Cinetica enzimtica de la pectinasa en el jugo de mango

Weiwen Zeng Z., Santiago Osorio A.

Resumen
Las industrias usan tecnologas y operaciones que pueden acelerar, retardar o
proporcionar beneficios a los procesos de transformacin y aprovechamiento de los
frutas como el empleo de enzimas en los procesos de obtencin de pulpas de frutas.
El objetivo del tratamiento enzimtico con pectinasa, es el de aumentar la cantidad
de slidos solubles de la pulpa y disminuir la viscosidad de la misma, as que se
elaboro esta practica con el fin de observar el comportamiento de la velocidad de
hidrolisis enzimtica en un medio in vitro. Para esto se lavaron, cortaron y licuaron
varios mangos, se reparti en beakers y se aforo al doble de volumen con agua y se
adiciono una cantidad de enzima. Los resultados obtenidos no favorecieron lo que
ya esta planteado tericamente, puesto que se presentaron comportamientos
polinomicos y se concluyo que hay molculas que estn afectando el volumen de
control desfavoreciendo la reaccin enzimtica.

Introduccin
Segn Andrea et al (2007), los frutos exticos son bastante apetecidos por los
consumidores a nivel nacional e internacional, debido a la tendencia de consumir
alimentos sanos con un alto aporte nutricional.
Cada da se conocen nuevas tecnologas y operaciones que pueden acelerar,
retardar o proporcionar beneficios a los procesos de transformacin y
aprovechamiento de los frutas, como es el caso de las enzimas desarrolladas por
medio de la Biotecnologa. En este momento en el mercado hay diferentes tipos de
enzimas empleadas en los procesos de obtencin de pulpas de frutas, como las
pectinasas, las cuales brindan mayores ventajas ya que permiten estandarizar las
condiciones en los procesos, aumentar rendimientos, disminuir costos y mejorar
caractersticas fisicoqumicas y sensoriales de los productos.
El objetivo del tratamiento enzimtico con pectinasa, es el de aumentar la cantidad
de slidos solubles de la pulpa y disminuir la viscosidad de la misma.
Las sustancias pcticas son polisacridos de cadenas largas formada de cido -D-
galacturnico, unido entre si por enlaces 1-4, como se observa en la Figura 1, tienen
una parte ms o menos amplia de grupos carboxilos esterificados por radicales
metilo.

Figura 1. molcula de pectina

Las pectinas se encuentran como componente estructural de los frutos y verduras
principalmente en las paredes celulares y los espacios intercelulares de los tejidos, y
resultan atacadas por una serie de enzimas llamadas pectinasas. Las sustancias
pcticas se dividen en:
Protopectina. Es insoluble en agua, se encuentra en los frutos verdes, ayudan a
mantener la dureza y firmeza de estos. En las paredes celulares las pectinas se
hallan combinadas con celulosa, de la cual pueden separarse por hidrlisis suave u
otros medios, transformndose en pectinas solubles o cidos ppticos.
Pectinas. Es soluble en agua, son cadenas poligalacturonicas metiladas al 100%,
es capaz de formar geles cuando se le combina en proporciones adecuadas con
azcar, acido y agua, se encuentran en frutos maduros.
cidos pectnicos. Soluble en agua, tienen una proporcin de metilizacin inferior
al 100 %. Sus sales se denominan pectinatos.
cidos ppticos. Son los cidos poligalacturnicos exentos de metoxilo. Sus sales
se denominan pectatos.
Las pectinasas son un conjunto de enzimas que hidrolizan la pectina, estn
ampliamente distribuidas en la naturaleza y son producidas por vegetales, frutas y
microorganismos (hongos y bacterias). Estas enzimas presentan una extensa
aplicacin en la industria alimentara, siendo utilizadas principalmente en la
obtencin de pulpas, jugos, vinos y cervezas.
Las pectinasas se clasifican en: enzimas desesterificantes (pectinesterasas),
enzimas despolimerizantes (hidrolasas y liasas) y protopectinasas. Las enzimas
pectolticas (endopoligalacturonasa o pectinesterasa), son apropiadas para hacer
ms eficiente el proceso de obtencin de pulpas concentradas, presentando las
siguientes ventajas:
En el proceso de despulpado se obtiene un mejor rendimiento, evitando que
parte de la pulpa quede adherida en las semillas y la cscara, adems es
posible degradar las fibrillas de la fruta, lo cual reduce notablemente las
perdidas y se obtiene una pulpa de textura mas uniforme.
Reduce la viscosidad de las pulpas hasta en un 90%, lo cual evita la
gelificacin en el proceso de evaporacin, y ayuda a la transferencia de calor.
Aumenta los slidos solubles (Brix) en un 30%, reduciendo as el tiempo de
concentracin y los costos del proceso en general.
 Metodologa
Se lav, pel, licu y col varios mango. A 7 beakers se adicionaron del colado
250ml y 250ml de agua a cada beaker. Despus se adiciono la enzima pectinasa en
las concentraciones que se describirn a continuacin:

Tabla 1. Porcentaje de enzima que le correspondi a cada grupo.

subgrupo %P/P enzima
1 0,05
2 0,1
3 0,15
4 0,2
5 0,25
6 0,35
7 0,5

En un viscosmetro se midi la viscosidad inicial de cada preparacin, luego cada 15

minutos por una hora y media.

Resultados y anlisis
Subgrupo 1.

Tabla 2. Datos reportados por el subgrupo 1.

Tiempo Viscosidad
(minutos) (cP)
0 257,6
15 167,1
30 92,5
45 90,2
60 91,4
75 78,9

Con la figura 2 se mostro el comportamiento de la viscosidad de la primera

formulacin, que tiene un decrecimiento, como es de esperarse y como lo describe
Andrea (2007), Natalia (2007), Antonio (1988). Ntese que tiene un decrecimiento
rpido registrado a los primeros 30 minutos y despus cambios cortos con el
transcurrir el tiempo, y con un aumento en el tiempo 60. Dado que se adiciono como
enzima la pectinasa y se obtuvo perdida de viscosidad podemos, por razonamiento
transitivo, atribuirle esta consecuencia fsica a la hidrlisis de la pectina de la fruta.
El comportamiento de los primeros 30 minutos puede explicarse como la formacin
de complejo enzima-sustrato, perdiendo la mayor parte de la pectina presente; y
como se nota en los siguientes tiempos registrados se not cambios diminutos, esto
se puede deber a que se esta deteniendo la reaccin enzimtica por el agotamiento
del sustrato, otra razn puede ser que la enzima ha comenzado a desnaturalizarse
por el transcurrir el tiempo por ser una protena, perdiendo su capacidad cataltica, o
una tercera razn es que el producto de la reaccin tenga un ef1ecto inhibidor sobre
la actividad de la enzima, de modo que sta disminuye cuando el producto llega a
cierta concentracin, (Antonio, 1988). Dado que la pectina esta compuesta por
unidades de un cido (cido galacturonico metilado), despus de 30 minutos y con
un bajn tan notable de la viscosidad, no seria extrao encontrar gran concentracin
de cido galacturonico en la mezcla, por tanto esta tercera razn tambin es
aceptada (Theodore, 1973).

Tiempo VS Viscosidad
300
250
Viscosidad (cP)

200
150
100
50
0
0 20 40 60 80
Tiempo (min.)

Figura 2. Tiempo VS Viscosidad de los datos reportados por el subgrupo 1.

Adems se noto que despus de los 30 minutos la viscosidad no baja de los 70 cP

por tanto se infiere que hay otras molculas, adems de la pectina, que le atribuyen
esta caracterstica que lo diferencia del agua, como azucares libres producto de la
hidrlisis, otros carbohidratos como fibra y celulosa, vitaminas, protenas, minerales,
entre otras (Jos, 2003).

Subgrupo 2.

Tabla 3. datos reportados por el subgrupo 2.

Tiempo Viscosidad
(minutos) (cP)
0 230,6
15 150,8
30 143,8
45 139,5
60 138,5
75 135,6
 Tiempo VS Viscosidad
250
Viscosidad (cP)
200
150
100
50
0
0 20 40 60 80
Tiempo (min.)

Figura 3. Tiempo VS Viscosidad de los datos reportados por el subgrupo 2.

En esta formulacin cabe destacar que se uso un mango diferente, por tanto las
caractersticas fisicoqumicas iniciales son diferentes. Pero el comportamiento de
perdida de viscosidad es similar al de la primera formulacin, exceptuando que para
este caso no hay aumentos inesperados. Otra cuestin que se observo y destaco es
el nico gran cambio en la formulacin de la segunda formulacin se dio en el primer
intervalo de tiempo (primeros 15 minutos) con una perdida de casi 80 cP, en cambio
la primera formulacin tiene dos intervalos de inters que son a los 15 minutos de
haber iniciado la practica y a sus 15 siguiente (30 minutos), donde se registro una
perdida de aproximadamente 90 y 70 cP respectivamente. Recordando que las
materias primas sonde origen diferente, no es oportuno comparar los valores de
perdida. Pero cabe resaltar que el equilibrio de la viscosidad de la formulacin del
subgrupo 2 se alcanzo a en los primeros 15 minutos, en la mitad de tiempo que la
formulacin anterior, adems ntese que la formulacin 2 tiene el doble de enzima
que la formulacin 1

Subgrupo 3.
Tabla 4. datos reportados por el subgrupo 3.
Tiempo Viscosidad
(minutos) (cP)
0 192,8
15 97,5
30 99,8
45 98,8
 Tiempo VS Viscosidad
250

Viscosidad (cP)
200
150
100
50
0
0 10 20 30 40 50
Tiempo (min.)

Figura 4. Tiempo VS Viscosidad de los datos reportados por el subgrupo 3.

La tercera formulacin tambin muestra un equilibrio en los primeros 15 minutos,

con una disminucin en la viscosidad de aproximadamente 95 cP, y a partir de este
tiempo tiene variaciones mnimas de 1-2 cP, diferente al caso de la formulacin 2
con variaciones de 4 cP aproximadamente, asociando as que una mayor
concentracin de enzima da mayor disminucin en la viscosidad y por tanto tambin
en la pectina presente. Segn Auris y Emperatriz (2009) en un estudio de la
hidrlisis de productos amilceos describen la velocidad enzimtica in vitro con un
comportamiento similar a los obtenidos, una grafica de comportamiento logartmico.
Se obtiene la grafica correspondiente si se grafica concentracin de producto de la
hidrlisis en funcin del tiempo, que en caso de esta practica seria acido D-
galacturonico en funcin de tiempo.

Subgrupo 4.

Tabla 5. datos reportados por el subgrupo 4.

Tiempo Viscosidad
(minutos) (cP)
0 67,2
15 24,3
30 10,4
45 13,6
60 12,4
75 11,4
 Tiempo VS Viscosidad
80
70
Viscosidad (cP) 60
50
40
30
20
10
0
0 20 40 60 80
Tiempo (min)

Figura 5. Tiempo VS Viscosidad de los datos reportados por el subgrupo 4.

En esta preparacin se uso un mango que casualmente era de una especie con
viscosidad bajo, que segn Wendy et al. (2012), la viscosidad y cantidad de pectina
en un mango puede variar, como ya se dijo por la especie biolgica a la que
pertenezca, tambin pueden variar a medida que maduran pues que se hidrolizan
las protopectinas dando lugar a pectinas libres que aumentaran la viscosidad de la
pulpa. La formulacin 4 muestra un descenso de inters en los primeros 30 minutos,
que considerando que es una formulacin con mas concentracin relativa de enzima
es lenta, adems que la viscosidad final registrada es mas bajo que cualquier otra
formulacin.

Subgrupo 5.

Tabla 6. datos reportados por el subgrupo 5.

Tiempo Viscosidad
(minutos) (cP)
0 153
15 170,5
30 85,1
45 69,5
60 63,5
75 12,4

En esta formulacin todos los tiempos son de inters, puesto que comienza con un
incremento de 17,5 cP, despus un descenso de 85 cP aproximadamente, seguido
por dos tiempos que simulan un falso estado estacionario y por ultimo un nuevo
decline de 51 cP aproximadamente. Considerando que el mango es un material
biolgico, y que en sta practica no ha pasado por una transformacin trmica, los
microorganismos y levaduras propias del material siguen en funcionamiento (Victor,
2013), lo cual pueden producir alguna sustancia que altere la viscosidad, o podra
ser una falla en la toma de datos puesto que para que una sustancia aumente la
viscosidad en un sistema in vitro con una enzima industrial y despus no aparente
tener presencia en otros tiempos no es normal.

Tiempo VS Viscosidad
200
Viscosidad (cP)

150

100

50

0
0 20 40 60 80
Tiempo (min.)

Figura 6. Tiempo VS Viscosidad de los datos reportados por el subgrupo 5.

Aunque, despus de el primer decline, a los 30 minutos comienza una simulacin de

estar llegando al limite de cantidad de sustrato disponible, lo cual tampoco es
normal, puesto que en trabajos de hidrlisis in vitro de almidn de yuca y pectina de
mango de Auris (2009) y Wendy (2012) respectivamente, la curva que describe el
comportamiento de la hidrlisis solo pierde concavidad cuando se esta llegando al
agotamiento de sustrato. Y el ultimo decline da a entender que esta formulacin no
tiene otras molculas que aporten significativamente a la viscosidad, adems de que
es una formulacin con concentracin relativamente alta, 0,25% en peso, no es
aceptable que a los 75 minutos no halla llegado a una fase estacionaria definitiva.
Pero el hecho de que halla perdido tanta viscosidad puede significar el mejoramiento
de otros atributos como solidos solubles, acides, entre otros.

Subgrupo 6.

Tabla 7. datos reportados por el subgrupo 6.

Tiempo Viscosidad
(minutos) (cP)
0 116,4
15 83,8
30 130,9
45 83,8
60 79,2
75 82,5
 Tiempo VS Viscosidad
140
Viscosidad (cP) 120
100
80
60
40
20
0
0 20 40 60 80
Tiempo (min.)

Figura 7. Tiempo VS Viscosidad de los datos reportados por el subgrupo 6.

En el comportamiento de la formulacin 6 no se pudo encontrar algn patrn lgico,

puesto que por analoga simple, por tener mayor concentracin de enzima debera
de agotar el sustrato en un menor tiempo, pero la grafica muestra un
comportamiento polinomico, es decir, una lnea con varios puntos de inflexin.
Segn Guzmn et al. (2007) la variacin en la viscosidad puede deberse al escape
de alguna molcula puesto que el volumen de control esta en un sistema abierto.
Adems la formulacin esta conformada con material de un fruto vivo que como ya
se ha dicho, aun posee enzimas que pueden hidrolizar o liberar molculas que
modificaran la viscosidad.

Subgrupo 7.

Tabla 8. datos reportados por el subgrupo 7.

Tiempo Viscosidad
(minutos) (cP)
0 234,2
15 75,8
30 82,2
45 114,6
60 70,4
75 67,5
 Tiempo VS Viscosidad
250

Viscosidad (cP) 200

150
100
50
0
0 20 40 60 80
Tiempo (min.)

Figura 8. Tiempo VS Viscosidad de los datos reportados por el subgrupo 7.

La formulacin 7 tambin mostr un comportamiento polinomico, pero cabe destacar

que en el intervalo de 65-85 cP los datos muestran mayor regularidad, como si la
mnima cantidad de pectina estuviera en esos intervalos, y las razones a las
variaciones en los tiempos 15-45 minutos pueden ser las mismas que ya se ha
explicado. Adems se pudo observar que despus de una concentracin de enzima
mayor a 0,2 los desniveles son mas grandes y mas notables, pudiendo decir que
hay alguna algn organismo que vino con la enzima que produce las alteraciones.

Concentracin de enzima VS Velocidad de hidrlisis

Como se ha dicho anteriormente, la perdida de viscosidad se da por la hidrlisis de
pectina. Segn Antonio (1988) la cintica enzimtica se refiere a la velocidad de la
reaccin, expresada como producto formado por minuto, as que se expreso la
velocidad en un instante de tiempo por medio de la ecuacin 1.

( )
= Ecuacin 1

donde
: viscosidad final
: viscosidad inicial
: tiempo final

el negativo se debe a que la viscosidad es inversamente proporcional a la formacin

de acido galacturonico.
Tabla 9. Velocidades de cada concentracin en funcin del tiempo.
concentracin
Tiempo
0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,35 0,5
(minutos)
0 0 0 0 0 0 0 0
15 6,03 5,32 6,35 2,86 -1,17 2,17 10,56
30 5,5 2,89 3,1 1,89 2,26 -0,48 5,07
45 3,72 2,024 2,09 1,19 1,86 0,72 2,66
60 2,77 1,535 0,91 1,49 0,62 2,73
75 2,38 1,27 0,74 1,87 0,45 2,22
3,4 2,17 2,89 1,27 1,05 0,58 3,87

Tabla 10. Concentracin con su respectiva velocidad promedio.

concentracin velocidad Ln (velocidad)
0,05 3,4 1,223775432
0,1 2,17 0,774727168
0,15 2,89 1,061256502
0,2 1,27 0,2390169
0,25 1,05 0,048790164
0,35 0,58 -0,544727175
0,5 3,87 1,353254507

[enzima] VS velocidad y = -0.0426x + 2.1854

R = 3E-05
4.5
4
3.5
3
Velocidad

2.5
2
1.5
1
0.5
0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
[enzima]

Figura 9. Concentracin de enzima VS velocidades promedio.

 Ln (velocidad) VS [enzima] y = -0.7356x + 0.7619
R = 0.0265
1.5

1
Ln (velocidad)

0.5

0
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6

-0.5

-1
[enzima]

Figura 10. Concentracin de enzima VS logaritmo natural de la velocidades

promedio.

En un sistema in vitro, la enzima adicionada a cabo de un tiempo alcanza una

velocidad mxima que mantiene constante hasta acabar la cantidad de sustrato,
dado entonces que a cada formulacin se le adicionaba cada vez mayor cantidad de
enzima, es de esperar que la velocidad sea mayor. No se obtuvo como resultado
cosa parecida, como se muestra en la figura 9 los nicos rangos que siguen lo
descrito por la teora son 0,1-0,15 y 0,35-0,5, los otros rangos presentaron una
pendiente negativa, con otra contradiccin a lo terico, no presentan una linealidad,
es decir, si se traza una recta desde el primer punto hasta el ultimo, los otros puntos
no estn comprendidos dentro de la recta. De forma similar la recta generada por la
regresin lineal muestra una varianza de 0,000027 y puesto que esta ultima expresa
que relacin comparte un punto en el plano con la recta, donde 1 equivale a un
100% y por tanto pertenece a la recta, expreso que la recta no es confiable. Adems
calculando el valor del logaritmo de las velocidades y generando la regresin, se
obtuvo una varianza relativamente mas grande, as que se pudo concluir que la
velocidad de la enzima pectinasa en un cultivo in vitro tienen un comportamiento de
primer orden y mas logartmico que lineal.

Conclusin
La hidrolisis de la pectina en un cultivo in vitro de pulpa de mango, se manifest por
cambios fsicos en sus propiedades reologicas como la turbidez, es decir,
disminucin de su viscosidad.
En esta practica los comportamientos fueron anormales, puesto que el
comportamiento de la viscosidad de cada formulacin debi haber descrito un
movimiento logartmico y haberse detenido, adems la grafica de concentracin de
enzima VS velocidad debi haber simulado una recta. Esto se pudo deber al uso de
diferentes fuentes de materia prima, la formacin de molculas que desfavorecieran
el medio de las enzimas, perdi efectividad por desgaste o tiempo.

Recomendaciones
Utilizar materias primas de la misma especie y de la misma cosecha.
Preparar las formulaciones a partir de una sola matriz integrar todas las materias.

Bibliografa

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