Prof. Dr.

Paulo Cirino de Carvalho Filho

O que Citometria de Fluxo?
Cito Metria Fluxo Separar Partculas
Contar microscpicas
Examinar suspensas em meio
Clula Medida Movimento Classificar lquido em fluxo

Exemplos:
Clulas Cromossomos Bactrias Microesferas (Beads)
Quais so as vantagens?
Permite analisar vrias caractersticas de uma clula de forma rpida e
por vrios parmetros (multiparamtrica)

Quais parmetros podem ser avaliados?

FSC (Forward Scatter) Tamanho relativo da clula

SSC (Side Scatter) Granulosidade ou complexidade celular

FL Intensidade de Fluorescncia (vrios canais: FL1, FL2, FL3, FL4...)

Parmetros: Deteco da disperso Lateral do
Laser
SSC (Complexidade Interna)

Deteco da disperso Frontal do

FSC (Tamanho)
Incidncia

Laser
da fonte
Luminosa
Parmetros: FSC e SCC
Parmetro: Intensidade de Fluorescncia
Fluorocromos: Corantes que aceitam a energia liminosa (Ex: Laser) a um dado comprimento de onda
e reemite a luz a um comprimento de onda mais longo.

http://www.keokimed.com/
Princpios da absorbncia e emisso da luz
Princpios da absorbncia e emisso da luz
Quando a luz absorvida por um fluorocromo, seus
eltrons tornam-se excitados ao passar de um estado
de repouso (1) a um nvel mximo de energia
chamado de Estado excitado singleto (2)

Fluorocromo sofre mudana conformacional interna

liberando uma parte da energia absorvida como calor

Os eltrons, posteriormente, caem para um nvel

energtico mais baixo, mais estvel, chamado de
Estado relaxado singleto (3).

Os eltrons voltam para seu estado fundamental e

liberando a energia restante (Emisso) e fluorescncia
(4).
Princpios da Absorbancia e emisso da luz
Espectro de exitao/emisso do FITC (Isotiocianato de Fluorescena)

Fluorocromo excitado emite luz num comprimento de onda maior que o absorvido
Princpios da absorbncia e emisso da luz

https://www.bdbiosciences.com/sg/research/multicolor/spectrum_viewer/index.jsp
Fluorocromos para Citometria de Fluxo
Compensao de Fluorescncia

Para o Fluorocromo A Para o Fluorocromo B

5% da 17% da
Total da Total da
fluorescncia fluorescncia
fluorescncia fluorescncia
total do total do
total em FL-1 total em FL-2
Fluorocromo B Fluorocromo A
Instrumentos
Anlise (Cell Analyzers) SEPARAO (Cell Sorter)
FACS (Fluorescence Activated Cell Sorter)

BD LSRFortessa BD FACSCALIBUR BD FACSSEQ BD FACSAria III

4 lasers e 18 cores 4 cores Isolamento avanado e 18 cores
caracterizao de clulas
individuais para estudos
genmicos
Instrumentos
A citometria de fluxo pode ser usada para separar as clulas de acordo com o subtipo
ou expresso do eptopo.
 Citmetro de Fluxo
CONJUNTO DE SISTEMAS

Fludos ptico Eletrnico

Introduz e alinha as partculas Gera e coleta os sinais de luz Converte os sinais pticos em sinais
para anlise eletrnicos para a anlise em computador
Subsistema Fludo
Subsistema ptico: Componentes de Exitao
Subsistema ptico: Componentes Coletores
Subsistema Eletrnico
Formao do pulso eltrico

Altura: Mxima corrente de

sada

rea: O integral do pulso

Largura: O intervalo de tempo

em que o pulso ocorre

Intensidade de sinal: Pode ser

medida pela altura ou rea
Armazenamento de dados e anlise
Armazenamento de dados e anlise
1 2

1.Histograma

2.Dot plot

3 4 3.Density plot

4.Contour plot
Nesta
Citometria
citometria
foi
tecidos
Ento,
incluindo
mover
lasers,sistemas
detectores
os
Uma
misturar
as
atravs
Cada
seja

"Side
do
proporcional
O
com
A
no
disperso
Assim
em
Ao
o
Alm
podem
populaes
que
emm
Esta
dentro
ada
tais
ou
vamos
pelo
Para
consulte
As
so
quando
Depois
eemitindo
Um
para
na
Embora
detectar
alguns
18
Os
Tais
permitindo
demquina
partir
propriedades
podem
colocado
aas
detectada
o
detectado
complexidade
diretamente
complexidade.
complexidade,
dirigida
tambm
feixe
citmetro
pesquisador
medida
quantidade
citmetro
detector
computador
clulas
dados
molculas
tcnica
mesma
cores
um
clulas
preparada
citmetro
laser.
caminho
fluorocromos.
dados
analisar
luz
nmero
um
impulso
excitadas
como
citmetro
dados
possuem
propriedades
analisada
capacidade
acitmetro
alm
o
mais
detectar
vez
clula
populaes
disso,
Scatter".
animao,
como
quantidade
tcnica
resto
como
modo
fluorforo
histograma
dispersa
acitmetros
nos
de
que
da
impulso
permitir
ou
de
do
aseja
amostra
2,
diferentes
aque
ser
em
luz
da
podem
aao
clula
que
de
para
lateral
laser
informaes
anticorpos
uma
da
excitao,
dentro
de
amostra
animao
quantificar
um
reforam
organismos,
amostra.
laser
molculas
ir
de
concentrar
para
converte
no
3,
amostra,
os
aque
ao
uma
na
heterogneas
de
do
por
desta
detecta
com
citometria
comum
longo
na
analisados
um
modo
para
uma
anlise
deteco
de
fluorescentes,
no
citometria
ou
tamanho
fluxo
de
para
aaspirar
fluxo
cada
experimental
citmetro
dados
individualmente.
de
canal
pode
proporcional
pesquisador
amostra,
converte
quantidade
clulas
afluxo
de
tenso,
populao
amostra
feixe
pticos
vai
de
luz
clula.
de
cada
detectar
no
interna
que
um
passa
de
fluxo,
suspenso
citmetro
um
frente
comprimento
4formulrio
(SCT)
luz
lado
vamos
ento
luz
num
fluxo
dentro
homogneas.
de
ade
fluxo.
animao,
amostra
ou
clulas
cores,
um
dispersar
anlise
de
emitida
tenso,
"ponto
em
analisar
aao
clula
frente,
detector
compreender
dispersa
os
estreito,
acitmetro
o
de
converte
uma
dispersa,
aque
para
de
dos
formar
clula
marcados
fluxo
clulas
usada
afluorescentes
luz
grfico
luz
um
aluz
atravs
no
na
pesquisador
luz
citmetro
mesmo
emodo
tambm
contm
pode
de
sobre
asoluo
poderes
que
amostra,
varivel,
a(FSC)
de
serem
laser.
quantidade
de
fluorescncia.
em
tamanho
mostraoa
dispero
apresent-lo
em
esses
levar
proporcional
de
de
qual
dispersa
afludica
ao
amostra
dispersa
dados
deteco
eixo
dispersa
mistura
caminho
citmetros
emitida
passa
individuais
vrios
de
heterognea
por
fluxo
podem
de
luz,
auma
foi
de
chamado
analisar
recolhem
fluxo.
no
profundidade
de
vrias
para
uma
seguida,
que
de
ou
mesmo
em
detectar
uma
qual
individuais?
partir
lateral,
de
ns
do
levando
para
fluorescncia,
clulas
localizado
quantidade
ainterrogao".
luz
do
dados
fluxo
colocada
y.
apresentados
citometria
tempo.
clulas
interior
proporcional
ede
vrios
citometria
fluorforos,
salina
suspenso
fluorescentemente
luz
de
da
pode
clula.
so
atravs
pontos
forma
vrias
outro
podem
fluorforos
um
contar
clula.
de
feixe
dispersa
da
nica
em
heterognea
preparada
onda
pelo
fluxo
imenso
apopulaes
frontal
oat
anlise
disperso
por
de
do
dispersa
divida
directamente
excitadas,
pode
relativa
populaes
frente
fluxo,
extremamente
tamanho
tempo,
sistema
chamada
clula,
em
move-se
"forward
de
frente,
acomponentes-chave:
ser
vrios
mesmo
individuais
sinal
lado
de
direces.
da
efluorforo
filtros
luz,
presena
forma
de
fila
tambm
(dot
correto
no
perpendicular
edo
ser
fluxo
um
complexidade
utilizado
de
analisar
eanalisar
de
laser.
amostra
por
poder
de
na
por
de
para
clulas.
citmetro
feixe
antes
lateral
da
de
forma
analisados
lateralmente
ao
diferentes
plot).
histograma
fluxo
ao
de
fluorforos
luz
no
frontal
fluxo.
frente.
de
clulas
de
programas
atravs
detectar
clula
citometria
fluorescncia
Scatter",
na
tamanho
pesquisador
da
cada
computador
individuais
eixo
dispersa
de
emisso
pode
uma
de
das
ode
ojuntos,
amostra.
luz
laser,
quantitativos
tamanho,
tamanho,
um
edos
clula
clulas,
clulas
de
do
clula,
laser
lateral
detectar
pfluorforo
elo
fluxo,
Xda
feixe
lateralmete.
especficos
depesquisador.
clula.
na
fluxo
passarem
para
sua
aforma
de
aforma
forma,
forma,
luz
laser,
enviar
emitida
para
Anlise

Ac Monoclonal Ac Monoclonal
Clulas Conjugado com PE Conjugado com FITC

1
Marcao
das clulas
Anlise

FITC
Aplicaes
Imunofenotipagem

Diferenciao de populaes celulares

Cluster of Differentiation (CD)

Molculas utilizadas como marcadores.

Aplicaes
Imunofenotipagem

Exemplo:
Linfcito T reg:

CD4+ CD25+ FoxP3+

FITC PE PercP

Linfcito Th17:

CD4+ RoRyt+ IL-17+

FITC PE PercP
Aplicaes
Viabilidade Celular

Apoptose Necrose
Aplicaes
Viabilidade Celular
Aplicaes
Intensidade
DNA
Anlise do ciclo celular de
Fluorescncia

Tampo hipotnico HFS (Hypotonic Fluorescent Solution)

Iodeto de propdio + soluo permeabilizante de membrana
Aplicaes
Proliferao celular CFSE Carboxyfluorescein
succinimidyl
diacetate ester

Corante fluorescente lipoflico

citoplasmtico
Aplicaes
CBA (Cytometric Bead Array) Microesferas
+
Diferentes
intensidades de
Fluorocromos excitao
Deteco da produo de citocinas
CBA 25L = 6 Citocinas
ELISA 25L = 1 Citocina
Aplicaes
Clnicas
Contagens de linfcitos T auxiliares - Infeco pelo HIV

Para Avaliar o DNA de clulas tumorais e a atividade proliferativa Cncer de mama e

outras doenas malignas

Transplante de rgos

Isolar cromossomos humanos para a construo de bibliotecas genticas

Separar cromossomos X e Y - Criao de animais e fertilizao in vitro

Microbiologia