste sector
de lmina para que pueda colocarse una gota de aceite de inmersin. Luego, contine
girando el revlver hasta que el objetivo de inmersin (100X) contacte con la gota y encaje
en el eje ptico; finalmente, observe por el ocular y aclare la imagen solamente con el tomillo
micromtrico.
Una vez terminada la observacin limpie el objetivo de inmersin y la lmina con el campo
ligeramente humedecido con alcohol isoproplico o metanol.

2.2.3.- AUMENTOS DEL MICROSCOPIO Y CLCULO APROXIMADO DE


DIMENSIONES CELULARES
1. Para calcular el aumento del Microscopio, multiplique el aumento del objetivo por el del
ocular.
Ej.: Objetivo 40X y Ocular 10X
40 x 10 = 400 aumentos
2. Para el clculo aproximado de dimensiones celulares, se debe conocer el dimetro del campo
microscpico que vara de acuerdo al objetivo que se usa.

Dimetro del campo microscpico


Dimetro del
Ocular Objetivo
campo en micras
10X 10X 1500
10X 45X 400
10X 100X 150

Ejemplo: Si observamos una clula epitelial al Microscopio con objetivo 10X y


ocular 10X, y si sta ocupa la tercera parte del campo microscpico,
concluiremos que la clula mide aproximadamente 500 micras; es decir, la
tercera parte de 1500.

2.2.4.- CUIDADOS DEL MICROSCOPIO COMPUESTO


1. El Microscopio debe tomarse por el brazo, nunca por el tubo la platina, porque a la larga
deteriora el tomillo micromtrico.
2. Los objetivos y oculares constituyen la parte ms delicada del Microscopio, por lo que debe
tenerse sumo cuidado en su uso. As, el enfoque debe hacerse suavemente, evitando que la
lente frontal del objetivo roce el cubre objetos. Por ninguna razn debe desmontarse los
objetivos.
El objetivo de inmersin no debe usarse en seco y debe quedar escrupulosamente limpio
despus de su uso, para lo cual use el campo ligeramente humedecido con alcohol
isoproplico o metanol.
3. Al finalizar la observacin microscpica, coloque el objetivo de menor aumento en el eje
ptico dejando un espacio de 2 cm. entre ste y la lentilla del condensador, luego apague la
luz.

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III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Proceda a enfocar una muestra, con objetivo 4X, 10 X, 40 X y 100X.

Observe las diferencias en el campo ptico y el acercamiento.

IV. CUESTIONARIO

1) Realice un dibujo del microscopio y seale sus partes?


2) A qu se denomina campo ptico?
3) Por qu decimos que nuestro microscopio tiene sistema parafocal.
4) Qu es el poder de resolucin
5) Explique qu tipos de aberraciones se presentan en las lentes del microscopio.
6) Explique el fundamento del microscopio confocal laser y su utilidad.
7) qu entiende por bioseguridad
8) Identifique 3 situaciones de peligro y 3 de riesgo en el laboratorio.
9) qu barreras de proteccin debe tener en cuenta antes de empezar a trabajar.
10) Cmo promovera la cultura de bioseguridad?

V. OBSERVACIONES

VI. CONCLUSIONES

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PRCTICA
RECONOCIMIENTO DE ALGAS PROTOZOOS Y
CIANOBACTERIAS IN VIVO, COLORACION VITAL

I. OBJETIVOS

1) Conocer la morfologa de organismos unicelulares.


2) Conocer los distintos mtodos de observacin de microorganismos in vivo.

II. OBSERVACIN IN VIVO DE ORGANISMOS UNICELULARES


Indicaciones:
1. Ilumine correctamente su Microscopio, cuidando que la platina est en posicin horizontal.
2. Coloque la lmina porta objetos en su Microscopio.
3. Ponga una gota del agua estancada en el centro de la lmina de manera que la luz del Microscopio la
atraviese.
4. Proceda a enfocar con menor aumento y observar que tiene exceso de iluminacin y poca visin de
la muestra corrija ste defecto bajando el condensador y cerrando un poco el diafragma iris.
5. Observar elementos fijos, con pocos movimientos y veloces que tienen caractersticas especiales y
un fondo de partculas de tierra y cristales grises y oscuros. Pueden distinguirse:
- Algas, como la espirogira, de color amarillento verdoso a manera de pequeas escaleras en cuyo
interior se observan los cloroplastos.
- Diatomeas, de diferentes formas y tamaos, se las distingue porque son brillantes, amarillentas,
poco mviles; van desde la forma de un barril pequeo hasta cigarros o prismas.
- Parameccium, de gran movilidad, atraviesan raudamente el campo de observacin. Son
protozoarios que tienen forma ovoide, de zapatilla y se caracterizan por presentar su cuerpo
rodeado de cilios. En su interior observar el ncleo y vacuolas.
- Tambin puede observarse a la stilonichia, ms pequea que el Parameccium y con un pelo o
cerda en un extremo.
- Algunas veces se visualiza a la Euglena Viridis, caracterizada por presentar un flagelo largo
(Protozoario flagelado).
- La ameba, difcil de visualizar por su transparencia, presenta pocos movimientos y se desplaza
lentamente emitiendo pseudpodos en la superficie de su cuerpo.
- Tambin puede encontrar Vorticelas, tienen forma de cliz, con un pedicelo largo y delgado,
generalmente viven en colonias. La superficie del cliz est rodeada de cilios.

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6. Luego, coloque una gota de colorante vital (rojo neutro o azul de metileno) en su preparado y observe
nuevamente los organismos unicelulares.
7. Haga un dibujo de lo observado y coloque los nombres correspondientes.

Grafique la Observacin y Resultados

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III. EXAMEN EN FRESCO DE MICROORGANISMOS
1. Examen en Fresco
Es la forma ms simple de realizar la preparacin de un espcimen para su examen microscpico.
Las preparaciones en fresco se utilizan para observar microorganismos vivos.

Hay 2 tipos de tcnicas:


a. Preparacin en fresco simple entre porta y cubre.
Consiste en colocar una gota de lquido con los microorganismos sobre un porta objetos y luego
cubrirla con un cubreobjetos.

b. Gota pendiente
Consiste en colocar una gota de lquido con microorganismos en un cubreobjetos y cubrirlo con un
portaobjetos (de forma invertida) con una excavacin central (portaobjetos excavados). Se debe sellar
la preparacin con vaselina alrededor de la excavacin.
La ventaja de esta preparacin es que no se seca y puede ser observada durante un tiempo ms largo.

2. Coloraciones Vitales
Son los montajes de materia viva teidos. Suelen utilizarse para ello, determinados colorantes (azul
de metileno, rojo neutro) a muy baja concentraciones (1/1000, 1/10000). Su objetivo es facilitar la
observacin, mediante el colorante de la morfologa y la estructura bacteriana, pero sin provocar
alteraciones celulares ni destruir la bacteria.

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL


EXAMEN DE MICROORGANISMOS VIVOS
Este examen permite observar microorganismos vivos, se realiza con la finalidad de observar caracteres
de movilidad, morfologa, agrupacin, observacin de huevos y quistes de parsitos.
EXAMEN EN FRESCO

Material
- Microscopio
- Lminas cubreobjetos
- Lminas portaobjetos
- Agua destilada
- Asas de Kolle
- Muestra de levaduras in vivo
- Muestras fermentadas
- Cultivo de microorganismos

Metodologa
- Si la muestra proviene de un lquido, con un asa de kolle se coloca una gota de lquido
sobre un portaobjeto, sobre el que se coloca un cubreobjeto.
- Si la muestra proviene de un cultivo slido, se deposita primero una gota de suero
fisiolgico sobre el portaobjetos, para luego con la ayuda del asa de kolle realizar una
suspensin y colocar un cubreobjetos.
- Observar al microscopio con objetivo 40X.

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Grafique la Observacin y Resultados

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COLORACIONES VITALES
Estos tipos de exmenes pueden considerarse como preparaciones en fresco o como tcnicas
intermedias entre stas y las preparaciones fijadas y coloreadas. Son montajes de materia viva
teidas.

Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, a examinar, Cubreobjetos, Solucin de azul de


metileno (1/1000), Asas de platino, Grmenes diferentes

Procedimiento
- Sobre el portaobjeto colocar una gota de colorante azul de metileno (l/l000).
- Colocar una gota de la muestra a examinar y con ayuda de una asa de kolle mezclar. Seguir
el procedimiento (muestra liquida o slida).
- Observar al microscopio con el objetivo de 40X.

Grafique la Observacin y Resultados

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OBSERVACION DE CIANOBACTERIAS
INTRODUCCION
Las bacterias y cianobacterias carecen de muchas de las estructuras internas propias de las
clulas eucariticas. As, el citoplasma de las procariticas est rodeado por una membrana
plasmtica y una pared celular (como en las clulas vegetales), pero no hay membrana nuclear
ni, por tanto, ncleo diferenciado. Las molculas de ADN estn en contacto directo con el
citoplasma. Adems carecen de mitocondrias, retculo endoplasmtico, cloroplastos y aparato
de Golgi. Aunque, en general, las clulas procariticas carecen de estructuras internas
delimitadas por membrana, las cianobacterias, s contienen numerosas membranas llamadas
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tilacoides, que contienen clorofila y pigmentos fotosintticos que utilizan para captar la energa
de la luz solar y sintetizar azcares (fotosntesis).

OBJETIVO: Observar Nostoc (una cianobacteria) al microscopio ptico

Materiales:
Muestra biolgicca: Nosstoc (murmunta hidratada)

Procedimiento Experimental

1.Colocar un trocito de Nostoc en un portaobjetos.


2.Presionar con otro portaobjetos con cuidado.
3.Agregar una gota de agua
4.Colocar el cubreobjetos.
5.Observar al microscopio.
6.Dibujar lo observado indicando aumentos.
7.Indicar las diferentes estructuras observadas.

Grafique la Observacin y Resultados

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V. CUESTIONARIO

- Qu ventajas y desventajas ofrece una preparacin en fresco?


- Qu ventaja presenta una preparacin gota pendiente?
- Realice un dibujo del microscopio y seale sus partes?
- Que tipos de clulas son las bacterias y cianobacterias.
- Que estructuras comunes presentan las cianobacterias
- Cual es la importancia ecolgica de las cianobacterias
- Que problemas causas la presencia de cianobacterias en plantas de potabilizacin de agua.
- Por que los arroceros fomentan el crecimiento de Azolla carolininiana en los cultivos de arroz?

VI. OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES

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PRCTICA
PREPARACIN DE UN FROTIS BACTERIANO:
COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL -
TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS

I. OBJETIVOS

- Observar clulas muertas en frotis seco y teidas con diferentes procedimientos de coloracin.
- Distinguir las caractersticas macroscpicas y las estructuras microscpicas de los Aspergillus,
Penicilium y Rhizopus
- Conocer mediante las caractersticas macroscpicas y microscpicas las especies de Aspergillus,
Penicilium y Rhizopus
- Conocer la aplicacin de los gneros Aspergillus, Penicilium y Rhizopus en la industria.

II. MARCO TEORICO : COLORACION SIMPLE Y DIFERENCIAL

Debido a que las bacterias y otros microorganismos son pequeos y su protoplasto posee un ndice
de refraccin cercano al agua, se requiere generalmente tinciones biolgicas para visualizarlos
adecuadamente o demostrar el detalle de sus estructuras internas.
Los colorantes estn constituidos en su mayora por el anillo bencnico, y difieren uno de otro en
cuanto al nmero y disposicin de estos anillos y a la sustitucin de los tomos de hidrgeno por
otras molculas. Algunos de los grupos cromforos ms comunes hallados en los colorantes son:
C=C, C=O, C=S, C=N, N=N, N=O, NO2.
La intensidad de coloracin de colorante es proporcional al nmero de radicales cromforos del
compuesto.

2.1.- COLORACIONES DIFERENCIALES

PARED CELULAR
El espesor oscila generalmente entre 0.150 m y 0.500 m de espesor, pudiendo incluso
alcanzar 0.8 m (Lactobacillus). Las paredes de las clulas jvenes son ms delgadas que las
clulas de cultivo antiguo.

GRAMPOSITIVAS. La pared celular de las Grampositivas est constituida principalmente


por cadenas de peptidoglucano, a menudo unidas por puentes peptdicos.
Sin embargo estas clulas contienen tambin una gran cantidad de cidos teicocos, polmeros
de glicerol y ribitol unidos por grupos fosfato y aminocidos como D-alanina o azcares como
la glucosa estn unidos a los grupos glicerol y ribitol.

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GRAMNEGATIVAS. Presentan 3 capas de envoltura distintas, dispuestas de manera laxa,
estas incluyen la membrana externa (ME), con voluta, arrugada con surcos u ondulante, que
contiene el antgeno o somtico conocido como lipopolisacrido LPS, una capa densa
intermedia, y la membrana plasmtica interna. Un espesor de 0.0075 m.

2.2.- PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS


Este tipo de preparaciones son las ms frecuentes, tanto las obtenidas directamente a partir de
muestras clnicas como las obtenidas a partir de desarrollo de cultivos.

Los pasos a seguir para la realizacin de una preparacin fijada y coloreada son:

a. Confeccin del Frotis. Puede prepararse a partir de productos lquidos o slidos.


Producto lquido. Para preparar un frotis, se coloca sobre un portaobjetos de vidrio limpio y
seco, una gota del material a estudiar y se extiende con ayuda del asa de platino.
Cultivo en medio slido. Puede prepararse una suspensin del material en una gota de
solucin salina colocada previamente en el portaobjetos, extendindola con ayuda del asa de
platino.

b. Secado. Se dejar secar el frotis a temperatura ambiente.

c. Fijacin. La fijacin tiene como objeto la inmovilizacin de las estructuras del material a
estudiar en un estado lo ms prximo posible al estado vivo. Consiste en una muerte rpida de
los microorganismos, debida a la coagulacin de las albminas protoplsmicas. Existe un gran
nmero de fijadores, tanto en forma simple (etanol, cido pcrico). Las formas ms habituales
de fijacin son: por el calor y alcohol en fro.

d. Coloracin. Es el proceso de coloracin de los microorganismos.

e. Lavado. Eliminacin del exceso de colorante.

f. Secado. Se secar la preparacin al aire.

CLASIFICACIN DE LAS COLORACIONES


La clasificacin de los colorantes es algo confusa, pero est basada en los cromforos presentes.

a. Segn su estructura qumica. Pueden clasificarse como cido o Bsico, trmino que no
ndica sus reacciones de pH en solucin, sino, si una parte de la molcula es aninica o
catinica.
Los colorantes bsicos, tien estructuras de naturaleza cida, como la cromatina nuclear
de las clulas. Ej: Cristal violeta, Violeta de Genciana, Verde de Malaquita. Safranina.
Los colorantes cidos, reaccionan con sustancias bsicas, tales como estructuras
citoplsmaticas, y como colorante de contraste. Ej: cido pcrico.
Los colorantes neutros, cuando se asocia un colorante cido con uno bsico. Ej: Wright,
Giemsa, Hematoxilina - Eosina.
Los colorantes indiferentes, suelen ser insolubles en agua y solubles en alcohol. Ej:
Sudn III.

CLASIFICACIN DE LAS TINCIONES

a. Tinciones Simples. Son las que utilizan un solo colorante y permiten conocer la morfologa
y tipo de agrupacin bacteriana. ejplo. Tincin azul de metileno, Tincin fucsina.

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b. Tinciones Diferenciales. Utilizan ms de un colorante y sirven para poner de manifiesto las
caractersticas de afinidad de los microorganismos por ciertos colorantes como; Tincin Gram,
Tincin cido-alcohol resistente.

c. Tinciones Estructurales. Utilizan ms de un colorante y sirven para poner de manifiesto


estructuras bacterianas. como; Tincin de flagelos, Tincin de esporas, Tincin de cpsulas,
Tincin de corpsculos metacromticos

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: PREPARACIN DE UN FROTIS


BACTERIANO: COLORACIONES: SIMPLE Y DIFERENCIAL

3.1. PREPARACIONES FIJADAS Y COLOREADAS

Preparacin del Frotis

- Flamee el asa para siembra hasta que se ponga al rojo vivo. Sostenga el asa inmediatamente
arriba de la porcin azul de la flama. Ponga el asa tan cerca de la posicin vertical como
sea posible. Djela enfriar (cuente hasta 20).
- Tome una porcin de la muestra que se va examinar, colocando el asa en posicin plana
en la superficie del lquido.
- Coloque el asa sobre el portaobjeto y aplnese ligeramente en el centro de ste (el
portaobjeto deber estar numerado).
- Sosteniendo todava el asa aplanada sobre el portaobjeto muvala trazando una espiral del
centro a la periferia. Debe dejar cierto espacio entre la muestra y cada uno de los 4 lados
del portaobjetos.
- Flamee de nuevo el asa hasta que est al rojo vivo para destruir cualesquiera bacterias que
se encuentren en ella.

Fijacin
- Confirme que el frotis se ha secado completamente al aire libre.
- Pase el portaobjeto tres veces a travs de la llama del mechero de Bunsen, con la muestra
hacia arriba.
- Djelo enfriar antes de aplicar la tincin.

3.2. TINCIONES SIMPLES

Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, Azul de metileno (solucin acuosa al 1%),


Safranina (solucin acuosa 1%), Asas de platino, Grmenes diferentes, Aceite de inmersin.

TINCIN DE AZUL DE METILENO


Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorcin del colorante por los
diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el
colorante con dificultad son as fcilmente diferenciables.

Procedimiento
- Tome una lmina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un
frotis.
- Con l esa tome una pequea porcin del cultivo en medio slido y disuelva en la gota de
agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frtices que se obtengan
no deben ser ni muy gruesos m muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijacin del frotis.
- Cubrir la preparacin con el colorante (2 o 3 gotas) y se deja actuar de unos 5 minutos.
19
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el
frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con aceite de inmersin.

Grafique la Observacin y Resultados

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TINCIN DE SAFRANINA

Las bacterias aparecen de color rojo.

Procedimiento
- Tome una lmina portaobjeto limpia, coloque una gota de agua destilada para hacer un
frotis.
- Con el asa tome una pequea porcin del cultivo en medio slido y disuelva en la gota de
agua (cuando el cultivo es medio liquido no necesita de agua). Los frtices que se obtengan
no deben ser ni muy gruesos ni muy finos.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijacin del frotis.
- Cubrir la preparacin con el colorante de safranina (2 3 gotas) y se deja actuar de unos
5 minutos.
- Lavar bien con agua corriente, evitando que el chorro de agua caiga directamente sobre el
frotis, hasta quitar el exceso de colorante.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con aceite de inmersin.

Grafique la Observacin y Resultados

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3.3. COLORACIONES DIFERENCIALES
Material. Microscopio, Lminas portaobjetos, Set para la coloracin de Gram, Asas de platino,
Grmenes diferentes, Aceite de inmersin.

TINCIN GRAM
El cristal violeta acta como un colorante primario, que se une a la pared celular bacteriana
luego de un tratamiento con una solucin dbil de iodo (Mordiente). Algunas bacterias debido
a su naturaleza qumica de sus paredes celulares, poseen la capacidad de retener el cristal violeta,
an luego del tratamiento con un decolorante orgnico, tal como una mezcla de alcohol y
acetona. Tales bacterias se denominan Grampositivas.
Las bacterias Gramnegativas debido a su mayor contenido lipdico en su pared celular, pierden
la coloracin primaria del cristal violeta cuando son tratadas con el decolorante. El colorante
secundario o de contraste utilizado es la safranina. Las bacterias Gramnegativas que han
perdido el cristal violeta, aparecen rojas o rosadas vistas al microscopio, habiendo fijado la
safranina como contracolor a sus paredes celulares.
Las bacterias aparecen de color azul, aunque el grado de absorcin del colorante por los
diferentes microorganismos es variable, y algunas estructuras como las esporas absorben el
colorante con dificultad son as fcilmente diferenciables.

Reactivos
- Solucin de Cristal Violeta(Cristal violeta= 1.0 g, Alcohol 95 = 20 ml, Agua destilada
csp=100 ml)
- Solucin de Lugol (Yodo en cristales, 1.0 g, Yoduro de potasio= 2.0 g, Agua destilada=
100 ml)
- Decolorante (Acetona= 50 ml, Etanol= 50 ml) Etanol comercial
- Safranina ( Safranina= 0.25 g, Alcohol 95= 10 ml, Agua destilada csp=100 ml)

Procedimiento
- Coloque una asada de caldo nutritivo que contiene una mezcla de bacterias Grampositivas
y Gramnegativas sobre una lmina portaobjeto limpia.
- Deje secar a temperatura ambiente o pasando por la llama suavemente para obtener la
fijacin del frotis, con la finalidad de que el material no sea arrastrado durante el proceso
de tincin.
- Colocar el preparado sobre un soporte de tincin y cubrir la superficie con solucin de
cristal violeta por 1 minuto. Lavar bien con agua de cao.
- Cubrir el preparado con Iodo de Gram durante 1 minuto. Lavar con agua.
- Sostener el portaobjeto entre el pulgar y el ndice y baar la superficie con unas gotas del
decolorante acetona-alcohol hasta no arrastrar ms colorante violeta. Se requiere unos 10
segundos ms o menos. Tambin puede utilizar etanol comercial como decolorante , en
este caso dar ms tiempo aproximadamente 1 minuto.
- Cubrir la superficie con la safranina durante 1 minuto. Lavar con agua de cao.
- Secar al aire, a temperatura ambiente.
- Observar al microscopio con lente de inmersin. (100X) y con aceite de inmersin.

Grafique la Observacin y Resultados

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MARCO TEORICO : TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS

1. ASPERGILLUS
A. CARACTERISTICAS MICROBIOLOGICAS

Caractersticas morfolgicas del hongo: tamao y forma de las cabezas conidiales, Morfologa de los
conidiforos, filides y metulas, y en la presencia de clulas de Hulle y de esclerocios. En la siguiente
figura se muestra las principales estructuras morfolgicas del gnero Aspergillus:

B. APLICACIONES INDUSTRIALES

En la produccin de enzimas que se emplean en la industria molinera y panadera:


ALFA y BETA-AMILASA.
El nombre de diastasas corresponde a un sinnimo de las amilasas, aunque se usa Principalmente
para designar la alfa-amilasa, que se extrae de cereales.
Origen de alfa-amilasa'. Fngico (Aspergillus oryzae), de cereales y del pncreas.

En la produccin de enzimas que se aplican en la industria de alimentos azucarados.

INVERTASA O SACARASA.
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Origen y accin'. La hidrlisis de la sacarosa en glucosa y fructosa (azcar invertido) puede ser realizada
por dos enzimas: la betafructosidasa, que acta sobre el extremo fructosa de la molcula de sacarosa,
y la alfa-glucosidasa, que la ataca por el extremo de la glucosa. Actualmente, se entiende generalmente
por "invertasa" la beta-fructosidasa, que es producida por levaduras (Sacaromyces cerevisiae,
Candida), mientras que la alfa-glucosidasa constituye preferentemente las invertasas intestinales y de
hongos (Aspergillus oryzae).Rango de pH: 4-6.

La aplicacin de enzimas en los detergentes


Las enzimas optimizan la eficiencia de los detergentes, a la vez que permiten el trabajo de limpieza a
bajas temperaturas y perodos ms cortos de lavado.
Las enzimas usadas en los detergentes de lavado de ropa actan sobre los materiales que constituyen
las manchas, facilitando la remocin de estos materiales y de forma ms efectiva que los detergentes
convencionales.

Lipasas: Las lipasas deben mezclarse con los lpidos para romperlos por hidrlisis, pero las
lipasas son solubles en agua y los lpidos son insolubles en agua. Por lo tanto, la hidrlisis slo
ocurre en la interfase entre la gota lipdica y la fase acuosa, lo que causa que la reaccin sea
relativamente lenta e inefectiva. Se busca desarrollar lipasas que permitan la remocin de manchas
de grasas a bajas temperaturas de lavado. Una combinacin de bsqueda y manipulacin gentica
ha conducido a la introduccin reciente de lipasas en los jabones en polvo. Un ejemplo es la lipasa
Hamicola , que se logr producir en Aspergillus otyzae y que se conoce como "Lipolasa".

Preparativos de celulasas comerciales y aplicaciones en procesos extractivos Extraccin de


aceite. El uso de algunos preparados celulolticos en el proceso de extraccin ha tenido un efecto
positivo sobre el rendimiento de la extractabilidad del aceite. El efecto de un preparado enzimtico
producido por Aspergillus fumigatus fue evaluado sobre la extraccin del aceite de soya. En condiciones
ptimas, el contenido de aceite de soya extrable (24.9 % en base seca) y el porcentaje de recuperacin
del aceite de soya (99 %).

El efecto de una enzima cruda obtenida de Aspergillus fumigatus, con actividad mixta principalmente
celulasa, hemicelulasa, quitinasa, xilanasa, pectinasa y proteasa; sobre el rendimiento en la extraccin
de aceite a partir de las semillas de ajonjol, de cacahuate y de girasol. Los niveles de porcentaje de
aceite extrado fueron de 51.4 a 56.7 % para el aceite de ajonjol, de 51.0 a 53.2 % en el caso del aceite
de cacahuate y de 55.3 a 57.1 %

Extraccin de colorantes. La extraccin de colorantes es otra aplicacin atribuida a algunos


preparados enzimticos.
Extraccin de antioxidantes con preparados enzimticos con actividades mixtasmixtas
El preparado enzimtico comercial Grindamyl pectinasa, con actividad mixta principalmente
pectinasa, pero ambin celulasa y hemicelulasa, producido por Aspergillus niger, no slo fue efectivo al
aumentar la extraccin de los fenoles debido a la degradacin de los polisacridos
(celulosa,.hemicelulosa y pectina) que constituyen la pared celular de la cascara de uva, sino que
mejor tambin la actividad antioxidante de los extractos fenlicos

2. PENICILLIUM
Las especies de Penicillium son reconocidas por su denso cepillar como las estructuras de la espora-
cojinete.
Los conidiforos son simples o ramificados y son terminados por los racimos de fales en forma de
botella.
Las esporas (conidios) se producen en cadenas secas de las extremidades de los fialides, con la espora
ms joven en la base de la cadena, y son casi siempre verdes.

23
La ramificacin es una caracterstica importante para identificar especie del penicillium. Algunos son no
ramificados y llevan simplemente un racimo.de fialides en la tapa del estpite. Otros pueden tener un
racimo de ramas, cada cojinete un racimo de fialides. Un tercer tipo tiene ramas el llevar de una segunda
pedido de ramas, llevando alternadamente un racimo de fialides. Estos tres tipos de sistemas del cojinete
de la espora (penicilli) se llaman monoverticillate, biverticillate y terverticillate respectivamente.
Colonias de crecimiento rpido, vellosas, aterciopeladas, verdosas con una corona radial ancha y blanca,
a 25 C (no crecen o crecen pobremente a 37 C) (Figura 66). Puede haber gotas de exudado sobre la
superficie de la colonia. Reverso habitualmente amarillento o cremoso. Esporulacin abundante. Olor
aromtico, especiado o afrutado (a manzanao a pina).

ECOLOGIA
El Penicillium es gnero grande y difcil encontrado casi por todas partes, y generalmente el gnero ms
abundante de hongos en suelos. La ocurrencia comn de la especie del Penicillium en alimento es un
problema particular. Unas ciertas especies producen las toxinas y pueden hacer el alimento no comestible
o an peligroso. Es una buena prctica desechar los alimentos que demuestran el desarrollo de cualquier
moho.
Se le encuentra en el polvo domstico, en los edificios hmedos y mohosos donde deteriora diferentes
materiales de construccin, entre los que resaltan el papel de decoracin (crece bien en la cola empleada
para su adhesin a las paredes). No muestra una notable variacin estacional. Las mximas
concentraciones de conidios en el aire se alcanzan en invierno y primavera (mayores en las reas urbanas
que en las rurales).

APLICACIONES DEL PENICILLLIUM


Por otra parte unas ciertas especies de Penicillium son beneficiosas a los seres humanos. Los quesos tales
como Roquefort, Brie, camembert, Stilton, etc. se maduran con la especie de Penicillium y son
absolutamente seguros de comer.
La cepa de Penicillium notatum aislada por A. Fleming produca 2 mg de penicilina por cada litro de
cultivo, posteriormente se encontr que otros Penicillium eran mejores productores de penicilina y se
eligi a Penicillium chrysogenum como cepa sper productora de este antibitico. Finalmente, la
seleccin de sucesivos mutantes sper productores y la mejora en las tcnicas de fermentacin realizadas
por la industria biotecnolgica han hecho que actualmente se obtengan 20 g/L de penicilina Se le emplea
en la produccin de algunos alcaloides como la roquefortina C, meleagrina y chrisogina.

Incluye las siguientes especies:


Penicillium bilaiae
> Penicillium camemberti, que es usado para producir los quesos camembert y brie.
> Penicillium candida, dem.
> Penicillium glaucum, que es usado para producir queso gorgonzola.
> Penicillium marneffei, que desarrolla una micosis sistmica emergente que afecta a roedores y
humanos, especialmente a personas inmunodeprimidas, conocida como penicilioisis
> Penicillium notatum, que es usado para producir la penicilina.
> Penicillium purpurogenum
> Penicillium roqueforti, que es usado para producir los quesos roquefort, danish blue y
recientemente tambin gorgonzola

3. RHYZOPUS

Las especies del Rhizopus son hongos filamentosos cosmopolitas encontrados en suelo, fruta que se
decae y las heces del vehculo, animales, y el viejo pan. En ciertas especies del Rhizopus son causas
ocasionales del zygomycosis (phycomycosis). Pueden causar infecciones serias (y a menudo fatales) en
seres humanos y animales debido a su tarifa de crecimiento rpida. En ciertas especies son patgeno de

24
la planta, y uno, oligosporus del Rhizopus, se utiliza en la produccin del tempeh, un alimento fermentado
derivado de las sojas.
Las especies del Rhizopus producen las esporas de dos diversas maneras. Los sporangiospores son el
interior producido a pinhead-como la estructura, el esporangio, y son gentico idnticos a su padre, los
zygospores se producen despus de que dos mycelia se fundan durante la reproduccin sexual, y dan
lugar a las colonias que pueden ser gentico diferentes de sus padres.

EL GNERO MUCOR
Se caracteriza por no formar estolones ni rizoides. Por estos motivos, sus especies invaden lentamente
los medios de cultivo.

EL GNERO RHYZOPUS
Posee estolones y rizoides, razn por la cual invaden rpidamente los medios de cultivo. En este Gnero
los esporangiforos nacen en los nudos de los estolones, o sea sobre los rizoides.

EL GENERO ABSIDIA
Los esporangiforos derivan internodalmente de segmentos de hifas entre rizoides.

APLICACIONES INDUSTRIALES
Importancia econmica, sntesis de productos industriales: produccin de cidos lctico, ctrico,
succnico, oxlico, etc. Y alimentos populares orientales: su-fu y tem-pe

Mucor racemosus: Se presenta en dos formas segn el medio en que se desarrolle. Una forma tpica o
filamentosa, en medios slidos y otra forma atpica o levaduriforme que por lo general aparece en los
medios lquidos y que es aprovechada en la industria para obtener etanol por fermentacin de mostos
azucarados, en cambio, la forma tpica se usa para obtener enzimas (amilasas).

Mucor rouxil: Hidroliza el almidn posteriormente y posteriormente fermenta los azcares formados
en la hidrlisis anterior produciendo etanol en forma lenta, por lo cual es conveniente sembrar una
levadura a las 24 horas de desarrollo de Mucor para facilitar la fermentacin alcohlica. Esto es en sntesis
lo que se conoce con el nombre de proceso amilo. La forma tpica se emplea para la fabricacin de
amilasas.
Rhyzopus nigricans: Es un hongo de bajo poder amiloltico, puede hidrolizar el almidn y producir
etanol, pero en menor proporcin que otras especies, por lo cual no se lo aplica en la industria de
fermentacin alcohlica, en cambio, en los ltimos aos se

25
IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL: TINCION Y MORFOLOGIA DE HONGOS

A. MATERIAL

Asa de kolle Lminas portaobjetos


Mechero Lminas cubreobjetos
Azul de lactofenol Microscopio

B. MATERIAL BIOLOGICO
Muestras de alimentos con hongos
Cultivo de Aspergillus niger
Cultivo de Penicillium

C. REACTIVOS

C.1. Azul de lactofenol.


Fenol 20 g Glicerol 40 ml
cido lctico 20 g Agua destilada 20 ml

Disolver los componentes antes mencionados y despus se agrega el colorante.


Se puede emplear cualquiera de los siguientes:
Azul de algodn 0.05g
Azul de metileno 0.05 g
Azul de cotton de Perrier 0.05 g

2. CULTIVOS

Se realiza el cultivo en Agar Sabauraud. Se deja a temperatura ambiente.


Las colonias sospechosas son aquellas que producen colonias de muy rpido crecimiento, son vellosas o
algodonosas y empujan la tapa de la placa Petri. Inicialmente son blancas pero cambian a gris, marrn o
negro con la madurez a medida que se forman esporas.

2.1. AGAR SABOURAUD

A. FUNDAMENTO
Es un medio recomendado para el aislamiento de hongos, particularmente a aquellos asociados a
infecciones dermatolgicas. Su bajo pH inhibe el desarrollo de muchas bacterias contaminantes que
pueden estar presentes en la muestra.

B. COMPOSICION

C. PREPARACION

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I. RESULTADOS

A. ASPEGILLUS NIGER

Caracteres Macroscpicos Caracteres Microscpicos



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B. ASPERGILLUS FUMIGATUS

Caracteres Macroscpicos Caracteres Microscpicos



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C. ASPEGILLUS FLAVUS

Caracteres Macroscpicos Caracteres Microscpicos



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D. PENICILLIUM

Caracteres Macroscpicos Caracteres Microscpicos



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a. RHYZOPUS

Caracteres Macroscpicos Caracteres Microscpicos



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b. MUCOR

Caracteres Macroscpicos Caracteres Microscpicos



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........................................................................................................ ........................................................................................................
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c. ABSIDIA

Caracteres Macroscpicos Caracteres Microscpicos



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V. CUESTIONARIO: COLORACION SIMPLE Y DIFERENCIAL

1. Qu es un colorante y cules son sus propiedades?

2. A qu se debe la afinidad que tiene un colorante por la bacteria?


3. De qu manera influye el pH en la coloracin?
4. Por qu es necesario utiliza mtodos de tincin para visualizar a las bacterias?
5. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de bacilos
6. Mencione 4 microorganismos que tengan la forma de espirales
7. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos grampositivos y explique
la funcin que cumple cada uno de ellos.
8. Dibuje los componentes de la pared celular de los microorganismos gramnegativos y explique
la funcin que cumple cada uno de ellos.
9. Explique el fundamento de la coloracin de Gram y esquematice.
10. A qu se denomina mordiente y mencione tres ejemplos?
11. Mencione tres razones por las que un microorganismo grampositivo se observa gramnegativo.
12. Mencione tres microorganismos (gnero) que sean cocos grampositivos, bacilos,
grampositivos, cocos gramnegativo y bacilos gramnegativos.

CUESTIONARIO: TINCIN Y MORFOLOGA DE HONGOS


1. Dibuje e indique las partes del Aspergyllus?
2. Mencione las enfermedades producidas por el gnero Aspergillus?
3. Mencione 4 diferencias entre cada especie de Aspergillus (Macroscpicas y microscpicas)?
4. Cmo diferencia el gnero Aspergillus del Penicilium?
5. Indique Ud. 4 aplicaciones del Aspergillus?
6. Indique Ud. 4 aplicaciones del Penicillium?
7. Dibuje e indique las partes del Penicillium?
8. Mencione Ud. Cules son las caractersticas macroscpicas del Penicillium?
9. Cules son los hongos que pertenecen a los Zygomycetes?
10. Dibuje e indique las partes de los Zygomycetes?
11. Indique Ud. Cules son las diferencias que permiten identificar un Mucor, Rhyzpopus y una
Absidia?
12. Mencione Ud. 5 aplicaciones Industriales de estos hongos?

VI. OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES

30
PRCTICA
EQUIPO Y MATERIAL DE LABORATORIO;
ACONDICIONAMIENTO Y ESTERILIZACIN

I. OBJETIVOS
1) Dar a conocer al estudiante las tcnicas para el acondicionamiento y esterilizacin de materiales y
equipos ms empleados en un laboratorio de microbiologa industrial.

2) Ejecutar con habilidad y destreza el acondicionamiento de materiales para el anlisis microbiolgico.

3) Justificar la importancia de los mtodos de esterilizacin para el control microbiolgico de los


alimentos.

II. MARCO TERICO


El acondicionamiento de los materiales as como la esterilizacin de los mismos es el primer paso en el
control microbiolgico de los alimentos, pues de l depender el xito del anlisis.

2.1.- METODOS DE ESTERILIZACION POR CALOR

El calor acta desnaturalizando y coagulando las protenas.

2.1.1.- ESTERILIZACIN POR CALOR SECO

Se requiere temperaturas elevadas y un periodo ms prolongado de calentamiento que la


esterilizacin con vapor. Su uso est limitado primariamente a la esterilizacin de material de vidrio
y aquellas sustancias que sean impermeables al vapor.

El mecanismo por el cual los organismos son destruidos se basa en los efectos letales del calor seco
debido a la desecacin en general, lesin por oxidacin y efectos txicos de los niveles de electrlitos.

En ausencia de agua, disminuye el nmero de grupos polares de la cadena peptdica y se requiere


ms energa para abrir las molculas, de all la aparente mayor estabilidad del organismo.

Se emplea el horno o estufa de esterilizacin, en la que se aplica una temperatura de 160-170C


durante 1 hora.

31
a) Flameo o Llama Directa. Consiste en exponer los materiales a esterilizar (asas y agujas de
kolhe, esptulas, pinzas, tijeras, etc.) al contacto de la llama de un mechero para eliminar
rpidamente los microorganismos del entorno; Ejemplo: mechero de Bunsen.

b) Aire Caliente. Para ello se utiliza un horno bacteriolgico u horno Pasteur, donde se esteriliza
el material a temperaturas de 170-180C por 2 horas. Es generalmente empleado para esterilizar
material de vidrio.

2.1.2 ESTERILIZACIN POR CALOR HMEDO

Se usa el vapor, tanto porque las bacterias se mueren ms rpidamente cuando se encuentran
hmedas como porque el vapor proporciona un medio de distribuir el calor uniformemente en todas
partes del recipiente de esterilizacin, el vapor debe conservarse a una presin de 1000g/cm3 sobre
la presin atmosfrica para obtener una temperatura de 121C. Se produce tambin rupturas de
cadena nica en el ADN, y la prdida de la viabilidad de las clulas expuestas a calor leve puede
correlacionarse con la introduccin de estas rupturas. La lesin de ADN parece ser enzimtica,
como resultado de activacin o liberacin de una nucleasa.

El calor produce tambin una prdida de la integridad funcional de la membrana y filtracin de


pequeas molculas y material absorbente de 260 nm. Este material es de origen ribosmico y
aparentemente es resultado de la degradacin de los ribosomas por ribonucleasas activadas por el
tratamiento con calor. Existe tambin degradacin del ARN ribosmico y la prdida de viabilidad
de las clulas expuestas a temperaturas elevadas.

a) Por Ebullicin. Se coloca el material a esterilizar en agua hirviendo (100C) por 15-35 minutos.

b) Vapor de agua sin Presin. Se coloca el material a esterilizar a la accin del vapor de agua y a
temperatura no mayor de 100C; para ello puede hacer uso del autoclave con la espita abierta.
Se utiliza para materiales termolbiles como es el caso de algunos medios de cultivo.

c) Vapor de agua con Presin. Se realiza en un autoclave a 15 libras de presin y 121C por 15-
20 minutos. Se emplea para esterilizar medios de cultivo y todos aquellos materiales que no
pueden esterilizarse por calor seco. Se puede usar; autoclave, pasteurizacin o tindalizacin.

c.1) Autoclave: es un equipo construido en acero inoxidable, de forma cilndrica, paredes


resistentes, puede ser horizontal o vertical; consta de:

Caldera de material resistente, fondo cncavo cubierta de una camisa metlica cilndrica.
Dispositivos para la instalacin de la fuente calorfica (gas, electricidad o vapor de agua).
Orificios superiores para purga de gases de combustin.
Tapa con vlvula de seguridad, espita, manmetro.
Canastilla para colocar el material a esterilizar.

2.2 ESTERILIZACIN POR FILTRACIN

Consiste en hacer pasar las sustancias lquidas o gaseosas a esterilizar a travs de membranas porosas
que retienen a los microorganismos; sirve para la esterilizacin de sustancias termolbiles. El
material filtrante puede ser de porcelana, tierras de infusorios, acetato de celulosa, etc.

2.3 ESTERILIZACIN POR RADIACIN ULTRAVIOLETA


32
Poseen efectos letales y mutagnicos en las bacterias presentando su mayor efectividad como agente
bactericida en la regin espectral de alrededor de los 260 nm. de longitud de onda, ste mtodo
presenta muchas dificultades tcnicas.

III. MATERIALES Y EQUIPO


- Material de vidrio: pipetas, palcas Petri
- Erlenmeyer, tubos de ensayo
- Papel craff, algodn, gasa, tijeras
- Mechero de Bunsen
- Horno Pasteur de aire caliente
- Autoclave

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL


4.1 PREPARACIN DE MATERIAL A ESTERILIZAR

a) Preparacin de tubos matraces

- Los tubos, matraces y frascos antes de su esterilizacin deben llevar sus tapones de algodn
respectivamente, los cuales deben cerrar suavemente no muy flojos ni apretados, ni largos
ni cortos, preparados segn el mtodo siguiente:
- De acuerdo al tapn a confeccionar se toma el pedazo convenientemente de algodn de
fibra, extendida, rectangular
- Practicar un dobles de 1/3 a lo largo de la fibra.
- Enrollar de un extremo, presionando sobre si mismo hasta completar toda la longitud.
- Rotar con los dedos el trozo confeccionado aplastando para drsele la forma de cono
truncado, con el dimetro a la medida del recipiente a taponar, el tapn debe entrar en el
recipiente hasta la mitad, y el otro medio quedar fuera. Se pueden preparar los tapones
envueltos en gasa para evitar el hilachamiento.

Tubos de Ensayo
- Formar un paquete de tubos de ensayo taponados, empaquetarlos con papel kraft y
amarrarlos, en su defecto se le envuelve con papel slo la zona de las bocas.

Frascos y Matraces
- Los frascos y matraces se taponan con algodn, se cubre con papel kraft y se amarra con
hilo pabilo.
- Colocar el nombre del medio de cultivo
- Rotular la fecha de preparacin.

b) Preparacin para proteger las pipetas


- En el extremo de succin de cada pipeta introducir una porcin de algodn con auxilio de
una aguja o puntero delgado, evitando que quede muy ajustado.
- Cortar tiras largas de papel kraft de unos 3 cm. de ancho, y colocar uno de sus extremos,
en una de las puntas del papel envolver la punta de la pipeta en forma oblicua y envolver
toda la longitud de la pipeta girndose en espiral en forma ajustada y en la parte terminal
de la boquilla se remata con una torsin para protegerla y se rompe el resto de papel
sobrante.
- Anotar con un lpiz la medida de la pipeta y la fecha de su esterilizacin.

c) Preparacin de las placas Petri


33
- Cortar papel kraft tamao adecuado para cubrir ntegramente las placas petri completas.
- Con la parte brillante del papel hacia fuera se envuelve la placa ponindose esta en el centro,
se envuelve la placa tomndose dos extremos opuestos del papel, dndose una vuelta
alrededor de ella, los otros dos extremos del papel se doblan en tringulos, rematndose
con un fuerte dobles hacia el dorso de la placa, dndosele una apariencia de paquete de
regalo.

4.2 ESTERILIZACIN CON CALOR SECO

El procedimiento de esterilizacin por aire caliente slo se puede emplear con utensilios de vidrio
o metal.

a) Procedimiento para la esterilizacin en horno


- Ponga el termostato a l75C y encienda el horno.
- Si hay un ventilador verifique que est funcionando.
- Vigile el termmetro. Cuando la temperatura llegue a l75C. sgase calentando durante 60
minutos ms.
- Apague el horno. Espere a que la temperatura descienda hasta 60C. Abra la puerta del
horno.
- El papel empleado para envolver deber de haber tomado un color marrn oscuro, si el
color del papel es amarillo plido indicar que el horno no se ha calentado bastante. Si el
papel se ha ennegrecido indicar que el horno se ha calentado demasiado.

4.3 ESTERILIZACIN CON CALOR HMEDO

a) Procedimiento para la esterilizacin con autoclave


- Llene con agua el fondo de la autoclave (hasta el soporte de la canasta). Cercirese que el
agua no toque la canasta. Elimine el exceso de agua abriendo la espita del drenaje.
- Introduzca en la autoclave la canasta con los materiales que se van a esterilizar, se pueden
aadir indicadores de la esterilizacin, como ciertas piezas de papel especial que ennegrecen
al lograrse la temperatura adecuada.
- Cierre la tapa de la autoclave, cerciorndose de que la arandela de goma se encuentra en su
surco. Atornille a niveles iguales los sujetadores de la tapa, con firmeza pero sin apretarlo
demasiado.
- Abrir la vlvula de salida del aire.
- Inicie el calentamiento de la autoclave.
- Vigile la salida de aire hasta que aparezca un chorro de vapor. Aguarde 3- 4 minutos hasta
que el chorro de vapor sea uniforme y continuo, esto indicar que todo el aire ha sido
expulsado de la autoclave.
- Cierre a continuacin la vlvula de salida del aire. Apritense los sujetadores de la tapa del
autoclave y reduzca la temperatura ligeramente.
- Cuando se obtenga la temperatura adecuada 120C se deber regular el calor para
conservarla. Y esperar por 15 minutos.
- Reduzca completamente el calor tan pronto como se cumpla el tiempo requerido.
- Cuando la temperatura descienda a menos de 80C abra la vlvula de salida de aire para
igualar las presione dentro y fuera del autoclave.
- Deje enfriar la autoclave y a continuacin retire cuidadosamente la canasta con los
utensilios estriles.

34
V. CUESTIONARIO

1. Qu mtodo de esterilizacin utiliz en la prctica, cite algunos ejemplos?

2. Cree usted que es importante acondicionar y esterilizar los materiales antes del control
microbiolgico, por qu?

3. Cite en forma ordenada cada uno de los pasos a seguir para poner en funcionamiento el
autoclave.

4. Compare la resistencia al calor de las clulas vegetativas con esporas bacterianas. Y explique a
que se debe tal diferencia.

5. Cite usted tipos de filtros empleados en el proceso de esterilizacin.

VI. OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES

35
PRCTICA
MEDIOS DE CULTIVO

I. OBJETIVOS

a. Identificar las diferentes condiciones de un medio de cultivo para que pueda llevarse a cabo un
crecimiento microbiano.
b. Describir los medios de cultivo ms empleados en bacteriologa.
c. Conocer las aplicaciones y utilidades de los medios de cultivo ms corrientes.
d. Saber manejar el material que se emplea en la elaboracin de cualquier medio de cultivo.

II. MARCO TEORICO

2.1 REQUERIMIENTOS NUTRICIONALES DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

El medio proporciona los elementos necesarios para el crecimiento microbiano. De acuerdo con
esto, siempre se requerir una fuente de energa y una fuente no energtica como son las sales,
factores de crecimiento, etc., que sin proporcionar energa son necesarias para su desarrollo.

2.1.1.- REQUERIMIENTOS ENERGTICOS DE LOS MICROORGANISMOS

A. FUENTES DE CARBONO
En la mayor parte de los casos, la fuente de carbono corresponde a azcares en forma de mono o
disacridos, como glucosa, lactosa, maltosas etc., e incluso hay microorganismos que pueden utilizar
azcares ms complejas para obtener energa., como es el caso del almidn.
Existen tambin bacterias capaces de utilizar el gas carbnico CO2 hecho que es caracterstico de
las bacterias fotosintetizantes y quimiolittrofas.
Otros microorganismos pueden crecer a expensas del metano, benceno e, incluso hidrocarburos
como fuente de energa: Ejemplo: Cladosporium.
Por ltimo, existen especies como Pseudomonas que pueden utilizar como fuente de energa un gran
nmero de componentes hidrocarbonados diferentes.

B. FUENTE DE NITROGENO
Pueden presentarse como protenas completas, que sera el caso de la gelatina o incluso protenas
an ms complejas, como es el caso de los extractos de carne, sales de amonio, o como peptonas
etc.
Es frecuente encontrar peptonas como fuente de nitrgeno que corresponden a pptidos o
polipptidos dependiendo de su complejidad pero en cualquier caso son tambin protenas que
estn parcialmente hidrolizadas, aunque no se las deba considerar como tal.
El bio-Thione, es una denominacin comercial correspondiente a una peptona ppsica de carne.
La casena en forma de peptona tripsica de casena se usa para estudiar la formacin de indol por
parte de la bacteria debido al alto contenido de triptfano que posee este tipo de peptona. Tambin
es utilizada para estudiar la reduccin de los nitratos e incluso para el cultivo de algunos protozoos.
36
La peptona papanica de soja, es una fuente de nitrgeno especialmente para hongos y ciertos
grmenes como Neisserias.
Otra fuente de nitrgeno serian: nitratos, nitrgeno orgnico, amoniaco, sales de amonio,
aminocidos, etc.

2.1.2. REQUERIMIENTOS NO ENERGTICOS DE LOS MICROROGANISMOS

A. FUENTE DE AZUFRE
Todos los microorganismos que utilizan en su metabolismo azufre lo hacen mayoritariamente en
forma de sulfatos, a veces en forma de tiosulfatos y en otras ocasiones lo pueden obtener a partir
de algn aminocido, ejemplo: metionina, cisterna, tiamina, etc.
Ejemplo de medios de cultivo: TSI, LIA, SIM, SS.

B. FUENTE DE FSFORO
En general, las bacterias que utilizan el fsforo lo suelen hacer en forma de fosfato.

C. IONES METLICOS
Son utilizados por las bacterias bajo la forma de iones a concentraciones muy bajas. Por ej: el Sodio,
el Potasio, Magnesio, Hierro, etc.
Tambin se encuentra otro tipo de iones metlicos Cobalto, Molibdeno.
Estos iones son esenciales para el crecimiento microbiano y dependiendo de su concentracin
pueden inhibir el crecimiento de otros, como el caso del sodio que a concentraciones altas inhibe
el crecimiento de un tipo de microorganismo y facilita el crecimiento de otros.
- Agar Manitol Salado, contiene 7.5% ClNa permite el crecimiento de Staphylococous.
- Agar Streptococus KF contiene 6.5% ClNa permite el crecimiento del Enterococus.

D. FACTORES DE CRECIMIENTO
Existen bacterias que an con los medios antes descritos no crecen o, si lo hacen, es muy
lentamente. A este tipo de bacterias les hace falta adems una serie de componentes definidos que
no son capaces de fabricar por s solas.
A este tipo de componentes se denomina factores de crecimiento y van a corresponder a algn tipo
de aminocido de bacterias muy exigentes o incluso vitaminas, bases pricas o pirimidinicas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:
- Agar sangre enriquecido con metionina, cido glutmico y cido nicotinico para el crecimiento
de Xanthomonas.
- El Agar Chocolate permite el desarrollo de colonias hmedas, lisas y grises del Haemophylus
influenzae. Este medio contiene hematina (factor X) y est enriquecido con otros cofactores,
como el NAD (factor V), que permite el desarrollo de este microorganismo.
- Agar Sangre enriquecido con Glicerol - papa (Bordet Gengou) para crecimiento de Bordetella
pertusis. Se observa colonias en gotas de mercurio brillantes es fcil de apreciar.
- Agar sangre enriquecido con nitrgeno suplementario y vitaminas del complejo B para el
crecimiento del Flavobacterium.

E. FACTORES INHIBIDORES
Son componentes que van a impedir el crecimiento de algn tipo de microorganismo por bloqueo
de sus procesos metablicos.
Los antibiticos son agentes inhibidores o destructores de la propia bacteria.
La azida sdica inhibe el crecimiento de los Gramnegativos.
Algunos colorantes: Eosina Azul de metileno impide el crecimiento bacteriano de los
Grampositivos.
Cristal Violeta impide el crecimiento de los Grampositivos.

37
Las sustancias inhibidoras son muy tiles para la identificacin y tipificacin de pruebas
bioqumicas de las bacterias.

Ejemplo de medios de cultivo y microorganismos:


Agar Mac Conkey: Las sales biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de las bacterias
Gramnegativas.
El medio EMB contiene Eosina y azul de metileno que son colorantes de anilina y van a inhibir
el crecimiento de los microorganismos Grarnpositivos, permitiendo el crecimiento de todas las
Enterobacterias.
Agar Salmonella Shigella contiene una alta concentracin de sales biliares y citrato de sodio,
inhibe a todas las bacterias Grampositivas y a muchas Gramnegativas incluyendo las coliformes.

2.3.- CONDICIONES QUE HA DE CUMPLIR UN MEDIO DE CULTIVO


Para que un microorganismo crezca en un medio de cultivo es necesario:
- Una composicin de nutrientes adecuada a las necesidades de ese microorganismo.
- Unas condiciones fsico-qumicas apropiadas. De acuerdo con ello, habra que considerar:
A. TEMPERATURA PTIMA
Los microorganismos, pueden clasificarse en una de las cinco categoras siguientes en funcin de los
rangos de temperatura de crecimiento.
- Los psicrfilos crecen bien a 0C y tienen una temperatura ptima o inferior, la mxima es de 20C.
Se aslan del rtico y Antrtico. Pueden crecer a 0C, aunque su temperatura ptima sea 20 a 30C
y la mxima de casi 35C. Las bacterias y los hongos responsables de la putrefaccin de alimentos
refrigerados.
- Los Mesfilos, crecen a una temperatura ptima de 20 a 45C, siendo la mnima de 15 a 20C y la
mxima de casi 45C. La mayora de los microorganismos pertenecen a esta categora. Las bacterias
patgenas para el hombre suelen crecer a una temperatura ptima de 37C.
- Los termfilos, pueden crecer a una temperatura de 55C o superiores. La temperatura mnima es
normalmente de 45C y la ptima es de 55 a 65C. Microorganismos que crecen en fardos de heno,
tuberas de agua caliente, aguas termales.
- Los Hipertermfilos, temperatura ptima de entre 80C y casi 113C, no crecen por debajo de
55C. Microorganismos aislados en zonas calientes del suelo marino.

RANGOS DE TEMPERATURA PARA EL CRECIMIENTO MICROBIANO


Temperaturas cardinales (C)
Microorganismo
Mnima ptima Mxima
Bacillus psichrophilus -10 23-24 28-30
Microcococcus cryophilus -4 10 24
Pseudomona fluorescens 4 25-30 40
Staphylococcus aureus 6.5 30-37 46
Enterococcus faecalis 0 37 44
Escherichia coli 10 37 45
Neisseria gonorrhoeae 30 35-36 38
Thermoplasma acidophilum 45 59 62
Bacillus stearthermophilus 30 60-65 75
Sulfolobus acidocaldarius 60 80 85
Pyrococcus abyssi 67 96 102
Pyrodictium occultum 82 105 110
Pvrolobus fumarii 90 106 113
Candida scotti 0 4-15 15
Saccharomyces cerevisiae 1-3 28 40
Mucor pusillus 21-23 45-50 50-58

B. GRADO DE HUMEDAD
Va a corresponder a la cantidad de agua que va a necesitar la bacteria para su crecimiento.
En general, cualquier medio slido o lquido requiere cierta proporcin de agua.
38
En medios sin agua es muy difcil el crecimiento bacteriano: de ah que la liofilizacin y cualquier
mtodo de deshidratacin, sea un buen medio de conservacin.

C. pH
Cada especie tiene un rango definido de pH para su crecimiento y un pH ptimo de crecimiento.
- Los acidfilos tienen un valor de pH ptimo de crecimiento entre 0 y 5.5.
- Los neutrfilos, entre 5.5 y 8.0
- Los alcalfilos prefieren un rango de pH entre 8.5 y 11.5
La mayora de las bacterias y protozoos son neutrfilos.
La mayora de hongos prefieren medios ligeramente cidos, con valores de pH de 4 a 6.
Variaciones intensas en el pH pueden daar a los microorganismos alterando la membrana plasmtica
o inhibiendo la actividad de las enzimas y las protenas transportadoras.
El pH ptimo en la mayora de los casos es cercano a la neutralidad.
Los tiobacilos pueden crecer mejor a pH muy cido, a pH prximo a 0.
Los bacilos ureasa positivo tal como Proteus crece a pH cercano a 8.
El Vibrio Cholerae crece bien a pH 9.
En un medio de cultivo pueden aparecer variaciones de pH como consecuencia de los metabolitos
que se producen por la degradacin de los nutrientes por parte de las bacterias. Es tpico que en la
fermentacin glucdica se produzca acidificacin del medio o en la degradacin proteica utilizando la
bacteria sales amnicas como fuente de energa se alcalinice el medio.
Siempre es necesario tamponar el medio de cultivo, al menos al comienzo para mantener el pH dentro
de los lmites fisiolgicos.

EFECTOS DEL PH EN EL CRECIMIENTO MICROBIANO

Lmite Lmite
Microorganismo pH ptimo
inferior superior
Picrophilus oshimae 0 0.7 SD
Thiobacillus thiooxidans 0.5 2.0-3.5 6.0
Sulfolobus acidocaldarius 1.0 2.5 4.0
Lactobacillus acidophilus 4.0-4.6 5.8-6.6 6.8
Staphylococcus aureus 4.2 7.0-7.5 9.3
Proteus vulgaris 4.4 6.0-7.0 8.4
Escherichia coli 4.4 6.0-7.0 9.0
Clostridium sporogenes 5.5-5.8 6.0-7.6 8.5-9.0
Pseudomonas aeuriginosa 5.6 6.6-7.0 8.0
Nitrosomonas 7.0-7.6 8.0-8.8 9.4
Bacillus pasteurii 8.5 SD SD
Bacillus alcalophilus 8.5 10.6 11.5

D. PRESIN OSMTICA
Se suele trabajar en condiciones de isotonia (300 miliosmoles) aunque existen muchas bacterias que
pueden crecer a concentraciones algo superiores.
Las bacterias pueden mantenerse vivas y crecer en medios muy acuosos e hipotnicos; este hecho es
debido a su pared rgida que permite que el agua no penetre en la bacteria y sta se rompa.
En las bacterias halfilas, su crecimiento so produce especialmente a concentraciones muy altas de
cloruro sdico; Ej: Staphylococus.
Como la concentracin osmtica de un hbitat tiene efectos tan marcados sobre los microorganismos,
es de gran utilidad expresar cuantitativamente el grado de disponibilidad del agua. Se emplea la
actividad de agua (aw).

Actividad del Agua Ambiente Microorganismo

39
1.00 (agua pura) Sangre Mayora de Gramnegativos
no halfilos
0.95 Pan Bacilos Grampositivos, Basidiomycetes
0.90 Jamn Cocos, Bacillus, Fusarium, Mucor, Rhizopus
0.85 Salami Staphylococus, Saccharomyces
0.80 Conservas Penicillum
0.75 Lagos salados Halobacterium, Aspergillus
Pescado salado Actinospora
0.70 Cereales, dulces Aspergillus
0.60 Chocolate Saccharomyces
Leche Xeromyces
deshidratada

E. CONCENTRACION DE OXGENO
Un organismo que puede crecer en presencia de oxgeno atmosfrico es AEROBIO, mientras que
otro puede crecer en su ausencia, es ANAEROBIO.
Los ANAEROBIOS FACULTATIVOS no precisan de Oxigeno para crecer, pero lo hacen mejor
en su presencia.
Los ANAEROBIOS AEROTOLERANTES como Enterococcus faecalis pueden crecer bien tanto
en su presencia como en su ausencia.
Por el contrario los ANAEROBIOS ESTRICTOS U OBLIGADOS, ejemplo: Bacteroides.
Fusobacterium, Clostridium, no toleran en absoluto el oxigeno y mueren en su presencia.
Los anaerobios tolerantes y los estrictos no pueden producir energa mediante la respiracin aerobia
y deben utilizar vas de fermentacin o respiracin anaerobia para este objetivo.
Finalmente existen unos pocos microorganismos como el Campylobacter, que son
MICROAEROFILOS que son daados por el nivel de oxigeno atmosfrico 20% precisando para
su crecimiento niveles del 2 al 10% de Oxgeno.

2.3.- PRINCIPALES TIPOS DE MEDIOS DE CULTIVO

Existen muchos tipos distintos de medios de cultivo, as como diferentes clasificaciones. De acuerdo
con esto y segn criterios se podran dividir en:

2.3.1.-MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU PROPORCIN EN AGUA

A. MEDIOS SLIDOS
Corresponden a aquellos medios donde la proporcin en agar est siempre por encima del 15%.
La importancia, de los medios slidos es muy grande, pues permite el aislamiento, purificacin y
visualizacin del crecimiento en colonias, as como su posible identificacin a travs de medios
especficos y diferenciales de caracteres, slidos elaboracin de antibiogramas, etc.
Ejemplo de medios de cultivo:
- Agar Mac Conkey, permite el crecimiento de microorganismos Gramnegativos.
- Agar EMB, permite el crecimiento de coliformes.
- Agar Chapman, permite el crecimiento de Staphylococcus.
- Agar Sabouraud, permite el crecimiento de hongos.
- Agar Nutritivo, permite el estudio de la morfologa de las colonias.

B. MEDIOS LQUIDOS
Tambin denominados caldos, no contienen agar. Son de gran utilidad para la realizacin de recuentos
bacteriolgicos por turbidimetra, especialmente til en levaduras, para la realizacin de inculos, para
obtener metabolitos primarios o secundarios, de los microorganismos como: antibiticos, cidos
lcticos, etc.
40
Ejemplo de medios de cultivo:
- Caldo MRVP, para investigar la ruta utilizada en la degradacin de glucosa.
- Caldo Peptona, para investigar la produccin de Indol.
- Caldo Lactosado, para investigar la formacin de cido y gas
- Caldo BHI, permite el crecimiento de microorganismos considerados difciles de cultivar.
C. MEDIOS SEMISLIDOS
Son medios intermedios entre los lquidos y los slidos; su proporcin en agar suele ser inferior al 5%
pero siempre presentan una cierta cantidad que le proporcione consistencia semislida. Son tiles
para algunas pruebas bioqumicas:
- Agar SIM, estudiar movilidad, produccin de H2S, Indol.
- Agar MIO, estudiar movilidad, produccin de Indol y Ornitina.

2.3.2.- MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU USO O UTILIZACIN

A. MEDIOS PARA AISLAMIENTO


Son medios con la particularidad de poder obtener a partir de ellos colonias aisladas. Estos, segn sea
su composicin, se pueden a su vez dividir en:
A.1. MEDIOS ENRIQUECIDOS
Son medios a los cuales, como su nombre indica, se les aade adems de los componentes bsicos,
uno o varios elementos, como por ejemplo casena soja, triptfano, etc., que facilitan el crecimiento
de algn tipo de microorganismo generalmente exigentes, lo que nos permite aislar el microorganismo
que buscamos.

A.2. MEDIOS SELECTIVOS


Son medios en cuya composicin presentan componentes que impiden el crecimiento de algn tipo
bacteriano.
- Medio Salmonella Shigella, contiene en su composicin sales biliares, citrato de sodio y el verde
brillante que inhibe a la flora Grampositiva y los hacen con el grupo coliforme.
A.3. MEDIOS DIFERENCIALES
Corresponden a aquellos medios que presentan las mismas propiedades que los medios selectivos, es
decir, tienen componentes que inhiben el crecimiento de algunas bacterias y, lo que es ms
caracterstico de este medio, presentan sustancias que al ser utilizadas, o no, por las bacterias que van
a crecer en dicho medio, dan una informacin suplementaria y especfica, es decir, diferencial; por
ejemplo:
- El medio Levine (EMB) este medio presenta en su composicin eosina y azul de metileno que
inhiben el crecimiento de los Grampositivos y algunas Gramnegativas, facilitando el crecimiento
de la enterobacterias, que segn utilicen o no la lactosa darn lugar a una coloracin caracterstica
para cada tipo de microorganismo.
Los medios diferenciales suelen ser tambin selectivos y se usan con fines de aislamiento e
identificacin.
- Agar TSI, que permite investigar si un microorganismo es capaz de utilizar la Glucosa, Lactosa y
Sacarosa, adems si puede producir H2S.
- Agar LIA, permite investigar si un microorganismo descarboxila o desamina el aminocido Lisina.
- Agar Citrato de Simmons, investiga si el microorganismo es capaz de utilizar el citrato como nica
fuente de carbono.

B. MEDIOS PARA CRECIMIENTO EN GENERAL


Son medios ya sea en forma lquida o slida que sirven para el cultivo de la mayor parte de las bacterias.
Su composicin va a corresponder a una fuente de carbono, una fuente de nitrgeno, sales y agua.
Dentro de los medios generales ms empleados tendramos el caldo comn, que est compuesto por
extracto de carne, peptona, glucosa, cloruro de sdico y agua.

41
C. MEDIOS DE MANTENIMIENTO DE CEPAS
Son medios que suelen tener los nutrientes necesarios para mantener a las cepas vivas durante
perodos de tiempo relativamente largos mantenindose tales medios generalmente a temperaturas lo
suficientemente bajas en cada caso como para impedir su crecimiento. Ejemplo, leche descremada
que congelada se utiliza a menudo para mantener cepas durante meses.

2.3.3.- MEDIOS DE CULTIVO SEGN SU COMPOSICIN


A. MEDIOS NATURALES
B. MEDIOS SEMISINTTICOS
C. MEDIOS SINTTICOS
D. MEDIOS COMPLEJOS

2.3.4.- MEDIOS DE CULTIVO SEGUN SU PRESENTACIN


A. MEDIOS DESHIDRATADOS O LIOFILIZADOS
B. MEDIOS YA PREPARADOS
C. MEDIOS SLIDOS EN PLACA PETRI
D. MEDIOS SLIDOS EN TUBO
D.1. Con Agar Inclinado
D.2. Con Agar Semi-Inclinado o Pico de Flauta
E. MEDIOS LQUIDOS EN TUBO

III. MATERIALES Y REACTIVOS

d. MATERIAL REQUERIDO
- Matraces 250 ml, 100 ml. 50 ml Probetas de 50ml, 100 ml. Baguetas. Balanza. Esptula.
Agua destilada. Placas Petri .Tubos de ensayo.

e. MEDIOS DE CULTIVO
- Agar nutritivo. Agar TSI. Agar Citrato de Simmons. Agar Mac Conkey
Agar Sabouraud. Agar LIA .

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

4.1. PREPARACIN
- Para la preparacin de medios de cultivo se usa agua destilada.
- El medio de cultivo a preparar debe ser pesado, segn la cantidad que est indicada en la
etiqueta del medio de cultivo.
- Agregar el medio de cultivo en el matraz, y aadir la mitad del volumen de agua que se
requiere, agitar suficientemente para conseguir una suspensin homognea, despus
incorporar el agua restante, aprovechando esta adicin para desprender e incorporar al
conjunto las partculas del medio de cultivo que hubieran quedado adheridas a la pared
interna del recipiente.
- Los medios nutritivos que contienen agar deben ser calentados para conseguir su disolucin.
- Para reconocer que se ha alcanzado una disolucin completa, al agitar no debe adherirse el
medio a la pared interna del recipiente; la solucin es viscosa y resbala libremente.
- Tapar el matraz con el tapn de algodn, envolver con papel Kraft y pabilos.

4.2. ESTERILIZACION
- Se esterilizar el medio de cultivo, ya disuelto en el autoclave en caso de ser necesario.
- El tiempo es de 15 minutos a 121C.

42
4.3. REPARTICION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO
- Debe verterse el medio de cultivo a una temperatura de 45-55C.
- Previamente hay que remover el medio de cultivo hacindolo oscilar en sentido circular su
recipiente para garantizar la homogeneidad del medio.
- Los tubos llenos con medios de cultivo esterilizado, todava lquido, se colocan en la
posicin deseada:
o Pico y Fondo o Pico de flauta o semi inclinado
o Pico o inclinado
o Fondo
o El medio de cultivo se deja solidificar en la posicin lograda.
- Repartir:
o En Placas (aproximadamente 16 a 20 ml) los siguientes medios de cultivo:
Agar nutritivo
Agar Mac Conkey
Agar EMB
Agar Sabouraud
o En Tubos: la posicin de pico y fondo (aproximadamente 4 ml)
Agar TSI
Agar LIA
o En Tubos: la posicin de pico (aproximadamente 2 a 3 ml)
Agar Citrato de Simmons
o En tubos: la posicin de Fondo (aproximadamente 3 ml)
Agar SIM

4.4. ALMACENAMIENTO
- Los medios de cultivo deshidratados debern conservarse en lugar seco, protegidos contra
la luz, a una temperatura de 15C a 30C, y en envases bien cerrados.
- Los medios de cultivo preparados, listos para su uso, tienen un slo tiempo limitado de
conservacin. Cuando no se indique otra cosa y bajo condiciones adecuadas de conservacin
es de varios meses. Se recomienda temperatura de 4 8C.
- Las placas Petri, preparadas con el medio de cultivo, debern pre encintarse con cinta
adhesiva su borde lateral, para impedir fugas entre el cuerpo de la placa y la tapa.

4.5. COMPOSICION Y PREPARACIN DE CADA UNO DE LOS MEDIOS


UTILIZADOS

AGAR NUTRITIVO
Composicin
Peptona, 17.0 g. Extracto de carne, 3.0 g. Cloruro de sodio, 5.0 g
Agar Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 m
Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________

Descripcin del Medio


Requerimiento Energtico
Fuente de carbono: ________________________
Fuente de nitrgeno: _______________________
Requerimiento no Energtico
Fuente de azufre: _________________________
Fuente de fsforo: ________________________
Iones metlicos: __________________________
43
Factores de crecimiento: ____________________
Factores de arranque: ______________________
Factores inhibidores: ______________________

Segn su proporcin en agua


_________________________________________________________

Segn su uso o utilizacin


_________________________________________________________

Segn la composicin
_________________________________________________________

Segn su presentacin
_________________________________________________________

AGAR MAC CONKEY


Composicin
Peptona de casena 17.0 g. Rojo neutro 0.03 g. Peptona de carne 3.0 g.
Cristal violeta 0.001 g. Lactosa 10.0 g. Sales biliares 1.5 g. Cloruro de sodio 5.0 g
Agar Agar 12.5 g. Agua destilada 1000 ml.

Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________

Descripcin del Medio


Requerimiento Energtico
Fuente de carbono: ________________________
Fuente de nitrgeno: _______________________
Requerimiento no Energtico
Fuente de azufre: _________________________
Fuente de fsforo: ________________________
Iones metlicos: __________________________
Factores de crecimiento: ____________________
Factores de arranque: ______________________
Factores inhibidores: _______________________

Segn su proporcin en agua


_________________________________________________________

Segn su uso o utilizacin


_________________________________________________________

Segn la composicin
_________________________________________________________

Segn su presentacin
_________________________________________________________
AGAR TSI
Composicin
Extracto de carne, citrato de amonio, 0.2 g. Extracto de levadura, 3.0 g. , peptona de sacarosa,
Tiosulfato de sodio, 0.3 g. Peptona, 20.0 g. Rojo de fenol, 24 mg., sacarosa,
44
Cloruro de sodio, 5.0 g. Lactosa, 10.0 g. Agar Agar, 12 g. Glucosa, 1.0 g
Agua destilada, 1000 ml

Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________

Descripcin del Medio


Requerimiento Energtico
Fuente de carbono: ________________________
Fuente de nitrgeno: _______________________
Requerimiento no Energtico
Fuente de azufre: ________________________
Fuente de fsforo: _______________________
Iones metlicos: _________________________
Factores de crecimiento: ___________________
Factores de arranque: _____________________
Factores inhibidores: _____________________
Segn su proporcin en agua
_________________________________________________________
Segn su uso o utilizacin
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________

MEDIO EMB.

Composicin
Fosfato dipotsico, 1.0 g. , 5.0 g. Sulfato de magnesio, 0.2 g, peptona, azul de metileno, lactosa,
sacarosa, caseina, Agar Agar, 12.5 g. Agua destilada, 1000 ml

Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________

Descripcin del Medio


Requerimiento Energtico
Fuente de carbono: ________________________
Fuente de nitrgeno: _______________________
Requerimiento no Energtico
Fuente de azufre: _________________________
Fuente de fsforo: ________________________
Iones metlicos: __________________________
Factores de crecimiento: ____________________
Factores de arranque: ______________________
Factores inhibidores: ______________________
Segn su proporcin en agua ___________________________________________
Segn su uso o utilizacin ___________________________________________
Segn la composicin _____________________________________________
Segn su presentacin. _____________________________________________

45
CALDO LURIA BERTANI (LB)
Composicin
Extracto de levadura,.. g. ,
Cloruro de sodio.. g.
Triptonag
Agua destilada. ml

Preparacin
_________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________

Descripcin del Medio


Requerimiento Energtico
Fuente de carbono: ________________________
Fuente de nitrgeno: _______________________
Requerimiento no Energtico
Fuente de azufre: ________________________
Fuente de fsforo: _______________________
Iones metlicos: _________________________
Factores de crecimiento: ___________________
Factores de arranque: _____________________
Factores inhibidores: _____________________
Segn su proporcin en agua
_________________________________________________________
Segn su uso o utilizacin
_________________________________________________________
Segn la composicin
_________________________________________________________
Segn su presentacin
_________________________________________________________

V. CUESTIONARIO

1. Defina Ud. los siguientes trminos y mencione 1 ejemplo de microorganismo: Aerobios obligados,
Anaerobio facultativo, Anaerobio aerotolerante, Anaerobio estricto, Microaerofilo.
2. Cules son las condiciones que debe reunir un medio de cultivo?
3. Cual es al funcin del agar-agar en los medios de cultivo?
4. Por qu es difcil para los microorganismos crecer en medios con valores bajos de aw?
5. A qu se denomina medio sinttico o definido? De 3 ejemplos.
6. Qu es un medio complejo?. De 3 ejemplos.
7. Qu es un medio selectivo?. De 3 ejemplos.
8. Qu es un medio diferencial?. De 3 ejemplos.
9. Realice una grfica donde se coloquen los rangos de temperatura para el crecimiento microbiano, y
clasifique en categoras diferentes segn los rangos de temperatura de su crecimiento (psicrfilos.
Psicrtrofos, mesfilos, termfilos, Hipertermfilos?
10. Con qu sustancias puede enriquecerse un medio de cultivo? Mencione por lo menos 4.
11. Qu es un medio de transporte y para qu sirve? De 2 ejemplos.
12. Qu medios diferenciales conoce? Qu utilidades tienen?
13. Qu es un medio selectivo y qu funcin tiene? Mencione por lo menos 3 y qu sustancias se le
agregan para que cumpla esa funcin?
14. Cmo pueden incubarse los microorganismos anaerobios estrictos?
15. Cmo pueden incubarse los microorganismos microaerfilos?
46
16. Para qu sirve utilizar un medio de cultivo semislido? Cmo se obtiene la consistencia del agar
blando?

VI. OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES

47
PRCTICA
SIEMBRA DE MICROORGANISMOS

I. OBJETIVOS

- Explicar los diferentes tipos de siembra que puedan realizarse.


- Saber llevar a cabo los diferentes mtodos de siembra e inoculaciones.
- Proporcionar los medios adecuados para que el alumno trabaje en condiciones de asepsia y
esterilidad.

II. MARCO TEORICO

Para poder estudiar los microorganismos, se necesita como requisito previo poder cultivarlos en
condiciones de laboratorio y, por tanto inicialmente deben ser aislados.

Para ello, se dispone de muestras, que muchas veces suelen presentar los siguientes problemas:
- Que no existe la cantidad suficiente de microorganismos que se busca.
- Que las muestras contengan varios tipos de microorganismos, pacte de los cuales son
contaminantes, hacindose necesario su aislamiento inicial para obtener cultivos puros.

2.1. SIEMBRA
Procedimiento que consiste en inocular a los microorganismos en medios de cultivo adecuados
para que se desarrollen y multipliquen, de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en
condiciones ptimas de temperatura y tiempo de inoculacin, puedan desarrollarse y
multiplicarse IN VITRO. Se siembra con dos finalidades:
a. Para hacer un aislamiento.
b. Para hacer un transplante.

AISLAMIENTO
Permite la separacin de los microorganismos al estado de pureza a partir de una muestra
problema. Se requiere un medio slido con gran superficie para que los microorganismos al
ser diseminados sobre el medio, generen su progenie (cepa) por formacin de colonias
separadas. Si se aslan especies distintas, cada colonia tendr caractersticas especiales, la
morfologa bacteriana ser tambin distintiva.

TRANSPLANTE
Significa la separacin previa de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo, que puede
ser lquido o slido.

Se conserva la cepa pura, y por subsiguientes transplantes en medios especiales, se logra


conocer las propiedades culturales y bioqumicas y como resultado la identificacin especfica.
Los trasplantes se pueden realizar:
1. De lquido a slido.
2. De lquido a lquido.
3. De slido a slido.
48
4. De slido a lquido.

2.2. MATERIAL DE SIEMBRA O INOCULACION


Existen los siguientes materiales:

ASAS DE SIEMBRA
El asa de siembra consiste de un alambre de Nichrome o platino, con una punta en asa o recta
y en el otro extremo insertado con un mango cilndrico para un uso sencillo.

Se utiliza para inoculacin o siembra por estra en medios slidos, presentan un arco bastante
cerrado en su extremo cuyo dimetro es ms o menos especfico es decir muchas asas son
calibradas y corresponden a un volumen determinado de siembra las ms utilizadas son las de
0,01 mililitro que se esterilizan por flameado.

HILOS DE PLATINO (ASA EN PUNTA)


Son similares a las asas con la diferencia de no presentar arco en su extremo, nicamente es un
hilo. Se utiliza para la siembra por picadura en medios semislidos y slidos.

ASAS DE DIGRASKY
Son asas de vidrio en forma de tringulo ms o menos abierto. Se utiliza para extender el
inculo lquido previamente adicionado en la placa, a travs de una pipeta pasteur. Se esteriliza
en autoclave, aunque generalmente se puede hacer empapando en alcohol y prendiendo la
llama hasta agotar el alcohol del asa.

HISOPOS
Se utiliza para la toma de muestras, para transportar muestras sin que esta sufra desecacin,
deterioro o contaminacin. Sirve para extender la muestra a travs del hisopo en el medio de
cultivo. Se suele comercializar ya estril listo para utilizar y desechables.

PIPETAS

49
Se pueden disponer de forma individual o en paquetes. Pueden ser de vidrio, reutilizables por
esterilizacin o de plstico, generalmente desechables. Pueden ser graduadas (contienen
volmenes especficos), en cuyo caso su aspiracin se realizar con aspiradores para pipeta tipo
pera o pipeta. La pipeta pasteur no contiene volmenes graduados son muy utilizados en
bacteriologa y cuya aspiracin se realiza con chupetes de goma. Tambin nos encontramos
con micropipetas utilizadas para la siembra de microlitros y mililitros en un determinado medio
de cultivo.

2.3. PREPAPACION DE INOCULOS


Un inculo corresponde a una cantidad suficiente y representativa de microorganismos
problema. As pues, se debe partir, por un lado, de un, cultivo puro y, por otro lado, de una
concentracin adecuada de microorganismos problema.

Si la muestra no es pura se aplicar distintos mtodos para el aislamiento mediante tcnicas


especficas, como es el caso de la siembra por estras en placa o por agotamiento, o la tcnica
de la placa invertida, que en general va a permitir el crecimiento ms o menos separado de los
microorganismos. Es muy til usar medios de cultivo enriquecidos especficos y diferenciales
que permitan el crecimiento del tipo de microorganismos concreto que buscamos. De esta
forma, una muestra natural que en principio no es pura puede ser aislada y desarrollada como
puro.

METODOS DE PREPARACION DE INOCULOS


Si la muestra es slida o semislida se tomar siempre con asa de siembra estril. Si la muestra
es lquida se tomar con pipeta graduada o pipeta pasteur estril en cantidad suficiente y, en
ambos casos se homogenizar

2.4. PREPARACIN DE INCULOS


Si la muestra es slida o semislida se tomara siempre con asa de siembra estril. Si la muestra
es lquida se tomar con pipeta graduada o pipera pasteur estril en cantidad suficiente, y en
ambos casos se homogenizar posteriormente en el medio especfico de cultivo.

Si la muestra tomada con asa de siembra estril se adiciona a un medio lquido se homogenizar
y se dejar crecer a la temperatura adecuada, que generalmente para organismos patgenos
coincidir con la temperatura corporal, dejndolos crecer aproximadamente 24 horas. En
ocasiones excepcionales se hace necesaria la utilizacin de un rotavapor para que el crecimiento
se establezca por igual en todo el medio lquido, aunque esto va a depender de su aplicacin
posterior y de la cantidad de inculo que se requiera.

Si la muestra se toma con asa de siembra estril y se adiciona en un medio de cultivo slido, se
utilizara diferentes tcnicas de siembra y posteriormente se verificar el cultivo, ej. siembra por
agotamiento.

Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y se adiciona a un medio liquido,
se homogenizar la mezcla inicial por agitacin y se dejar crecer a una temperatura de 37C
por 24 horas. Es importante que los inculos sean siempre jvenes.
Si la muestra se toma con pipeta graduada o pipeta pasteur y sta se aade a un medio slido,
se extender con el asa de Digrasky, previamente estril a travs de toda la placa incubndose
a a temperatura adecuada durante 24 horas. Se requieren tambin cultivos jvenes.

Los medios lquidos pueden ser agua destilada estril, solucin salina estril o caldo de cultivo
base.

50
A veces es necesario partir de un inculo con un nmero aproximados de microorganismos
problema. En estos casos, los inculos se establecen en medios lquidos y el nmero de
microorganismos se recuenta de forma aproximada, por comparacin de medios lquidos con
diferentes gradientes de turbidez. Este es el caso de la escala de Mc-Farland formada por una
batera de tubos cada uno de las cuales tiene distinta turbidez segn la concentracin de sulfato
brico. Cada tubo corresponder a una determinada concentracin de microorganismos.

2.5. METODOS DE INOCULACION O SIEMBRA (MTODOS DE AISLAMIENTO)


El paso de una muestra microbiana aun medio de cultivo, ya sea lquido o slido se denomina
siembra o inoculacin.
El paso de una muestra microbiana de un medio de cultivo a otro se denomina resiembra.
La siembra del inculo puede realizarse en medio slido o en medio lquido.

2.5.1. SIEMBRA DEL INCULO EN EL MEDIO SLIDO


Estas siembras pueden darse en placa o en tubo.

2.5.2. SIEMBRA DEL INCULO EN PLACA


Todo aislamiento implica el agotamiento de una muestra sobre la superficie del medio slido.
Se va descargando gradualmente el inculo, para que en los ltimos planos del medio queden
escasas clulas aisladas que en el ambiente nutritivo se irn multiplicando, logartmicamente
hasta formar colonias puras.
Los mtodos de aislamiento varan segn el dispositivo de siembra y la forma de distribuir el
inculo.
Cualquiera que sea el mtodo ensayado, aprovechando el mximo de superficie del medio se
logra el aislamiento de mayor nmero de cepas microbianas.

CLASES DE SIEMBRA
- Siembra por agotamiento o por estras.
- Siembra por difusin.
- Siembra por diseminacin.

a. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO: ESTRIA SIMPLE


Con el asa de siembra (previamente esterilizado por flameado) se construye una cantidad
adecuada de muestra problema depositando el inculo en uno de los extremos superiores de
la placa, a partir de aqu se realizar movimientos en zig - zag de un extremo a otro de la placa
no tomndose en ningn momento nuevos inculos y no levantndose el asa hasta concluir la
siembra en toda la placa.

- ESTRIA MLTIPLE
Se tomar la muestra problema con el asa de siembra previamente estril y dicho inculo se
depositar en el extremo superior de la placa, extendindose de un extremo a otro de sta solo
en la parte superior. Flameado el esa de platino y girando ligeramente dicha placa repetiremos
el proceso anterior que nos permitir arrastrar la muestra desde uno de los bordes donde qued
la muestra hasta el otro extremo superior de la placa. Se vuelve de nuevo a flamear el asas de
platino sin coger muestra como en el caso anterior y siguiendo la misma direccin se repite la
51
operacin hasta un total de cuatro o cinco veces, que son los que tienen cabida
aproximadamente en una placa, teniendo en cuenta que el ltimo tramo se efectuar hacia el
interior de la misma.
El resultado son colonias cada vez ms separadas como consecuencia de que cada vez que se
va arrastrando y separando ms la muestra. Es importante que para separar estas colonias se
realice en cada estra un flameado previo del asa de siembra.

- TECNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES


Con un rotulador para vidrio, en la base de la placa (reverso), se dibujan dos lneas
perpendiculares que debern cruzarse en el centro de la placa de tal forma que esta queda
dividida en cuatro cuadrantes iguales. Se tomar con el asa de siembra estril una cantidad de
inculo y se adicionar en el extremo superior de uno de los cuadrantes extendindose por
todo ese cuadrante en forma de zig - zag. Realizamos la misma operacin sin flamear el asa en
todos los dems cuadrantes siguiendo un orden de tal forma que iremos arrastrando el
microorganismo problema observndose en el ltimo cuadrante las colonias ms aisladas o
separadas.

- TECNICA DE LOS TRES GIROS


Se rotula la placa en forma anloga al caso anterior. Se toma inculo con el asa de platino y se
siembra por estra la mitad superior de la placa. Sin flamear el asa de platino giraremos la placa
unos 90 y volveremos a sembrar una segunda vez. As sucesivamente hasta completar toda la
siembre (girando de nuevo la placa 900) sta tcnica no es muy utilizada.

b. SIEMBRA POR DIFUSION (TCNICA DE BARRY)


En este mtodo, el medio de cultivo se mezcla con el inculo, al solidificar las colonias crecen
en diferentes niveles, los cuales servirn para contaje de colonias.

52
Para ello en el medio de cultivo previamente fundido (de 20 a 25 ml de medio a una
temperatura de 45 a 50C) en el tubo, en el tubo se adicionar la cantidad de inculo que oscila
entre 0,1 a 0,4 y se homogenizar la muestra en el tubo mediante el vibrador.

Una vez, constituida la muestra, se vierte sta en la placa Petri estril y se dejar solidificar, la
mezcla tambin se podra realizar en la misma placa Petri, aunque la homogenizacin en este
caso es ms difcil. Esta tcnica es utilizada, por ejemplo, para la determinacin de CMI
(concentracin mnima inhibitoria) de un antibitico frente a determinados microorganismos.

c. SIEMBRA POR DISEMINACIN (CON ASA DE DIGRASKY).


Consiste en adicionar al medio slido, un inculo que puede oscilar entre 0,2 y 1 ml segn los
casos con una pipeta graduada estril, y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky
tambin estril. Esta tcnica se puede utilizar para el recuento de clulas viables, antibogramas,
etc.

2.6. SIEMBRA DEL INCULO EN TUBO

a. SIEMBRA POR ESTRIA EN MEDIO SLIDO INCLINADO


Se toma con asa de siembra previamente esterilizada por flameado una cantidad de muestra
adecuada. Se aade al tubo desde el fondo de la superficie de sta realizando movimientos
ascendentes en zig - zag hasta completar toda la superficie del medio. Este mtodo es utilizado
para conservar cepas durante largos perodos, as como para la realizacin de ciertas pruebas
bioqumicas como la prueba de ureasa.

b. SIEMBRA POR PICADURA


Se suelen tomar con hilo de siembra aunque en algunas ocasiones tambin puede hacerse con
asa de siembra. Consiste en introducir el asa en el medio de cultivo que se encuentra en el tubo
hasta el fondo de esta y en posicin central. Esta tcnica se utiliza para la siembra de medios
de cultivo semislidos ej. medio de oxidacin - fermentacin de Hugh-Leiffson.

53
c. SIEMBRA POR PICADURA Y ESTRIA
Consiste en la utilizacin de las dos tcnicas anteriormente descritas. Este mtodo se lleva a
cabo cuando el medio es slido y est inclinado. Primero se realiza la siembra por picadura y
posteriormente la siembra por estra ej. prueba de medio KIA y la prueba en medio citrato
entre otras.

2.7. CULTIVOS PUROS: AISLAMIENTO EN PLACA Y TRANSFERENCIA


CELULARES

El empleo de microorganismos en Biotecnologa se fundamente en la obtencin de cultivos


puros, que estn constituidos por una nica especie microbiana. La mayora de las aplicaciones
en biotecnologa conlleve el uso de cultivos puros.

La mayora de los mtodos de obtencin de cultivos puros se basa en algn mtodo de dilucin.
El mtodo ms til y prctico es el aislamiento en placa, en el que un cultivo mezclado se
inocule y se extiende sobre la superficie de un medio de cultivo de modo que las clulas
individuales queden separadas una de otras. Cada clula aislada crece ahora para formar una
colonia y, por lo tanto, un cultivo (o clon) puro puesto que las clulas que componen la colonia
son la progenie de una nica clula original.

Existen varios mtodos para confirmar la pureza de un cultivo:

1. Repitiendo la operacin de aislamiento; una colonia aislada procedente de un aislamiento


en placa inicial debera dar lugar al repetir la operacin a colonias todas del mismo tipo, y
cuya morfologa concuerda con la del aislamiento inicial.
2. El examen microscpico de los organismos procedentes de una colonia deberan mostrar
un nico tipo celular. Los mtodos diferenciales de tincin Gram, son tiles pare
establecer que la colonia una mezcla de tipos microbianos diferentes.

Es necesario emplear una tcnica asptica para transferir los cultivos puros y para mantener la
esterilidad a los medios y soluciones. Trabajando aspticamente, el biotecnlogo tome
prudentemente las precauciones necesarias para prevenir la contaminacin o de las soluciones
con microorganismos no deseados.

54
III. MATERIALES Y EQUIPOS

Material de Vidrio Otros materiales


- Tubos de ensayo (16 x 125) (13 x 100) - Gradillas
- Placas petra - Mechero Bunsen
- Pipetas 1ml, 5ml, 10 ml - Asas de siembra
- Erlenmeyer - Algodn
- Pinzas
Equipos
- Estufa 37C
- Autoclave

Reactivo y Medios de cultivo


- Medios de cultivo
Agar Mc Conkey Agar TSI, LIA (tubos pico de flauta)
Agar nutritivo Agar SIM (tubos fondo)
Agar Saboraud Caldo SIM

IV. PROCEDIMIENTO DE MUESTRAS


4.1. SIEMBRA DE UNA MUESTRA LQUIDA CON EL ASA DE DIGRASKY
Muestra: Inculo de un cultivo puro
Medio de cultivo: Agar nutritivo
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________

4.2. SIEMBRA POR AGOTAMIENTO O AISLAMIENTO EN ESTRIA


Muestra: Microorganismos
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey
Medio de cultivo: Agar EMB
Medio de cultivo: Agar nutritivo
Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Propsito: Obtener colonias aisladas para observar sus caractersticas
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________

4.3. TCNICA DE LOS CUATRO CUADRANTES


Muestra: Muestra fermentada y de microorganismos
Medio de cultivo: Agar Sabouraud
Medio de cultivo: Agar Mac Conkey
Medio de cultivo: Agar EMB
Medio de cultivo: Agar nutritivo

Propsito: Obtener colonias aisladas para observar sus caractersticas


____________________________________________________________

55
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________

____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________

____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________

____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________
____________________________________________________________

V. CUESTIONARIO

1. Por qu razn no debes compartir el mechero de Bunsen?


2. Cul es la razn para flamear los tubos antes y despus de cada transferencia?
3. Por qu debes evitar el usar el pulgar para sostener las tapas durante una transferencia?
4. Explica por qu debes evitar que el asa llena de inculo toque la boca del tubo fuente o del tubo a
ser inoculado.
5. Cuando tomas un inculo de un tubo con agar inclinado. por qu es necesario tocar una parte
estril del agar con el asa antes de tocar el crecimiento bacteriano?
6. Por qu el asa debe ser flameada antes y despus de todos los procedimientos de siembra?
7. Por qu las placas de agar deben mantenerse invertidas durante la incubacin?

VI. OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES

56
PRCTICA
CARACTERSTICAS CULTURALES: MORFOLOGA DE
COLONIAS

I. OBJETIVOS

- Aprender las diferentes caractersticas de la morfologa colonial utilizadas en la identificacin de


bacterias.
- Estudiar caractersticas culturales de crecimiento de los microorganismos en medio slido
- Investigar las manifestaciones de crecimiento de los microorganismos en medio lquido

II. MARCO TERICO

GENERALIDADES:

Para estudiar las caractersticas de los microorganismos (forma, estructura, tamao, consistencia,
cromogenesis y otros), es necesario sembrarlos y cultivarlos en medios de cultivos apropiados segn el
tipo de microorganismo, de tal forma que proporcione los nutrientes necesarios para su crecimiento y
desarrollo. La siembra de microorganismos se realiza en medios slidos y lquidos.

Una colonia es una agrupacin de bacterias formada a partir de la reproduccin de una Unidad
Formadora de Colonia (UFC) sobre un medio slido; aunque vara de tamao generalmente es visible a
simple vista.
Una UFC puede ser un solo microorganismo o bien un grupo de microorganismos de una misma especie
como en el caso de bacterias que tienen tendencia a permanecer unidas como los estafilococos o los
estreptococos.
Las colonias bacterianas tienen una medida, forma, textura y en algunos casos color caractersticos, que
aunque puede variar de acuerdo al medio en que se encuentren, es constante bajo condiciones controladas
y depende de la especie bacteriana que la forme.
Debido a que las caractersticas de las colonias ocurren en varios grados y combinaciones dependiendo
de las bacterias y son a menudo muy uniformes, sirven para identificar bacterias en cultivos mezclados.
Sin embargo, adems de stas caractersticas se requiere tambin estudiar la fisiologa y propiedades
inmunolgicas de las bacterias para poder realizar una identificacin completa.
La morfologa colonial es comparable a una estadstica ya que se deriva de una clula individual pero es
la caracterstica de la masa celular. As pues, por ejemplo, la pigmentacin es aparente en la colonia, pero
no en la clula individual, en el caso de la consistencia mucosa de algunas colonias esta se deriva de la
sustancia capsular en aquellas bacterias con cpsula muy grande.
Medida de las colonias. sta caracterstica es bastante constante dentro de las especies y puede ir desde
colonias muy diminutas hasta un dimetro de varios milmetros.

Forma. Est determinada por su borde y su espesor. En las siguientes figuras se pueden observar varias
formas, elevaciones y bordes de colonias bacterianas.

57
Consistencia y textura. La consistencia de las colonias puede variar desde una colonia seca que puede
moverse sobre el agar con el asa, hasta una colonia viscosa que se pega al asa y forma filamentos o hilos
mucosos cuando se trata de separarla del agar..

La superficie puede ser uniformemente brillante y suave o puede ser estriada con muescas concntricas
o quebradas. Al examinar la colonia con luz transmitida puede aparecer con textura granular o amorfa.

Pigmentacin. Esta caracterstica es muy comn en las bacterias saprfitas en las que las colonias
aparecen rojas, anaranjadas, amarillas, etc. De los microorganismos patgenos uno de los pigmentados
ms importantes es Staphylococcus aureus que tiene un color amarillo dorado. El pigmento no se aprecia
en las clulas individuales a que se debe a grnulos intracelulares muy pequeos para verse con luz
transmitida.

III. MATERIALES Y EQUIPO

Se utilizarn las placas y tubos sembrados en la prctica anterior.


1 mechero Bunsen
2 asa bacteriolgica

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

TRMINOS DESCRIPTIVOS PARA LA MORFOLOGA DE COLONIAS EN LA


SUPERFICIE DE UN MEDIO SLIDO

58
SUPERFICIE

Lisa
Rugosa
Plegada

CONSISTENCIA (probarla con el asa)


Cremosa
Membranosa
COLOR
Se usan trminos comunes para definirlo y se especifica si el pigmento producido
Difusible o no.

CARACTERSTICAS PTICAS

LUZ TRANSMITIDA (observar a travs de la colonia)


Opaca: no permite el paso de luz
Traslcida: Deja pasar la luz sin permitir la completa visibilidad de los objetos
Observados a travs de la colonia.
Transparente: Deja pasar la luz permitiendo ver claramente los objetos observados a travs de la
colonia.
LUZ REFLEJADA (observar la superficie de la colonia)
Opaca
Brillante

CULTIVO EN CALDO
Al igual que en los medios slidos, en los medios lquidos las caractersticas de la
bacteria sembrada se reflejan en las caractersticas que presenta el caldo
Inoculado como son:
Turbidez: Opacidad ms o menos densa, signo de crecimiento.
Pelcula: Crecimiento casi contino sobre el lquido
Sedimento: Depsito de clulas en el fondo del tubo que se resuspende al agitar

Crecimiento en caldo Nutritivo


59
Crecimiento en medio semislido

PRESENTACIN DE RESULTADOS
Anote las caractersticas coloniales de cada cepa en la tabla, basndose en el Texto, las figuras:

AGAR EN SUPERFICIE
Bacteria

Forma

Borde

Elevacin

Superficie

Consistencia

Color

Luz
transmitida

Luz reflejada

MEDIO SEMISLIDO
60
Bacteria

Movilidad

IV. CUESTIONARIO

1. Qu mtodo utilizara para reconocer un cultivo para reconocer un cultivo puro, joven, injuriado y
envejecido.
2. Por qu algunos microorganismos de importancia industrial desarrollan en caldo una caracterstica
de forma de pelcula.
3. Cmo se visualiza el polisacrido extracelular y a qu bacteria puede corresponder?
4. Qu es la prueba de catalasa, cmo se realiza y qu utilidad tiene?
5. Cmo se interpretan los resultados de una prueba de fermentacin de hidratos de carbono?

V. OBSERVACIONES

VI. CONCLUSIONES

61
PRCTICA
CURVA DE CRECIMIENTO

I. INTRODUCCIN

Los cultivos bacterianos actan como suspensiones coloidales, absorbiendo y reflejando la luz que
incide sobre ellos. La turbidimetra mide la entidad de luz transmitida por la suspensin, mientras
que la medida de la luz difractada recibe el nombre de nefelometra. Por estos procedimientos se
puede estimar el nmero de bacterias en el cultivo, ya que, dentro de un rango, la luz absorbida o
difractada por una suspensin bacteriana es directamente proporcional a la concentracin de
clulas en el cultivo. El espectrofotmetro es el aparato que se utiliza para la medida de la luz
transmitida. Este aparato proporciona luz monocromtica por medio de un filtro que permite slo
el paso de la longitud de onda elegida. La cantidad de luz transmitida por una suspensin bacteriana
es medida por una clula fotoelctrica e inversamente proporcional a la cantidad de bacterias.
Normalmente la multiplicacin bacteriana no se expresa como disminucin de la luz transmitida
(transmitancia), sino como aumento de la luz absorbida (absorbancia), ya que esta ltima es
directamente proporcional al nmero de bacterias presentes en la suspensin. La relacin entre la
transmitancia y la absorbancia se expresa matemticamente de la siguiente manera:

Absorbancia = 2 - log % de transmitancia

Para la medida de la luz difractada se emplea e! nefelmetro.

Para el manejo prctico de los cultivos bacterianos en estudios de turbimetria es muy til el uso de
matraces con brazo lateral, ya que permite la realizacin de medidas sin necesidad de tomar
muestras del cultivo, evitando as el riesgo de contaminacin por la manipulacin.

II. OBJETIVOS

1) Determinar los principios generales en un crecimiento microbiano.


2) Realizar una curva de multiplicacin bacteriana.

III. FUNDAMENTO TERICO

Durante el crecimiento celular, todos los constituyentes de la clula aumentan en cantidad, en la


mayora de organismos el crecimiento continuo hasta que la clula se divide en dos nuevas clulas,
proceso denominado fisin binaria. Cada una de las clulas hijas recibe, un cromosoma completo,
copias de todas las macromolculas, monmeros e iones inorgnicos.

El intervalo para la formacin de dos clulas a partir de una se llama generacin y el tiempo
requerido para que esto ocurra se llama tiempo de generacin o tiempo de duplicacin,na entre los
microorganismos, algunos crecen rpidamente y se dividen en solo 20 a 30 minutos, otros requieren
de una a tres horas, otros de varias horas o incluso das.
62
3.1. CURVA DE CRECIMIENTO
Si se inocula un medio liquido con clulas microbianas, procedentes de un cultivo que ha
crecido a saturacin, en el que se ha determinado el nmero de clulas variables por minuto
peridicamente y trazamos una grfica de ello, se obtiene una curva de crecimiento. Esta
curva se divide en cuatro fases fundamentalmente y son las siguientes:
1. Fase de Rezago.- Llamado fase de adaptacin, los microorganismos se encuentran
desprovistos de metabolitos, enzimas y otros constituyentes que deben ser sintetizados
hasta alcanzar concentraciones que permitan que el crecimiento se reinicie.
2. Fase Exponencial.- Llamada fase logartmica, es consecuencia de la divisin celular y
las nuevas clulas crecen en progresin geomtrica, se sintetiza nuevo material celular a
velocidad constante aumentando la masa en forma exponencial.
3. Fase Estacionaria.- Los nutrimentos se agotan y se acumulan productos metablicos
txicos. Aqu cesa el crecimiento de una poblacin.
4. Fase de Declinacin.- Llamada fase de muerte celular en el cultivo, varia con el
microorganismo y condiciones de cultivo, la velocidad de mortalidad aumenta hasta
alcanzar un nivel sostenido.

Fases de Crecimiento
Latencia Exponencial Estacionaria Muerte
Rezago Logaritmo Nutrientes se agotan
Declinacin
Adaptacin Divisn celular Acumulan metabolitos txicos
Crecimiento Sesa crecimiento
1
9,0
Log 10 organismos

Turbidez 0,75
viables/ml

Densidad ptica
8,0 Viables (densidad ptica)

0,5
7,0

0,25
6,0

5,0 0,1
Tiempo

IV. PARTE EXPERIMENTAL


4.1 MATERIALES Y REACTIVOS
- Cubres
- Cultivo E. Coli sobre un slant de agar nutritivo
- Cubetas
- Caldo Luria Bertani estril o Caldo nutritivo
- Jeringa descartable de 10 cc.
- Contmetro

Equipo
- Mechero Bunsen
- Estufa de incubacin a 37C
- Microscopio
- Espectrofotmetro

63
V. METODOLOGIA
5.1. CRECIMIENTO EN MEDIO LQUIDO

Curva de Crecimiento.- Las clulas que estn creciendo en un cultivo discontinuo (en un
matraz en agitacin) normalmente experimentan cuatro diferentes estadios de crecimiento:
una fase de latencia (lag), una fase de crecimiento estacionado, y una fase de muerte. Las
clulas en fase de latencia, que proceden de una alcuota de un cultivo anterior que ha sido
transferida a un medio nuevo, no crecen en seguida.

Primero tienen que adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a crecer a un ritmo rpido.
La duracin de esta fase de latencia depende de numerosos factores: la edad y genotipo del
inculo, de la temperatura, de la concentracin en nutrientes del cultivo viejo y nuevo, de la
aireacin, y de la concentracin de toxinas que pueden haberse formado en el cultivo viejo.

Una vez que las clulas empiezan a crecer rpidamente, se dice que han entrado en la fase de
crecimiento logartmica (log) o exponencial. En este estadio las clulas crecen rpidamente,
y a diferencia de las clulas de las fases de latencia y estacionaria, la mayora de las clulas se
hallan en el mismo estado fisiolgico. La velocidad de crecimiento durante la fase log
depende del nivel de nutrientes y de la aireacin de cultivo. La constante de velocidad de
crecimiento (u) sirve para definir la velocidad de crecimiento de un cultivo durante un
crecimiento equilibrado: u = In2/g (g es el tiempo medio de duplicacin o tiempo de
generacin).

Conforme se consumen los nutrientes en un crecimiento discontinuo y se van acumulando


productos inhibitorios, la velocidad de crecimiento va disminuyendo, hasta llegar a detenerse
al llegar el cultivo a la fase estacionaria. En la fase estacionaria las clulas no estn todas en
el mismo estado fisiolgico; algunas todava se estn dividiendo mientras que otras ya han
comenzado a morirse. Pero la poblacin total se mantiene constante. Conforme se agota la
mayor parte de los nutrientes, el nmero de clulas que mueren sobrepasa al nmero de
clulas que se producen, y el cultivo entra en la fase de muerte.

Realizacin (Fig. 1)
(Todas las maniobras que se describen a continuacin se deben realizar en condiciones de
esterilidad en las proximidades del mechero.)
1. Aadir solucin salina estril al slant de E. coli hasta cubrirlo completamente (entre 2 y 3
mi) y resuspender las bacterias en la solucin salina por agitacin.
2. Tomar 0.5 ml de la suspensin bacteriana con una pipeta estril y aadirlos a un matraz
con 50 ml de Caldo nutritivo prparado por componentes, estril.
3. Incubar el matraz en un bao termostatado a 37 C, con agitacin (200 rpm).
4. Medir la absorbancia del cultivo a distintos tiempos (longitud de onda aconsejada: (540
nm). Ajustar el espectrofotmetro a 100 % de transmitancia con un tubo conteniendo
Caldo Nutritivo estril antes de cada medida.
5. Recoger alcuotas de 9 ml del cultivo cada 15 minutos de incubacin y colocadas en
refrigeracin hasta su lectura
6. Dibujar una curva de multiplicacin con los datos obtenidos, colocando en el eje de
abscisas los valores de tiempo y en el de ordenadas los de absorbancia.

64
VII. CUESTIONARIO:

1. Por qu se calibra el espectrofotmetro a 100% de transmitancia con medio de cultivo estril?


2. Por qu motivo puede ser de alguna forma til conocer la curva de multiplicacin de una
bacteria?
3. Identificar en la grfica las fases del desarrollo microbiano.
4. Proponer otra tcnica experimental de evaluacin del crecimiento microbiano.

65
VIII. OBSERVACIONES

IX. CONCLUSIONES

66
PRCTICA
CONTEO DE CLULAS MICROBIANAS

I. OBJETIVO
Determinar el recuento directo de clulas microbianas con la cmara de contaje celular.

II. FUNDAMENTO TERICO


Una suspensin celular se caracteriza por presentar un nmero de partculas microscpicas
dispersas en un fluido. Habitualmente ser necesario determinar tanto la densidad de las clulas en
la suspensin como el porcentaje de stas que son viables.

Para determinar la densidad de las clulas se emplean diferentes tcnicas, desde la relativamente
simple cmara de contaje celular de la que existen numerosas variantes, entre ellas la que empleamos
(cmara de Neubauer), hasta equipos automticos de contaje celular como el Cell Coulter.

Sin embargo, es posible determinar la densidad celular empleando mtodos ms sencillos. Nos
basta con una cmara de contaje celular, por ej. La cmara de Neubauer, y un microscopio. Una
cmara de contaje celular es un dispositivo en el que se coloca una muestra de la suspensin a
medir. El dispositivo presente unas seales que determina un volumen conocido (x microlitros).
Al contar bajo el microscopio el nmero de partculas presentes en ese volumen se pueden
determinar la densidad de partculas en la suspensin de origen.

La cmara de Neubauer es una cmara de contaje adaptada al microscopio de campo claro o al de


contraste de fases. Se trata de un portaobjetos con una depresin en el centro, en el fondo de la
cual se ha marcado con la ayuda de un diamante una cuadrcula como la que se ve en la imagen. Es
un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separacin entre dos lneas consecutivas de 0.25 mm. As pues
el rea sombreada y marcada L corresponde a 1 milmetro cuadrado. La depresin central del
cubreobjetos est hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se cubre con un
cubreobjetos ste dista de la superficie marcada 0.1 milmetro, y el volumen comprendido entre la
superficie L y el cubreobjetos es de 0.1 milmetro cbico, es decir 0.1 microlitro.

Si contamos las cuatro reas sombreada (L) observando un total de x clulas entre las cuatro reas,
la concentracin en la suspensin celular ser:

67
Concentracin en la suspensin (clulas / mL) == 10000 (x/4)

En la imagen puedes observar el aspecto de una de las regiones marcadas como L y que en el
microscopio se ven como una cuadrcula de 16 pequeos cuadrados de 0.25 milmetros de lado.
Esta imagen ha sido tomada empleando un microscopio invertido de contraste de fases.

Existen numerosos modelos de cmaras de contaje celular adaptadas a su uso en microscopa. En


la imagen puedes observar una cmara de Neubauer doble, como las que usas en el laboratorio de
prcticas.

El recuento directo al microscopio es tedioso, pero es una forma rpida de estimar la cantidad de
clulas microbianas, sin embargo, tiene algunas limitaciones:
1) No se distinguen las clulas muertas de las clulas vivas.
2) Las clulas pequeas son difciles de ver bajo el microscopio y posiblemente se omitan algunas
clulas.
3) La precisin es difcil de lograr
4) Se requiere un microscopio de contraste de fases cuando no se ha teido la muestra.
5) El mtodo no es adecuado para suspensiones de clulas de baja densidad. En el asa de bacterias,
en una suspensin de clulas con menos de 106 clulas por mililitro, se podran ver pocas o
ninguna bacteria.

III. MATERIALES Y REACTIVOS


- Cultivo de E. coli - Cultivo de levadura
- Matraz - Pipetas
- Cmara del Neubauer -Pipeta Pasteur
- Estufa - Microscopio

IV. METODOLOGA

CARGANDO LA CMARA
Agita la suspensin celular con el vrtex. Aspira una pequea cantidad de suspensin con
una pipeta Pasteur. Deposita una gota pequea en la superficie pulida de la cmara de
recuento cerca del extremo del cubre. La suspensin entrar en la cmara por capilaridad.
Una cmara adecuadamente llenada contiene clulas solo en el espacio contenido entre el
cubre y la cmara de recuento. No debera sobrar fluido que cayera en los surcos.

V. CUESTIONARIO

68
1.- Investigue las caractersticas de:
Cmara de cuenta de Petroff Hausser, equipos automticos de Contaje celular, Otros mtodos de
recuento celular
2.- Indique como diferencia las clulas viables de clulas totales.
3.- Describa los mtodos directos e indirectos de contaje celular.

VI. OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES

69
PRCTICA
AISLAMIENTO DE BACTERIAS POR EL MTODO DE
DILUCIN EN PLACA
I. OBJETIVOS

Aprender la tcnica de dilucin para el aislamiento y cuenta en placa de diferentes fuentes de inculo.

II. INTRODUCCIN

Dentro del grupo de recuentos microbianos a base de cultivos con formacin de colonias, la tcnica por
vaciado en placa es la ms utilizada. La muestra en cantidades conocidas se deposita en cajas petri estriles,
se adiciona el medio de cultivo fundido a una temperatura de 45C y se mezcla con la muestra.
Despus de la incubacin se cuentan las colonias desarrolladas las que multiplicadas por el inverso de la
dilucin que corresponda permite estimar el nmero de microorganismos viable por gramo o mL de
muestra, obviamente con las condiciones de prueba (medio de cultivo, condiciones fisicoqumicas y tipo
de colonias contadas), el recuento obtenido se referir a determinado grupo de microorganismos. Esta
tcnica permite la mayora de las veces cuantificar la contaminacin en alimentos, medicamentos.

SIEMBRA POR DISEMINACIN (CON ASA DE DIGRASKY).


Consiste en adicionar el medio slido, un inculo que puede oscilar entre 0,2 y 1 ml segn los casos con
una pipeta graduada estril, y posteriormente se extiende con el asa de Digrasky tambin estril. Esta
tcnica se puede utilizar para el recuento de clulas viables, antibogramas, etc.

TECNICA DE SIEMBRA POR DILUCION


Se dispondr de un batera de tubos con medio de cultivo especfico o agua estril segn los casos. Se
adicionar una cantidad de muestra liquida o slida en los tubos sabiendo la cantidad de muestra o inculo
que se aade en el tubo inicial. Se agitar hasta homogenizar. Con la pipeta estril se tomar una cantidad
exacta y se adiciona al segundo tubo, que se homogeniza. Repetimos la operacin anterior con el tercer
tubo y as sucesivamente hasta obtener la dilucin deseada. Con la dilucin obtenida por ej. l0 -4 y 10-5
inocular en placas de cultivo una cantidad exacta y extender con el asa de Digrasky previamente estril.
Incubar a temperatura ptima de 24 horas y posteriormente recontar. Existen muchas variaciones de este
mtodo. Una de ellas es hacerlo en medio de cultivo agar, donde se mezcla en los tubos la muestra y se
diluye hasta obtener la dilucin deseada; posteriormente son vertidos en placas y se le deja solidificar.

III. MATERIAL REACTIVOS

70
Tubos de rosca, Cloruro de sodio, Gradilla Agar nutritivo, Mechero, Juegos de tincin de Gram, Cajas
Petri, Pipetas de 1 y 10 ml, 1 probeta de 100 ml,
Material que deben traer los alumnos: masking-tape, algodn, gasa, alcohol.

IV. METODOLOGA

SIEMBRA POR DILUCION

Preparacin de reactivos y medio de cultivo:


Solucin isotnica: Pesar 0.09 g de NaCl y disolviendo en 100 ml de agua destilada
Agar nutritivo: Preparar 200 ml de medio siguiendo las indicaciones del reactivo.
Envolver cajas de Petri y pipetas..
Bajo condiciones estriles hacer las diluciones en la solucin isotnica estril, de acuerdo a la figura 1.
Tomar 0.1 ml de la dilucin 10-1, 10-2, 10-3, 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 y colocar en cajas de petri bajo condiciones
estriles. Inocular de la misma manera con las diluciones siguientes
Se realizar el conteo en placa por superficie.
Incubar las cajas en forma invertida a 30C, de 24 a 48 horas.
Considerar las siguientes reglas para la realizacin del reporte de la prctica:
Reglas para conteo en placa. Seleccionar aquellas placas donde aparezcan de 30 a 300 colonias, pues hay
menor error en el conteo.
Contar todas las colonias de la placa. Si el nmero se estima mayor de 300 y no hay diluciones
subsecuentes: 301-500 colonias se divide en dos partes y el nmero de colonias contadas se multiplica
por 2.
501-800 colonias se divide en cuatro partes y el nmero de colonias contadas se multiplica por 4.
>800 colonias se cuentan de 10 a 20 cuadros se promedia y se multiplica por el nmero de cuadros que
ocupa la caja.
El nmero de colonias contadas deber ser multiplicado por el inverso de la dilucin y considerar si la
tcnica fue por vertido o por superficie (debido al volumen de la muestra).
Redondear la cifra obtenida en el recuento de tal forma que haya dos dgitos al inicio de la cifra por
ejemplo: 129 se reporta 130, 2,417 se reporta 2400, 49 se reporta 49
Fig. 1

SIEMBRA EN PROFUNDIDAD

71
Preparar las muestras segn procedimientos recomendados para la preparacin y dilucin de muestras.
Pipetear a placas Petri estriles, alcuotas de 1 ml. A partir de las diluciones, dilucin 10-1, 10-2, 10-3, 10-4,
10-5, 10-6, 10-7.
Agregar inmediatamente a las placas Petri 15 ml de agar nutritivo licuado y temperado a 45C, mezclar
rpidamente con movimientos vaivn y rotacin de la placa; dejar solidificar.
Incubar las placas en posicin invertida a 37 C por 48 horas.
Efectuar el recuento de microorganismos segn:
a) Seleccionar dos placas correspondientes a una dilucin que contenga entre 30 y 300 colonias.
b) Tomar la media aritmtica de dos recuentos y multiplicar por el factor de dilucin utilizada. Reportar
el resultado como numero de m.o. aerobios mesofilos viables por gramo o mililitro, segn el caso
c) Si las placas de dos diluciones consecutivas presentan recuentos menores que 30 y mayores que 300,
tomar el promedio de los dos recuentos y computar el recuento para cada una de las diluciones y
establecer la relacin de los dos recuentos

V. RESULTADOS

Reportar el nmero de unidades formadoras de colonia/ml de muestra de TODOS LOS EQUIPOS


en una tabla con los resultados de todos los equipos y discutir.
Presentar descripcin de morfologa de colonias y microscpica.

VI. CUESTIONARIO

1. Indique la importancia de utilizar el mtodo de dilucin para el aislamiento de microorganismos.


2. Comparar el mtodo de dilucin con el de estra para el aislamiento de microorganismos.
3. Por qu el nmero de microorganismos es el resultado de multiplicar el nmero de colonias por
el inverso de la dilucin?
4. De los datos obtenidos en la prctica cules cree que sean congruentes y cules no y porque?
5. Por qu la incubacin se realiza con las placas en posicin invertida?
6. Qu finalidad tienen las diluciones y donde se requerirn ms diluciones, en muestra fresca o
procesada, por qu?

VII. OBSERVACIONES

VIII. CONCLUSIONES

72
PRCTICA
OBTENCIN DE CIDO ALGNICO A PARTIR DEL ALGA
Lessonia trabeculata

I. OBJETIVO
Aplicar tcnicas de extraccin de cido alguinio a partir de algas.
Aplicar tcnicas de purificacin de cido alguinio a partir de algas.

II. INTRODUCCIN.
Existen variedades de algas pardas que producen cido algnico, que es la base para producir alginato de Sodio,
Potasio, Calcio, etc. El alga Lessonia trabeculata, crece en grandes cantidades en las costas de Arequipa.

En el litoral sur peruano se encuentran tres especies de algas pardas, tales como: Macrocystis pyrifera,
sargazos Lessonia trabeculata (aracanto, palo) y Lessonia nigrescens (aracanto negra), en ambientes
inter y submareales. Existen dos modos de su aprovechamiento: a) por medio de la extraccin, y b)
mediante el recojo, colecta y acopio, por lo cual existen disposiciones normativas, que en resumen, en la
actualidad, prohben la actividad extractiva a nivel de todo el litoral peruano (RM N 839- 2008-
PRODUCE), y de otro lado, autorizan el recojo, colecta y acopio de algas varadas (RM N 264-2009-
PRODUCE).

III. MARCO TERICO

En las algas pardas, el cido algnico es uno de los principales constituyentes de las paredes celulares,
casi siempre se encuentra con otros polisacridos, como laminarina (5-30%), fucoidina (2-12%),
diferencindose de estas dos ltimas por la propiedad de insolubilidad en el agua y por encontrarse asociado con
varios cationes: calcio, magnesio y sodio. El cido algnico es un polisacrido, de frmula general: (C6H8O6)n,
donde n se repite de 80 a 83 veces., y compuesto de cido manurnico y cido gulurnico unidos con
enlaces -1,4, en su estado natural se encuentran formando geles con iones Ca+2, Na+, Mg+2, Sr+2 y Ba+

73
Fig Molculas constitutivas del cido algnico.

El cido algnico se solubiliza en medio alcalino (Na2CO3, NaOH) por intercambio inico, formndose alginato
de sodio, que es soluble y de fcil extraccin.
Al cido algnico y los alginatos son bastante higroscpicos y un secado completo es muy lento, presentando
una humedad de un 15-25%.
La viscosidad de una solucin de alginato es una propiedad que depende o deriva de su peso molecular del
polisacrido, y de la relacin de cido manurnico a cido gulurnico (M/G).

Material de Laboratorio:
Termmetro, vasos de precipitacin, probetas, telas de tocuyo, erlenmyers, fiolas, pH-metro, papeles filtrantes,
pipetas, embudos, etc.
Reactivos:
cido clorhdrico, carbonato de sodio anhidro, nitrato de plata, hipoclorito de sodio, etanol, etc.
Equipos:
Potencimetro, balanza analtica, estufa graduada para baja temperatura.

IV. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

1.- Pesar 20 gr de alga seca (tallos y hojas) y colocarla en un baln de vidrio de 2 litros, con suficiente
cantidad de agua destilada que cubra las algas. Se produce un hinchamiento de las hojas y ablandamiento
de los tallos, el lavado se repite varias veces para eliminar las sales solubles hasta que los lquidos no den
precipitado con solucin diluida de nitrato de plata.

2.- Para eliminar las impurezas, se hacen varios lavados con solucin 0,2 N de HCl, los cuales terminan
cuando el lquido del lavado no da turbidez con etanol.
As se transforman los alginatos en cido algnico (insoluble).
MCl HAlg HCl MAlg.
3.- Luego se corta la muestra en pequeos trozos, se agrega agua y se calienta hasta 45 C por unos 10
minutos.
5.- Las muestras lavadas se tratan con una solucin de Na2CO3 al 10% en peso (ajustando el pH a 9-10),
se calienta hasta 70 C agitando continuamente, luego dejar en reposo por varias horas, conviene dejarlo
hasta el da siguiente, de tal modo que se macere. Durante la maceracin, el cido algnico se somete a un
tratamiento alcalino para solubilizar el extracto como alginato de sodio, como resultado, la solucin
presentar un aspecto lechoso parduzco y viscoso.
6.- Se filtra y el residuo se vuelve a tratar con Na2CO3 al 2% a 70 C por 10 minutos, se filtra y el filtrado
se agrega a la solucin anterior y, si es necesario, se vuelve a filtrar.
7.- Los filtrados anteriores tienen un aspecto coloidal y de color pardo oscuro. Para blanquearlo o
decolorarlo se agrega una solucin de hipoclorito de sodio al 5.25% en la proporcin de 1/10 del
volumen de los filtrados resultantes que contiene el vaso de precipitado y se deja actuar por unos 10
minutos.
8.- Al filtrado total contenido en el vaso de precipitados se determina el pH inicial, luego se acidifica con
HCl concentrado, agregando de 10 en 10 ml , midiendo su pH hasta llegar a pH=2:

74
Se observa la formacin de una gran masa de precipitacin blanquecina, que se deposita en el fondo del
recipiente. Se hace el filtrado empleando tela de tocuyo blanco, lavando el filtrado con cido clorhdrico
diluido.
9.- La purificacin consiste en cambiar de fase el compuesto de inters para eliminar con la otra fase los
contaminantes, en este caso se precipitar con cloruro de calcio el alginato quedando los contaminantes,
en su gran mayora, en las aguas sobrenadantes.
2NaAlg + CaCl ----- CaAlg + 2NaCl
10.- El precipitado obtenido, Alginato de calcio, se blanquea y desodoriza mediante un lavado con
NaClO. El alginato de calcio es de inters comercial obtenido en forma purificada, a partir de l pueden
obtenerse los restantes.
A continuacin el alginato de Calcio se acidifica con cido clorhdrico al 5%, 11.- para transformarse en
cido algnico, como se muestra en la siguiente reaccin:
CaAlg + 2HCl---- HAlg + CaCl
12.- El cido algnico se escurre y se seca en estufa de vaco a 50C hasta peso constante, por unas 5
horas, se enfra y se pesa.
El ltimo producto buscado es el alginato de sodio el que se consigue desde la solucin cida de cido
algnico por alcalinizacin con NaOH 5 N, como este alginato es soluble en agua se seca en estufa de
vaco a 50C hasta peso constante.
HAlg + NaOH ---- NaAlg + H2O

Aplicaciones del alginato:


Alimenticias: Espesante, estabilizante o propiedades de suspensin en jugos de fruta, salsa de ensaladas,
milk shakes, salsas, cremas, cerveza, adornos para postres. Propiedades gelificantes en alimentos para
animales, relleno de aceitunas, gelatinas. Control en fabricacin de quesos, fabricacin de helado,
cubiertas de frutas en postres.
Farmacuticas: Propiedades espesantes en jarabes, emulsiones, lociones, cremas. Caractersticas de
rpida hidratacin en desintegracin de tabletas, controlador de irrigacin de droga. Propiedades
gelificantes en polvos de impresin dental.
Textiles: Propiedades gelificantes en gomas para impresin, propiedades de limpieza, sistemas reactivos
de tinta, sistemas de dispersin de tinta, inhibidor de transporte fluido, baos de tinta.
Otras: Propiedades de formacin de pelcula, interaccin con silicatos, electrodos de soldadura, sellado
de conservas, barnices, cermicas, pinturas cremosas.

V. CUESTIONARIO

1. Explique la estructura qumica del alginato


2. Proponga mtodos alternativos de purificacin de alginato
3. Proponga un anlisis qumico del producto final para determinar la composicin y estructura del
alginato
4. En cuanto a la capacidad gelificante de los alginatos, explique los mecanismos de gelificacion interna
y externa y su diferencia entre ellos.

VI. RESULTADOS

75
VII. OBSERVACIONES

VIII. CONCLUSIONES

76
PRCTICA

AISLAMIENTO Y SELECCIN DE
MICROORGANISMOS DE INTERS INDUSTRIAL

I. OBJETIVOS

Seleccionar microorganismos de diferentes fuentes, que puedan servir para la obtencin de metabolitos
de inters industrial.
Aplicar tcnicas de purificacin de microorganismos aprendidas previamente en microbiologa general.

II. MARCO TEORICO

Las reas de aplicacin de la microbiologa industrial son muy variadas, y de ellas surge la importancia y
el impacto que tiene esta disciplina en la actualidad.
En primer lugar, se debe destacar la importancia de la microbiologa industrial en el mantenimiento de la
salud y tratamiento de enfermedades, fundamentalmente por su aplicacin en la produccin de
compuestos de actividad farmacolgica y de vacunas.
En la industria de alimentos es tambin significativa la aplicacin de la microbiologa industrial, en la
produccin de bebidas, enzimas, saborizantes, productos lcteos y muchas otras aplicaciones.
La produccin agropecuaria se ve tambin favorecida en sus aspectos de produccin vegetal y animal,
por un conjunto variado de procesos microbiolgicos.
El rea de aplicacin en minera est relacionada con la biolixiviacin, o sea, con la aplicacin de
microorganismos en la extraccin de metales de minerales de baja ley.
Finalmente, el rea de servicios se refiere fundamentalmente a la aplicacin de microorganismos en la
purificacin de efluentes, aspecto fundamental para el mantenimiento de la calidad de vida.
Debido a que el xito o fracaso de un proceso fermentativo comienza con el microorganismo utilizado,
para la eleccin del mismo se deben tener en cuenta los criterios generales que se indican a continuacin:

1. La cepa a utilizar debe ser genticamente estable.


2. Su velocidad de crecimiento debera ser alta.
3. La cepa debe estar libre de contaminantes, incluidos fagos.
4. Sus requerimientos nutricionales deberan ser satisfechos a partir de medios de cultivo de costo
reducido.
5. Debe ser de fcil conservacin por largos periodos de tiempo, sin prdida de sus caractersticas
particulares.
6. Debera llevar a cabo el proceso fermentativo completo en un tiempo corto.
7. Si el objetivo del proceso es un producto, ste debera ser de alto rendimiento y de fcil extraccin del
medio de cultivo.

77
Los microorganismos que se utilizan en un proceso, pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de
fuentes naturales o de una coleccin de cultivos. En el mbito industrial, en general, cada firma posee su
propia coleccin de organismos, muchos de los cuales han sido mejorados por medio de tcnicas clsicas
de mutacin o de ingeniera gentica. Sin embargo, estas cepas slo son empleadas por la industria que
las posee, debido al gran valor comercial que representan. En algunos casos se dispone de organismos
modificados genticamente para llevar a cabo reacciones especficas de biosntesis, degradacin o
biocatlisis, los cuales estn protegidos por patentes. Esto significa que un gran porcentaje de organismos
aislados o modificados no est disponible para uso general en laboratorios.
Si el organismo a utilizar es aislado de fuentes naturales, como agua, suelo, plantas y desechos, la eleccin
del material de partida puede hacerse teniendo en cuenta que el organismo exprese en ese ambiente las
propiedades que son de inters.
Por ejemplo, en suelos tratados con pesticidas, se podran encontrar organismos adaptados a la
degradacin de estos productos qumicos; o en larvas de insectos muertos, agentes causales de la muerte.
Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de xito dependen de la tcnica elegida para el mismo;
en este caso las alternativas son: a) aislamiento directo, b) enriquecimiento del cultivo con o sin pre
tratamiento de la muestra.

III. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

Materiales y Reactivos
Asa.
Hisopos estriles.
Bolsas plsticas 1 l.
Cuchillo.
Caja Petri con agar nutritivo.
Caja Petri con agar papa dextrosa.
Caja Petri con agar YPD con 10 % de
Aceite de oliva.
Incubadora.
Mechero.
Balanza.

Las muestras que se analizarn son tierra, queso y pia.


Procedimiento para tierra
1. Pesar 10 g de tierra y mezclar con 90 ml de solucin salina estril dentro de una bolsa de
plstico; homogeneizar durante 1 minuto.
2. Inocular con el asa calibrada cada una de las cajas de cultivo, por la tcnica de estras, para
tener colonias aisladas.
3. Incubar las cajas de APD a 30 C y de AN a 37 C.
Procedimiento para queso
1. Pesar 10 g de queso y mezclar con 90 ml de solucin salina estril dentro de una bolsa de
plstico; homogeneizar durante 1 minuto.
2. Inocular con el asa calibrada cada una de las cajas de cultivo, por la tcnica de estras, para
tener colonias aisladas.
3. Incubar las cajas de APD a 30 C y de AN a 37 C.
Procedimiento para la pia
1. Mojar un hisopo con solucin salina estril y frotar la superficie de la pia con l.
2. Descargar el hisopo sobre un tercio de la superficie de la caja de cultivo y estriar la descarga
con un asa calibrada para tener colonias aisladas.

78
3. Incubar las cajas de APD a 30 C y de AN a 37 C.
Procedimiento para identificar los microorganismos de inters industrial
Dependiendo del uso que se est buscando para los microorganismos y la industria donde se emplearn,
ser el procedimiento a seguir.
1. En el queso se buscarn levaduras con actividad lipasa o esterasa, para eso se inocularn
diferentes colonias por picadura en la superficie de una caja de agar YPD
Con 10 % de aceite de oliva. De ser positivo, se observar un halo transparente, resultado de
la actividad lipasa positiva.
2. Tambin en el queso se buscarn bacterias del genero Lactobacillus cido-lcticas, con potencial
para ser utilizadas para la preparacin de yogur. Se efectuarn las pruebas bioqumicas
pertinentes para su identificacin.
3. En la pia se buscarn hongos del gnero Aspergillus, productoras de cido actico, as como
bacterias cido-acticas para la produccin de vinagre. La identificacin del hongo se har
con base en sus caractersticas macroscpicas y microscpicas, y para las bacterias se harn
pruebas bioqumicas.
4. Con la tierra se seguir el procedimiento dependiendo lo que crezca en la caja de cultivo, ya
sea hongos, levaduras o bacterias. Para el caso de los hongos, se identificarn con base en sus
caractersticas macroscpicas y microscpicas; para las bacterias, se harn pruebas
bioqumicas. En el caso de las levaduras, se observarn las caractersticas morfolgicas de las
colonias y un frotis en fresco al microscopio.

IV. CUESTIONARIO

1. Mencione cinco industrias en donde se utilizan microorganismos durante los procesos de


fabricacin.
2. Mencione cinco bacterias que son utilizadas en la industria alimentaria, as como el producto o
proceso en el que participan.
3. Mencione cinco levaduras que son utilizadas en escala industrial, as como el producto o proceso
en el que participan.
4. Mencione los lugares donde se pueden encontrar las bacterias del gnero Lactobacillus.
5. Mencione los lugares donde se pueden encontrar hongos del genero Aspergillus.

79
V. RESULTADOS

Resultados de las pruebas que se efectuaron a cada una de las colonias.

Bacterias Levaduras Hongos


Tierra

Queso

Pia

VI. OBSERVACIONES

Fotografas de las cajas de cultivo

VII. CONCLUSIONES

80
PRCTICA
AISLAMIENTO Y CULTIVO DEL RHIZOBIUM

I. OBJETIVO

- Obtener ndulos de Rhizobium de races de alfalfa.


- Observacin microscpica de bacterias de Rhizobium

II. FUNDAMENTO TERICO


La produccin agrcola basada en leguminosas es fundamental para la alimentacin humana,
especialmente si es en equilibrio con el ambiente. Por ello la interaccin natural de estas plantas
con una bacteria del suelo a nivel de la raz, es ecolgicamente importante, como medida para
evitar el uso excesivo de fertilizantes nitrogenados que deterioran el suelo y contaminan el
ambiente.

La fijacin biolgica del N2, solo se observa cuando la bacteria reconoce a su hospedero, lo infecta
a travs de los pelos radicales para que en la matriz de las clulas corticales induzca una meiosis y
mitosis acelerada que da lugar a un tejido hipetrofiado: El ndulo en el sistema radical de la
leguminosa para entonces Rhizobium ha perdido su pared celular y se ha transformado en un
bacteroide, mientras que por la enzima llamada nitrogenasa fija el N2 y lo convierte en amonio,
que luego transfiere al ribosoma vegetal para la sntesis de protenas vegetales; simultneamente
por la fotosntesis la leguminosa reduce el C02 en carbohidratos que servirn como fuente de
carbono y energa para Rhizobium, y con ella al aumentar la reserva de la glucosa mantenerlo
activo en el ndulo hasta cubrir las necesidades de N de la planta.

Por tanto el uso de inoculantes a base de Rhizobium que reducen la aplicacin de fertilizantes
qumicos al suelo; incrementan el contenido de N en el cultivo vegetal, su peso seco y mantienen
el rendimiento en las leguminosas, lo que en consecuencia al bajar su costo de produccin y la
contaminacin de mantos acuferos y suelos, es vital para una agricultura sustentable.

GRUPOS DE INOCULACIN CRUZADA Y ASOCIACIONES


DE Rhizobium LEGUMINOSA
Grupo de Especies de Gnero Leguminosa
Inoculacin cruzada Rhizobium hospedero incluida
Grupo de alfalfa R. meliloti Medicago Alfalfa
Melilotus Trebol dulce
Trigonella Alholva
Grupo del trbol R. leguminosarum Trifolium Trbol
biovar trifolii

81
III. MATERIALES Y REACTIVOS

Material Biolgico
- Races de alfalfa con ndulos
Matraces
- Placa Petri
- Pinzas bistur
- Mecheros
- Vasos PP 100 ml
Reactivos
- Agua destilada estril
- Hipoclorito de sodio 2.5%
- Bicloruro de Mercurio 0.2%
- Medio PSA (papa sacarsa agar)

IV. METODOLOGA

1. Preparacin del Medio PSA


Sancochar 125 gr de papa pelada con 250 ml de agua destilada, hasta que las papas estn
cocidas.
Filtrar la solucin de coccin y a 100 ml de volumen adicionar 3 gr de sacarosa y 1.2 g agar
agar autoclave 120C 15? Y proceder a plaquear
2. Observacin Microscopia de Bacterias de Rhizobium
- Obtener los ndulos de Rhizobium de las races de alfalfa.
- Caracterizar los ndulos segn posicin en las races, color, forma, tamao.
- Lavar con agua destilada los ndulos y realizar diseccin del ndulo sobre un porta objeto
y dejar caer el lquido interno para realizar un frotis.
- Fijar el frotis de Rhizobium.
- Realizar coloracin Gram
- Observacin en el microscopio a 100X

3. Cultivo de Rhizobium en Medio PSA


Esterilizacin de ndulos
- Disponer los ndulos en un matraz de 100 ml
- Lavar con etanol 70%, 1 minuto, decantar.
- Lavar en hipoclorito de sodio al 2.5% de 5 8 minutos, decantar
- Lavar con agua destilada estril 3 veces
- Realizar la diseccin del ndulo con la ayuda de pinzas y bistur sobre papel estril.
- Dejar caer el lquido interno del ndulo seccionado apretando con la pinza o pasar sobre
la superficie del medio.
- Tapar la placa y llevarla a incubar a 26 27C en estufa, 5 das.

82
V. CUESTIONARIO
- Qu otros medios se utilizaran para el cultivo de Rhizobium.
- Cul es la ruta metablica que utiliza el Rhizobium.
- Cul sera la importancia industrial del aislamiento y cultivo de Rhizobium.

VI. OBSERVACIONES

VII. CONCLUSIONES

83
PRCTICA
ANALISIS MICROBIOLOGICO DE AGUAS CONTAMINADAS

I. FUNDAMENTO TEORICO
La deteccin y cuantificacin de todos los microorganismos patognicos potencialmente presentes en el agua demanda tiempo,
los costos son elevados y no siempre se obtienen resultados positivos o que confirmen la presencia de los microorganismos.

El objetivo de la prueba microbiolgica del agua es proveer subsidio acerca de su potabilidad, es decir, ausencia de riesgo de
ingestin de microorganismos causadores de enfermedades, mayormente provenientes de la contaminacin por excrementos
humanos y de otros animales de sangre caliente. Vale resaltar que los microorganismos presentes en aguas naturales son, en
su mayora, inofensivos a la salud humana. Pero en la contaminacin por desecho sanitario estn presentes microorganismos
que podrn perjudicar la salud humana. Los microorganismos patognicos incluyen virus, bacterias, protozoarios y
helmintos.

El agua potable no debe contener microorganismos patognicos y debe estar libre de bacterias
indicadoras de contaminacin fecal. Como indicadores de contaminacin fecal, las bacterias de referencia
elegidas son las del grupo coliforme. El principal representante de ese grupo de bacterias es llamado
Escherichia coli. Ese grupo de bacterias ha sido elegido como indicador de contaminacin del agua
debido a los siguientes factores:

a. Estn presentes en el excremento de animales de sangre caliente, incluso de los seres humanos;

b. Son de fcil deteccin y cuantificacin por medio de tcnicas sencillas y econmicamente


viables, en cualquier tipo de agua;

c. Su concentracin en el agua contaminada est directamente relacionada al gradiente de


contaminacin fecal;

d. El tiempo de sobrevivencia en el agua es mayor que las bacterias patognicas intestinales, por
ser menos exigentes en trminos nutricionales, adems de ser incapaces de multiplicarse en
ambiente acutico o multiplicarse menos que las bacterias entricas; y. Son ms resistentes a
los agentes tensoactivos y agentes desinfectantes que a las bacterias patognicas.

BACTERIAS DEL GRUPO COLIFORME


Conceptos:
Coliformes
Los coliformes son bacilos gram negativos, no esporgenos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae
que fermentan la lactosa en 48 horas (son las enterobacterias fermentadoras de la lactosa) con produccin
de cido y gas en presencia de sales biliares.

En este grupo se incluyen cuatro gneros: Escherichia, Citrobacter, Enterobacter y Klebsiella, adems de
algunas cepas de Serratia (ver Tabla ).

84
Tabla . Caractersticas del grupo coliforme

Prueba Escherichia Klebsiella Enterobacter Citrobacter


Glucosa + + + +

Gas glucosa + + + +

Lactosa + + + d

Indol + d - -

Rojo metilo + - - +

Voges-Proskauer - + + -

Citrato - + + +

Urea - + +/- d

Movilidad +/- - + +
d= dudoso

El hbitat natural de los coliformes es el tracto intestinal humano y animal, aunque tambin se
pueden aislar de muestras medioambientales (tierra, polvo, aguas superficiales y vegetales). As, su
procedencia puede ser tanto fecal como no fecal. Los coliformes son resistentes a condiciones
medioambientales adversas, soportan la desecacin, pero no condiciones de congelacin o refrigeracin.
Esta ltima caracterstica hace que su investigacin en alimentos congelados no tenga ninguna relevancia.
Solamente son tiles como indicadores de la calidad en ciertos tipos de productos terminados o
indicativos de la fase de conservacin y almacenamiento.

En el grupo coliforme destacan por su mayor significacin sanitaria los coliformes fecales,
entendiendo como tales aquellos capaces de desarrollarse entre 44 y 46C (habitualmente 44,5 o 45,5C)
con produccin de cido y gas a partir de lactosa.

Coliformes totales (bacterias del grupo coliforme) bacilosgram-negativos, aerobios o anaerobios


facultativos, no formadores de esporos, oxidase-negativos, capaces de desarrollarse en presencia de sales
biliares o agentes pensativos que fermentan la lactosa con produccin de cido, gas y aldehdo a 35,0
0,5oC en 24-48 horas, e que pueden presentar actividad de la enzima galactosa. La mayora de las
bacterias del grupo coliforme pertenece a los gneros Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter,
aunque varios otros gneros y especies pertenezcan al grupo; Coliformes termotolerantes subgrupo
de las bacterias del grupo coliforme que fermentan la lactosa a 44,5 0,2oC en 24 horas; teniendo por
principal representante la Escherichia coli, de origen exclusivamente fecal.

Escherichia coli bacteria del grupo coliforme que fermenta la lactosa y manitol, con produccin de
cido y gas a 44,5 0,2oC en 24 horas, produce indo a partir del triptfano, oxidase negativa, no hidroliza

85
la urea y presenta actividad de las enzimas galactosa y glucuronidase, que es considerado el ms
especfico indicador de contaminacin fecal reciente y de eventual presencia de organismos patognicos.

El origen fecal de la E. coli es incuestionable y su naturaleza ubicua poco probable, lo que valida su papel
ms especfico de organismo indicador de contaminacin, tanto en aguas naturales como tratadas.

El Recuento Estndar de Bacterias es muy importante durante el proceso de tratamiento del agua, ya que
permite evaluar la eficiencia de varias etapas del tratamiento. Es importante tambin conocer la densidad
de bacterias, haya visto que un aumento considerable de la poblacin bacteriana puede comprometer la
deteccin de organismos coliformes. Aunque la mayora de esas bacterias no sea patognica, puede
representar riscos a la salud, como tambin, deteriorar la calidad del agua, provocando olores y sabores
desagradables.

II. PROCEDIMIENTO

Por razones prcticas, en este experimento slo vamos a tratar de distinguir la presencia y
cantidad de cuatro posibles tipos de bacterias contaminantes:

Escherichia coli Samonella


typhimurium Proteus morganii
Enterobacter aerogenes.

El mtodo a seguir consistir en efectuar una serie de diluciones decimales del agua contaminada en
solucin fisiolgica, siguiendo el esquema que se representa a continuacin:

0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml 0.1 ml

0.9 ml ClNa 0.9%

MUESTRA 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5

A partir de estas diluciones hay que inocular los siguientes medios:

1) Para recuento de bacterias totales por ml, hay que extender 0.1 ml de las diluciones 10-5,
10-4 y 10-3 sobre tres placas de agar comn, e incubarlas a 37C durante la noche en posicin
invertida. Tras incubar 24 horas se cuenta el nmero de colonias y se multiplica por los factores de
dilucin correspondientes.

2) Determinacin de bacterias coliformes. Se extiende 0.1 ml de las diluciones


10 y 10-4 sobre dos placas de agar MacConkey, incubndolas de la forma descrita. Una vez crecidas,
-5
se cuentan las colonias rojas y las rosceas y se multiplican ambos nmeros por los factores de
dilucin. Una vez efectuado el recuento, se toman varias colonias rojas y/o rosas al azar y se extiende
un inculo denso sobre la superficie de una placa de agar EMB, incubando a continuacin a 37C
durante toda la noche. En este medio, confirmativo para E. coli, esta especie debe dar lugar a
colonias negras con reflejos verdes metalizados, mientras que Enterobacter da colonias ms rosceas y
nunca reflejos. Utilizando este criterio, determinar el porcentaje de E.coli, sobre el total de coliformes.

86
3) Determinacin de Salmonella y Proteus. Se extienden 0.1 ml de las diluciones 10-
5 y 10-4 en placas de agar al verde brillante, y se incuban a 37C durante 24-48 horas. Sobre este
medio Salmonella y Proteus generan metabolitos alcalinos que hacen que los alrededores de las
colonias se vuelvan rosa, mientras que los eminentemente fermentadores no crecen o viran hacia el
amarillo (una buena forma de detectar coliformes).
Con estos datos, hay que deducir el nmero de bacterias (por ml) de agua contaminada que dan
colonias rosas. Para confirmar si se trata de Salmonella o Proteus, hay que reinocularlas en caldo de
urea y en TSI. Sobre caldo de urea la estirpe de Proteus debe generar color azul. Salmonella da
negativo para ambas actividades. En TSI nicamente la estirpe de Salmonella debe aparecer
con precipitados negros (por produccin de SH2 que genera sulfuro de hierro), apareciendo el resto
de los caracteres siguientes:

Fondo* Pendiente Ennegrecimiento


S. typhimurium A+G Alcalino S
P. morganii A+G Alcalino No
(*) A indica produccin de cido y G de gas.

III. RESULTADOS

IV. OBSERVACIONES

V. CONCLUSIONES

87
PRCTICA
MTODO PARA LA DETERMINACIN DE BACTERIAS
COLIFORMES, COLIFORMES FECALES Y ESCHERICHIA
COLI POR LA TCNICA DE DILUCIONES EN TUBO
MLTIPLE (NMERO MS PROBABLE O NMP)

I. OBJETIVO

Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos coliformes fecales.


Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la bsqueda de
microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli.
Organizar e interpretar los resultados.

II. GENERALIDADES

Debido a que un gran nmero de enfermedades son transmitidas por va fecal-oral utilizando como
vehculo los alimentos y el agua, es necesario contar con microorganismos que funcione como indicador
de contaminacin fecal. Estos deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben
tener una sobrevivencia similar a la de los patgenos intestinales y debe de ser capaces de desarrollarse
extraintestinalmente.

El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin embargo, las
caractersticas de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse fuera del intestino tambin se
observan en aguas potables, por lo que el grupo coliforme se utiliza como indicador de
contaminacin fecal en agua; conforme mayor sea el nmero de coliformes en agua, mayor ser la
probabilidad de estar frente a una contaminacin reciente.

Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no slo sobreviven, sino que se multiplican, por lo
que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado distinto al que recibe en el agua. En
productos alimenticios que han recibido un tratamiento trmico (pasteurizacin, horneado, coccin,
etc.), se utilizan como indicadores de malas prcticas sanitarias.

Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogneo con hbitat primordialmente


intestinal para la mayora de las especies que involucra.

El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gram- negativos aerobios o
anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con produccin de gas en un lapso
mximo de 48 h. a 35C 1C. Este grupo est conformado por 4 gneros principalmente: Enterobacter,
Escherichia, Citrobacter y Klebsiella.
El grupo de coliformes fecales, est constituido por bacterias Gram-negativas capaces de
fermentar la lactosa con produccin de gas a las 48 h. de incubacin a
88
44.5 0.1C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la ms prominente es
Escherichia coli.

La demostracin y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse mediante el


empleo de medios de cultivo lquidos y slidos con caractersticas selectivas y diferenciales.

Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado dentro de la familia
Enterobacteriaceae (bacterias entricas), existe como comensal en el intestino delgado de humanos y
animales. Sin embargo, hay algunas cepas de E. coli patgenas que provocan enfermedades diarreicas.
Estas
E. coli se clasifican con base en las caractersticas que presentan sus factores de virulencia nicos, cada
grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente. Las propiedades de adherencia a las clulas
epiteliales de los intestinos grueso y delgado son codificadas por genes situados en plsmidos. De
manera similar las toxinas son mediadas por plsmidos o fagos.

Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli enterohemorrgica
(EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa (EAEC) E. coli enteroadherente difusa
(DAEC). Existen otras cepas que no han sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores,
las 4 primeras estn implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos
contaminados.

Escherichia coli enterotoxignica ETEC es reconocida como el agente causal de la diarrea del
viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin fiebre. Este tipo de infecciones es muy
frecuente en pases subdesarrollados y afecta principalmente a los nios.
Patognesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una toxina termolbil
de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y funcin es similar a la toxina del clera,
la otra toxina que produce es termoestable y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de
resistir temperaturas de ebullicin hasta por 30 minutos.

La infeccin puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales frescos (lechuga en
ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido calculada en aproximadamente 108 bacterias,
por otra parte en jvenes y ancianos la dosis infectiva puede ser ms baja.
Escherichia coli enteropatgena ECEP. Es causa importante de diarrea en los lactantes
particularmente en los pases en vas de desarrollo. La ECEP se adhiere a las clulas de la mucosa del
intestino delgado. Sus factores de virulencia favorecen la adhesin y en ocasiones penetra a las clulas
mucosas. La infeccin
Por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada aunque ocasiones puede ser crnica.
Patognesis. El microorganismo produce dos protenas: la intimina que codificada por el gen eae y
un factor de adherencia que es codificado por plsmido, ambas protenas permite su unin a los
enterocitos y la destruccin las microvellosidades intestinales.
Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua contaminada y
productos crnicos. En estudios con voluntarios se encontr que la dosis infectiva es de 106
microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado con mltiples serotipos especficos de E. coli
los cuales pueden ser identificados mediante la tipificacin del antgeno O (somtico) y en ocasiones
del antgeno H (flagelar).
Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra estrechamente
relacionado con el gnero Shigella, produce una enfermedad similar a la shigelosis. La enfermedad se
presenta comnmente en nios de pases subdesarrollados y en personas que viajan a dichos
lugares. La EIEC provoca la enfermedad (diarrea disentrica invasiva) al invadir las clulas
epiteliales de la mucosa intestinal.
A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos, en el caso de EIEC
la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias. Algunas caractersticas importantes de este

89
microorganismo que permiten diferenciarlo de la cepa tpica de E. coli son: No utiliza la lactosa como
fuente de carbono, no descarboxilan la lisina, es inmvil y anaerogenicos.
La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y destruir el epitelio del colon
debido a que es capaz de evadir la lisis en los fagolisosomas.
Escherichia coli enterohemorrgica EHEC produce verotoxina, denominada as por su efecto
citotxico sobre las clulas Vero, una lnea de clulas renales de monoverde africano. Existen al
menos dos variantes antignicas de la toxina. La ECEH se ha asociado con colitis hemorrgica, una
variedad grave de diarrea; y con el sndrome urmico hemoltico, enfermedad capaz de producir
insuficiencia renal aguda, anemia hemoltica microangioptica y trombocitopenia. La verotoxina tiene
muchas propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas de Shigella dysenteriae
tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la verotoxina el ms comn y el nico que
puede identificarse en muestras clnicas es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es
negativa a la prueba de MUG.
La causa ms comn de esta infeccin es el consumo de carne sin cocinar o poco cocinada,
particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los casos de colitis hemorrgica y
sus complicaciones asociadas pueden prevenirse mediante la coccin completa de la carne
En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y sntomas causados por las cepas de Escherichia coli
antes descritas.

Propiedades y sntomas causados por algunas cepas de Escherichia coli patgenas

III. FUNDAMENTO

La determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo del Nmero ms Probable


(NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo microbiano de fermentar la lactosa con
produccin de cido y gas al incubarlos a 35C 1 C durante 48 h., utilizando un medio de
cultivo que contenga sales biliares. Esta determinacin consta de dos fases, la fase presuntiva y
la fase confirmativa.
90
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio el cual
permite la recuperacin de los microorganismos daados que se
encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de
carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado bilis verde
brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos microorganismos capaces de
tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante.
La determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se realiza a partir
de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la capacidad de las bacterias para
fermentar la lactosa y producir gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 0.1 C por
un periodo de 24 a 48 h.
La bsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se
siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de
metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioqumicas bsicas (IMViC) a las colonias tpicas.

IV. MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES

1. Para anlisis de agua

Para la preparacin del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de muestras de agua o
hielo, consultar el cuadro 1.

5 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o caldo


lactosado concentracin doble o triple con campana de Durhama.
5 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de
Durhamb.
5 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de Durham o caldo EC
MUG con campana de Durham b.
2 cajas Petri con agar para mtodos estndar d
2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno c
6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe
3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIM (opcional)e
3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de caldo citrato de Koser o citrato de Simmons
(opcional)

2. Para anlisis de alimentos

1 matraz de 250 mL con 90.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solucin amortiguadora de fosfatosa
2 tubos de 16 x 150 mm con 9.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solucin amortiguadora de
fosfatosa
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio concentracin sencilla o
caldo lactosado concentracin sencilla con campana de Durhama
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con campana de
Durhamb.
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC o EC-MUG con campana de Durhamb.
cajas Petri con agar para mtodos estndard 2 cajas Petri con agar Mac Conkeyc
6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe
3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIMe
3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de citrato de Simmons, o caldo citrato de Kosere

91
V. SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES
Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovace Frascos gotero con indicador rojo de metiloe
Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e
Frascos gotero con solucin de hidrxido de potasio al 40 % VP2e
COLORANTES PARA TINCIN DE GRAMd

VI. MATERIAL Y EQUIPO


Mechero, a,b,c,d,e. Propipetaa.
Gradillaa,b,c,e. Balanza granatariaa. Stomachera
Bolsas para stomacher .
Lmpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c Lentes de seguridadc
Pipetas de 10.0 mL estriles con tapn de algodna. Pipetas de 1.0 mL estriles con tapn de
algodna. Pipetas Pasteur estriles a, b, c, d
Asa bacteriolgicab,c,d,e Portaobjetosd Microscopio pticod Termmetro calibradob
Bao de agua a 44.5 0,1C.b Incubadora a 35 2,0Ca.
Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180Ca Autoclavea

NOTAS
Material necesario al inicio de la prctica.
Material necesario a las 48 h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 96
h. de iniciada la prctica. Material necesario a las 120 h. de iniciada la prctica.
Material necesario a las 144 h. de iniciada la prctica

92
DETERMINACIN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES

93
DETERMINACIN DEL NMP DE COLIFORMES EN MUESTRAS SLIDAS O ALIMENTOS

94
VII. PROCEDIMIENTO

1. Agua y hielo

1.1 Prueba presuntiva

Agitar la muestra y transferir volmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de los tubos con
caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado. tubos para homogeneizar la muestra.

CUADRO 1. Preparacin de inculo con caldo lauril sulfato de sodio

Incubar los tubos a 35 0,5C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay formacin de
gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se observa produccin de gas,
incubar 24 h. ms.

1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva, a otro
tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de
Durham.
Agitar los tubos para su homogeneizacin.
Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 h..
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento) y produccin
de gas despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h..
Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de organismos coliformes
totales/100 mL.

1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva (caldo lauril
sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de Durham.
Agitar los tubos para su homogeneizacin.
Incubar a 44.5 0.1 C en incubadora o un bao de agua durante 24 a 48 h.

95
Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y produccin de gas
despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.
Consultar la tabla 1 2 de NMP para conocer el nmero ms probable de organismos coliformes
fecales/ 100 mL.

Control de calidad
1. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de Enterobacter
aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.

1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli

Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por estra cruzada en
agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
Incubar las placas invertidas a 35C por 18-24 h.
Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfologa colonial: Colonias con centro
negro, planas con o sin brillo metlico. Si no hay colonias con morfologa tpica, probar una o ms
colonias lo ms parecido E. coli de cada placa y sembrarlas en agar cuenta estndar para realizar las
pruebas de morfologa microscpica y pruebas bioqumicas.
Incubar las placas a 35C por 18-24 h.
Hacer un frotis y teirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos cortos o
cocobacilos Gram-negativos.

1.4.1 Identificacin bioqumica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC).

a. Produccin de indol (I)

Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35C por 24 2 h.


Adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs.
La presencia de una coloracin roja en la superficie del tubo se considera prueba positiva.

b. Produccin de cidos mixtos (Rojo de metilo, RM)

Inocular un tubo adicional con caldo RM-VP e incubar a 35C por 48 2 h.


Adicionar 5 gotas de solucin de rojo de metilo.
Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo es una
prueba negativa.

c. Produccin de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)

Inocular un tubo con caldo RM-VP e incubar a 35C por 48 2 h.


Adicionar 0.6 mL de solucin VP1 y 0.2 mL de solucin VP2 y agitar.
Dejar reposar durante 10 minutos sin agitar el tubo; se considera una prueba positiva cuando se
desarrolla un color rosa en la superficie.

d. Utilizacin del citrato (C)

Inocular un tubo con caldo citrato de Koser o Simmons un inculo ligero para evitar turbiedad en el
tubo (opcional: puede utilizarse citrato de Simmons)
Incubar a 35C por 96 h.
El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera una prueba positiva.
NOTAS

96
Para determinar la produccin de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al agar SIM.
Este medio se inocula por picadura con el asa bacterioogca de forma recta.
Se incuba a 35C por 24 2 h. Finalizado el periodo de incubacin se adiciona el reactivo de
Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo.
Para determinar la utilizacin del citrato de sodio como nica fuente de carbono, tambin se puede
utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se inocula en la superficie (pico de
flauta). Se incuba a 35C de 24 a 48 h. La presencia de una coloracin azul debida al vire del indicador
que contiene el medio, indica prueba positiva

1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG (4 metil-
umbeliferil- -D-glucuronido)

FUNDAMENTO

Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de gas producen la
enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato especfico 4-metilumbeliferil-beta-D-
glucurnido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser expuesto a una fuente de luz
ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una fluorescencia azul fcil de observar. Cuando
el MUG es incorporado al caldo EC se puede identificar Escherichia coli.
a. Prueba confirmativa

A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) y de cada tubo que muestre formacin de gas , tomar
una asada y sembrar en un nmero igual de tubos con medio de confirmacin EC-MUG.
Incubar a 44,5 0,2C en bao de agua durante 24 h., observar si hay formacin de gas; si no
se observa la formacin de gas continuar la incubacin 24 h. ms.
Irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la lectura.
Utilizar estos resultados para calcular el nmero ms probable (NMP) de E. coli.

Control de calidad

Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K. pneumoniae
como control negativo.

2. Alimentos

2.1 Preparacin de la muestra.

Moler 10.0 gramos de la muestra en un picador 2 veces o con cubiertos estriles y mezclar.
Adicionar el alimento a 90.0 mL de agua peptonada al 0.1 %, licuar y dejar en reposo de 2-3
minutos.
Realizar diluciones hasta 10- 3 g/mL con agua peptonada al 0.1 %. En caso de trabajar con
muestras congeladas, descongelarlas previamente entre 2y 5 C.

2.1.1 Prueba presuntiva.

Aadir 1.0 mL de la dilucin 10- 1 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato
de sodio.
Aadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3 g/mL a dos series de 3 tubos cada una con caldo
lauril sulfato de sodio.
Incubar a 35-37C durante 24-48 h.
Los tubos despus de la incubacin, se registrarn como positivos si presentan crecimiento y
produccin de gas.

97
2.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva a otro
tubo de 16 x 150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante (brila), con campana de
Durham.
Agitar los tubos para su homogeneizacin.
Incubar a 35 2 C durante 24 a 48 h.
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe crecimiento y produccin de gas,
despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.
Consultar las tablas de NMP que se encuentran en el anexo para conocer el nmero ms
probable de organismos coliformes totales por mL.

2.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.

Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba presuntiva (caldo
lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC conteniendo campana de
Durham.
Agitar los tubos para su homogeneizacin.
Incubar a 44.5 0.1 C en incubadora o un bao de agua durante 24 a 48 h.
Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y produccin de gas
despus de un perodo de incubacin de 24 a 48 h.
Consultar la tabla de NMP (ANEXO) para conocer el nmero ms probable de organismos
coliformes fecales por mL.

Control de calidad

Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.

2.4 Prueba confirmatoria de Escherichia coli.

Confirmar la presencia de Escherichia coli en por lo menos el 10% de las pruebas con resultados
positivos de coliformes fecales; sembrar en placas de agar McConkey a partir de los tubos que
demostraron la presencia de gas en la prueba confirmativa.
Incubar las placas a 35 0.5C durante 24 2 h., observar las colonias tpicas fermentadoras
de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitacin de sales biliares.
Hacer tincin de Gram para observacin de la morfologa de las bacterias.
Seleccionar 1 o ms colonias aisladas para realizar pruebas IMViC.

Todos los cultivos que:


Fermenten la lactosa con produccin de gas dentro de las 48 h. a 35C.
Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos no esporulados
Se obtenga las siguientes combinaciones para el IMVIC: Biotipo 1(++--) o Biotipo 2 (-+--) son
consideradas como Escherichia coli.
Calcular el NMP de E. coli basndose en la proporcin de los tubos positivos de caldo EC.

98
CLCULOS Y EXPRESIN DE RESULTADOS

Calcular la densidad microbiana con base en el nmero ms probable conforme al procedimiento


sealado en la tabla 1, (que se muestra a continuacin y es utilizado para el anlisis de agua), para estimar
la poblacin de bacterias coliformes totales, bacterias coliformes fecales y Escherichia coli de acuerdo con
las diluciones empleadas.

Expresar en NMP/g o mL para alimentos y NMP/100 mL para agua. En el caso de usar volmenes de
20 mL de muestras de agua en 5 tubos o 10 mL de muestras de agua en 10 tubos, utilizar las siguientes
tablas:
TABLA 1. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias combinaciones de
resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con 20 mL de muestra de agua o hielo.

TABLA 2. ndice del NMP con 95% de lmite de confianza para varias combinaciones de
resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con 10 mL de muestra de agua o hielo.

99
FRMULA Y PREPARACIN DE REACTIVOS
USADOS EN LAS DIFERENTES PRCTICAS

1.- SOLUCIN DE AGUA OXIGENADA AL 10%


PREPARACIN
Preparar antes de usarse. Colocar 1 ml de agua oxigenada en 9 ml de agua destilada

2.- COLORANTE DE AZUL DE METILENO AL 5%


PREPARACIN
Azul de metileno 5.0 gr
Agua destilada 100 ml

3.- REACTIVOS DE LA TCNICA DE GRAM


A) COLORANTE CRISTAL VIOLETA
FRMULA:
Cristal violeta 2.0 gr
Etanol al 95% 20 ml
Oxalato de amonio 0.8 gr
Agua destilada 80 ml
PREPARACIN:
1.- Disolver el cristal violeta en el etanol
2.- Disolver el oxalato en el agua
3.- Mezclar las dos soluciones
B) SOLUCION DE LUGOL
FORMULA
Yoduro de potasio 10.0 gr
Agua destilada 20.0 ml
Yodo metlico 5.0 gr
Etanol, aforar a 100.0ml
PREPARACIN:
1.- Disolver el yoduro de potasio en el agua
2.- Agregar el yodo metlico y disolver
3. Aforar a 100 ml con etanol
C) SOLUCIN DE ALCOHOL ACETONA
FORMULA
Acetona 1 volumen
Etanol al 95% 2 volmenes
D) COLORANTE SAFRANINA
FORMULA
Safranina 0.5 gr
Agua destilada 100.0 ml
PREPARACIN
Disolver la safranina en aproximadamente 20 ml de agua, despus aforara a 100 ml con ms
agua.

4.- REACTIVOS DE LA TCNICA DE ZIEHL- NEELSEN


A) COLORANTE FUCSINA FENICADA
100
FORMULA:
Fucsina bsica 5.0 gr
Fenol 25.0 grs
Etanol al 95% 50 ml
Agua destilada aforar a 500 ml
PREPARACIN
1.- Colocar el fenol en 100 ml de agua destilada y calentar en bao a ebullicin
2.- Aadir la fucsina bsica y disolver
3.- Aadir el etanol y mezclar
4.- Aforar la solucin a 500 ml con agua destilada
B) SOLUCIN DE ALCOHOL CIDO
FORMULA
cido clorhdrico 3.0 ml
Etanol al 95 100.0 ml
PREPARACIN
Adicionar el cido clorhdrico al etanol, lentamente y agitando
C) COLORANTE AZUL DE METILENO
FORMULA
Azul de metileno 5.0 gr
Agua destilada 100.0 ml

5.- MEZCLA CRMICA


Dicromatode potasio 20.0 gr
cido sulfrico concentrado 20.0 ml.
Aguadestilada 250.0 ml.

101
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