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Estrategias catalíticas usadas por las enzimas

1) Uso de la energía de unión con el sustrato. La energía libre liberada al formarse


múltiples interacciones débiles entre E y S sirve a dos propósitos: a)) establece la
especificidad del S y b) incrementa la eficiencia de la catálisis
- El set completo de interacciones se forman cuando S alcanza el estado de transición
- La energía de unión promueve cambios estructurales en E (ajuste inducido) y/o en S
f ili d la
facilitando l catálisis
áli i

2) Catálisis covalente. El sitio activo contiene un grupo reactivo (generalmente un potente


nucleófilo) que se modifica covalentemente en el transcurso de la reacción

3) Catálisis ácido-base. Un grupo ácido o básico de la enzima juga un rol como donor o
aceptor de protones

4) Catálisis
C táli i por iones
i metálicos.
táli U ión
Un ió metálico
táli pueded serviri como:
a) Un catalizador electrofílico
b) Un estabilizdor de una carga negativa en intermediarios de la reacción
c) Un generador de un nucleófilo incrementando la acidez de un grupo o molécula vecina
d) Puede
P d unirsei all S incrementando
i t d ell número
ú d interacciones
de i t i con E y asíí contribuir
t ib i a la
l
energía de unión
e) Puede ayudar en la conformación correcta del sitio activo y/o al posicionamiento correcto
de S en el mismo
f) Puede
P d participar
ti i aceptando
t d o trasfiriendo
t fi i d electrones
l t en reacciones
i redox
d

5) Catálisis por aproximación. En reacciones bisustrato, la velocidad es incrementada por el


acercamiento y posicionamiento correcto de los reactantes en el sitio activo de E
Influencia de la disminución de entropía sobre la velocidad de una reacción

Vel relativa

En a) los reactivos están separados, en b) están en una sola molécula con posibilidad de
libre rotación y en c) no pueden rotar. El producto es en todos los casos un anhídrido.
Las proteasas catalizan una reacción extremadamente lenta en las
condiciones celulares

Aunque
q la reacción es termodinámicamente favorable,, la vida media de un enlace ppeptídico
p a
pH 7.0 es de 10 a 1000 años. Las proteasas la hacen posible en el orden de los milisegundos.
La estabilidad del enlace peptídico es debida su caracter parcial de doble enlace que hace al C
carbonílico poco suscptible a un ataque nucleofílico.

Para acelerar la proteólisis, una enzima debe facilitar el ataque


nucleofílico sobre un carbonilo poco reactivo
Estructura de la Quimotripsina
Serina proteasas: enzima
proteolíticas con una Ser
que es transitoriamente
modificada
difi d en ell ciclo
i l
catalítico

Estructura primaria Estructura tridimensional Detalle del Sitio activo


Las serina
proteasas
utilizan u
u una
combinación
de catálisis
covalente y
ácido-base
La interacción
entre 3 residuos
del sitio activo
(tríada
catalítica)
convierte a la
Ser195 de
Quimotripsina
en un potente
nucleófilo, que
es acilado
transitoriamente.
Similares tríadas catalíticas son usadas por otras proteasas

Subtlisina

Carboxipeptidasa II
Proteasas que utilizan otras estrategias
catepsinas, caspasas

pepsina, renina,
proteasas retrovirales
Cys activada como un nucleófilo

termolisina,
carboxipeptidasa A, agua activada como nucleófilo por Aspartico
metaloproteasas de ECM

agua activada como nucleófilo por metal


Especificidad de las proteasas

La quimotripsina cliva a las proteínas sobre el carboxilo


de aminoácidos aromáticos o hidrofóbicos grandes
g

Aunque la tripsina es estructuralmente muy similar a la


quimotripsina y usa el mismo mecanismo catalítico, su
especificidad es muy diferente, cliva a las proteínas sobre
el carboxilo de aminoácidos básicos (lisina o arginina)
Un bolsillo hidrofóbico adyacente al sitio
activo
act vo es responsable
espo sab e de laa espec
especificidad
c dad de laa
quimotripsina
En la tripsina, el
bolsillo presenta una
carga
g negativa,
g , lo qque
lo hace específico para
residuos positivos
(lisina, arginina)
En la elastasa, el
bolsilo es específicos
para residuos
pequeños
ñ ((como
alanina y serina)

Otras proteasas
presentan una
combinación de
bolsillos a ambos
lados del sitio de
clivaje y así son
específicas para una
determinada secuencia
Inhibidores de proteasas como fármacos
Inhibidores de proteasas en la terapia anti HIV: HIV usa una aspartil
proteasa para formar las proteínas virales a partir de un precursor
miltidominio. Crixivan inhibe específicamente a esta poteasa bloqueando la
formación de partículas virales

Inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina (ACE), una


metaloproteasa, se usan en el control de la presión arterial. Ej: captopril,
enalapril
p
Catálisis por la
anhidrasa
carbónica
bó i

Anhidrasa carbónica II
humana:
La enzima contiene un Zn++
esencial para la actividad
unido a los anillos
imidazólicos de 3 histidinas y
a una molécula de agua.

El Zn++ facilita la disociación


del H2O bajándole el pKa de
15,7 a 7
1. El Zinc facilita la liberación de
un H+ de una molécula de agua,
generando
ge e a do uun ión
ó hidróxido.
d ó do.
2. El CO2 se une al sitio activo y es
posicionado para reaccionar con el
ión hidróxido.
3. El ión hidróxido ataca al CO2
convirtiéndolo en bicarbonato.
4. El sitio catalítico es regenerado
all liberarse
lib ell bicarbonato
bi b y unirse
i
una nueva molécula de agua

La histidina 64 se encarga de
transferir el H+ liberado en (1)
hacia la superficie de la proteína
sonde es aceptado por un buffer
Endonucleasas de restricción (clivan al ADN en secuencias específicas)
Las bacterias usan estas enzimas para
degradar
g ADN extraño,, protegiendo
p g
al propio por metilación.
La secuencia reconocida por EcoRV
(izquierda) y los sitios de metilación
((derecha)) en ADN pprotegido
g de la
acción catalítica de la enzima

Hidrólosis del enlace fosfodiester. Todas las


enzimas de restricción catalizan la hidrólisis de
un enlace fosfofiester del ADN, dejando un
grupo fosforilo
f f il unidoid all extremo
t 5′.
5′ El enlace
l
clivado se muestra en rojo.

Las enzimas de restricción requieren Mg++ para


s acti
su idad Este
actividad. E t ayuda
d a activar
ti a una molécula
lé l
de agua y la posiciona de manera que pueda atacar
al fosfato desplazando al oxigen 3´ del fósforo.
No hay diferencia de afinidad entre ADN específico y no específico, pero el aparato
catalítico completo se ensambla sólo en el complejo con el ADN específico

Estructura
E t t d
dell sitio
iti de
d reconocimiento
i i t
de ECORV. La secuencia del sitio de
reconocimiento es simétrica alrededor
del eje de rotación indicado en verde.

Distorsión del sitio de reconocimiento. El camino de la doble hélice (mostrado en rojo) es


substancialmente distorsionado al unirse a la enzima, lo que no ocurre con ADN no específico.
La compración de las posiciones del ADN específico (rojo) y no específico (naranja) revela que en el
último el ADN queda demasiado lejos de la enzima para completar el sitio de unión del Mg++
Las interacciones adicionales con
ADN específico aumentan la energía
de unión,
unión la que es usada para
impulsar la distorsión del ADN
necesaria para formar el complejo
catalíticamente competente.

Metilación de Adenina. Por más que el ADN


contenga la secuencia específica, la metilación de
adenina bloquea la formación de puentes de
hidrógeno con la EcoRV endonucleasa y evita la
formación del complejo catalíticamente
competente.
Las enzimas de restricción tipo II presentan un motivo estructural
conservado Cuatro elementos estructurales conservados,
conservado. conservados incluyendo la
región del sitio activo (en azul) son resaltadas en color en estos modelos
de un único monómero de cada enzima dimérica. Las posiciones de las
secuencias de aminoácidos que forman estos elementos dentro de cada
secuencia total se indica debajo de cada estructura
Nucleósido monofosfato (NMP) quinasas: Catalisis del intercambio de un grupo
fosforilo entre nucleótidos sin promover hidrólisis

Transferencia de grupos fosforilo por NMP


quinasas. Estas enzimas catalizan la inter-
conversión de un nucleósido trifosfato (aquí
ATP) y un nucleósido monofosfato (NMP) en
dos nucleósidos difosfato (ADP y NDP) por la
transferencia de un grupo fosforilo (en rojo)

Estructuras de Adenilato Quinasa y


G
Guanilato
il t Quinasa.
Q i El dominio
d i i de
d unión
ió all
NTP es una característica común en éstas y
otras nucleótido quinasas homólogas. El
dominio consiste de una lámina β central
rodeada a ambos lados por α-hélices
α hélices (en
púrpura) además un loop clave denominado
P-loop (en verde).
El dominio central de las NMP Quinasas. El P-loop se muestra en verde. Las
líneas punteadas representan el resto de la estructura proteica

Interacción del P-Loop con ATP. El P-loop de AMP quinasa interactúa con los grupos fosforilo
del ATP (mostrado con enlaces oscuros). Enlaces de hidrógeno (en verde) unen al ATP con
grupos NH de la proteína y a una lisina conservada entre las NMP quinasas
Complejos de los NTP con Mg++ (o Mn++) son los verdaderos sustratos para casi
todas las enzimas dependientes de NTP

Estructura de dos isoméros del complejo ATP-Mg++. Otros grupos coordinados al Mg++ fueron omitidos

Complejo ATP-Mg++
unido a AMP quinasa
El Mg++ se une a los
grupos fosforilos β y γ, y
las 4 moléculas de agua
unidas en las restantes
posiciones de coordinación
interactúan con grupos de
la enzima, incluyendo un
residuo conservado de
aspartato. Otras inter-
acciones son omitidas por
claridad
La unión de ATP induce un gran cambio conformacional
(ajuste inducido)

Conformational Changes in Adenylate Kinase.


Grandes cambios conformacionales son asociados con la unión
del ATP:
El P-loop (en verde) se cierra sobre el complejo ATP-Mg++, a su
vez el “lid domain” (amarillo) forma una tapa compacta sobre el
sustrato.
Esto posiciona al trifosfsto cerca del sitio de unión del NMP
(catálisis por aproximación)
Cambios conformacionales adicionales son producidos por la
unión del NMP que resultan en el correcto posicionamiento de
ambos sustratos evitando la transferencia del fosforilo al agua
El dominio P-Loop está
presente en un gran número de
proteínas que sufren grandes
cambios conformacionales
como: la ATP sintetasa, motores
moleculares como miosinas,
proteínas transductoras de
señales como transducina,
factor de elongación Tu,
helicasas y muchas otras

Tres proteínas que contienen


dominios P-Loop NTPasa