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BIOQUIMICA BACTERIANA I

Tovalino Len Evelyn

Escuela Profesional de Ingeniera en


Acuicultura

Facultad de Oceanografa, Pesquera, Ciencias


Alimentarias y Acuicultura

Universidad Nacional Federico Villarreal

2016
Objetivos
Determinar la capacidad de los microorganismos de metabolizar ciertos azucares

Diferenciar la metabolizacin por cambios en el medio de cultivo

Clasificar al microorganismo

Mtodo

Participantes

- mbito espacial y temporal

La prctica se realiz el 21 de Junio en el laboratorio de microbiologa de la Facultad de


Oceanografa, Pesquera, Ciencias Alimentarias y Acuicultura, ubicado en Roma 350,
distrito de Miraflores

Materiales

Tubos de ensayo

Papel kraft

Hilo pabilo

Algodn

Aguja kohle

Gradillas para tubos de ensayo

Mechero Bunsen

Encendedor

Rotulador

Lata

EQUIPOS

Estufa
PROCEDIMIENTO

1. FERMENTACION DE AZUCARES

Cerrar puertas y ventanas

Desinfectar la mesa de trabajo y las manos con alcohol

Seleccionar los materiales a utilizar

Elegir la muestra a cultivar

Abrir la llave general de gas

Seleccionar el agar rojo fenol con maltosa, sacarosa, glucosa, lactosa en tubos de
ensayo (previamente preparados)

Colocar una lata con agua en calentamiento

Regenerar los medios de cultivo hasta pasar de fase solida a liquida

Enfriar hasta 45 C

Esterilizar el alambre de la aguja kohle, colocndola oblicuamente a la llama

Abrir el tubo de ensayo que contiene la cepa, flamear tres veces su boca

Introducir la aguja kohle y tomar el inoculo

Flamear nuevamente la boca del tubo y taparlo

Sembrar el inoculo en los tubos de ensayo por picadura profunda

Flamear tres veces la boca del tubo que contiene el agar y taparlo

Colocar el tubo en la gradilla

Esterilizar el alambre de la aguja kohle, colocndola oblicuamente a la llama

Rotular los tubos que contiene el agar

Dejar solidificar

Colocar los tubos en una lata vaca y cubrir la superficie con papel craff

Incubar a 37 C por 24 - 48 horas

Leer el cambio de color y clasificar al microorganismo


Figura 1. Calentamiento de los tubos Figura 2. riEsterilizacin de la aguja
kohle

Figura 3. Siembra del inoculo Figura 4. Incubacin en la estufa


Figura 5. Resultados

2. PRUEBA POLITROPA DE TSI

Cerrar puertas y ventanas

Desinfectar la mesa de trabajo y las manos con alcohol

Seleccionar los materiales a utilizar

Elegir la muestra a cultivar

Abrir la llave general de gas

Seleccionar el medio TSI previamente preparado

Encender el mechero Bunsen

Esterilizar el alambre de la aguja kohle, colocndola oblicuamente a la llama

Abrir el tubo de ensayo que contiene la cepa, flamear tres veces su boca

Introducir la asa kohle y tomar el inoculo

Flamear nuevamente la boca del tubo y taparlo

Introducir el inoculo en el medio TSI en el centro y luego hacer una estria en la


parte inclinada

Flamear tres veces la boca del tubo que contiene el medio TSI y taparlo

Colocar el tubo en la gradilla

Esterilizar el alambre de la asa kohle, colocndola oblicuamente a la llama

Rotular el tubo que contiene el medio

Colocar el tubo en una lata vaca

Cubrir la lata con papel craft y asegurar el papel con hilo pabilo

Incubar a 37 C por 24 - 48 horas

Anotar los cambios en el medio


Figura 6. Toma del inoculo Figura 7. Resultado

Resultados

En la tabla 1 se presentan los datos de fermentacin de azucares

CEPA MEDIO TIEMPO/ COLOR FERMENTACION


T
E. COLI ARF + GLUCOSA 48 HORAS AMARILLO
37 C
E. COLI ARF + MALTOSA 48 HORAS ROJO -
37 C
E. COLI ARF + LACTOSA 48 HORAS AMARILLO
37 C
E. COLI ARF + SACAROSA 48 HORAS AMARILLO
37 C

ARF = Agar Rojo Fenol


En la tabla 2 se presentan los datos de prueba politropa de TSI

CEPA MEDIO TIEMPO/ T CLASIFICACION

E. COLI TSI 48 HORAS 37 C FERMENTACION DE


GLUCOSA Y LACTOSA

Discusiones
FERMENTACION DE AZUCARES

El caldo rojo de fenol es usado para observar la fermentacin de algn carbohidrato


como puede ser maltosa, glucosa, sacarosa, lactosa, trealosa, etc. El caldo rojo de fenol
solo lleva un carbohidrato a la vez.

Ingredientes bsicos:

Peptona de casena, 12g


Extracto de carne, 1g
Cloruro sdico, 5g
Rojo fenol, 0.018g
Carbohidrato, 10g
Agua destilada, 1000ml

El caldo debe estar a PH 7.4, el color del caldo queda naranja-rojizo.

Si hay fermentacin del carbohidrato el caldo tornara de color amarillo, puede


observarse gas en forma de burbujas, estas burbujas se pueden ver mucho mejor en una
campana de Durham. Si no hay fermentacin el caldo tiene una coloracin naranja-
rojiza.

Este fenmeno se basa en que el metabolismo de la fermentacin produce cidos


medianamente fuertes como el cido actico, acido frmico, cido lctico, cido mlico,
entre otros, esto depende del tipo de carbohidrato que se ponga en el caldo. El rango de
pH del indicador rojo de fenol es: 6.8 8.4, esto nos dice que a PH de 6.8 o menos el
medio esta cido y el indicador cambia a color amarillo y si el pH es de 8.4 o ms el
medio esta bsico y el color se mantiene naranja-rojizo.

PRUEBA TSI
Determina la capacidad de un organismo de atacar un hidrato de carbono especfico
incorporado en un medio de crecimiento bsico, con produccin o no de gases, junto
con la determinacin de posible cido sulfhdrico.

El agar AHK es un medio diferencial que determina tanto la fermentacin de los


hidratos de carbono y la produccin de cido sulfhdrico. Las bacterias pueden utilizar
cualquiera de los sustratos incorporados en el medio y ser metabolizados, caractersticas
que son utilizadas para la diferenciacin de stas, principalmente para las
Enterobacterias.

Este medio contiene lactosa con una concentracin de 1% y glucosa 0.1%, lo cual
permite la observacin de la fermentacin de uno o de ambos carbohidratos por parte de
las bacterias, adems de la produccin de gas y de cido sulfhdrico.

La fermentacin es un proceso que se lleva acabo en condiciones aerbicas (pico de


flauta) y anaerbicamente (capa inferior). En el pico de flauta la glucosa
(monosacrido) es catabolizada inicialmente por medio del ciclo anaerbico de
Embden-Meyerhof, utilizado tanto por los aerobios como por los anaerobios para dar
cido pirvico, y posteriormente ste ser degradado a travs del ciclo de Krebs para dar
CO2, H2O y energa.

Por otra parte la lactosa (disacrido) ser primero degradada a sus monosacridos
correspondientes (glucosa y galactosa).

Beta-galactosidasa

Lactosa glucosa + galactosa

Ciclo de Krebs

Glucosa o galactosa CO2 + H2O + energa anaerbico

El medio TSI contiene una cantidad limitante de glucosa y una concentracin 10 veces
mayor de lactosa. Las Enterobacterias y los fermentadores de glucosa comienzan
metabolizando este azcar, ya que las enzimas que utilizan la glucosa estn presentes
como constituyentes de las bacterias, y stas pueden obtener mayor energa por
utilizacin del azcar ms simple.

Todos los otros carbohidratos deben ser convertidos en glucosa para entrar en el ciclo de
Embden-Meyerhof. La utilizacin de la glucosa se realiza en forma aerobia sobre la
estra, donde el oxgeno presente acta como aceptor terminal de electrones y en la parte
terminal de la columna en condiciones de anaerobiosis. Una vez que una bacteria
fermentadora de glucosa ha reducido toda la glucosa disponible a piruvato, comenzar a
metabolizar el piruvato a travs del ciclo aerbico de Krebs (sobre la estra), formando
productos finales cidos. El cido en el medio hace virar el amarillo del indicador de
pH, rojo de fenol. Entonces, luego de 6 horas de incubacin, la zona de la estra y el
fondo del tubo inoculado con un fermentador de glucosa tendrn un color amarillo. Si el
microorganismo no fermenta la glucosa, el fondo permanecer rojo (indicando que no
hay variacin del pH) o se alcalinizar (lo que puede visualizarse por un color rojo algo
ms intenso que del medio original), demostrando que la bacteria no es miembro de la
familia Enterobacteriaceae.

Despus de haber agotado la cantidad limitada de glucosa, una bacteria con capacidad
para utilizar la lactosa o sacarosa comenzar a degradarlas. Como el medio contiene 10
veces ms lactosa que glucosa, las bacterias encontrarn sustrato suficiente para
continuar la formacin de productos finales cidos. Luego 18 24 horas de incubacin
todo el medio TSI permanecer de color amarillo. Esta reaccin se denomina cido
sobre cido (A/A) y el organismo se identifica como un fermentador de lactosa. La
produccin de gas provocar la ruptura de la columna de agar o la empujar hacia la
parte superior, de modo que un fermentador de lactosa que produce gas dar una
reaccin A/A ms gas.

Si el organismo en estudio no es capaz de usar la lactosa del medio, debe producir


energa en forma menos eficiente al utilizar las protenas y aminocidos del medio como
fuentes nutritivas.

El metabolismo proteico se produce en la superficie de la zona inclinada donde el


oxgeno es abundante. Los productos de la degradacin de la peptona (como el
amoniaco) son alcalinos y provocan el viraje del indicador rojo de fenol a su color rojo
original. Un TSI inoculado con una bacteria que no fermenta la lactosa al cabo de 18-24
horas de incubacin presentar la zona inclinada roja y el fondo del agar permanecer
amarillo debido al metabolismo anaerobio de la glucosa durante la primera etapa. Esta
reaccin se denomina alcalina sobre cido (K/A).

Las bacterias que fermentan la glucosa tambin pueden formar productos alcalinos a
partir de la utilizacin de la peptona, sobre la zona inclinada. Estas reacciones sern
K/K.
Referencias bibliogrficas

Microbiology, 2002.

http://www.austin.cc.tx.us/microbugz/06anaerobicjar.html

http://www.microscience.com/STM.htm

http://www.microbiologyonline.org.uk/about.html