Está en la página 1de 34
Cátedra de Bioquímica y Biología Molecular - Curso 2009 - Clases Teóricas Complementarias
Cátedra de Bioquímica y Biología Molecular
- Curso 2009 -
Clases Teóricas Complementarias
Cofactores enzimáticos Moléculas no proteicas Coenzimas Moléculas orgánicas como ácido lipoico, FAD, Iones
Cofactores enzimáticos
Moléculas no proteicas
Coenzimas
Moléculas orgánicas
como ácido lipoico, FAD,
Iones
inorgánicos
como el Mg +2 ,
K + , Fe +2 /
Fe +3 , Zn +2
FMN NAD+ NADP+
,
,
Cu +2 Se
,
,
El FAD y FMN están unidos covalentemente
(Grupos prostéticos)
Holoenzima
parte proteica
+
Cofactor
=
Apoenzima
A los cofactores enzimáticos podemos distinguirlos entre: a) Cofactores estequimétricos o co-sustratos (cuando son
A los cofactores enzimáticos podemos distinguirlos entre:
a) Cofactores estequimétricos o co-sustratos (cuando son
modificados en la reacción). Ej:
Glucosa-6-P + NADP +
6-fosfogluconato + NADPH + H +
glucosa-6-P deshidrogenasa
b) Cofactores catalíticos (cuando no se modifican en la
reacción). Ej: Biotina en reacciones de carboxilación, iones
inorgánicos en muchas reacciones)
Al unos elementos inor ánicos que son cofactores enzimáticos
Al unos elementos inor ánicos que son cofactores enzimáticos
Papel del potasio en el centro activo de la piruvato quinasa La piruvatoquinasa cataliza la
Papel del potasio en el centro activo de la piruvato quinasa
La piruvatoquinasa cataliza la reacción
Fosfoenolpiruvato + ADP
Piruvato +ATP
La fijación inicial del potasio induce cambios
conformacionales en la quinasa, resultantes en
una mayor afinidad por el PEP. Además el K +
orienta al PEP en la posición correcta para la
transferencia de su fosfato al segundo sustrato,
el ADP. El magnesio coordina el sustrato con el
centro activo de la enzima .
Papel del magnesio ligado al ATP, en el centro activo de las quinasas. El magnesio
Papel del magnesio ligado al ATP, en el centro activo de las quinasas.
El magnesio se combina con el ATP para formar el verdadero sustrato y, además
puede hacer lábil el enlace P-O del ATP para favorecer la transferencia del fosfato
a la glucosa u otro aceptor.
Algunas coenzimas sirven como transportadores de átomos o grupos funcionales Coenzima Grupos químicos transferidos
Algunas coenzimas sirven como transportadores de átomos o grupos
funcionales
Coenzima
Grupos químicos transferidos
Precursores dietarios
CLASIFICACION DE ENZIMAS (EC X.X.X.N) 1- OXIDOREDUCTASAS (catalizan reacciones redox) Deshidrogenasas: producen la
CLASIFICACION DE ENZIMAS (EC X.X.X.N)
1- OXIDOREDUCTASAS (catalizan reacciones redox)
Deshidrogenasas: producen la deshidrogenación de un sustrato (Ej: LDH, alcohol
deshidrogenasa)
Oxidasas: transfieren electrones del donor al oxígeno dando H2O2 o H2O (Ej: glucosa oxidasa,
citocromo oxidasa)
Oxigenasas: catalizan la incorporación de oxígeno a un sustrato
Dioxigenasas: incorporan ambos átomos del O 2 . (Ej: oxigenación de catecol)
Monooxigenasas (hidroxilasas): incorporan 1 átomo del O2 en forma de –OH al sustrato, y el otro
se reduce a H 2 O.
Peroxidasas: utilizan H 2 O 2 como oxidante (Ej: NADH peroxidasa)
Catalasa: es única en que H 2 O 2 sirve como oxidante y reductor ( 2 H 2 O 2 O 2 + 2 H 2 O)
2 -TRANSFERASAS (transfieren grupos funcionales entre donores y aceptores)
Aminotransferasas (transaminasas): transfieren grupos –NH2 desde aminoácidos a cetoácidos
(ej: TGO, TGP)
Quinasas: transfieren el grupo γ-fosforilo del ATP u otro nucleósido trifosfato a grupos –OH o –
NH2 (ej: glucoquinasa).
Acil transferasas
Metil transferasas
Glucosil transferasas,Fosforil transferasas, etc.
3- HIDROLASAS (catalizan la transferencia de un grupo del donor al agua –hidrólisis) Esterasas Glucosidasas
3- HIDROLASAS (catalizan la transferencia de un grupo del donor al agua –hidrólisis)
Esterasas
Glucosidasas
Amidasas (Peptidasas)
Fosfatasas
Tiolasas
Fosfolipasas
Desaminasas
Ribonucleasas
Dnasas
4 -LIASAS (añaden o eliminan H2O, NH3 o CO2, o aldoles al o del sustrato)
Decarboxilasas
Deshidratasas (ej: fumarasa)
HidratasasAldolasas
Liasas (rompen uniones C-C, C-O o C-N por medios no hidrolíticos ni oxidativos)
5- ISOMERASAS (catalizan isomerizaciones diversas)
Isomerasas: producen isomerizaciones cis-trans, ceto-enol, aldosa-cetosa, etc. (ej:
fosfofructoisomerasa)
Epimerasas: producen la inversión en carbonos asimétricos (ej: UDP- glucosa epimerasa)
Mutasas: catalizan la transferencia intramolecular de un determinado grupo (ej:
fosfogliceromutasa)
6 -LIGASAS (Catalizan reacciones sintéticas en las que se unen dos moléculas a
expensas de un enlace fosfato de alta energía como ATP)
Sintetasas (ej: acilCoA sintetasa, aminoacil ARNt sintetasa, glutamina sintetasa, etc.)
Carboxilasas: cuando producen la incorporación de CO2 (ej: acetilCoA carboxilasa, piruvato
carboxilasa, etc)
Deducción de la ecuación de Michaelis–Menten
Deducción de la ecuación de Michaelis–Menten
Propiedades de la ecuación de Michaelis-Menten Reacción de orden 1 a baja [S] y de
Propiedades de la ecuación de Michaelis-Menten
Reacción de orden 1 a baja [S]
y de orden 0 a alta [S]
90% de saturación es alcanzado con una [S] de 10 Km
para 99% de saturación se necesita una [S] de ≈ 100 Km
Número de recambio (turnover), de algunas enzimas kcat s -1 Enzima Sustrato
Número de recambio (turnover), de algunas enzimas
kcat s -1
Enzima
Sustrato
¿Existe un máximo para la eficiencia de catálisis? La relación k cat / K m
¿Existe un máximo para la eficiencia de catálisis?
La relación k cat / K m provee un índice de la eficiencia catalítica del enzima
E y S deben encontrarse para formar el complejo ES, y la velocidad de este
proceso está determinada por su velocidad de difusión.
Así, la eficiencia catalítica de una enzima no puede superar la velocidad de
difusión
En medio acuoso, la velocidad difusión es aproximadamente 10 9 / M .seg
Las enzimas mas eficientes son las que tienen k cat / K m próximas a ese valor.
Esas enzimas han alcanzado casi la perfección catalitica debido a que la
gran mayoría de los encuentros entre E y S conducen a la reacción .
Enzimas cuya relación kcat / Km se aproximan a la máxima eficiencia catalítica
Enzimas cuya relación kcat / Km se aproximan
a la máxima eficiencia catalítica
Km esta relacionado inversamente con la afinidad de la enzima por el sustrato. Si k3<<k2,
Km esta relacionado inversamente
con la afinidad de la enzima por el
sustrato.
Si k3<<k2, Km es igual a la constante
de disociación del complejo E-S (Kd).
Km ≈ k2/k1 = Kd = 1/Ka
La velocidad máxima (Vm) es
directamente proporcional a la
cantidad total de enzima y es el
parámetro mayoritariamente
utilizado en la cuantificación de
enzimas
Vm = kcat [E]t
Cinética cooperativa n Vm [S] v = n n K0,5 + [S] La afinidad de
Cinética cooperativa
n
Vm [S]
v =
n
n
K0,5
+ [S]
La afinidad de E por S varía con [S].
K0,5 es la [S] necesaria para alcanzar el 50% de Vm y el
exponente n es el coeficiente de Hill.
La reacción es de orden n a bajas [S] y de orden 0 a altas [S]
Si n > 1 hay cooperatividad positiva y si n < 1 hay cooperatividad negativa.
Si n = 1, la cinética es michaeliana.
Koshland introdujo en concepto de sensibilidad enzimática, definido como S0.9/S0.1 donde:
S0.9 y S0.1 son las [S] con las que se obtiene el 90% y el 10% de Vm, respectivamente
n
0.5
1
2
S0.9/S0.1 533 81 9
para n=1 (sensibilidad normal)
para n<1 (subsensibilidad) y para n>1 (ultrasensibilidad)
Modelos que explican la cooperatividad (interaccion alostérica homotrópica) Las enzimas que presentan cinética
Modelos que explican la cooperatividad
(interaccion alostérica homotrópica)
Las enzimas que presentan cinética coperativa contienen al menos dos sitios de unión
para el sustrato. La unión del sustrato a uno de los sitios modifica la afinidad del
segundo sitio. Los modelos que explican este fenómeno consideran un equilibrio entre
una conformación tensa (forma T) y otra conformación relajada (forma R) de la
enzima. Ambos modelos pueden explicar la cooperatividad positiva, pero la
cooperatividad negativa es más fácilmente explicable por el modelo secuencial en el
que la unión del primer S favorece la conformación T del segundo sitio
ESTRATEGIAS DE REGULACIÓN ENZIMÁTICA USADAS EN EL CONTROL DEL METABOLISMO A) Regulación de la cantidad
ESTRATEGIAS DE REGULACIÓN ENZIMÁTICA USADAS EN
EL CONTROL DEL METABOLISMO
A) Regulación de la cantidad y disponibilidad de enzima activa
A1. Control de la expresión génica. Diferentes mecanismos de control a nivel de la transcripción,
procesamiento y degradación de mARNs, y de la traducción; pueden controlar la cantidad de enzima
A2. Modificaciones postraduccionales. Clivaje proteolítico, acilación, farnesilación, geranilación,
fosforilación y otras modificaciones pueden controlar la cantidad de enzima activa o su localización.
A3. Control de la degradación de enzimas. Activación de proteasas específicas, y señalización para
degradación proteosomal o lisomal pueden controlar la cantidad de enzima activa
B) Regulación de la actividad de enzimas
B1. Disponibilidad de sustratos (y productos). Las vías metabólicas cuyas reacciones son todas
reversibles (ej: rama no oxidativa de la vía de las pentosas-fosfato) pueden ir en una u otra dirección
dependiendo de la concentración de sustratos y productos. La sensibilidad a la [S] depende del coeficiente
de Hill.
B2. Disponibilidad de cofactores o co-sustratos. Ej: Control del ciclo de Krebs y otras vías oxidativas por
la relación NADH/NAD + o NADPH/NADP +
B3. Modulación de actividad por efectores alostéricos. El uso de activadores o inhibidores alostéricos es
un mecanismo muy frecuente de regulación de enzimas claves en muchas vías metabólicas.
B4. Modulación de actividad por modificación covalente reversible. Fosforilación-defosforilación,
adenilación-desadenilación y otros.
ESTRATEGIAS DE REGULACIÓN ENZIMÁTICA USADAS EN EL CONTROL DEL METABOLISMO (continuación) C) Regulación por
ESTRATEGIAS DE REGULACIÓN ENZIMÁTICA USADAS EN
EL CONTROL DEL METABOLISMO (continuación)
C) Regulación por compartamentalización o por unión a membranas
C1. Anfitropismo. Algunas enzimas son inactivas en solución y se activan por la unión a membranas
C2. Secuestro de enzimas en compartimentos celulares. Algunas enzimas que tienen su función en un
compartimento celular (p. ej. el citosol) pueden ser inactivadas por su secuestramiento en otro
compartimento celular (p. ej. en el núcleo)
D) Regulación de la especificidad del sustrato
En algunas enzimas, su especificidad por diferentes sustratos puede ser controlada por efectores alostéricos
u otros mecanismos.
E) Enzimas bifuncionales
Algunas proteínas pueden tener más de una actividad catalítica (catalizan al menos 2 reacciones químicas)
y mecanismos como fosforilación-defosforilación inducen la alternancia entre una u otra función catalítica.
F) Isoenzimas
Algunas enzimas pueden existir en diferentes isoformas que si bien catalizan la misma reacción pueden
tener diferentes propiedades catalíticas y/o regulatorias (diferente afinidad por S, Vmax, sensibilidad
diferencial a efectores alostéricos o a la modificación covalente), y diferente distribución subcelular o
tisular. Estas isoformas permiten la regulación diferencial de una vía metabólica en diferentes tejidos
además de la coordinación metabólica (entre diferentes compartimentos subcelulares o entre diferentes
tejidos)
En una vía metabólica, las enzimas regulatorias son generalmente aquellas que catalizan las etapas limitantes
En una vía metabólica, las enzimas regulatorias son
generalmente aquellas que catalizan las etapas limitantes (más
lentas) y que están alejadas del equilibrio
Principales mecanismos de regulación enzimática En azules se indican aquellos procesos que pueden cambiar la
Principales mecanismos de regulación enzimática
En azules se indican aquellos procesos que pueden cambiar la
cantidad de una enzima en la célula, y en rojo los que pueden
cambiar la actividad de moléculas de enzima ya existentes en la
célula
Interacción alostérica heterotrópica (Efectores alostéricos) Los efectores alostéricos negativos, (inhibidores)
Interacción alostérica heterotrópica (Efectores alostéricos)
Los efectores alostéricos negativos, (inhibidores) desplazan el equilibrio hacia la forma T de
la enzima, mientras que los positivos (activadores) favorecen la conformación R. Estos
juegan un rol importante en la regulación del metabolismo. Se unen a un sitio diferente al
sustrato. Pueden modificar Vm o la afinidad de la enzima por el sustrato

En la modulación alostérica tipo K, el modulador modifica la afinidad de la enzima por el sustrato (K0.5) sin cambiar la Vmax. Ej: Efecto de ATP y AMP sobre la glucógeno fosforilasa

afinidad de la enzima por el sustrato (K0.5) sin cambiar la Vmax. Ej: Efecto de ATP
afinidad de la enzima por el sustrato (K0.5) sin cambiar la Vmax. Ej: Efecto de ATP
afinidad de la enzima por el sustrato (K0.5) sin cambiar la Vmax. Ej: Efecto de ATP
afinidad de la enzima por el sustrato (K0.5) sin cambiar la Vmax. Ej: Efecto de ATP
En la modulación alostérica tipo V, la afinidad de los estados R y T por
En la modulación alostérica tipo V, la afinidad de los estados R y T por el sustrato son
similares, pero sus habilidades catalíticas (Vmax) son diferentes.
Ej: piruvato carboxilasas (activada por acetil Co-A 57 veces), guanilato ciclasa (activada
por NO 800 veces).
En muchos casos los efectores alostéricos modifican ambos parámetros (K0.5 y Vmax)
Los sitios de unión para efectores alostéricos pueden estar en subunidades regulatorias diferentes de las
Los sitios de unión para efectores alostéricos pueden estar en
subunidades regulatorias diferentes de las catalíticas. Ej: Calmodulina
es subunidad regulatoria de muchas enzimas activadas por Ca 2+.
MODELO DE REGULACION EN ENZIMAS CON SUBUNIDADES CATALÍTICAS Y REGULATORIAS La enzima posee subunidades catalíticas
MODELO DE REGULACION EN ENZIMAS CON SUBUNIDADES
CATALÍTICAS Y REGULATORIAS
La enzima posee subunidades catalíticas y
regulatorias. La unión del modulador M a la
subunidad regulatoria puede favorecer (como
se representan el modelo) o dificultar la unión
del sustrato
Inhibición por producto final, regulación negativa Inhibición simple de una via metabólica Inhibición múltiple.
Inhibición por producto final, regulación negativa
Inhibición simple de una via
metabólica
Inhibición múltiple. Cada producto
inhibe su propia sintesis. Además
intermediarios comunes o
productos finales inhiben la primer
reacción común a las tres vías.
La aspartato transcarbamilasa cataliza el primer paso en la síntesis de nucleótidos pirimídicos La ATC
La aspartato transcarbamilasa cataliza el primer paso
en la síntesis de nucleótidos pirimídicos
La ATC es una enzima alostérica representativa del modelo
concertado y de la inhibición por producto final (CTP). La unión del
sustrato a un sitio catalítico incrementa la actividad de los otros
sitios al promover la trancisión T a R (cooperatividad positiva). La
unión de CTP (efector alostérico negativo) a subunidades
regulatorias favorece la conformación T. Las transiciones
alostéricas son mediadas por cambios en la estructura cuaternaria.
Hay dos trímeros de subunidades catalíticas y tres dímeros de
subunidades regulatorias 2 c3 + 3 r2 → c6r6. El p-hidroxi-
mercuriobenzoato se une a grupos SH esenciales para mantener
la estructura multimérica y disocia las subunidades catalíticas de
las regulatorias
Transición entre estados T y R en la aspartato transcarbamilasa El CTP (citidintrifosfato), producto final
Transición entre estados T y R en la aspartato transcarbamilasa
El CTP (citidintrifosfato), producto final de síntesis de
nucléotidos pirimídicos promueve la transición R (activa)
a T ( inactiva). Los sustratos promueven la transición
conformacional inversa
La unión de CTP a las subunidades regulatorias induce una rotación que acerca las subunidades
catalíticas y ocluye los sitios activos. La unión de los sustratos (aspartato o carbamoilfosfato)
estabiliza las forma R promoviendo la rotación en sentido contrario, separando las subunidades
catalíticas y exponiendo los sitios activos. Se indican en rojo los enlaces de hidrógeno
intersubunidad que ocultan el sitio activo (en amarillo) y en azul los enlaces de H intrasubunidad
en el sitio activo no ocluído.
Un sustrato puede actuar actuar simultáneamente como un efector alostérico La fosfofructoquinasa 1 (PFK) es
Un sustrato puede actuar actuar simultáneamente como
un efector alostérico
La fosfofructoquinasa 1 (PFK) es la principal enzima que controla
el flu j o de la g lucólisis en músculo. El AT P es al mismo tiem p o
sustrato e inhibidor alostérico de esta enzima
PFK
es
subunidades idénticas.
un
tetrámero
de
4
Cada
subunidad une dos ATP, uno al
sitio catalítico y otro a un sitio
alostérico.
Modulación de la actividad de PFK-1 por ATP y AMP Aunque ATP y AMP se
Modulación de la actividad de PFK-1 por ATP y AMP
Aunque ATP y AMP se unen a diferentes sitios, existe interacción entre ellos de manera que la
unión de uno baja la afinidad por el otro
- El ATP es al mismo tiempo
un sustrato y un inhibidor
alostérico relativamente débil
- El AMP es un activador
alostérico fuerte
Modulación de la especificidad de sustrato La ribonucleótido reductasa cataliza la reducción de ribonucleósidos
Modulación de la especificidad de
sustrato
La ribonucleótido reductasa cataliza la reducción
de ribonucleósidos difosfato (NDPs) en desoxiribo-
nucleósidos difosfato (dNDPs).
NDP + NADPH + H + → dNDP + NADP + + H 2 O
Además de sitios que unen efectores reguladores de
la actividad global (sitios primarios), sitios
reguladores de la especificidad de sustrato aseguran
que los 4 dNDPs se produzcan en proporciones
adecuadas para su utilización en la síntesis del ADN
Modulación de la especificidad de sustrato (otro ejemplo) En la mayoría de los tejidos, la
Modulación de la especificidad de sustrato (otro ejemplo)
En la mayoría de los tejidos, la galactosil transferasa (GT) participa en la síntesis
de glicoproteínas (o glicolípidos) transfiriendo un residuo de galactosa desde UDP-
galactosa
GT
UDP-galactosa + glicoproteína —⎯—→ glicoproteína galactosilada + UDP
En la glándula mamaria, la prolactina induce la síntesis de α-lactalbúmina. Esta se
une a GT actuando como un regulador de especificidad: aumenta la afinidad por
glucosa que ahora actúa como aceptor resultando en la síntesis de lactosa
GT/α-lactalbúmina
UDP-galactosa + glucosa —⎯——⎯—→ lactosa + UDP
Regulación de la hexoquinasa IV (glucoquinasa) de hígado por secuestramiento en el núcleo La proteína
Regulación de la hexoquinasa IV (glucoquinasa) de hígado por
secuestramiento en el núcleo
La proteína regulatoria secuestra a la hexoquinasa IV en el núcleo
cuando la [Fructosa-6-fosfato] es alta, y la libera al citosol cuando la
[glucosa] es alta